JP2885092B2 - Ｃ反応性タンパク質の測定法及び測定試薬 - Google Patents
Ｃ反応性タンパク質の測定法及び測定試薬Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫比濁法による、検
体中のＣ反応性タンパク質（以下ＣＲＰと記載すること
もある）の測定方法に関する。さらに詳しくは、非特異
反応が抑制された、免疫比濁法による検体中のＣＲＰの
測定方法に関する。
体中のＣ反応性タンパク質（以下ＣＲＰと記載すること
もある）の測定方法に関する。さらに詳しくは、非特異
反応が抑制された、免疫比濁法による検体中のＣＲＰの
測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＣＲＰは、急性炎症あるいは急性の組織
崩壊で増加する急性期蛋白の一種で代表的な炎症マーカ
ーである。そのため、ＣＲＰの定量は、炎症・組織障害
を起こす種々の疾患の活動性、重症度、経過をみる際に
不可欠である。したがって、病院、臨床検査センター等
において、ＣＲＰはルーチンで測定されている。
崩壊で増加する急性期蛋白の一種で代表的な炎症マーカ
ーである。そのため、ＣＲＰの定量は、炎症・組織障害
を起こす種々の疾患の活動性、重症度、経過をみる際に
不可欠である。したがって、病院、臨床検査センター等
において、ＣＲＰはルーチンで測定されている。
【０００３】通常、検体中のＣＲＰの測定法としては、
試薬に抗ヒトＣＲＰ動物血清を用い、検体中のＣＲＰと
試薬中の抗ＣＲＰ抗体との反応により、抗原抗体複合体
を生成させる方法を利用する。そのような方法として、
ラテックス法、免疫比濁法等によるものが知られてい
る。一般に、ラテックス法は、高感度、かつ、高精度で
あり非特異的反応の影響も受けにくい。しかし、この方
法を、一般に普及している自動分析装置を使用すると、
ラテックス粒子の反応セルへの吸着がおこり、自動分析
装置の測定精度に悪影響を及ぼす。その結果、高価な反
応セルの寿命を短くするという問題があった。また、ラ
テックス粒子が高価で入手しにくいという問題もある。
試薬に抗ヒトＣＲＰ動物血清を用い、検体中のＣＲＰと
試薬中の抗ＣＲＰ抗体との反応により、抗原抗体複合体
を生成させる方法を利用する。そのような方法として、
ラテックス法、免疫比濁法等によるものが知られてい
る。一般に、ラテックス法は、高感度、かつ、高精度で
あり非特異的反応の影響も受けにくい。しかし、この方
法を、一般に普及している自動分析装置を使用すると、
ラテックス粒子の反応セルへの吸着がおこり、自動分析
装置の測定精度に悪影響を及ぼす。その結果、高価な反
応セルの寿命を短くするという問題があった。また、ラ
テックス粒子が高価で入手しにくいという問題もある。
【０００４】一方、免疫比濁法は、生化学自動分析装置
に適合可能なので、極めて有効な方法である。しかし、
免疫比濁法によるＣＲＰ測定においては、異好性抗体に
よる異常反応がおこることがある。そのため、検体によ
り誤差を生ずることがあるという極めて大きな問題があ
った。
に適合可能なので、極めて有効な方法である。しかし、
免疫比濁法によるＣＲＰ測定においては、異好性抗体に
よる異常反応がおこることがある。そのため、検体によ
り誤差を生ずることがあるという極めて大きな問題があ
った。
【０００５】そのような誤差を防止するため、ある種の
方法が考えられてきている。例えば、特開昭６１−２５
０６１では、入手容易な動物血清を使用して誤差を少な
くする方法が記載されている。この方法は、検体に、抗
ヒトＣＲＰ抗体及び動物血清を含む試薬を、加えて、検
体中のＣＲＰを測定することに特徴がある。しかし、こ
の方法では、検体ごとに、抗ヒトＣＲＰ抗体を含まない
