JP2007114129A

JP2007114129A - 反応性物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法および該微小粒子含有試薬

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Publication number: JP2007114129A
Application number: JP2005307879A
Authority: JP
Inventors: Mutsumi Tanaka; 睦田中
Original assignee: Alfresa Pharma Corp
Current assignee: Alfresa Pharma Corp
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2025-10-21
Also published as: JP5442179B2

Abstract

【課題】反応性物質結合微小粒子の分散液中での沈降を抑制することにより、分散液中の反応性物質結合微小粒子濃度を均一に保持する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、反応性を有する物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法を提供する。該方法は、該微小粒子の分散液中に、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる工程を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、抗体または抗原などの反応性を有する物質が結合した微小粒子（以下、反応性物質結合微小粒子という）の沈降抑制方法および該反応性物質結合微小粒子を用いた免疫測定用試薬に関する。特に、主として臨床検査の分野で、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる反応性物質結合微小粒子の沈降抑制方法および該反応性物質結合微小粒子を用いた免疫測定用試薬に関する。

近年、臨床検査などの各種検査においては、自動化および測定時間の短縮化の観点から、免疫反応を利用して、生体試料中の物質を測定する方法が広く用いられている。この免疫測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などが挙げられる。その中でも、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などの反応性を有する物質が結合した微小粒子（反応性物質結合微小粒子）を用いる方法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないため、特に測定の自動化や短時間化に適している。

しかし、これらのラテックス凝集法および金コロイド凝集法は、反応性物質結合微小粒子が沈降し易いため、使用時あるいは測定時に常に攪拌などによって、該微小粒子の濃度を均一化する必要があり、測定誤差を生じ易いという問題点がある。

例えば、上記方法に用いる試薬は、通常、試料の希釈、試料の本反応前の前処理、および本反応を補助する成分を主に含有する第一試薬と、主に反応に関与する主成分である反応性物質結合微小粒子を含有する第二試薬との２種から構成される。自動化分析装置を用いる場合は、まず、試料と第一試薬とを反応セルに分注し、続いて、一定時間経過後、反応セルに第二試薬を分注することによって、試料、第一試薬、および第二試薬の三者を混合して最終反応液を得、測定が行われる。この場合において、一旦、反応性物質結合微小粒子含有試薬（第二試薬）を分析装置にセットしても、一定期間ごとに第二試薬を攪拌し、濃度を均一にする必要があった。

従来、このような反応性物質結合微小粒子の沈降を抑制するための検討は行われていなかった。上記第一試薬、第二試薬および最終反応液の組成については、微小粒子の反応性の安定性の向上や反応促進の目的で改良がなされているのみである（例えば、特許文献１および２）。

特許文献１には、感作金属コロイドの反応性を安定化させる方法として、感作金属コロイドを含有する溶液に、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、およびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸またはそれらの塩から選ばれる物質の１種または２種以上を含有させることが記載されている。

特許文献２には、測定対象物質に対する抗体（または抗原）が結合した金コロイド粒子と測定物質とを反応させる溶液（最終反応液）中に、反応促進剤として、平均分子量が約２０，０００以上のポリアニオンまたはその塩を、０．４〜２．５（Ｗ／Ｗ）％含有させることが記載されている。
特開平１１−１０１７９９号公報特開平６−２１３８９１号公報

このように、測定値誤差の軽減を図るために、反応性物質結合微小粒子の沈降することを抑制し、試薬または反応液中での濃度を長期間、均一に保持する技術が望まれている。特に、自動分析装置においては、試薬をセットした後、攪拌操作を怠たると測定誤差が生じ、臨床判断ミスに繋がりかねないことから、反応性物質結合微小粒子の溶液中での沈降抑制方法、それを用いた測定試薬の開発は重要と考えられる。

したがって、本発明の目的は、反応性物質結合微小粒子の分散液中での該微小粒子の沈降を抑制する方法を提供することである。本発明の目的はまた、静置保存後または自動免疫分析装置にセット後、再度、攪拌操作にて分散させる必要がない、測定誤差の少ない試薬を提供することである。

