JP4982107B2 - 免疫学的微小粒子の凝集反応を用いる検体の測定方法および測定用キット - Google Patents

Description

本発明は、物質を結合した微小粒子を用いる免疫学的測定法に関する。特に、主として工業、環境、および臨床検査の分野における、抗原抗体反応を利用した微量成分の免疫学的測定方法ならびに免疫測定試薬キットに関する。

近年、臨床検査などの各種検査では自動化および測定時間の短縮が図られている。その検査の方法として、生体試料中の物質を測定するために免疫反応を利用する測定方法が広く用いられている。免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などの多くの方法がある。その中でも、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系での測定が可能なため、測定の自動化や短時間での測定に適している。特に、金コロイド粒子は５ｎｍ〜１００ｎｍの大きさであり、これはラテックス粒子より小さいため、より微量物質の測定に利用可能である（特許文献１および２）。

これらの測定法における主反応成分は、ラテックス粒子や金コロイド粒子に結合した被測定物質に特異的に反応する物質である。この被測定物質に特異的に反応する物質は、被測定物質に応じてそれぞれ異なるため、被測定物質に応じて、このような物質を結合させた独特の微小粒子を調製しなければならない。

しかしながら、このような微小粒子を調製する操作は、煩雑である。さらに、微小粒子に結合させる物質によっては、担体に結合しにくい場合、結合しても非特異的に自己凝集を起こして測定系に使用できない場合、あるいは結合によって特異性や測定物質との結合力が変化して使用できない場合もある。
特開２００５−２８３２５０号公報 特開２００４−３２５１９２号公報

本発明の目的は、上記のような被測定物質ごとに異なる物質をラテックスや金コロイドなどの微小粒子に結合させるという煩雑な操作を必要としない、免疫学的微小粒子の凝集反応を用いる検体の測定方法および測定用キットを提供することである。さらに、本発明の目的は、上記のように微小粒子への結合が適さない場合があるという問題をも解決しようとするものである。

本発明では、被測定物質と特異的に結合する物質をラテックスや金コロイドなどの微小粒子に結合させるのではなく、被測定物質と特異的に結合する物質を特異的に認識する物質をラテックスや金コロイドなどの微小粒子に結合させたものを、凝集反応の主成分として使用することにより、より簡便な測定を可能にした。

本発明は、検体中の被測定物質を測定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）該被測定物質と第１の特異的結合物質とを混合する工程であって、該第１の特異的結合物質が該被測定物質に特異的に結合し得る物質である、工程；
（ｂ）該工程（ａ）で得られた該混合液に、第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子を添加して混合する工程であって、該第２の特異的結合物質が該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、工程；および
（ｃ）該工程（ｂ）で得られた該混合液において、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；を含む。

１つの実施態様では、上記工程（ｂ）において、複数の上記被測定物質または複数の上記第１の特異的結合物質が認識する上記被測定物質の部位を結合させた担体である被測定物質結合担体が、前記微小粒子と同時に添加される。

ある実施態様では、上記第１の特異的結合物質は、上記被測定物質に対する抗体である。

さらなる実施態様では、上記第２の特異的結合物質は、上記第１の特異的結合物質に対する抗体であり、好適にはモノクローナル抗体である。

１つの実施態様では、上記微小粒子は、ラテックスまたは金コロイドである。

本発明はまた、測定用試薬キットを提供し、該キットは、
被測定物質に特異的に結合し得る物質である第１の特異的結合物質を含む第一試薬；および
第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子を含む第二試薬であって、該第２の特異的結合物質が該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、第二試薬；
を含む。

ある実施態様では、上記第二試薬は、複数の上記被測定物質または複数の上記第１の特異的結合物質が認識する上記被測定物質の部位を結合させた担体である被測定物質結合担体をさらに含む。

本発明の方法では、ラテックスや金コロイドなどの微小粒子に、被測定物質と特異的に結合する第１の特異的結合物質を特異的に認識する第２の特異的結合物質を結合させたものを、凝集反応の主成分として使用する。そのため、微小粒子に結合させる第２の特異的結合物質の特異的認識部位を、被測定物質と特異的に結合する第１の特異的結合物質の共通領域、例えば、第１の特異的結合物質が抗体である場合には抗体のＦｃ領域、あるいは化学的または分子生物学的手法を用いて付加したタグ領域、に設定すると、被測定物質に応じて第１の特異的結合物質（例えば、被測定物質に対する抗体）を変更するだけで、容易に被測定物質を測定できる。すなわち、測定物質ごとに異なる物質を微小粒子に結合させるという、煩雑な操作の必要がない。

