JP2534067B2 - Ｃ反応性タンパクの定量法 - Google Patents
Ｃ反応性タンパクの定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＣ反応性タンパク（以下「CRP」と略称す
る）の定量法に関し、更に詳細には、免疫比濁法を改良
した、自動分析に適するCRPの定量法に関する。
る）の定量法に関し、更に詳細には、免疫比濁法を改良
した、自動分析に適するCRPの定量法に関する。
CRPは人血清中にあつて、肺炎双球菌菌体多糖類（Ｃ
物質）と反応するタンパクであり、β−グリブリン分画
中に存在するが、正常人血清中には認められず、炎症あ
るいは組織崩壊が起こると速やかに血液中に現われてく
る。このため、血清中のCRP量を測定することにより、
各種の化膿性疾患及びその感染症、リウマチ熱、リウマ
チ様関節炎、その他の膠原病、心筋梗塞、悪性腫瘍など
の診断が可能であり、特にリウマチ性疾患では活動性の
判定、治療効果および予後の診断に有用である。
物質）と反応するタンパクであり、β−グリブリン分画
中に存在するが、正常人血清中には認められず、炎症あ
るいは組織崩壊が起こると速やかに血液中に現われてく
る。このため、血清中のCRP量を測定することにより、
各種の化膿性疾患及びその感染症、リウマチ熱、リウマ
チ様関節炎、その他の膠原病、心筋梗塞、悪性腫瘍など
の診断が可能であり、特にリウマチ性疾患では活動性の
判定、治療効果および予後の診断に有用である。
従来、CRP量を測定する方法としては、CRPが抗原性を
有することを利用し、例えば抗体である抗CRP抗体を担
体ラテツクスに感作し、抗原抗体反応をラテツクスの凝
集として自動分析機により検出してCRP量を測定するラ
テツクス比濁法；スライドグラス上でCRPと抗CRP抗体を
単体ラテツクスに感作し抗原抗体反応せしめ、生じたラ
テツクス凝集の量を肉眼により観察してCRP量を測定す
るラテツクススライド凝集法；抗体である抗CRP抗体を
アガロースゲルなどのゲル中に添加しておき、抗原抗体
反応をゲル内沈降反応として見る免疫一元拡散法；プレ
ートあるいはビーズに抗CRP抗体を固相化しておき、抗
原CRPを反応させ、更に、抗CRP酵素標識抗体を反応させ
て反応した抗体の酵素量を測定するエンザイムイムノア
ツセイ法などが採用されてきた。
有することを利用し、例えば抗体である抗CRP抗体を担
体ラテツクスに感作し、抗原抗体反応をラテツクスの凝
集として自動分析機により検出してCRP量を測定するラ
テツクス比濁法；スライドグラス上でCRPと抗CRP抗体を
単体ラテツクスに感作し抗原抗体反応せしめ、生じたラ
テツクス凝集の量を肉眼により観察してCRP量を測定す
るラテツクススライド凝集法；抗体である抗CRP抗体を
アガロースゲルなどのゲル中に添加しておき、抗原抗体
反応をゲル内沈降反応として見る免疫一元拡散法；プレ
ートあるいはビーズに抗CRP抗体を固相化しておき、抗
原CRPを反応させ、更に、抗CRP酵素標識抗体を反応させ
て反応した抗体の酵素量を測定するエンザイムイムノア
ツセイ法などが採用されてきた。
しかしながら、ラテツクス比濁法はラテツクスの非特
異的凝集により測定値がばらついたり、試薬の乾燥によ
り自動分析機が詰まるなどの問題がある。
異的凝集により測定値がばらついたり、試薬の乾燥によ
り自動分析機が詰まるなどの問題がある。
また、ラテツクススライド凝集法は目視による方法で
あるため、測定の自動化が困難であるという問題があ
る。
あるため、測定の自動化が困難であるという問題があ
る。
更に、免疫一元拡散法は実施に長時間を要し、測定の
自動化も困難であるという問題がある。
自動化も困難であるという問題がある。
更にまた、エンザイムイムノアツセイ法では実施に際
して高価な酵素標識抗体を必然的に必要とし、しかも酵
素の種類や鮮度に依存する誤差の発生があり、操作も繁
雑であるという問題を有している。
して高価な酵素標識抗体を必然的に必要とし、しかも酵
素の種類や鮮度に依存する誤差の発生があり、操作も繁
雑であるという問題を有している。
一方、従来、免疫比濁法によるCRPの定量法も知られ
ているが、当該方法では反応の増強剤としてポリエチレ
ングリコールが用いられている。しかし、ポリエチレン
グリコールを用いるとCPR以外の物質と比特異的に反応
してしまい、精度が低くなるという問題がある。
ているが、当該方法では反応の増強剤としてポリエチレ
ングリコールが用いられている。しかし、ポリエチレン
グリコールを用いるとCPR以外の物質と比特異的に反応
してしまい、精度が低くなるという問題がある。
従つて、精度が高く、安価で、現在汎用の生化学用自
動分析機に好適に適用できるCRPの定量法の開発が望ま
れていた。
動分析機に好適に適用できるCRPの定量法の開発が望ま
れていた。
本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意検討を行な
つたところ、IgG型抗体とCRPの抗原抗体反応の初期にお
ける生成凝集の増加率はほぼ一定であり、CRPの濃度に