試薬でブランクを測定し、その値を検体のＣＲＰ値より
差し引かなければならない。そのため、通常測定の２倍
の労力を必要とし、非効率的であり、実用上、問題があ
る。
方法が考えられてきている。例えば、特開昭６１−２５
０６１では、入手容易な動物血清を使用して誤差を少な
くする方法が記載されている。この方法は、検体に、抗
ヒトＣＲＰ抗体及び動物血清を含む試薬を、加えて、検
体中のＣＲＰを測定することに特徴がある。しかし、こ
の方法では、検体ごとに、抗ヒトＣＲＰ抗体を含まない
試薬でブランクを測定し、その値を検体のＣＲＰ値より
差し引かなければならない。そのため、通常測定の２倍
の労力を必要とし、非効率的であり、実用上、問題があ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、非特
異反応が抑制された、免疫比濁法による検体中のＣＲＰ
の測定方法及び測定試薬を提供することである。
異反応が抑制された、免疫比濁法による検体中のＣＲＰ
の測定方法及び測定試薬を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、免疫比濁
法による検体中のＣ反応性タンパク質を測定する方法で
あって、かつ、誤差の原因である非特異的反応の影響を
受けない方法を、開発するため、鋭意努力した。その結
果、驚くべきことに、検体に、抗ヒトＣＲＰ抗体を加え
る前に、ｔｈｒｅｏ−１，４−ジメルカプト−２，３−
ブタンジオールを添加すると、Ｃ反応性タンパク質測定
の問題である、非特異的反応が、極めて効率的に抑制さ
れることを見出だした。本発明はかかる知見により達成
されたものである。
法による検体中のＣ反応性タンパク質を測定する方法で
あって、かつ、誤差の原因である非特異的反応の影響を
受けない方法を、開発するため、鋭意努力した。その結
果、驚くべきことに、検体に、抗ヒトＣＲＰ抗体を加え
る前に、ｔｈｒｅｏ−１，４−ジメルカプト−２，３−
ブタンジオールを添加すると、Ｃ反応性タンパク質測定
の問題である、非特異的反応が、極めて効率的に抑制さ
れることを見出だした。本発明はかかる知見により達成
されたものである。
【０００８】本明細書中のｔｈｒｅｏ−１，４−ジメル
カプト−２，３−ブタンジオールとは、一般に、ジチオ
スライトール、ＤＴＴともよばれる。以下、この化合物
を単に、ＤＴＴと記載することもある。
カプト−２，３−ブタンジオールとは、一般に、ジチオ
スライトール、ＤＴＴともよばれる。以下、この化合物
を単に、ＤＴＴと記載することもある。
【０００９】本発明は、免疫比濁法による検体中のＣ反
応性タンパク質を測定する方法において、あらかじめ、
ＤＴＴを添加することを特徴とするＣ反応性タンパク質
の測定方法である。この方法により、免疫比濁法による
ＣＲＰ測定の非特異的反応を抑制することができる。
応性タンパク質を測定する方法において、あらかじめ、
ＤＴＴを添加することを特徴とするＣ反応性タンパク質
の測定方法である。この方法により、免疫比濁法による
ＣＲＰ測定の非特異的反応を抑制することができる。
【００１０】本明細書中の免疫比濁法とは、抗原と抗体
とを反応させ、格子状結合物を生成させ、それにより生
じた濁りを測定して、抗原または抗体を定量する方法で
ある。免疫比濁法としては、分光光度計を用いるのが好
ましい。ラテックス法は、広い意味で免疫比濁法に含ま
れるが、本明細書では、免疫比濁法に含まれないものと
する。ラテックス法は、非特異的反応が少なく、一方で
は、自動分析装置に適用しにくいので、本発明の効果を
受けにくいからである。
とを反応させ、格子状結合物を生成させ、それにより生
じた濁りを測定して、抗原または抗体を定量する方法で
ある。免疫比濁法としては、分光光度計を用いるのが好