本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討した結果、反応性物質結合微小粒子の分散液中において、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を共存させることにより、反応性物質結合微小粒子の沈降を抑制し、かつ分散液中の反応性物質結合微小粒子の濃度を長期にわたり均一に保持できることを見出して、本発明を完成するに至った。

本発明は、反応性を有する物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法を提供し、該方法は、該微小粒子の分散液中に、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる工程を含む。

１つの実施態様においては、上記分散液中に、上記ポリアニオンおよびその塩は０．３〜５質量％、上記デキストランは０．１〜５質量％、上記シクロデキストリンは０．１〜５質量％、上記ポリエチレングリコールは０．３〜５質量％、または前記グリセロールは５〜４０質量％の割合で含有される。

他の実施態様においては、上記ポリアニオンまたはその塩は、硫酸基を有する水溶性高分子化合物である。

別の実施態様においては、上記ポリアニオンは、デキストラン硫酸またはヘパリンである。

別の実施態様においては、上記反応性を有する物質が結合した微小粒子は、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である。

本発明の試薬は、反応性を有する物質が結合した微小粒子と、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含み、該微小粒子の沈降が抑制されている。

１つの実施態様においては、上記試薬中に、上記ポリアニオンおよびその塩は０．３〜５質量％、上記デキストランは０．３〜５質量％、上記シクロデキストリンは０．１〜５質量％、上記ポリエチレングリコールは０．５〜５質量％、または上記グリセロールは５〜４０質量％の割合で含有される。

本発明の試薬キットは、上記試薬を含む。

本発明の自動化免疫測定方法は、上記試薬と、試料とを混合する工程を含む。

本発明によれば、反応性物質結合微小粒子の沈降を抑制することができる。したがって、該微小粒子の沈降が抑制された試薬の提供が可能となる。この試薬は、該微小粒子の濃度が長期にわたり均一に保持されるため、例えば、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、該試薬を測定毎に攪拌せずとも、反応性物質結合微小粒子が最終反応液に等量分注することができるため、誤差の少ない安定した測定値を得ることが可能となる。

具体的には、反応性物質結合微小粒子含有試薬を自動分析装置にセットして長期間連続して測定する場合、あるいは一定期間をおいて測定する場合、従来必要であった、測定毎または一定期間毎の該微小粒子含有試薬を攪拌して、分散液中の濃度を均一にする操作を必要とせず、長期にわたり誤差の少ない正確な測定値を得ることができる。

これにより、測定者にとって大変な負担となっていた、煩雑な攪拌操作の必要性を無くすとともに、攪拌操作を怠ったことから生じる測定誤差およびそれによる臨床判断ミスを防ぐことができる。

１．反応性物質結合微小粒子の沈降抑制方法
本発明の反応性物質結合微小粒子の沈降抑制方法は、該微小粒子の分散液中に、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる工程を含む。

本発明の方法に用いられる反応性物質結合微小粒子は、免疫測定試薬として使用され得る微小粒子であり、好ましくはラテックス粒子および金属コロイド粒子である。金属コロイド粒子としては、金コロイド粒子が一般的に利用され易く、好ましく用いられる。金コロイド粒子は、市販品を用いてもよいし、当業者が通常用いる方法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法により調製してもよい。金コロイド粒子の粒径は、通常５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。

上記微小粒子に結合させる物質については、測定対象物質に特異的に結合するものであれば利用可能である。例えば、抗体、抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。

本発明の方法においては、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、またはグリセロールが用いられる。本明細書においては、これらの化合物を沈降抑制物質という。沈降抑制物質は、単独で用いてもよく、２以上を組み合わせて用いてもよい。

