JPS62207958A - 抗原又は抗体の定量法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗原又は抗体の定量法及びそのための試薬に関
する。

（従来の技術〉 ＣＲＰはＣ多糖体と反応して沈降物を生ずる蛋白質であ
り２種々の炎症性及び組織崩壊性疾患に際して出現する
非特異蛋白成分である。生体に上記疾患が生じた場合に
６〜２４時間以内の時間で増量しその回復に伴い減量消
失すると言う特徴を有しており、従ってその検査は臨床
上不可欠とされている。１Ｏ他ｔｚ４鋳ｔｏ技ｉｎ＜’
ｆ冒処イゝも）。

従来における―洋＊検査法としては毛細管法。

間の経過と共に定量的に把握することが不可能で難点が
ある等の欠陥がある。

また、低値域を測定する方法としてレーザー比濁計を用
い免疫比濁法により生成した濁りを測定することによっ
て仁キ雰啼測定するレーデ−比濁法が考案された。この
方法は、高感度ではあるが機器が極めて高価であるのみ
ならず、測定精度や測定範囲に問題があり、又高感度故
に試薬や検体血清の澄明度に特別の注意を払う必要があ
るのでその前処理が煩雑となる等の欠点が存在する。

しかしながら最近１通常の生化学自動分析装置を用い免
疫比濁法で生じた濁りを測定することによってヒ＝＝啼
測定する方法が普及しつつある。

すなわち、濁りの度合を分光光度計を用いて透過光でと
らえ；；；啼測定する方法である。この方法を用いれば
通常の生化学項目すなわちＧＯＴ。

定できるばかりでなく完全に自動分析することが可能で
ある。

（発明が解決しようとする問題点） しかしこの方法は生化学検査用に作られた分析装置に適
用したため免疫反応特有の検量線がシダモイドカープを
描く現象を解決することはできなかった。すなわち生化
学自動分析装置は検量線の作成を２つの既知濃度検体で
行なう２点検量機構であるため、免疫専用装置のように
曲線補正ができない。また１反応時間が短く設定されて
いるため抗原抗体の１比によシ抗原抗体反応の速度が違
値域での測定値の信頼性が重要であるが、この方法では
低値域での濃度が低いためばらつきが大きく診断上大き
な問題となる。

（問題点を解決するための手段） 第１の発明は、抗原又は抗体を含有する試料及び該抗原
又は抗体と同一の抗原又は抗体を含有する第１試薬を混
合して吸光度（Ａ１）を測定し１次いで、上記抗原又は
抗体に対応する抗体又は抗原を含有する第２試薬を添加
して抗原−抗体反応させて吸光度（Ａｘ）を測定し、こ
の測定値んから上記測定値Ａ１及び試薬に起因する吸光
度を差し引いた値（以下、算出吸光値という）から上記
試料中の抗原又は抗体を定量することを特徴とする抗原
又は抗体の定量法に関する。

第１の発明においては、抗原−抗体反応が十分に進行し
ないような濃度でしか抗原又は抗体を含有しない試料で
も、該抗原又は抗体と同一の抗原又は抗体を含む第１試
薬と混合することにより。

全体として抗原又は抗体の濃度を抗原−抗体反応が十分
に進行するような濃度まで高めることができ、しかも、
前記算出吸光値を求めることにより。

感度よく定量することができる。

第１の発明において、前記試料と第１試薬は２０〜４０
℃で混合するのが好ましい。この混合後、任意の時点で
吸光度（ＡＩ）を測定すればよいが。

好ましくは混合後、１〜１５分の間に測定するのが好ま
しく、第２試薬の添加直前に測定してもよい。また、第
１試薬中に含まれていえ抗原又は抗体分の混合後の濃度
は、第２試薬を添加したときれ に抗体過剰になるように調整させるのが好ましい。

この混合後の濃度は、抗原又は抗体によって異なるため
一概には言えないが１例えば、抗原であるＣ反応性蛋白
（以下、ＣＲＰと略す）については。

約０．０１　ｍｇ／ｄｌ　〜約２０＠／ｄｌが好ましく
、特に約ｏ、　ｏ　ｓ　＠／ｄｔ　〜約４ｒａａ／ｄｌ
が好ましい。

吸光度（ＡＩ）を測定後、第２試薬を添加し、抗原−抗
体反応させるが、この反応は、２０〜４０℃で行なうの
カニ好ましい。吸光度（Ａ２）の測定は、第２試薬を添
加して１分以上経過後に行なうのが好ましく、特に３〜
１５分の間に行なうのが好ましい。第２試薬を添加した
場合に、全液量中、抗体が過剰になるように調整される
のが好ましい。第２試薬を添加した場合に、全液量中に
おける抗体の濃度は、抗体によって異なシー概に言えな
いが。

