JP2607363B2 - 免疫比濁法によるｃｒｐの測定法 - Google Patents
免疫比濁法によるｃｒｐの測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はCRP即ちＣ反応性蛋白の測定法に係り、殊に
免疫比濁法によるその測定法に係る。
免疫比濁法によるその測定法に係る。
CRPは、周知のように、炎症や組織壊死が生ずる場合
に血中に出現する特性を有している蛋白であるが、正常
人の血清中にも微量のCRPが存在していることが明らか
となり、その機能が解明されつつある。
に血中に出現する特性を有している蛋白であるが、正常
人の血清中にも微量のCRPが存在していることが明らか
となり、その機能が解明されつつある。
従って、本発明による測定法は上記の炎症や感染症等
の臨床診断における検査法の一つとして利用することが
できる。
の臨床診断における検査法の一つとして利用することが
できる。
（従来の技術） 従来におけるCRPの定量法としては毛細管法、ラテッ
クス凝集法、一元免疫拡散法及び免疫比濁法がある。
クス凝集法、一元免疫拡散法及び免疫比濁法がある。
これらの従来法の内で免疫比濁法においては抗体とし
てポリクローナル抗体が採用されている。
てポリクローナル抗体が採用されている。
（発明が解決しようとする問題点） 抗CRPポリクローナル抗体を用い高感度な且つ特異性
の高い測定系を確立するためには、ポリクローナル抗体
を親和性クロマトグラフィー等により充分に精製する必
要がある。又、ポリクローナル抗体は免疫動物の固体差
等により異なるものとなり、従って常に一定の品質乃至
性質を有する抗体を調製することが困難であると謂う問
題を有していた。
の高い測定系を確立するためには、ポリクローナル抗体
を親和性クロマトグラフィー等により充分に精製する必
要がある。又、ポリクローナル抗体は免疫動物の固体差
等により異なるものとなり、従って常に一定の品質乃至
性質を有する抗体を調製することが困難であると謂う問
題を有していた。
（発明の目的） 従って、本発明の目的は、特異性が高く且つ安定なCR
Pの測定法を提供することにある。
Pの測定法を提供することにある。
（目的を達成するための手段及び作用） 本発明方法によれば、上記の目的は、免疫比濁法によ
りCRPを測定するに際して、ゲル内及び液相中でのCRPと
の反応において濁度を形成する抗CRPモノクローナル抗
体を用いることを特徴とする、免疫比濁法によるCRPの
測定法により達成することができる。即ち、本発明方法
においては、測定されるべき抗原（CRP）と反応する抗
体として抗CRPモノクローナル抗体が使用されるため
に、ポリクローナル抗体を使用する場合と比較して反応
における特異性が高く、従って試料（検体）中にたとえ
構造の近似した物質が存在しても測定精度の低下を来す
ことがない。更に、モノクローナル抗体は、その産生細
胞株から常に一定の性質を有するものを作成できるの
で、その安定な供給が可能であり、従って使用される抗
体に依存して測定精度が変化するのを阻止することがで
きる。
りCRPを測定するに際して、ゲル内及び液相中でのCRPと
の反応において濁度を形成する抗CRPモノクローナル抗
体を用いることを特徴とする、免疫比濁法によるCRPの
測定法により達成することができる。即ち、本発明方法
においては、測定されるべき抗原（CRP）と反応する抗
体として抗CRPモノクローナル抗体が使用されるため
に、ポリクローナル抗体を使用する場合と比較して反応
における特異性が高く、従って試料（検体）中にたとえ
構造の近似した物質が存在しても測定精度の低下を来す
ことがない。更に、モノクローナル抗体は、その産生細
胞株から常に一定の性質を有するものを作成できるの
で、その安定な供給が可能であり、従って使用される抗
体に依存して測定精度が変化するのを阻止することがで
きる。
本発明方法の実施に際しては、認識する抗原決定基の
異なる複数種類の抗CRPモノクローナル抗体を用いるの
が好ましい。
異なる複数種類の抗CRPモノクローナル抗体を用いるの
が好ましい。
（発明の効果） 免疫比濁法によりCRPを測定するに際して、本発明方
法によれば、抗体として抗CRPモノクローナル抗体が用
いられるので特異性及び測定感度を向上させることがで
きる。又、モノクローナル抗体であるために、常に一定
の性質乃至品質を有するものを入手使用することがで
き、従って、測定結果の信頼性が向上する。
法によれば、抗体として抗CRPモノクローナル抗体が用
いられるので特異性及び測定感度を向上させることがで
きる。又、モノクローナル抗体であるために、常に一定
の性質乃至品質を有するものを入手使用することがで
き、従って、測定結果の信頼性が向上する。
（実施例） ａ）抗CRPモノクローナル抗体産生細胞の作製患者血清
を原料とし、これを硫安分画、DEAEイオン交換クロマト
グラフィー、Ca2+沈殿、セファクリルＳ−300ゲル濾過
により精製したCRPをBALB/C系マウスに免疫し、その脾
細胞をマウス骨髄腫細胞（P3U1）と融合し、限界稀釈法