依存すること、上記抗原抗体反応を特定の非イオン性界
面活性剤の存在下で行えば、免疫反応が増強されること
により、測定時間を短縮できるとともに直線性が伸びて
測定範囲が拡大すること、更にCRP以外の物質との非特
異的反応を起こさず、高い精度が得られることを見出
し、本発明を完成した。
つたところ、IgG型抗体とCRPの抗原抗体反応の初期にお
ける生成凝集の増加率はほぼ一定であり、CRPの濃度に
依存すること、上記抗原抗体反応を特定の非イオン性界
面活性剤の存在下で行えば、免疫反応が増強されること
により、測定時間を短縮できるとともに直線性が伸びて
測定範囲が拡大すること、更にCRP以外の物質との非特
異的反応を起こさず、高い精度が得られることを見出
し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、フェニル基を有するポリオキシエ
チレンエーテル系界面活性剤の存在下、検体に抗CRP・I
gG型抗体を添加し、生じた凝集による吸光度変化量を測
定することを特徴とする免疫比濁法によるCRPの定量法
である。
チレンエーテル系界面活性剤の存在下、検体に抗CRP・I
gG型抗体を添加し、生じた凝集による吸光度変化量を測
定することを特徴とする免疫比濁法によるCRPの定量法
である。
本発明は、CRPを含む検体中に好ましくは過剰の抗CRP
・IgG型抗体を、フェニル基を有するポリオキシエチレ
ンエーテル系界面活性剤の共存下で添加し、抗原抗体反
応により生じた凝集の吸光度変化量を測定することによ
りおこなわれる。
・IgG型抗体を、フェニル基を有するポリオキシエチレ
ンエーテル系界面活性剤の共存下で添加し、抗原抗体反
応により生じた凝集の吸光度変化量を測定することによ
りおこなわれる。
検体としては、各種体液が用いられるが、一般には血
清が好ましい。
清が好ましい。
本発明においては、検体への抗CRP・IgG型抗体の添加
に際し、フェニル基を有するポリオキシエチレンエーテ
ル系界面活性剤を共存せしめることにより、非特異的反
応を起こすことなく免疫反応を増強することができ、こ
れにより測定時間の短縮、測定範囲の拡大及び高精度化
が可能となるものである。かかるフェニル基を有するポ
リオキシエチレンエーテル系界面活性剤としては、その
HLB値が13〜20以上のものが好ましく、より具体的には
例えばポリオキシエチレンオクチルフエニルエーテル
（E0＝30〜100のもの）、ポリオキシエチレンノニルフ
エニルエーテル（E0＝30〜100のもの）などが挙げら
れ、これらは単独で、または組み合わせて使用できる。
また、CRPと抗CRP・IgG型抗体との凝集反応系の好まし
い温度範囲は室温ないし40℃程度、pH範囲は4.5〜8.5で
あるので、本発明の実施には反応系をこの条件に適合さ
せることが必要である。更に、抗CRP・IgG型抗体（及び
フェニル基を有するポリオキシエチレンエーテル系界面
活性剤）の検体への添加は、同時に行なつても、あらか
じめフェニル基を有するポリオキシエチレンエーテル系
界面活性剤を加えておいた検体中へ抗CRP・IgG型抗体を
添加しても、いずれでも良く、これらのうち、抗CRP・I
gG型抗体は、一般には、原液ないし200〜300倍程度に希
釈して用いることができ、フェニル基を有するポリオキ
シエチレンエーテル系界面活性剤は２〜20重量％程度で
用いられる。なお抗CRP・IgG型抗体（及びフェニル基を
有するポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤）の添
加時及びその後においては、系が均一となるよう攪拌を
行なうことが必要である。
に際し、フェニル基を有するポリオキシエチレンエーテ
ル系界面活性剤を共存せしめることにより、非特異的反
応を起こすことなく免疫反応を増強することができ、こ
れにより測定時間の短縮、測定範囲の拡大及び高精度化
が可能となるものである。かかるフェニル基を有するポ
リオキシエチレンエーテル系界面活性剤としては、その
HLB値が13〜20以上のものが好ましく、より具体的には
例えばポリオキシエチレンオクチルフエニルエーテル
（E0＝30〜100のもの）、ポリオキシエチレンノニルフ
エニルエーテル（E0＝30〜100のもの）などが挙げら
れ、これらは単独で、または組み合わせて使用できる。
また、CRPと抗CRP・IgG型抗体との凝集反応系の好まし
い温度範囲は室温ないし40℃程度、pH範囲は4.5〜8.5で
あるので、本発明の実施には反応系をこの条件に適合さ
せることが必要である。更に、抗CRP・IgG型抗体（及び
フェニル基を有するポリオキシエチレンエーテル系界面
活性剤）の検体への添加は、同時に行なつても、あらか
じめフェニル基を有するポリオキシエチレンエーテル系
界面活性剤を加えておいた検体中へ抗CRP・IgG型抗体を
添加しても、いずれでも良く、これらのうち、抗CRP・I
gG型抗体は、一般には、原液ないし200〜300倍程度に希
釈して用いることができ、フェニル基を有するポリオキ