上記沈降抑制物質の１種であるポリアニオンとしては、例えば、デキストラン硫酸、へパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸が挙げられる。ポリアニオンの塩としては、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウムなどが挙げられる。ポリアニオンまたはその塩の中でも、沈降抑制効果が高い観点から、硫酸基を有する水溶性高分子化合物が好適に用いられる。このような化合物は、例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、デキストラン硫酸ナトリウム、およびヘパリンナトリウムである。

本発明の方法は、上記反応性物質結合微小粒子の分散液中に、上記沈降抑制物質を共存させる。共存させる手段は、特に制限されない。例えば、反応性物質結合微小粒子の分散液に沈降抑制物質を加えてもよいし、沈降抑制物質または沈降抑制物質を分散媒で希釈した希釈液に、反応性物質結合微小粒子を加えてもよいし、あるいは反応性物質結合微小粒子と沈降抑制物質とを混合し、この混合物を分散媒に加えてもよい。なお、分散媒は、特に制限されないが、例えば、水、あるいは後述する緩衝剤を用いた緩衝液などが用いられる。

本発明の方法において、分散液中の反応性物質結合微小粒子の濃度は、当該分野で通常採用される濃度であり得る。

本発明の方法において、分散液中に共存される沈降抑制物質の濃度は、沈降抑制物質の種類に応じて適宜設定される。例えば、ポリアニオンまたはその塩の場合、好ましくは０．３〜５質量％、より好ましくは０．５〜２質量％、さらに好ましくは０．７〜１．１質量％である。デキストランまたはシクロデキストリンの場合、好ましくは０．１〜５質量％、より好ましくは０．２〜１．８質量％、さらに好ましくは０．５〜１．５質量％である。ポリエチレングリコールの場合、好ましくは０．３〜５質量％、より好ましくは０．５〜３質量％である。グリセロールの場合、好ましくは５〜４０質量％、より好ましくは１０〜３５質量％である。

本発明の方法によれば、反応性物質結合微小粒子の分散液中に、沈降抑制物質を共存させることによって、反応性物質結合微小粒子の沈降を抑制することができる。したがって、この方法を用いることによって、分散液中で該微小粒子を長期にわたり均一に保持することが可能となる。

２．反応性物質結合微小粒子と沈降抑制物質とを含む試薬
本発明の試薬は、上記反応性物質結合微小粒子と、上記沈降抑制物質とを含み、必要に応じて、緩衝剤、糖、糖アルコール、アルブミン、塩化ナトリウム、防腐剤、およびその他の添加剤を含む。この試薬は、反応性物質結合微小粒子の沈降が抑制されているため、該微小粒子の濃度が長期にわたり均一に保持される。本発明の試薬は、通常、液状であり、反応性物質結合微小粒子を用いた試薬、特に当該分野で通常用いられる免疫測定用試薬の第二試薬として用いられる。

本発明の試薬中の反応性物質結合微小粒子の濃度、および沈降抑制物質の濃度は、特に制限されない。反応性物質結合微小粒子の沈降の抑制を高める観点から、上記方法で採用される濃度の範囲内であることが好ましい。

本発明の試薬に含有され得る緩衝剤としては、リン酸緩衝液；トリス塩酸緩液；コハク酸緩衝液；グリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）などのグッド緩衝液などが挙げられる。上記緩衝剤は、試薬中のｐＨが５〜９、あるいは濃度が１〜１００ｍＭとなるように含有されることが好ましい。

本発明の試薬に含有され得る糖および糖アルコールとしては、グルコース、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。上記糖または糖アルコールは、試薬中の濃度が０．０１〜１０質量％であることが好ましい。

本発明の試薬に含有され得るアルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。アルブミンは、試薬中の濃度が０．００１〜１質量％であることが好ましい。

本発明の試薬に含有され得る防腐剤としては、アジ化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤は、試薬中の濃度が０.０１〜０．５質量％であることが好ましい。

本発明の試薬に含有され得るその他の添加剤としては、ツィーン２０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモールなどが挙げられる。