により５種類のモノクローナル抗体産生細胞株（CRB1
7、CRB18、CRB19、CRB20、CRB23）を得た。
を原料とし、これを硫安分画、DEAEイオン交換クロマト
グラフィー、Ca2+沈殿、セファクリルＳ−300ゲル濾過
により精製したCRPをBALB/C系マウスに免疫し、その脾
細胞をマウス骨髄腫細胞（P3U1）と融合し、限界稀釈法
により５種類のモノクローナル抗体産生細胞株（CRB1
7、CRB18、CRB19、CRB20、CRB23）を得た。
ｂ）抗CRPモノクローナル抗体の精製 マウス腹水中で産生させたモノクローナル抗体を硫安
分画、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、プロティン
ＡセファロースCL−4Bにより精製したものを実験に使用
した。尚、抗体産生細胞を無血清培地で培養した培養上
清を濃縮し、50％飽和硫安で分画してモノクローナル抗
体を回収し、これを実験に供することもできる。
分画、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、プロティン
ＡセファロースCL−4Bにより精製したものを実験に使用
した。尚、抗体産生細胞を無血清培地で培養した培養上
清を濃縮し、50％飽和硫安で分画してモノクローナル抗
体を回収し、これを実験に供することもできる。
ｃ）抗CRPモノクローナル抗体のサブクラス及び抗原決
定基の解析 各イムノグロブリンサブタイプに対する抗血清を用い
てゲル内沈降反応で調べた結果、CRB17がIgG1であり、C
RB18及びCRB23がIgG3であり、CRB19及びCRB20がIgG2bで
あった。又、これらのモノクローナル抗体の抗原決定基
についてゲル内沈降反応及びEIAにて検討を行った結
果、これらの５種類のモノクローナル抗体はCRB17とCRB
20の２種類からなるグループと、CRB18とCRB19とCRB23
の３種類からなるグループとに分かれることが判明し
た。このことは、各グループがCRP分子上の異なる抗原
決定部位を認識して結合するものであることを示唆して
いる。
定基の解析 各イムノグロブリンサブタイプに対する抗血清を用い
てゲル内沈降反応で調べた結果、CRB17がIgG1であり、C
RB18及びCRB23がIgG3であり、CRB19及びCRB20がIgG2bで
あった。又、これらのモノクローナル抗体の抗原決定基
についてゲル内沈降反応及びEIAにて検討を行った結
果、これらの５種類のモノクローナル抗体はCRB17とCRB
20の２種類からなるグループと、CRB18とCRB19とCRB23
の３種類からなるグループとに分かれることが判明し
た。このことは、各グループがCRP分子上の異なる抗原
決定部位を認識して結合するものであることを示唆して
いる。
ｃ）測定方法 ｉ）上記のｂ）項に記載の方法により得た抗CRPモノク
ローナル抗体を、５％PEG 6000及び0.2％Tween 20を含
有する0.02M HEPES緩衝液（pH7.4,0.1M NaCl含有）で10
倍に稀釈して反応液とする。この反応液1mlに検体20μ
ｌを添加し37℃で30分間インキュベートした後に、分光
光度計により340nmで吸光度を測定した。一方、上記と
同様の反応液であって、但し抗体を含有しない系を別途
に準備し、この系につき上記と同様に処理した上で吸光
度を測定した。両吸光度の0.D.差を反応生成物の量とす
る。
ローナル抗体を、５％PEG 6000及び0.2％Tween 20を含
有する0.02M HEPES緩衝液（pH7.4,0.1M NaCl含有）で10
倍に稀釈して反応液とする。この反応液1mlに検体20μ
ｌを添加し37℃で30分間インキュベートした後に、分光
光度計により340nmで吸光度を測定した。一方、上記と
同様の反応液であって、但し抗体を含有しない系を別途
に準備し、この系につき上記と同様に処理した上で吸光
度を測定した。両吸光度の0.D.差を反応生成物の量とす
る。
ii）５％PEG 6000、0.2％Tween 20及び0.1M NaClを含有
する0.02M HEPES緩衝液（pH7.4）である反応液Ｉ（500
μｌ）に検体10μｌを添加し37℃で５分間プレインキュ
ベートし、上記のｂ）項に記載の方法により得た抗CRP
モノクローナル抗体を含有するPBS（pH7.4）である反応
液II（50μｌ）を添加して更に５分間インキュベートし
た後に、分光光度計により340nmで吸光度を測定した。
一方、上記と同様にして、但し反応液IIとして抗体を含
有しないものを使用した系について吸光度を測定した。
両吸光度のO.D.差を反応生成物の量とする。
する0.02M HEPES緩衝液（pH7.4）である反応液Ｉ（500
μｌ）に検体10μｌを添加し37℃で５分間プレインキュ
ベートし、上記のｂ）項に記載の方法により得た抗CRP
モノクローナル抗体を含有するPBS（pH7.4）である反応
液II（50μｌ）を添加して更に５分間インキュベートし
た後に、分光光度計により340nmで吸光度を測定した。