例えば抗ＣＲＰ抗体では、約３　Ｘ　１０””　ｍｇ／
　ｄｌ〜ｌｒｒ１ｇ／ｄＩ！が好ましく、特に、約０．
０２　ｍｇ／ｄｉ　〜０．２ｍｇ／ｄｌ！が好ましい。

第１の発明において、試薬に起因する吸光度とは１例え
ば、前記の試料の代わシに水、緩衝液又は生理食塩水を
用いて吸光度ＡＩ及びＡ２を測定するのと同様にして、
吸光度Ａ１及びＡ２に対応して、それぞれ、吸光度ＡＩ
′及びＡｚ’を測定し、Ａ２′からＡｌ′を差し引いた
値（Ａ２−　Ａｒ’　）である。

前記の吸光度Ａ１．　Ａｍ、　ＡＩ’及びＡ２′から算
出吸光値Ａを式 Ａ＝Ａ２−Ａｔ　　（Ａ２’−ＡＩ’）　　　　　　・
・・ｆｌ）によって算出する。

一万、前記の試料として、標準試料（既知量の抗原又は
抗体を含む試料）の希釈系列を用い、前記と同様にして
算出吸光値を求め、算出吸光値と抗原又は抗体の量（単
位は２例えば、■／ｄｔ　）の検量線を作成しておき、
未知量の抗原又は抗体を含む試料について、前記のとお
り算出吸光値を求め、この値に対応する抗原又は抗体の
量を該検量線から求めることによって、未知量の抗原又
は抗体を含む試料中の抗原又は抗体の量を定量すること
ができる。

また、未知量の抗原又は抗体を含む試料中の抗原又は抗
体の量は２武門 （ただし２式中、Ａは未知量の抗原又は抗体を含む試料
の算出吸光値並びにＣｓ及びＡｓは各々成る既知量の抗
原又は抗体を含む試料の抗原又は抗体の１１及び算出吸
光値である）によ、！７Ｃを求めるこって、さらに感度
高めることができる。例えば。

Ａ１については、（試料とｍ１試薬の総容量）／（試料
、第１試薬及び第２試薬の認容ｔ）を、並びにＡ！′に
ついては、（水、緩衝液又は生理食塩水と第１試薬の総
容量）／（水、緩衝液又は生理食塩水。

第１試薬及び第２試薬の総容量）を、それぞれ積算する
。

第１の発明において、試料としては２例えば。

血清、尿等があり、定量されるべき抗原としては。

例えば、Ｃ几Ｐ、）ランスフェリン、補体蛋白であるＣ
３及びＣ１などがあυ、定量されるべき抗体としては、
　　ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ等がある。また、前記
において、吸光度の測定波長は、水又は生理食塩水、試
料に実質的に非透過でなければ任意であるが１通常、２
００〜１．ＯＯＯｎｍの範囲から選べばよい。

ｉＪ２の発明は、第１の発明に使用し得る抗原又は抗体
の定量用試薬に関する。

すなわち、第２の発明は、抗原又は抗体を含有するｍ１
試薬及び該抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を含有
する第２試薬を組合せてなる抗原又は抗体の定量用試薬
に関する。

第２の発明の第１試薬及び第２試薬は通常、緩衝溶液と
して使用される。この時使用される緩衝液としては、リ
ン酸塩（−水素リン酸塩と二水素リン酸塩の組合せ、塩
としてはＮａ塩、に塩等がある）、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタンと塩酸の組合せ、グツド緩衝剤な
どの水溶液であり、ｐＨは５〜９に調製されるのが好ま
しい。

第１試薬には２反応促進剤を含有させることができ、特
に９分子量ｓ、　ｏ　ｏ　ｏ〜１０．　ＯＯＯのポリエ
チレングリコールが好ましい。反応促進剤は第１試薬中
に、濃度で０〜１０重量％の範囲で含有させるのが好ま
しく、特に２〜５重量％が好ましい。反応促進剤が多す
ぎると抗原−抗体反応の促進以外に非特異的反応が進行
しやすくなる。抗原及び抗体の種類及び性質によシ、適
量の反応促進剤が選ばれる。