シエチレンエーテル系界面活性剤は２〜20重量％程度で
用いられる。なお抗CRP・IgG型抗体（及びフェニル基を
有するポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤）の添
加時及びその後においては、系が均一となるよう攪拌を
行なうことが必要である。
吸光度変化量の測定は、一般には300〜400nmの波長で
おこなわれる。また、本発明方法においては、凝集生成
量がほぼ一次的に増加する時期においての吸光度の変化
を測定することが重要であるので、一般には反応開始後
０〜15分までに、好ましくは反応開始後５分以内に吸光
度測定を終了させることが望ましい。また、測定用機器
としては、光度計を有する汎用の自動分析機であればよ
く、特に限定されないが、もちろん手動で行なうことも
できる。なお、本発明方法においてより精度を高めるた
めには、単位時間当たりの吸光度変化の測定値から最小
二乗法により吸光度変化量を求めれば良い。
おこなわれる。また、本発明方法においては、凝集生成
量がほぼ一次的に増加する時期においての吸光度の変化
を測定することが重要であるので、一般には反応開始後
０〜15分までに、好ましくは反応開始後５分以内に吸光
度測定を終了させることが望ましい。また、測定用機器
としては、光度計を有する汎用の自動分析機であればよ
く、特に限定されないが、もちろん手動で行なうことも
できる。なお、本発明方法においてより精度を高めるた
めには、単位時間当たりの吸光度変化の測定値から最小
二乗法により吸光度変化量を求めれば良い。
本発明方法によれば、例えば検量線を用いることによ
り、吸光度変化量からCRP量が求められる。検量線は、C
RPを含まない検体液、例えばCRPを含まない血清と、濃
度既知のCRPを含む標準血清を用いることにより容易に
作成される。
り、吸光度変化量からCRP量が求められる。検量線は、C
RPを含まない検体液、例えばCRPを含まない血清と、濃
度既知のCRPを含む標準血清を用いることにより容易に
作成される。
本発明方法を容易に実施するためには、本方法を実施
するために必要な成分、すなわち、必須成分である抗CR
P・IgG型抗体及びフェニル基を有するポリオキシエチレ
ンエーテル系界面活性剤のほか、検体のpHを一定範囲に
保ち、検体の濁りを防ぐための緩衝液、防腐剤、無機塩
等を含有する分析試薬用キツトを利用すると有利であ
る。
するために必要な成分、すなわち、必須成分である抗CR
P・IgG型抗体及びフェニル基を有するポリオキシエチレ
ンエーテル系界面活性剤のほか、検体のpHを一定範囲に
保ち、検体の濁りを防ぐための緩衝液、防腐剤、無機塩
等を含有する分析試薬用キツトを利用すると有利であ
る。
このような分析試薬用キツトの一例を示せば次の通り
である。
である。
第１試薬： フェニル基を有する ポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤２〜20 重量
％ 防腐剤 ０〜0.2重量％ 無機塩（NaCl、リン酸ナトリウム等） 0.5〜３ 重量％ 精製水 バランス （緩衝液を用い、pHを5.5〜8.0に保持する） 第２試薬： 抗CRP・IgG型抗体 原液〜200倍希釈 フェニル基を有する ポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤２〜20 重量
％ 防腐剤 ０〜0.2重量％ 無機塩等 0.5〜３ 重量％ 緩衝液（pH5.5〜8.0） バランス 〔発明の効果〕 本発明方法によれば、フェニル基を有するポリオキシ
エチレンエーテル系界面活性剤の存在下に抗原抗体反応
を行うことにより、非特異的反応を起こすことなく免疫
反応を増強することができ、これにより測定時間を短縮
でき、測定範囲も拡大し、かつ高い精度が得られるもの
である。また本発明方法では、ラテツクス等の担体や、
酵素標識抗体を用いる必要がないため、酵素の種類、鮮
度による誤差がなく、経済的にしかも簡便に、かつラテ
ツクス等の非特異的凝集による問題を伴なわずにCRP量
を測定することができる。
％ 防腐剤 ０〜0.2重量％ 無機塩（NaCl、リン酸ナトリウム等） 0.5〜３ 重量％ 精製水 バランス （緩衝液を用い、pHを5.5〜8.0に保持する） 第２試薬： 抗CRP・IgG型抗体 原液〜200倍希釈 フェニル基を有する ポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤２〜20 重量
％ 防腐剤 ０〜0.2重量％ 無機塩等 0.5〜３ 重量％ 緩衝液（pH5.5〜8.0） バランス 〔発明の効果〕 本発明方法によれば、フェニル基を有するポリオキシ
エチレンエーテル系界面活性剤の存在下に抗原抗体反応
を行うことにより、非特異的反応を起こすことなく免疫
反応を増強することができ、これにより測定時間を短縮
でき、測定範囲も拡大し、かつ高い精度が得られるもの
である。また本発明方法では、ラテツクス等の担体や、
酵素標識抗体を用いる必要がないため、酵素の種類、鮮
度による誤差がなく、経済的にしかも簡便に、かつラテ