さらに、本発明によれば、被測定物質と直接結合する物質（第１の特異的結合物質）は、ラテックスや金コロイドなどの微小粒子と結合されないため、微小粒子との結合による、第１の特異的結合物質の特異性や被測定物質との結合能力の変化、自己凝集の可能性、第１の特異的結合物質の安定性の変化などの不確定要素の解消にもつながる。

本発明において、測定に供する被測定物質を含む検体としては、血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料；環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。

被測定物質は、該被測定物質と特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）が存在し得るものであれば、特に限定されない。被測定物質としては、例えば、アルブミン、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ミオグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン、シスタチンＣ、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ペプシノーゲンＩおよびII、コラーゲンなどの蛋白質；高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質などの脂質蛋白質；デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸；アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、アミラーゼなどの酵素；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、これらに対する抗体などの感染症に関する抗原や抗体；ハロペリドール、ブロムペリドールなどの薬物；性ホルモンなどのホルモンなどが挙げられる。

被測定物質と特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）としては、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。例えば、抗体または抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。被測定物質を特異的に認識できかつ以下で詳述する第２の特異的結合物質に認識されやすい点で、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が好ましい。また、第１の特異的結合物質は、第２の特異的結合物質による認識部位（例えば、タグ）が化学的または分子生物学的手法を用いて付加されていてもよい。このような第１の特異的結合物質は、市販のものであってもよく、あるいは被測定物質に応じて当業者が通常用いる方法によって調製したものであってもよい。

被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）に特異的に結合する物質（第２の特異的結合物質）は、微小粒子に結合される。第２の特異的結合物質としては、免疫反応を利用した免疫測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。あるいは、測定対象に特異的に結合する物質に特異的に結合するものも利用可能である。例えば、抗体または抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。

第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質に特異的に結合し、その結合部位は、第１の特異的結合物質に存在する任意の領域を認識する。例えば、第１の特異的結合物質が抗体である場合は、抗体のＦｃ領域、Ｖ領域、あるいは化学的または分子生物学的手法を用いて付加されたタグ領域などが挙げられる。第２の特異的結合物質は、抗体である場合、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。このような第２の特異的結合物質は、市販のものであってもよく、あるいは第１の特異的結合物質に応じて当業者が通常用いる方法によって調製したものであってもよい。

本発明において、第２の特異的結合物質を結合させるための微小粒子は、免疫測定試薬に使用され得る微小粒子であればよい。ラテックスおよび金属コロイドが好ましい。金属コロイドの場合、金コロイドが一般的に利用されやすい点で好ましい。金コロイド粒子は、市販されているものを用いてもよく、あるいは当業者が通常用いる方法（例えば、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法）により調製したものを用いてもよい。金コロイド粒子の粒径は、通常１０ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。

本発明の方法に用いられる第２の特異的結合物質を結合した金コロイド粒子（以下、結合金コロイド粒子という場合がある）は、例えば、以下のように調製し得る：金コロイド粒子溶液（５４０ｎｍにおける吸光度が約２．０）１Ｌに対して、通常、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇの第２の特異的結合物質（例えば、抗体）を添加し、冷蔵または室温下で５分〜２４時間撹拌する。次いで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングし、遠心分離を行うことにより、目的の結合金コロイド粒子を得ることができる。得られた微小粒子は、測定に必要な濃度となるように緩衝液に分散させる。緩衝液のｐＨは５〜９が好ましく、濃度は１〜１００ｍＭが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）などのグッド緩衝液が好適に用いられる。

緩衝液は、必要に応じて、糖および糖アルコール、アジ化ナトリウム、アルブミン、塩化ナトリウムなどの塩類、防腐剤などの添加物を含有してもよい。糖および糖アルコールとしては、グルコース、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられ、その濃度は、０．０１〜１０ｗ／ｖ％が好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく、その濃度は０．００１〜１ｗ／ｖ％が好ましい。防腐剤としてはアジ化ナトリウムが好ましく、その濃度は、０.０１〜０．５ｗ／ｖ％が好ましい。その他の添加物としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモールなどが挙げられる。