本発明の試薬は、上記のように、反応性物質結合微小粒子の沈降が抑制されているため、該微小粒子の濃度が長期にわたり均一に保持される。したがって、例えば、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、測定毎に該試薬を攪拌せずとも、反応性物質結合微小粒子を最終反応液に等量分注することができ、誤差の少ない安定した測定値を得ることが可能となる。

３．試薬キット
本発明の試薬キットは、上記反応性物質結合微小粒子と沈降抑制物質とを含む試薬（本発明の試薬）を含む。この試薬キットは、例えば、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などを用いた免疫測定、特に自動化免疫測定に用いられる。

本発明の試薬キットが免疫測定用試薬キットとして用いられる場合、そのキットは、通常、試料の希釈、試料の免疫反応前の前処理、および免疫反応を補助する成分などを含有する第一試薬、本発明の試薬（第二試薬）、および必要に応じて、検量線作成用の測定対象物質の標準品から構成され得る。

本発明の試薬キットは、本発明の試薬中の微小粒子に結合された反応性物質に応じて、試料中の種々の物質を測定対象とすることができる。測定対象となり得る物質（測定対象物質）としては、例えば、アルブミン、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ミオグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン、シスタチンＣ、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ペプシノーゲンＩおよびＩＩ、コラーゲンなどの蛋白質；高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質などの脂質蛋白質；デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸；アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、アミラーゼなどの酵素；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、およびこれらに対する抗体などの感染症に関する抗原や抗体；ハロペリドール、ブロムペリドールなどの薬物；性ホルモンなどのホルモンなどが挙げられる。

測定に供する測定対象物質を含む試料としては、血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料、環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。

４．自動化免疫測定方法
本発明の自動化免疫測定方法は、本発明の試薬を用いて行われる。この自動化免疫測定方法は、試薬中において、反応性物質結合微小粒子の沈降が抑制され、その濃度が長期にわたり均一に保持されるため、測定毎に該試薬を攪拌せずとも、反応性物質結合微小粒子を最終反応液に等量分注することができ、誤差の少ない安定した測定値を得ることができる。

本発明の自動化免疫測定方法は、具体的には、試料、第一試薬、および本発明の試薬（第二試薬）を自動分析装置にセットし、試料に、第一試薬および第二試薬を順次自動的に混合することによって行われる。第一試薬と第二試薬との割合は、適宜設定される。好ましくは本発明の試薬（第二試薬）は、２〜９倍、より好ましくは３〜５倍に希釈される。

本発明の自動化免疫測定方法は、例えば、長期間連続して測定する場合、あるいは、一定期間をおいて測定する場合であっても、従来必要であった、測定毎または一定期間毎の該微小粒子含有試薬を攪拌して、溶液中の濃度を均一にする操作を必要とせず、長期にわたり誤差の少ない正確な測定値を得ることができる。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。以下の実施例において、特に記載がない限り、％はいずれも質量／容量％（Ｗ／Ｖ％）を表す。

実施例１：金コロイド液の調製
９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸溶液２ｍＬを攪拌しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間攪拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１％炭酸カリウムでｐＨ７．１に調節した。

実施例２：シスタチンＣ測定用第一試薬の調製
５％塩化ナトリウム、０．２％ＥＤＴＡ、０．２％アルキルフェニルジスルホン酸ナトリウム塩、および０．３５％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．５ＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．７）溶液に、反応促進剤としてポリエチレングリコールを１．０〜２．５％程度添加してシスタチンＣ測定用第一試薬とした。

実施例３：抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬（第二試薬）の調製
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この抗シスタチンＣ抗体溶液１００ｍＬを、実施例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間攪拌した。さらに、５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間攪拌した。次いで、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた。さらに、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去し、Ａ溶液で抗体感作金コロイドを分散させ、全量を２１０ｍＬとし、抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬（第二試薬）を得た。

実施例４：グリセロールまたはポリエチレングリコールの添加効果の検討
（１）シスタチンＣ濃度が約８ｍｇ／Ｌの試料（試料１）の測定
抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬（第二試薬）に、グリセロールを３３％含有するように添加して、グリセロール含有第二試薬を調製した。