ツクス等の非特異的凝集による問題を伴なわずにCRP量
を測定することができる。
特に本発明方法は、反応の初期の段階の凝集の生成量
変化を免疫凝集法により測定するものであるため、現在
汎用の生化学用自動分析機に有利に利用することができ
るものである。
変化を免疫凝集法により測定するものであるため、現在
汎用の生化学用自動分析機に有利に利用することができ
るものである。
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。
限定されるものではない。
実施例 CRPが陰性の血清及びCRP濃度が2.0mg/dlの血清によ
り、CRP濃度０、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0（単
位；各mg/dl）の血清を調製し、これらを用い下記方法
により標準検量線を作成した。
り、CRP濃度０、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0（単
位；各mg/dl）の血清を調製し、これらを用い下記方法
により標準検量線を作成した。
（１） 使用機器 日立705型自動分析装置 （２） 試薬 （ｉ） 第１試薬 リン酸緩衝液（pH7.2） 0.1 M NaCl 0.15M アジ化ソーダ 0.1 ％ （ii） 第２試薬 HEPES緩衝液（pH7.2） 0.05M NaCl 0.15M アジ化ソーダ 0.1 ％ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル 5.25％ 抗ヒトCRP抗体・ヤギIgG型血清 10倍希釈 （３） 操作方法 上記機器及び試薬を用いて行なつた測定操作の概略を
第１図に示す。まず反応セル中に水のみを入れた、セル
ブランクの340nmの吸光度を測定し、次いで水を排出後
検体血清20μ及び第１試薬50μを入れ、１回目の吸
光度を測定した。以後20秒間隔で計31回、10分間にわた
り測定した。ここでセルブランクの吸光度は、装置内の
演算機構により自動的に各測定値より差し引かれる。第
１試薬の添加５分後に第２試薬350μを添加し、反応
を開始させた。
第１図に示す。まず反応セル中に水のみを入れた、セル
ブランクの340nmの吸光度を測定し、次いで水を排出後
検体血清20μ及び第１試薬50μを入れ、１回目の吸
光度を測定した。以後20秒間隔で計31回、10分間にわた
り測定した。ここでセルブランクの吸光度は、装置内の
演算機構により自動的に各測定値より差し引かれる。第
１試薬の添加５分後に第２試薬350μを添加し、反応
を開始させた。
上記各測定値の内、第19〜23回目（第２試薬添加後１
分〜２分20秒）に測定された吸光度を採り、最小二乗法
により単位時間当たりの吸光度変化量を算出した。
分〜２分20秒）に測定された吸光度を採り、最小二乗法
により単位時間当たりの吸光度変化量を算出した。
（４） 標準検量線の作成 前記した７種の血清20μずつを用い、上記操作方法
に従つて単位時間当たりの吸光度変化量（ΔmABS×10/m
in）を求め、CRP濃度との関係をプロツトして標準検量
線を作成した。これを第２図に示す。
に従つて単位時間当たりの吸光度変化量（ΔmABS×10/m
in）を求め、CRP濃度との関係をプロツトして標準検量
線を作成した。これを第２図に示す。
（５） 従来法との比較 上記で用いたのと同じ血清について、抗CRP混合抗体
を用い、ツーポイント・エンド・アツセイ（５分間）を
用いて測定した結果を第３図に示す。この結果から明ら
かなように、従来法では吸光度変化量とCRP濃度の関係
の間には大きなバラツキがあり、定量法として使用する
ことは不可能である。
を用い、ツーポイント・エンド・アツセイ（５分間）を
用いて測定した結果を第３図に示す。この結果から明ら
かなように、従来法では吸光度変化量とCRP濃度の関係
の間には大きなバラツキがあり、定量法として使用する
ことは不可能である。
第１図は、自動分析装置による吸光度測定手順の概略を
示す図面であり、第２図は、標準検量線を示す図面であ
る。第３図は、従来法により求めたCRP濃度と吸光度変
化量の関係を示す図面である。
示す図面であり、第２図は、標準検量線を示す図面であ
る。第３図は、従来法により求めたCRP濃度と吸光度変
化量の関係を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−92354（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−192962（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−187862（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−243363（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−218864（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−498（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−192661（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】フェニル基を有するポリオキシエチレンエ