本発明においては、必要に応じて、複数の被測定物質または複数の第１の特異的結合物質が認識する被測定物質の部位（すなわち、被測定物質の一部）を結合させた担体を、第２の特異的物質を結合した微小粒子と共存させる。複数の被測定物質またはその一部を結合させるための担体としては、各種動物由来のアルブミン、ヘモシアニン、サイログロブリン、フィブリノーゲン、酵素などから適宜選ばれる。本発明においては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。担体１分子当たり、４〜４０程度の被測定物質またはその一部が結合していることが好ましい。

被測定物質またはその一部とこれらの担体との結合は、当業者が通常用いる方法により製造することができる。このような製造方法は、被測定物質またはその一部に存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基などの官能基を利用して、被測定物質またはその一部と担体とを直接または結合剤を介して化学結合させるものであり、被測定物質またはその一部の構造に応じて種々のものが知られている（生化学実験法11 エンザイムイムノアッセイ、P.Tijssen著、石川栄治編、252頁、1989年、東京化学同人）。化学結合を形成させるための試薬としては、アシル化剤、アルキル化剤などが挙げられる。好ましくは、カルボキシル基を活性化することにより得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、弱アルカリ条件下で用いられるマレイミド類などである。

被測定物質と第１の特異的物質との結合反応、および得られた結合物と第２の特異的物質との凝集反応において、反応温度、ｐＨ、緩衝液の種類、共存する塩の種類や濃度、その他の共存物質などの反応条件は、従来の免疫学的反応と同様である。例えば、一般的に行われているように、反応促進の目的で、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの水溶性高分子を反応系に添加してもよい。

本発明において、検体中の被測定物質を測定する方法は、
（ａ）該被測定物質と第１の特異的結合物質とを混合する工程であって、該第１の特異的結合物質が該被測定物質に特異的に結合し得る物質である、工程；
（ｂ）該工程（ａ）で得られた該混合液に、第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子を添加して混合する工程であって、該第２の特異的結合物質が該第１の特異的結合物質に特異的に結合し得る物質である、工程；および
（ｃ）該工程（ｂ）で得られた該混合液において、該微小粒子の凝集反応を測定する工程；を含む。

この方法において、被測定物質が、第１の特異的結合物質を複数個結合し得る場合は、工程（ａ）で被測定物質と該被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）とを反応させて複合体を形成させた後、工程（ｂ）で被測定物質に特異的に結合する物質を認識する物質（第２の特異的結合物質）を結合させたラテックスや金コロイドなどの微小粒子（以下、結合微小粒子という場合がある）と反応させることによって凝集反応を生じさせ、その程度を機械的に測定する。

本発明の方法は、例えば、以下のように行われる：被測定物質を含む検体または該検体を緩衝液などで適切に希釈したものなどと、被測定物質に特異的に結合する第１の特異的結合物質とを混合し、複合体を形成させる。次いで、この複合体を含む反応液に、上記のように得られた結合微小粒子を添加して混合することにより、複合体と結合微小粒子とが反応し、凝集反応が生じる。微小粒子として金コロイドを用いる場合は、この凝集反応に起因する所定の波長における吸光度変化を測定する。測定結果を、予め作成しておいた金コロイド凝集反応の吸光度変化と被測定物質の量との関係を表す検量線に当てはめることにより、容易に検体中の被測定物質の量を求めることができる。なお、吸光度変化が一定値以下であれば陰性、一定値以上であれば陽性として判定を行う、定性および半定量をすることも可能である。

金コロイドを用いる場合、反応開始後の吸光度変化は、一波長測定であっても二波長測定であってもよい。二波長測定の場合は、測定波長は、第一波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍと、第二波長３６０ｎｍ〜５８０ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５５０ｎｍである。一波長測定の場合は、上記二波長測定の場合の第一波長または第二波長のいずれか一方の波長領域の波長で測定することができる。本発明の方法において吸光度変化とは、以下の２通りの測定により得られた値であり、いずれであってもよい：
（１）反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で２回測定し、その差を吸光度変化とする；または
（２）反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率（その最大変化率を用いる場合もある）を吸光度変化とする。