第１試薬には、さらに界面活性剤を含有させることがで
きる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンノニル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪
酸エステル等の非イオン系界面活性剤、ｔたはポリオキ
シエチレンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル硫酸およびそれらの塩類等
の陰イオン界面活性剤が用いられる。界面活性剤は試料
の濁りによる影響の除去及び試薬中の気泡等の影響を回
避し、データの精度を向上させる効果がある。第１試薬
中の界面活性剤の濃度は０〜５重量−の範囲であり、好
ましくは０．０１〜５慢、特に好ましくは０．０５〜１
．（ｌの範囲である。界面活性剤の量が多すぎると抗原
−抗体反応を阻害したシ粘度が高すぎて分析装置を傷め
やすくなる。

第１試薬中の抗原又は抗体の濃度は、抗原−抗体反応開
始時に抗体過剰になりやすいように適宜調整して使用さ
れる。例えば、ＣＩ（、Ｐの場合、０．０１〜２０ｍｇ
／ｄＩ！が好ましく、０．０５〜４ｆｆ１ｇ／ｄｌが特
に好ましい。一般に、抗原又は抗体の量が少なすぎると
検量線が低値域で直線になりにりく、一方。

抗原が多すぎると高儂度での検量線の直線範囲が狭くな
る傾向がある。

なお、ここで使用される抗原又は抗体は、これと対応す
る抗体又は抗原と実質的に反応するものであればよく２
例えば、ＣＲＰの場合２人由来のものが好ましいが、抗
ＣＲＰ抗体と反応するものであれば、動物由来のもので
もよい。これは、第２試薬に含有させる抗体又は抗原に
ついても同様であシ１例えば、抗ＣＲＰ抗体としては、
抗ヒトＣｉｔ　Ｐヤギ血清、抗ヒトＣＩＬ　Ｐウサギ血
清等から得られたｒ−グロブリン分画を使用することが
できる。

第２試薬中の抗体又は抗原の濃度は、抗原−抗体反応ｖ
１４始時に、抗体過剰になりやすいように適宜決定され
る。例えば、抗ＣＩ′ＬＰ抗体は、０．０２〜５ｚｇ／
ｄｌが好ましく、　０．１〜１　ａｙ；）／ｄｉが特に
好まし、い。

第１試蘂及び第２試薬にはイオン強度調節のため塩化ナ
トリウム、塩化カリウムなどを含有させることができる
。鮮度は０〜ＩＭが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好
ましく、Ｏ，ＯＳ〜０．２　Ｍが最も好ましい。抗原−
抗体反応はイオン強度により反応様式が違ってくるので
イオン強度は高すぎても低すぎてもいけない。

第１試薬及び第２試薬にはアジ化ソーダなどの防腐剤を
添加しても良く、各試薬中に、０〜１％が好ましい。

（実施例） 次に本発明の実施例を示す。

以下で使用する試薬及びＣＲＰｊ３１Ａ準血清は次のと
おシである。

（１）第１試薬組成１ｐＨ７，６０） 塩化ナトリウム　　　　　　Ｏ，１Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液　　　　１５ｍＭアジ化ソーダ　
　　　　　　（）、１％ＣＲＰ　　　　　　　　　　　
　　　１．Ｏｍｇ／／（２）第２試薬組成（ｐＨ７，６
０） 塩化ナトリウム　　　　　　０．１　Ｍトリス−ＨＣｌ
緩衝液　　　　１５ｍＭアジ化ソーダ　　　　　　　０
゜１チ ＋３１ＣＲＰ標準血清 ヒト血清白米ＣＲＰ濃度　　り、Ｏ■／ｄ１実施例１ 前記ＣＲＰ標準血清を生理食塩水を用いて希釈し、ＣＲ
Ｐａ度がｏ、５ｒｒＩＱ／ａＩ！から５．０　＠／ｄｉ
まで０．５　ｍｇ　／　ａＩ！間隔で１０段階の希釈系
列を作成し。

試料とした。各試料を用いて１次のとおり定量し。

検量線を作成した。

日立７０５形自動分析装置を用い次に示す分析条件で行
なった。すなわち、前記第１試薬５００μｌに対し上記
サンプルを１０μｌ加え（注入し）。

３７℃でプレインキュベーとし４分２０秒〜４分４０秒
後主波長３４０ｎｍ（副波長７００ｎｍ）で吸光度（Ａ
ｘｔ）を測定した。この後５分間経過後に、第２試薬１
００μｌを加え（注入し）１反応を開始し、１０分経過
後に、上記と同様の波長で吸光度（Ａｘｅ；濁度）を測
定した。同様の分析条件Ａｘ１．　Ａｘ２　、　Ａｂｌ
及びＡｂ、から式％式％） によシ、算出吸光値を求め、検量線を作成した。