一方、上記と同様にして、但し反応液IIとして抗体を含
有しないものを使用した系について吸光度を測定した。
両吸光度のO.D.差を反応生成物の量とする。
ｅ）結果 ｄ−ｉ）項の測定方法による実験結果 上記のｂ）項に記載の方法により精製された５種類の
抗CRPモノクローナル抗体をそれぞれ単独で用い且つ標
準血清（CRP濃度が1.0、5.0及び10.0mg/dlのもの）を用
いて濁度形成を調べた結果は、第１図のグラフに示され
る通りであり、モノクローナル抗体の種類に応じて差は
あるが、何れのモノクローナル抗体も濁度を形成するこ
とが判明した。尚、このグラフから、CRB17は全体的
に、又CRB23は高濃度での濁度形成において良好なこと
が判る。
抗CRPモノクローナル抗体をそれぞれ単独で用い且つ標
準血清（CRP濃度が1.0、5.0及び10.0mg/dlのもの）を用
いて濁度形成を調べた結果は、第１図のグラフに示され
る通りであり、モノクローナル抗体の種類に応じて差は
あるが、何れのモノクローナル抗体も濁度を形成するこ
とが判明した。尚、このグラフから、CRB17は全体的
に、又CRB23は高濃度での濁度形成において良好なこと
が判る。
従って、モノクローナル抗体抗体CRB17とCRB23とを用
い且つこれらの混合比率を1:1、2:1及び1:2で変化さ
せ、標準血清（CRP濃度が1.0、5.0及び10.0mg/dlのも
の）を用いて濁度形成を調べた結果は、第2A、2B及び2C
図のグラフに示される通りであり、CRB17を多くすれば
低濃度での感度が向上し、一方CRB23を多くすれば高濃
度での濁度形成が良好となること並びに両者の混合比率
を適当に設定することにより、例えば1:1に設定するこ
とにより（第2A図）、検量線の直線化が可能なることが
判明した。
い且つこれらの混合比率を1:1、2:1及び1:2で変化さ
せ、標準血清（CRP濃度が1.0、5.0及び10.0mg/dlのも
の）を用いて濁度形成を調べた結果は、第2A、2B及び2C
図のグラフに示される通りであり、CRB17を多くすれば
低濃度での感度が向上し、一方CRB23を多くすれば高濃
度での濁度形成が良好となること並びに両者の混合比率
を適当に設定することにより、例えば1:1に設定するこ
とにより（第2A図）、検量線の直線化が可能なることが
判明した。
ｄ−ii）項の測定方法による実験結果 上記の第ｄ−ii）項に記載の測定方法に従い、検体と
して標準血清（CRP濃度がそれぞれ1.0、5.0及び10.0mg/
dlのもの）を用い且つ反応液IIに含有されるモノクロー
ナル抗体としてCRB17とCRB23の1:1混合物を用いて濁度
形成を340nmで調べた結果は、第３図のグラフに示され
る通りであった。
して標準血清（CRP濃度がそれぞれ1.0、5.0及び10.0mg/
dlのもの）を用い且つ反応液IIに含有されるモノクロー
ナル抗体としてCRB17とCRB23の1:1混合物を用いて濁度
形成を340nmで調べた結果は、第３図のグラフに示され
る通りであった。
このグラフにおけるCRP濃度と濁度との関係は極めて
直線的なものであり、従ってこれは検量線として用いる
のに好適なことが判る。
直線的なものであり、従ってこれは検量線として用いる
のに好適なことが判る。
第１図は、各種のモノクローナル抗体を用いて、本発明
方法によりCRPを測定する場合のCRP濃度と吸光度との関
係を示すグラフであり、第2A図、2B図及び2C図は２種類
のモノクローナル抗体即ちCRB17及びCRB23を且つこれら
の混合比率を1:1、2:1及び1:2で用いて、本発明方法に
よりCRPを測定した場合のCRP濃度と吸光度との関係を示
すグラフであり、第３図はモノクローナル抗体CRB17とC
RB23の1:1混合物を抗体として本発明方法によりCRPを測
定した場合のCRP濃度と吸光度との関係を示すグラフで
あって、検量線として好適なものを示すグラフである。
方法によりCRPを測定する場合のCRP濃度と吸光度との関
係を示すグラフであり、第2A図、2B図及び2C図は２種類
のモノクローナル抗体即ちCRB17及びCRB23を且つこれら
の混合比率を1:1、2:1及び1:2で用いて、本発明方法に
よりCRPを測定した場合のCRP濃度と吸光度との関係を示
すグラフであり、第３図はモノクローナル抗体CRB17とC
RB23の1:1混合物を抗体として本発明方法によりCRPを測
定した場合のCRP濃度と吸光度との関係を示すグラフで
あって、検量線として好適なものを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−211659（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−237363（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−91985（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】免疫比濁法によりCRPを測定するに際し