上記測定には、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析装置などが利用できる。特に、本発明の方法を生化学自動分析装置での測定に適用することにより、多数の検体を短時間に測定することが可能である。

あるいは、本発明の方法においては、被測定物質が、第１の特異的結合物質に対して１：１で結合する場合は、工程（ａ）において、被測定物質と該被測定物質に特異的に結合する物質（第１の特異的結合物質）とを反応させて複合体を形成させた後、工程（ｂ）では、複数の被測定物質または複数の第１の特異的結合物質が認識する被測定物質の部位を結合させた担体である被測定物質結合担体共存下で結合微小粒子を反応させる。そうすることにより、工程（ａ）で被測定物質の濃度依存的に反応できなかった過剰の第１の特異的結合物質が、工程（ｂ）において被測定物質結合担体に結合して複合体を形成し、この複合体が、さらに結合微小粒子に結合されている第２の特異的結合物質と結合して凝集する。この凝集反応は、工程（ａ）後の被測定物質と結合していない第１の特異的結合物質量に依存することになる。その量は、工程（ａ）における反応時の被測定物質の量で規定されるので、その凝集反応の程度を機械的に測定することにより、被測定物質の量を測定することができる。

本発明によれば、本発明の方法に用いるための測定用試薬キットが提供される。このキットは、被測定物質に特異的に結合し得る物質である第１の特異的結合物質を含む第一試薬；および、第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子を含む第二試薬；を含む。第二試薬は、必要に応じて、複数の被測定物質または複数の第１の特異的結合物質が認識する被測定物質の部位を結合させた担体である被測定物質結合担体を含む。

上記の試薬は、どのような形態で提供されてもよく、それぞれ個別に密封包装されて提供されることが好ましい。上記キットは、検量線作成用の被測定物質の標準品、使用時に各物質を溶解して適切な濃度の溶液を調製するための緩衝液、使用説明書など含んでいてもよい。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

（実施例１：金コロイド液の調製）
９５℃の蒸留水１Ｌに１０ｗ／ｖ％塩化金酸溶液２ｍＬを撹拌しながら加え、１分後に２ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間撹拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１ｗ／ｖ％炭酸カリウムでｐＨ７．１に調節した。

（実施例２：抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体結合金コロイド試薬の調製）
抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体（Production of Antibodies, Reagents for Immunology and Services社）を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この液１００ｍＬを上記実施例１で調製した約１Ｌの金コロイド液に加え、冷蔵下で２時間撹拌した。５．４６ｗ／ｖ％マンニトール、０．５ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃にて９０分間撹拌した。８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、３ｗ／ｖ％マンニトール、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ、および０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去し、Ａ溶液を加えて抗体結合金コロイドを分散させ、全量を７０ｍＬとし、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体結合金コロイド溶液を調製した。

次いで、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体結合金コロイド溶液７０ｍＬに、Ａ溶液を２８０ｍＬ添加し、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体結合金コロイド試薬を調製した。

（実施例３：フェリチン測定１用第一試薬の調製）
１．０ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、０．５ｗ／ｖ％ＥＤＴＡ、および０．３５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．２Ｍ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）の溶液（Ｂ溶液）に、抗ヒトフェリチンマウスＩｇＧ抗体（Biogenesis社）を１．６μｇ／ｍＬ、ならびに反応促進剤としてポリエチレングリコールを１．０〜２．５ｗ／ｖ％程度添加して、フェリチン測定１用第一試薬とした。

（実施例４：フェリチンの測定１）
本実施例では、第一試薬として実施例３で調製したフェリチン測定１用第一試薬を、第二試薬として実施例２で調製した抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体結合金コロイド試薬を用いた。ヒトフェリチンを、それぞれ０、５０、１００、２５０、５００、および１０００ｎｇ／ｍＬになるように、３ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン含有０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）（Ｃ溶液）に溶解したものを標準溶液とした。標準溶液を下記の測定方法にて測定し、検量線を作成した。次いで、ＢＩＯ ＲＡＤ社製のコントロール血清１、２、および３を、同様に測定した。

測定方法：試料１０μＬに、第一試薬を１６０μＬ添加し、３７℃にて約５分間加温した後、第二試薬を８０μＬ加えて３７℃にて反応させて、日立７０７０自動分析装置により、波長５０５ｎｍおよび６６０ｎｍでの測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。検量線を図１に、コントロール血清１、２、および３の測定結果を表１に示す。