ましい。ラテックス法は、広い意味で免疫比濁法に含ま
れるが、本明細書では、免疫比濁法に含まれないものと
する。ラテックス法は、非特異的反応が少なく、一方で
は、自動分析装置に適用しにくいので、本発明の効果を
受けにくいからである。
【００１１】本発明の好ましい方法としては；検体中の
Ｃ反応性タンパク質と抗ヒトＣ反応性タンパク質血清と
を反応させることにより検体中のＣ反応性タンパク質を
測定する方法において、検体にＤＴＴを添加し、次ぎ
に、検体のＣ反応性タンパク質と抗ヒトＣ反応性タンパ
ク質血清とを反応させることを特徴とするＣ反応性タン
パク質の測定方法、である。この方法では、免疫比濁法
によるＣＲＰ測定の非特異的反応を抑制し、かつ、通常
検体の測定には影響を与えない自動分析装置による測定
を達成できる効果を有する。
Ｃ反応性タンパク質と抗ヒトＣ反応性タンパク質血清と
を反応させることにより検体中のＣ反応性タンパク質を
測定する方法において、検体にＤＴＴを添加し、次ぎ
に、検体のＣ反応性タンパク質と抗ヒトＣ反応性タンパ
ク質血清とを反応させることを特徴とするＣ反応性タン
パク質の測定方法、である。この方法では、免疫比濁法
によるＣＲＰ測定の非特異的反応を抑制し、かつ、通常
検体の測定には影響を与えない自動分析装置による測定
を達成できる効果を有する。
【００１２】この方法は、つぎの試薬により、実施でき
る。すなわち、検体中のＣ反応性タンパク質を測定する
試薬であって； ｉ）ＤＴＴを添加した第１試薬、及び ｉｉ）抗ヒトＣ反応性タンパク質血清を含む第２試薬、 からなる免疫比濁法試薬を用いて、検体中のＣＲＰを測
定することができる。
る。すなわち、検体中のＣ反応性タンパク質を測定する
試薬であって； ｉ）ＤＴＴを添加した第１試薬、及び ｉｉ）抗ヒトＣ反応性タンパク質血清を含む第２試薬、 からなる免疫比濁法試薬を用いて、検体中のＣＲＰを測
定することができる。
【００１３】上記第１試薬は、免疫比濁法で通常、第１
試薬に使用されている緩衝液であって良い。例えば、ト
リス緩衝液等が使用できる。また、通常、第１試薬に添
加されるものを添加しても構わない。食塩等の塩、防腐
剤、または界面活性剤を添加しても良い。もちろん、Ｄ
ＴＴは必須成分として含まれる。
試薬に使用されている緩衝液であって良い。例えば、ト
リス緩衝液等が使用できる。また、通常、第１試薬に添
加されるものを添加しても構わない。食塩等の塩、防腐
剤、または界面活性剤を添加しても良い。もちろん、Ｄ
ＴＴは必須成分として含まれる。
【００１４】第２試薬は、免疫比濁法で通常、第２試薬
に使用されている緩衝液であって良い。例えば、トリス
緩衝液等が使用できる。また、通常、第２試薬に添加さ
れるものを添加しても構わない。食塩等の塩、防腐剤、
または界面活性剤を添加しても良い。もちろん、抗ヒト
Ｃ反応性タンパク質血清は、必須成分として含まれる。
に使用されている緩衝液であって良い。例えば、トリス
緩衝液等が使用できる。また、通常、第２試薬に添加さ
れるものを添加しても構わない。食塩等の塩、防腐剤、
または界面活性剤を添加しても良い。もちろん、抗ヒト
Ｃ反応性タンパク質血清は、必須成分として含まれる。
【００１５】
【作用】本発明では、免疫比濁法による検体中のＣ反応
性タンパク質を測定する方法において、あらかじめ、Ｄ
ＴＴ、すなわち、ＳＨを有する化合物を添加する。その
結果、非特異的反応を抑制して、Ｃ反応性タンパク質を
測定できる。この理由は、検体中の非特異的物質がＳ−
Ｓ結合を有する物質であるということも考えられる。す
なわち、ＤＴＴが、非特異的物質中のＳ−Ｓ結合を開裂
させ、非特異的活性を低下させることに起因するとも考
えられる。
性タンパク質を測定する方法において、あらかじめ、Ｄ
ＴＴ、すなわち、ＳＨを有する化合物を添加する。その