この結果を第１図にグラフ１として示す。

比較例１ 実施例ＩＫおける第１試薬からＣＲＰを除いたこと以外
は実施例１と同様にして検ｉ−線を作成した。これを第
１図にグラフ２として示す。

実施例２ 前記ＣＦＬＰ標準血清を生理食塩水を用いて希釈し、ｃ
ａｐ濃度が２ｒｎｇ／ｄｔから２０ｍｇ／ｄｌ　まで２
１１１ｇ／ｄＩ！間隔で１０段階の希釈系列を作成し、
試料とした。これらの試料を用いたこと以外は実施例１
と同様にして検量線を作成した。この結果を第２図にグ
ラフ３として示す。

比較例２ 比較例１において、希釈系列として実施例２の希釈系列
を用いたこと以外は比較例１と同様にして検量線を作成
した。この結果を第２図にグラフ４として示す。

実施例３ 試料として人血ｉ９５検体を用い２本発明と５ＲＩＤ法
（栄研化学■製マイプレートＣＲＰ使用）との相関関係
を求めた。

実施例１と同じ条件で、試料の代わりに生理食塩水及び
試料としてＣ凡Ｐ標準血清（ＣＲＰ濃度Ｃｓ　：　５０
　ｍｇ／　ｄｌ　）を用い、各々、　ｆ４出吸光値ＡＢ
及びノ〜Ｓを求めた。

また、上記各検体を試料として、実施例１と同様にして
算出吸光値Ａｘを求めた。

ＡＸ、ＡＢ及びＡｓから、各検体のｃｒもＰ濃度ＣｘＩ
ｍｇ／ｄｌりを２式 によって決定した。

この結果と、各々同一検体について５ＩＩＩＤ法による
結果との相関関係を＠３図に示す。

比較例３ 試料として人血清６４検体を用い、また、第１試薬中の
ＣＲＰを除いたこと以外は、実施例３と同様にして、５
ＲＩＤ法の結果との相関関係を求め、この結果を第４図
に示した。

第１図及び第２図から明らかなように本発明によれば、
低濃度域まで含め、検を線は低濃度域まで優れた直線性
を示す。従って、検量線の作成に当って既知量の抗原又
は抗体を含む試料１個について算出吸光値を求めれば、
検量線を作成できることがわかる。

また、＠３図と第４図を比較することにより。

本発明によれば、５ＲＩＤ法で（−）となった検体と（
±）となった検体を明確に区別できることがわかる。

（発明の効果） 第１の発明に係る方法によれば、また、第２の発明に係
る試薬を使用すれは、抗原又は抗体を低濃度域を含め精
度よく、容易に定量することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１及び比較例１で得られた検量線、第２
図は実施例２及び比較例２で得られた検量線、第３図は
実施例３における本発明と５ＲＩＤ法との相関関係及び
第４図は比較例３における比較法と８３Ｌ　Ｉ　Ｄ法と
の相関関係を示す。 符号の説明 １・・・実施例１で得られた検量線 ２・・・比較例１ ３・・・実施例２ ４・・・比較例２ 代理人　弁理士　若　林　邦　彦゛　　１楕４参市のＣ
Ｒｆ’　４ｇ　　　　　”ｌ／”）第　１　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原又は抗体を含有する試料及び該抗原又は抗体と
   同一の抗原又は抗体を含有する第１試薬を混合して吸光
   度（Ａ＿１）を測定し、次いで、上記抗原又は抗体に対
   応する抗体又は抗原を含有する第２試薬を添加して抗原
   −抗体反応させて吸光度（Ａ＿２）を測定し、この測定
   値Ａ＿２から前記測定値Ａ＿１及び試薬に起因する吸光
   度を差し引いた値から上記試料中の抗原又は抗体を定量
   することを特徴とする抗原又は抗体の定量法。 ２　抗原又は抗体を含有する第１試薬及び該抗原又は抗
   体に対応する抗体又は抗原を含有する第２試薬を組合せ
   てなる抗原又は抗体の定量用試薬。