日立７０７０自動分析装置に、シスタチンＣ濃度が約８ｍｇ／Ｌの試料（試料１）、実施例２で調製した第一試薬、および上記グリセロール含有第二試薬をそれぞれセットして、以下の条件下でセット時の吸光度変化量を測定した。

（測定条件）
３μＬの試料１に、第一試薬を２４０μＬ分注し、３７℃で約５分間加温し、次いで、グリセロール含有第二試薬を６０μＬ分注し、３７℃で反応した。その後、主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３１の二ポイント測定を行って、二ポイント間の吸光度変化量を測定した。なお、吸光度変化量は、上記第二試薬を分注する際に、攪拌しなかった場合（無攪拌吸光度変化量）および予め攪拌した場合（攪拌吸光度変化量）のそれぞれについて測定した。

測定後、１日経過した後、上記と同様にして、１日経過後の吸光度変化量（無攪拌吸光度変化量および攪拌吸光度変化量）を測定した。

得られたセット時および１日経過後の無攪拌吸光度変化量と、攪拌吸光度変化量とからそれぞれの測定値差を算出した。結果を表１に示す。

他方、グリセロール含有第二試薬の代わりに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を２％含有する第二試薬（ＰＥＧ含有第二試薬）、グリセロールを３３％およびＰＥＧを２％含有する第二試薬（混合物含有第二試薬）、または第二試薬をそのまま用いたこと以外は、上記と同様にして、吸光度変化量を測定し、測定値差を算出した。結果を表１に併せて示す。

（２）シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）の測定
試料１の代わりに、シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）を用いたこと以外は、上記（１）と同様にして、測定値差を算出した。結果を表２に示す。

（３）シスタチンＣ濃度が約１ｍｇ／Ｌの試料（試料３）の測定
試料１の代わりに、シスタチンＣ濃度が約１ｍｇ／Ｌの試料（試料３）を用いたこと以外は、上記（１）と同様にして、測定値差を算出した。結果を表３に示す。

上記表１〜３の結果から明らかなように、第二試薬に沈降抑制物質（グリセロール、ポリエチレングリコール、またはグリセロールとポリエチレングリコールとの混合物）を加えた場合は、沈降抑制物質を加えない場合に比べて、１日経過後の測定値差が格段に小さかった。沈降抑制物質を加えない場合は、１日経過すると、抗体結合金コロイド粒子が重力により沈降するため、試薬液上層部の濃度が希薄になる。したがって、測定直前に攪拌しなければ、自動分析装置では濃度の希薄になった上層域から試薬を反応セルへ分注されるために、反応に直接関与する抗体結合金コロイド粒子量が減少し、吸光度変化量が大幅に減少する。このため、１日静置後では、測定前に抗体結合金コロイド試薬を攪拌した場合と攪拌しなかった場合の吸光度変化量を比較すると同一試料を測定しているにもかかわらず、大きな差が認められた。

このことから、グリセロールおよび／またはポリエチレングリコールを抗体結合金コロイド試薬に添加することで、静置保存時に抗体結合金コロイド粒子の沈降が抑制され、抗体結合金コロイド試薬の均一性が保たれることがわかった。

実施例５：デキストランまたはデキストラン硫酸ナトリウムの添加効果の検討
（１）シスタチンＣ濃度が約８ｍｇ／Ｌの試料（試料１）の測定
抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬（第二試薬）に、デキストランを１％含有するように添加して、デキストラン含有第二試薬を調製した。

グリセロール含有第二試薬の代わりに、デキストラン含有第二試薬を用いたこと、およびセット時１日経過後の吸光度変化量の代わりに、セット時３日経過後の吸光度変化量を測定したこと以外は、実施例４の（１）と同様にして、吸光度変化量を測定し、測定値差を算出した。結果を表４に示す。