結果、非特異的反応を抑制して、Ｃ反応性タンパク質を
測定できる。この理由は、検体中の非特異的物質がＳ−
Ｓ結合を有する物質であるということも考えられる。す
なわち、ＤＴＴが、非特異的物質中のＳ−Ｓ結合を開裂
させ、非特異的活性を低下させることに起因するとも考
えられる。
【００１６】
【実施例】実施例中、対照にラテックス法のＬｐｉａエ
ースＣＲＰ（ダイヤトロン）を用いた。その他の試薬と
して、ＤＴＴ（ナカライ）及びヤギ血清（ニットーボ
ー）を用いた。測定は日立７１５０自動分析装置を使用
した。ＣＲＰ測定用免疫比濁法試薬の組成は次のものを
用いた。
ースＣＲＰ（ダイヤトロン）を用いた。その他の試薬と
して、ＤＴＴ（ナカライ）及びヤギ血清（ニットーボ
ー）を用いた。測定は日立７１５０自動分析装置を使用
した。ＣＲＰ測定用免疫比濁法試薬の組成は次のものを
用いた。
【００１７】 第１試薬 トリス緩衝液（ｐＨ ７．６） ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．１５Ｍ Ｔｗｅｅｎ２０ ２．０％ アジ化ソーダ ０．１％ ポリエチレングリコール６０００ ４．０％ ＤＴＴ ０（本発明の実施例では、 １〜１０ｍＭ）
【００１８】第２試薬 トリス緩衝液（ｐＨ ７．６） ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．１５Ｍ Ｔｗｅｅｎ２０ ２．０％ アジ化ソーダ ０．１％ ポリエチレングリコール６０００ ４．０％ 抗ヒトＣＲＰ抗体・ヤギＩｇＧ型血清 １０．０％
【００１９】日立７１５０自動分析装置の３７℃の反応
セル中に、検体血清１５μｌ及び第１試薬２５０μｌを
入れ、第１試薬の添加５分後に第２試薬５０μｌを添加
し、５分間、抗原抗体反応をさせた。そして、装置内の
演算機構により２ポイントアッセイを行い、検体ブラン
クを除いた、３４０ｎｍにおける反応前後の吸光度変化
量を測定した。標準曲線から、検体中のＣＲＰの濃度を
求めた。
セル中に、検体血清１５μｌ及び第１試薬２５０μｌを
入れ、第１試薬の添加５分後に第２試薬５０μｌを添加
し、５分間、抗原抗体反応をさせた。そして、装置内の
演算機構により２ポイントアッセイを行い、検体ブラン
クを除いた、３４０ｎｍにおける反応前後の吸光度変化
量を測定した。標準曲線から、検体中のＣＲＰの濃度を
求めた。
【００２０】参考例１．非特異反応検体の性質 検体中のＣＲＰをルーチン的に免疫比濁法で測定してい
る際、異常検体Ａ，Ｂが存在した。
る際、異常検体Ａ，Ｂが存在した。
【００２１】この検体とＣＲＰ測定用免疫比濁法試薬と
は、非特異的反応を示し、この検体は正誤差を有した。
この２検体と免疫比濁法試薬との反応曲線を調べた。検
体Ａは、標準ＣＲＰの反応曲線に近似し、かつ、希釈に
対してもほぼ理論的であった。検体Ｂは、標準的なＣＲ
Ｐの反応とは異なり直線的な反応であり、検体の希釈に
よって低値化した。第２試薬に抗ヒトＣＲＰヤギ血清の
代わりに、通常のヤギ血清を用い、非特異的反応を呈し
た検体の反応をみた。検体Ａは抗ヒトＣＲＰヤギ血清で
反応性を示したが、通常のヤギ血清では反応しなかっ
た。一方、検体Ｂはヤギ血清と反応性を示し、検体中、
非特異的抗体の存在を示唆した。すなわち、２検体は、
異なった性質を示した。
は、非特異的反応を示し、この検体は正誤差を有した。
この２検体と免疫比濁法試薬との反応曲線を調べた。検
体Ａは、標準ＣＲＰの反応曲線に近似し、かつ、希釈に
対してもほぼ理論的であった。検体Ｂは、標準的なＣＲ
Ｐの反応とは異なり直線的な反応であり、検体の希釈に
よって低値化した。第２試薬に抗ヒトＣＲＰヤギ血清の
代わりに、通常のヤギ血清を用い、非特異的反応を呈し
た検体の反応をみた。検体Ａは抗ヒトＣＲＰヤギ血清で