ーテル系界面活性剤の存在下、検体に抗Ｃ反応性タンパ
クIgG型抗体を添加し、生じた凝集による吸光度変化量
を測定することを特徴とする免疫比濁法によるＣ反応性
タンパクの定量法。 - 【請求項２】吸光度変化量の測定を、抗Ｃ反応性タンパ
クIgG型抗体の添加後０〜15分の間の単位時間当たりの
吸光度変化量の測定として行なう特許請求の範囲第１項
記載のＣ反応性タンパクの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62171687A JP2534067B2 (ja) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Ｃ反応性タンパクの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62171687A JP2534067B2 (ja) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Ｃ反応性タンパクの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6415656A JPS6415656A (en) | 1989-01-19 |
| JP2534067B2 true JP2534067B2 (ja) | 1996-09-11 |
Family
ID=15927830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62171687A Expired - Lifetime JP2534067B2 (ja) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Ｃ反応性タンパクの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2534067B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10298630A (ja) * | 1997-02-25 | 1998-11-10 | Tokyo Yogyo Co Ltd | 溶融金属用取鍋の底吹きガスの吹き込み装置 |
| US6623921B2 (en) | 1998-07-30 | 2003-09-23 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for measurement of hepatitis C virus |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58187862A (ja) * | 1982-04-27 | 1983-11-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定改良剤および改良方法 |
| JPS5992354A (ja) * | 1982-11-18 | 1984-05-28 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫血清学的診断試薬 |
| JPS59192962A (ja) * | 1983-04-15 | 1984-11-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ラテツクス試薬 |
| JPS61243363A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-10-29 | Nitsusui Seiyaku Kk | Ｃｒｐの高感度定量法 |
| JPH0659232B2 (ja) * | 1985-06-27 | 1994-08-10 | 株式会社日本バイオテスト研究所 | モノクローナル抗体 |
| JP2607363B2 (ja) * | 1986-02-20 | 1997-05-07 | 日水製薬 株式会社 | 免疫比濁法によるｃｒｐの測定法 |
| JPS62218864A (ja) * | 1986-03-20 | 1987-09-26 | Hitachi Chem Co Ltd | ヒトｃ反応性タンパクの定量法 |
-
1987
- 1987-07-09 JP JP62171687A patent/JP2534067B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6415656A (en) | 1989-01-19 |
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