他方、デキストラン含有第二試薬の代わりに、デキストラン硫酸ナトリウムを１％含有する第二試薬（デキストラン硫酸含有第二試薬）または第二試薬をそのまま用いたこと以外は、上記と同様にして、吸光度変化量を測定し、測定値差を算出した。結果を表４に併せて示す。

（２）シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）の測定
試料１の代わりに、シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）を用いたこと以外は、上記実施例５の（１）と同様にして、測定値差を算出した。結果を表５に示す。

上記表４および５の結果から明らかなように、第二試薬に沈降抑制物質（デキストランまたはデキストラン硫酸ナトリウム）を加えた場合は、沈降抑制物質を加えない場合に比べて、３日経過後の測定値差が格段に小さかった。このことから、沈降抑制物質（デキストランまたはデキストラン硫酸ナトリウム）を抗体結合金コロイド試薬に添加することで、静置保存時に抗体結合金コロイド粒子の沈降が抑制され、抗体結合金コロイド試薬の均一性が保たれることがわかった。

実施例６：へパリンナトリウムの添加効果の検討
（１）シスタチンＣ濃度が約８ｍｇ／Ｌの試料（試料１）の測定
抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬（第二液）に、ヘパリンナトリウムを１％含有するように添加して、ヘパリン含有第二試薬を調製した。

グリセロール含有第二試薬の代わりに、ヘパリン含有第二試薬を用いたこと、およびセット時１日経過後の吸光度変化量の代わりに、セット時２日経過後の吸光度変化量を測定したこと以外は、実施例４の（１）と同様にして、吸光度変化量を測定し、測定値差を算出した。結果を表６に示す。

（２）シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）の測定
試料１の代わりに、シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）を用いたこと以外は、上記実施例６の（１）と同様にして、測定値差を算出した。結果を表７に示す。

上記表６および７の結果から明らかなように、第二試薬に沈降抑制物質（ヘパリンナトリウム）を加えた場合は、沈降抑制物質を加えない場合に比べて、２日経過後の測定値差が格段に小さかった。このことから、沈降抑制物質（ヘパリンナトリウム）を抗体結合金コロイド試薬に添加することで、静置保存時に抗体結合金コロイド粒子の沈降が抑制され、抗体結合金コロイド試薬の均一性が保たれることがわかった。

実施例７：デキストラン硫酸ナトリウムの添加効果（経時変化）
（１）シスタチンＣ濃度が約８ｍｇ／Ｌの試料（試料１）の測定
抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬（第二試薬）に、デキストラン硫酸ナトリウムを１％含有するように添加して、デキストラン硫酸含有第二試薬を調製した。

グリセロール含有第二試薬の代わりに、デキストラン含有第二試薬を用いたこと、およびセット時１日経過後の吸光度変化量の代わりに、セット時２日経過後、３日経過後、６日経過後、および７日経過後の吸光度変化量を測定したこと以外は、実施例４の（１）と同様にして、吸光度変化量を測定した。得られた吸光度変化量から、既知濃度の標準液で作成した検量線を用いてシスタチンＣ濃度を算出した。結果を表８および図１に示す。

（２）シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）の測定
試料１の代わりに、シスタチンＣ濃度が約４ｍｇ／Ｌの試料（試料２）を用いたこと以外は、上記実施例７の（１）と同様にして、吸光度変化量を測定し、シスタチンＣ濃度を算出した。結果を表９および図１に示す。

表８および９ならびに図１の結果から明らかなように、第二試薬に沈降抑制物質（デキストラン硫酸ナトリウム）を加えた場合は、特に攪拌しなくても、攪拌した際の測定値と変化なく、７日後まで安定した測定値が得られた。これに対して、沈降抑制物質を加えない場合は、測定前に攪拌し、抗体結合金コロイド粒子濃度を均一にしないと、抗体結合金コロイド粒子が徐々に沈降し、試薬上部の抗体結合金コロイド粒子濃度が薄くなることより、反応系に分注される抗体結合金コロイド粒子量が減少して、日数の経過に伴って測定値が低下した。