反応性を示したが、通常のヤギ血清では反応しなかっ
た。一方、検体Ｂはヤギ血清と反応性を示し、検体中、
非特異的抗体の存在を示唆した。すなわち、２検体は、
異なった性質を示した。
【００２２】参考例２．日常検査における異常反応の検
出 第２試薬の抗ヒトＣＲＰヤギ血清に代えて、ヤギ血清を
加え、非特異反応の検出を１８００検体について行っ
た。このヤギ血清によるブランク反応の平均値は０．０
ｍｇ／ｄｌ、ＳＤ＝０．０７７ｍｇ／ｄｌの正規分布を
示した。このうち０．５ｍｇ／ｄｌ相当以上の反応を示
した検体は３例（０．６５，０．７，０．９ｍｇ／ｄ
ｌ）あった。３例のうち２例はヤギ血清においても反応
を示し、ＣＲＰ測定に正誤差を与えていると考えられ
た。
出 第２試薬の抗ヒトＣＲＰヤギ血清に代えて、ヤギ血清を
加え、非特異反応の検出を１８００検体について行っ
た。このヤギ血清によるブランク反応の平均値は０．０
ｍｇ／ｄｌ、ＳＤ＝０．０７７ｍｇ／ｄｌの正規分布を
示した。このうち０．５ｍｇ／ｄｌ相当以上の反応を示
した検体は３例（０．６５，０．７，０．９ｍｇ／ｄ
ｌ）あった。３例のうち２例はヤギ血清においても反応
を示し、ＣＲＰ測定に正誤差を与えていると考えられ
た。
【００２３】実施例１．ＤＴＴ添加効果 非特異的反応を呈した２検体（Ａ，Ｂ）およびその他通
常の血清２５検体を用いて、第１試薬にＤＴＴを０，
２．５，５．０，７．５，１０ｍｍｏｌ／ｌを添加し、
非特異的反応の抑制を試みた。表１にその結果を示す。
２．５から５ｍｍｏｌ／ｌで効果を発揮し、非特異的反
応は抑制された。通常の検体はＤＴＴ添加試薬において
もほとんど影響を受けなかった。
常の血清２５検体を用いて、第１試薬にＤＴＴを０，
２．５，５．０，７．５，１０ｍｍｏｌ／ｌを添加し、
非特異的反応の抑制を試みた。表１にその結果を示す。
２．５から５ｍｍｏｌ／ｌで効果を発揮し、非特異的反
応は抑制された。通常の検体はＤＴＴ添加試薬において
もほとんど影響を受けなかった。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例２．ＤＴＴ添加（５ｍＭ）試薬の性
能 本発明のＤＴＴ添加試薬について、３種の検体で、同時
再現性、直線性及び測定感度について性能を調査した。
同時再現性はｎ＝１０，Ｍｅａｎ（±ＳＤ）＝１．４７
（０．０７），４．３０（０．０７），１０．８４
（０．０８）ｍｇ／ｄｌであった。直線性は１．５ｍｇ
／ｄｌ以下の低濃度で湾曲したが、それ以上では２０ｍ
ｇ／ｄｌまで直線性を示した。測定感度はＤＴＴ無添加
に対して約８０％であった。無ＤＴＴ試薬（Ｘ）とＤＴ
Ｔ添加（５ｍｍｏｌ）試薬（Ｙ）を比較するとｎ＝２
５，Ｙ＝−０．１７＋１．０５Ｘ，Ｓ．ｙｘ＝０．３
０，Ｘの平均値＝４．０６，Ｙの平均値＝４．０７とな
り、両者に差はなかった。
能 本発明のＤＴＴ添加試薬について、３種の検体で、同時
再現性、直線性及び測定感度について性能を調査した。
同時再現性はｎ＝１０，Ｍｅａｎ（±ＳＤ）＝１．４７
（０．０７），４．３０（０．０７），１０．８４
（０．０８）ｍｇ／ｄｌであった。直線性は１．５ｍｇ
／ｄｌ以下の低濃度で湾曲したが、それ以上では２０ｍ
ｇ／ｄｌまで直線性を示した。測定感度はＤＴＴ無添加
に対して約８０％であった。無ＤＴＴ試薬（Ｘ）とＤＴ
Ｔ添加（５ｍｍｏｌ）試薬（Ｙ）を比較するとｎ＝２
５，Ｙ＝−０．１７＋１．０５Ｘ，Ｓ．ｙｘ＝０．３
０，Ｘの平均値＝４．０６，Ｙの平均値＝４．０７とな
り、両者に差はなかった。
【００２６】
【発明の効果】本発明の測定法は、ＤＴＴを添加するこ
とによって免疫比濁法によるＣＲＰ測定の非特異的反応
が抑制される。しかし、本発明の測定法は、通常検体の
測定には影響を与えない。
とによって免疫比濁法によるＣＲＰ測定の非特異的反応