図１の検量線に示すように、被測定物質であるフェリチンの濃度依存的に、凝集反応による吸光度変化量が増加した。すなわち、検体中の被測定物質であるフェリチン量を、凝集反応の吸光度変化量として測定し、検量線と比較することによって定量できることがわかる。表１のフェリチン濃度の測定結果は、コントロール血清のフェリチン量の表示値の範囲内であり、本測定法の正確性が認められた。

（実施例５：抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体結合金コロイド試薬の調製）
抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体（Biogenesis社）を、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この液１００ｍＬを上記実施例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間撹拌した。次いで、Ａ溶液を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去し、Ａ溶液で抗体結合金コロイドを分散させ、全量を７０ｍＬとし、抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体結合金コロイド溶液を調製した。

次いで、抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体結合金コロイド溶液７０ｍＬに、Ａ溶液を２８０ｍＬ添加し、抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体結合金コロイド試薬を調製した。

（実施例６：フェリチン測定２用第一試薬の調製）
上記Ｂ溶液に、抗ヒトフェリチンウサギポリクローナル抗体（Dako Cytomation社）を０．２５μｇ／ｍＬ、および反応促進剤としてポリエチレングリコールを１．０〜２．５ｗ／ｖ％程度添加して、フェリチン測定２用第一試薬とした。

（実施例７：フェリチンの測定２）
本実施例では、第一試薬として実施例６で調製したフェリチン測定２用第一試薬を、第二試薬として実施例５で調製した抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体結合金コロイド試薬を用いた。ヒトフェリチンを、それぞれ０、５０、１００、２５０、５００、および１０００ｎｇ／ｍＬになるようにＣ溶液に溶解したものを標準溶液とした。標準溶液を下記の測定方法にて測定し、検量線を作成した。次いで、住友製薬バイオメディカル株式会社製のコントロール血清アクエックタイプＩＩを測定した。

測定方法：試料１０μＬに、第一試薬を１６０μＬ添加し、３７℃にて約５分間加温した後、第二試薬を８０μＬ加えて３７℃にて反応させて、日立７０７０自動分析装置により、波長５０５ｎｍおよび６６０ｎｍでの測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。検量線を図２に、コントロール血清アクエックタイプＩＩの測定結果を表２に示す。

図２の検量線に示すように、被測定物質であるフェリチンの濃度依存的に、凝集反応による吸光度変化量が増加した。すなわち、検体中の被測定物質であるフェリチン量を、凝集反応の吸光度変化量として測定し、検量線と比較することにより定量できることがわかる。表２のフェリチン濃度の測定結果は、コントロール血清アクエックタイプＩＩのフェリチン量の表示値の範囲内であり、本測定法の正確性が認められた。

（実施例７：ハロペリドール測定用第一試薬の調製）
Ｂ溶液に、抗ハロペリドールウサギポリクローナル抗体（特許文献２参照）を３μｇ／ｍＬ、および反応促進剤としてポリエチレングリコールを２．０〜３．５ｗ／ｖ％程度添加して、ハロペリドール測定用第一試薬とした。

（実施例８：ハロペリドール測定用第二試薬の調製）
実施例５で調製した抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃマウスモノクローナル抗体結合金コロイド溶液７０ｍＬに、Ａ溶液を１４０ｍＬ、およびハロペリドール結合ウシ血清アルブミン溶液（３０ｎｇ／ｍＬ：特許文献２参照）を３５μＬ添加して、ハロペリドール測定用第二試薬とした。

（実施例９：ハロペリドールの測定）
本実施例では、第一試薬として実施例７で調製したハロペリドール測定用第一試薬を、第二試薬として実施例８で調製したハロペリドール測定用第二試薬を用いた。ハロペリドールを、それぞれ０、５、１０、１５、２０、および２５ｎｇ／ｍＬになるようにＣ溶液に溶解した試料を調製した。ハロペリドール含有試料１０μＬに、第一試薬を２００μＬ添加し、３７℃で約５分間加温した後、第二試薬を５０μＬ加えて３７℃にて反応させて、日立７０７０自動分析装置により、波長５４６ｎｍおよび６６０ｎｍでの測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。図３にハロペリドール濃度と吸光度変化量との関係を示す。