このことから、抗体結合金コロイド試薬に、沈降抑制物質（デキストラン硫酸ナトリウム）を添加することで、抗体結合金コロイド粒子の沈降が抑制され、試薬中で抗体結合金コロイド粒子濃度を長期にわたり均一に保持できることがわかった。したがって、自動分析装置上に静置したままで攪拌することなく安定した測定値を得ることが可能となる。

実施例９：フェリチン測定用第一試薬の調製
５％塩化ナトリウム、０．２％ＥＤＴＡ、および０．３５％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．５ＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）溶液に反応促進剤としてポリエチレングリコールを１．５〜２．０％程度添加して添加してフェリチン測定用第一試薬とした。

実施例１０：抗フェリチン抗体結合金コロイド試薬（フェリチン測定用第二試薬）の調製
抗フェリチン抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この液１００ｍＬを、実施例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間攪拌した。さらに、５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間攪拌した。次いで、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた。さらに、８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去し、Ａ溶液で抗体感作金コロイドを分散させ、全量を２８０ｍＬとし、抗フェリチン抗体結合金コロイド試薬を得た。

実施例１１：デキストラン硫酸ナトリウムの添加効果の検討
(１）フェリチン濃度が約７６０ｎｇ／Ｌの試料（試料４）の測定
抗フェリチン抗体結合金コロイド試薬（第二試薬）に、デキストラン硫酸ナトリウムを０．２％含有するように添加して、デキストラン硫酸０．２％含有第二試薬を調製した。

日立７０７０自動分析装置に、フェリチン濃度が約７６０ｎｇ／Ｌの試料（試料４）、実施例９で調製した第一試薬、および上記デキストラン硫酸０．２％含有第二試薬をそれぞれセットして、以下の条件下でセット時の吸光度変化量を測定した。

（測定条件）
１０μＬの試料４に、第一試薬を１６０μＬ分注し、３７℃で約５分間加温し、次いで、デキストラン硫酸０．２％含有第二試薬を８０μＬ分注し、３７℃で反応した。その後、主波長５０５ｎｍおよび副波長７００ｎｍで測光ポイント１８から３１の二ポイント測定を行って、二ポイント間の吸光度変化量を測定した。なお、吸光度変化量は、上記第二試薬を分注する際に、攪拌しなかった場合（無攪拌吸光度変化量）および予め攪拌した場合（攪拌吸光度変化量）のそれぞれについて測定した。

測定した日から２日経過後、４日経過後、および７日経過後において、上記と同様にして、吸光度変化量（無攪拌吸光度変化量および攪拌吸光度変化量）を測定した。

得られたセット時、２日経過後、４日経過後、および７日経過後の無攪拌吸光度変化量および攪拌吸光度変化量から、既知濃度の標準液で作成した検量線を用いてフェリチン濃度を算出した。結果を表１０に示す。

他方、デキストラン硫酸０．２％含有第二試薬の代わりに、デキストラン硫酸を１．０％含有する第二試薬、デキストラン硫酸を２．０％含有する第二試薬、または第二試薬をそのまま用いたこと以外は、上記と同様にして、吸光度変化量を測定し、フェリチン濃度を算出した。結果を表１０に併せて示す。なお、デキストラン硫酸を２．０％含有する第二試薬を用いた場合または第二試薬をそのまま用いた場合（コントロール）のフェリチン濃度については、図２に併せて示す。

（２）フェリチン濃度が約５２０ｎｇ／Ｌの試料（試料５）の測定
試料４の代わりに、フェリチン濃度が約５２０ｎｇ／Ｌの試料（試料５）を用いたこと以外は、上記実施例１１の（１）と同様にして、吸光度変化量を測定し、フェリチン濃度を算出した。結果を表１１に示す。なお、デキストラン硫酸を２．０％含有する第二試薬を用いた場合または第二試薬をそのまま用いた場合（コントロール）のフェリチン濃度については、図２に併せて示す。