が抑制される。しかし、本発明の測定法は、通常検体の
測定には影響を与えない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−329357（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−213573（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−192661（ＪＰ，Ａ) 日本臨床検査自動化学会会誌第26回大 会予講集 第19巻第４号（1994年８月１ 日発行）Ｐ360 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/531 G01N 33/536 G01N 33/543
Claims (3)
- 【請求項１】 免疫比濁法による検体中のＣ反応性タン
パク質を測定する方法において、あらかじめ、ｔｈｒｅ
ｏ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオールを
添加することを特徴とするＣ反応性タンパク質の測定方
法。 - 【請求項２】 検体中のＣ反応性タンパク質と抗ヒトＣ
反応性タンパク質血清とを反応させ免疫比濁法で検体中
のＣ反応性タンパク質を測定する方法において、検体に
ｔｈｒｅｏ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジ
オールを添加し、次ぎに、検体のＣ反応性タンパク質と
抗ヒトＣ反応性タンパク質血清とを反応させることを特
徴とするＣ反応性タンパク質の測定方法。 - 【請求項３】 検体中のＣ反応性タンパク質を測定する
試薬であって； ｉ）ｔｈｒｅｏ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタ
ンジオールを添加した第１試薬、及び ｉｉ）抗ヒトＣ反応性タンパク質血清を含む第２試薬、 からなる免疫比濁法試薬。
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| JP24831994A JP2885092B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | Ｃ反応性タンパク質の測定法及び測定試薬 |
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| JP24831994A JP2885092B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | Ｃ反応性タンパク質の測定法及び測定試薬 |
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| JPH0886783A JPH0886783A (ja) | 1996-04-02 |
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- 1994-09-19 JP JP24831994A patent/JP2885092B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|
| 日本臨床検査自動化学会会誌第２６回大会予講集 第１９巻第４号（１９９４年８月１日発行）Ｐ３６０ |
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|---|---|
| JPH0886783A (ja) | 1996-04-02 |
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