て、ゲル内及び液相中でのCRPとの反応において濁度を
形成する抗CRPモノクローナル抗体を用いることを特徴
とする、免疫比濁法によるCRPの測定法。 - 【請求項２】認識する抗原決定基の異なる複数種類の抗
CRPモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、特
許請求の範囲第１項に記載の免疫比濁法によるCRPの測
定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61033864A JP2607363B2 (ja) | 1986-02-20 | 1986-02-20 | 免疫比濁法によるｃｒｐの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61033864A JP2607363B2 (ja) | 1986-02-20 | 1986-02-20 | 免疫比濁法によるｃｒｐの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62192661A JPS62192661A (ja) | 1987-08-24 |
| JP2607363B2 true JP2607363B2 (ja) | 1997-05-07 |
Family
ID=12398365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61033864A Expired - Fee Related JP2607363B2 (ja) | 1986-02-20 | 1986-02-20 | 免疫比濁法によるｃｒｐの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2607363B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7241578B2 (en) | 2002-05-22 | 2007-07-10 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Immunoassay method/equipment, biological component measurable toilet, anti-albumin monoclonal antibody, cell strain producing the same, and albumin detection kit |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2534067B2 (ja) * | 1987-07-09 | 1996-09-11 | 日水製薬株式会社 | Ｃ反応性タンパクの定量法 |
| JPH0264458A (ja) * | 1988-08-31 | 1990-03-05 | Nippon Shoji Kk | 血清アポｂの定量法 |
| JPH0264457A (ja) * | 1988-08-31 | 1990-03-05 | Nippon Shoji Kk | 血清アポａ−ｉの定量法 |
| JP6143818B2 (ja) | 2015-06-01 | 2017-06-07 | 田中貴金属工業株式会社 | マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58211659A (ja) * | 1982-06-03 | 1983-12-09 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫比濁法による血清ｃｒｐの簡易迅速定量法 |
| JPH0736016B2 (ja) * | 1984-05-11 | 1995-04-19 | 和光純薬工業株式会社 | 免疫グロブリンの定量方法 |
-
1986
- 1986-02-20 JP JP61033864A patent/JP2607363B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7241578B2 (en) | 2002-05-22 | 2007-07-10 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Immunoassay method/equipment, biological component measurable toilet, anti-albumin monoclonal antibody, cell strain producing the same, and albumin detection kit |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62192661A (ja) | 1987-08-24 |
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