表１０および１１ならびに図２の結果から明らかなように、第二試薬に沈降抑制物質（デキストラン硫酸ナトリウム）を加えた場合は、沈降抑制物質を加えない場合に比べて、２日経過後、４日経過後、および７日経過後の測定値差が格段に小さかった。特にデキストラン硫酸ナトリウム１．０％含有第二試薬および２．０％含有第二試薬を用いた場合、７日経過後においても、測定前に抗体結合金コロイド試薬を攪拌しなかった場合の測定値と、攪拌した際の測定値との差が全くなかった。沈降抑制物質を加えない場合は、測定前に攪拌し、抗体結合金コロイド粒子濃度を均一にしないと、抗体結合金コロイド粒子が徐々に沈降し、試薬上部の抗体結合金コロイド粒子濃度が薄くなり、反応系に分注される抗体結合金コロイド粒子量が減少して日数の経過に伴って測定値が低下した。

このことから、抗体結合金コロイド試薬に沈降抑制物質（デキストラン硫酸ナトリウム）を添加することで、抗体結合金コロイド粒子の沈降が抑制され、試薬中で抗体結合金コロイド粒子濃度を長期にわたり均一に保持できることがわかった。したがって、自動分析装置上に静置したままで攪拌することなく安定した測定値を得ることができることが可能となる。

本発明によれば、反応性物質結合微小粒子の沈降を抑制することができる。したがって、該微小粒子の沈降が抑制された試薬の提供が可能となる。この試薬は、該微小粒子の濃度が長期にわたり均一に保持される。そのため、例えば、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、該試薬を攪拌せずとも、反応性物質結合微小粒子を最終反応液に等量分注することができるため、誤差の少ない安定した測定値を得ることが可能となる。これにより、測定者にとって大変な負担となっていた、煩雑な攪拌操作の必要性を無くすとともに、攪拌操作を怠ったことから生じる測定誤差およびそれによる臨床判断ミスを防ぐことができる。この試薬および該試薬を含む試薬キットは、特に自動化免疫装置に有用である。

所定のシスタチンＣ濃度の測定値の経時変化を示すグラフである。所定のフェリチン濃度の測定値の経時変化を示すグラフである。

Claims

反応性を有する物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法であって、
該微小粒子の分散液中に、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる工程を含む、方法。
前記分散液中に、前記ポリアニオンおよびその塩が０．３〜５質量％、前記デキストランが０．１〜５質量％、前記シクロデキストリンが０．１〜５質量％、前記ポリエチレングリコールが０．３〜５質量％、または前記グリセロールが５〜４０質量％の割合で含有される、請求項１に記載の方法。
前記ポリアニオンまたはその塩が、硫酸基を有する水溶性高分子化合物である、請求項１または２に記載の方法。
前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはヘパリンである、請求項３に記載の方法。
前記反応性を有する物質が結合した微小粒子が、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
反応性を有する物質が結合した微小粒子と、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種の化合物とを含む試薬であって、該微小粒子の沈降が抑制されている、試薬。
前記試薬中に、前記ポリアニオンおよびその塩が０．３〜５質量％、前記デキストランが０．３〜５質量％、前記シクロデキストリンが０．１〜５質量％、前記ポリエチレングリコールが０．５〜５質量％、または前記グリセロールが５〜４０質量％の割合で含有される、請求項６に記載の試薬。
前記ポリアニオンまたはその塩が、硫酸基を有する水溶性高分子化合物である、請求項６または７に記載の試薬。
前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはヘパリンである、請求項８に記載の試薬。
前記反応性を有する物質が結合した微小粒子が、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である、請求項６から９のいずれかの項に記載の試薬。
請求項６から１０のいずれかの項に記載の試薬を含む、試薬キット。
請求項６から１０のいずれかの項に記載の試薬と、試料とを混合する工程を含む、自動化免疫測定方法。