図３に示すように、被測定物質であるハロペリドールの濃度依存的に、凝集反応による吸光度変化量が変化した。すなわち、検体中の被測定物質であるハロペリドール量を、凝集反応の吸光度変化量として測定し、検量線と比較することによって定量できることがわかる。

本発明によれば、第２の特異的結合物質の特異的認識部位を、第１の特異的結合物質の共通領域に設定すると、被測定物質に応じて第１の特異的結合物質（例えば、被測定物質に対する抗体）のみを変更するだけで、容易に種々の被測定物質を測定できる。すなわち、第２の特異的結合物質を種々の被測定物質において共通に使用できるため、被測定物質ごとに異なる物質を結合させて結合微小粒子を調製するという、煩雑な操作の必要もなく、コストの削減にもつながる。

さらに、本発明によれば、被測定物質と直接結合する物質（第１の特異的結合物質）は、ラテックスや金コロイドなどの微小粒子と結合されないため、微小粒子との結合による、第１の特異的結合物質の特異性や被測定物質との結合能力の変化、自己凝集の可能性、第１の特異的結合物質の安定性の変化などの不確定要素が解消され、より精度の高い測定が可能となる。

また、Ｂ／Ｆ分離を必要としないため、自動化にも非常に適している。例えば、臨床検査分野で普及している自動分析装置を利用する場合、上述のように被測定物質に応じて第１の特異的結合物質を変更するだけでよく、省力化にも寄与できる。したがって、工業、環境、および臨床検査の分野における、抗原抗体反応を利用した微量成分の免疫学的測定方法に好適である。

フェリチン測定１におけるフェリチン濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフ（フェリチン測定１用検量線）である。 フェリチン測定２におけるフェリチン濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフ（フェリチン測定２用検量線）である。 ハロペリドール濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフ（ハロペリドール用検量線）である。

Claims (6)

1. 検体中の被測定物質を測定する方法であって、
   （ａ）該検体と第１の特異的結合物質とを混合する工程であって、該第１の特異的結合物質が該被測定物質に特異的に結合し得る物質であり、該混合によって該第１の特異的結合物質と該検体中の該被測定物質とが複合体を形成する、工程；
   （ｂ）該工程（ａ）で得られた該混合液に、第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子を添加して混合する工程であって、該第２の特異的結合物質が該第１の特異的結合物質に対するモノクローナル抗体であり、該微小粒子の第２の特異的結合物質が、該混合液中の第１の特異的結合物質または該複合体の第１の特異的結合物質に結合する、工程；および
   （ｃ）該工程（ｂ）で得られた該混合液において、該微小粒子の凝集反応を測定し、該凝集反応が、該複合体と該第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子との反応により生じ、該凝集反応の程度が、該被測定物質の量に依存する、工程；
   を含む、方法。
2. 前記工程（ｂ）において、複数の前記被測定物質または複数の前記第１の特異的結合物質が認識する前記被測定物質の部位を結合させた担体である被測定物質結合担体が、前記微小粒子と同時に添加され、前記混合液中の第１の特異的結合物質が、該被測定物質結合担体および該微小粒子の第２の特異的結合物質と結合し、前記工程（ｃ）において、前記凝集反応が、該混合液中の第１の特異的結合物質、該被測定物質結合担体、該微小粒子の第２の特異的結合物質の結合を介して生じる、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の特異的結合物質が、前記被測定物質に対する抗体である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記微小粒子が、ラテックスまたは金コロイドである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 被測定物質に特異的に結合し得る物質である第１の特異的結合物質を含む第一試薬；および
   第２の特異的結合物質を結合させた微小粒子を含む第二試薬であって、該第２の特異的結合物質が該第１の特異的結合物質に対するモノクローナル抗体である、第二試薬；ならびに
   使用説明書
   を含み、
   該使用説明書が、請求項１に記載の方法を記載する、測定用試薬キット。
6. 前記第二試薬が、複数の前記被測定物質または複数の前記第１の特異的結合物質が認識する前記被測定物質の部位を結合させた担体である被測定物質結合担体をさらに含み、
   前記使用説明書が、請求項２に記載の方法を記載する、請求項５に記載のキット。

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