CN115856319A - 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种胶乳免疫比浊法的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;试剂R1包含以下组分:3‑(N‑吗啉基)丙磺酸缓冲液、氯化钠、聚乙二醇6000、硫酸葡聚糖钠盐、EDTA‑2Na、表面活性剂、叠氮钠;试剂R2包含以下组分:4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球、稳定剂、分散剂、叠氮钠。该试剂盒是稳定性强、准确度高、线性范围广、灵敏度高、抗干扰的液体试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域,特别是涉及一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒和应用。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(ST2)是白细胞介素-1受体超家族的成员之一,包括四种亚型,即可溶性ST2(sST2)、跨模型ST2(ST2L)、多变型ST2(ST2V)及跨膜多变型ST2(ST2LV),其中sST2、ST2L是心力衰竭的重要研究对象,IL-33是sST2和ST2L的功能配体,当心肌细胞和心肌成纤维细胞受到机械压力刺激时,ST2L和sST2均增高,IL-33与ST2L结合能抑制心肌细胞肥大和纤维化,从而保护心脏。但sST2则作为诱导受体与ST2L竞争性结合IL-33,抑制了ST2L与IL-33的结合,阻断ST2L/IL-33信号通路,削弱对心血管系统的保护作用,促进了心肌重构和心室功能障碍。心肌重构是心衰发生和发展的基本病理生理机制,主要表现为心室肥大和心肌纤维化。sST2反映的是一个持续和长期过程,反映心肌纤维化的程度。因此,sST2水平持续升高反映了心肌纤维化和心肌重构的持续进展。sST2作为心肌纤维化标志物,检测结果不受年龄、肾功能、性别、BMI等影响,对心衰伴肾功能不全患者的诊断和预后评估优于利钠肽。sST2可独立预测患者的死亡风险,且与NT-proBNP联合应用能够增强对死亡的预测能力。
目前临床检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)的方法主要有化学发光法、酶联免疫吸附实验法(ELISA)、荧光免疫层析法等,化学发光法准确性和灵敏度高,但是仪器设备昂贵,成本较高;酶联免疫吸附实验法(ELISA)目前在临床应用广泛,技术成熟,虽然在灵敏度、特异性、试剂价格等方面占有优势,但该技术在检测时间、操作性等方面存在弊端;免疫层析法的检测通常受至于荧光易衰减、测试结果半定量的不足,通常在快速检测中应用广泛,而在实际大型综合医院中对测试结果的准确度要求较高。胶乳免疫比浊法具有特异性高,操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点,但现在国内该方法试剂盒非常少,而且存在反应不灵敏、线性范围窄、稳定性较差、应用困难等问题,本发明针对可溶性生长刺激表达基因2蛋白进行胶乳增强免疫比浊法的研发以满足医院大规模临床检测以及化学分析的要求。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种胶乳免疫比浊法的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒,该试剂盒是稳定性强、准确度高、线性范围广、灵敏度高、抗干扰的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒由以下成分组成,该试剂盒含有试剂R1和试剂R2;
试剂R1包含以下组分:
试剂R2包含以下组分:
优选地,所述试剂R1的pH为6.5-8.0;所述试剂R2的pH为6.0-8.0。
优选的,所述试剂R1中的表面活性剂为磺化琥珀酸二环己酯钠盐和鼠李糖脂,且质量比为1:1。
优选的,所述试剂R2中的稳定剂为羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖,且质量比为1-3:2-3。
优选的,所述试剂R2中的分散剂为海藻酸钠。
鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球的制备方法为:取适量聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球加入100mmol/L MES缓冲液中,使其胶乳微球终浓度为2%,加入2mg/ml的N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺后重悬分散,加入8mg/ml的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDAC溶液,室温反应2小时;加入80mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液,4℃反应2h后离心,用100mmol/L、pH5.0的MES溶液洗涤两次;然后加入鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白单克隆抗体,在37℃孵育5小时,与胶乳微球进行偶联,形成抗体胶乳复合物;然后,加入适量的0.2%的BSA溶液在37℃条件下封闭3小时,再以12000rpm离心20分钟,去除上清,所得沉淀加入含50mmol/L的HEPES缓冲液洗涤、分散即得鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球。其中聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球的粒径分别为400nm、180nm、80nm,并且三种胶乳微球的体积比例为2:3:2。
将上述可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白的浓度。
本发明有益效果:
1、本发明试剂R1中的表面活性剂为磺化琥珀酸二环己酯钠盐和鼠李糖脂,具有更强的乳化、分散能力,有效的去除血脂、乳糜干扰,使试剂R1体系均一分散,大大增强试剂的抗干扰能力,同时鼠李糖脂为生物表面活性剂作用温和,对抗原抗体无副作用;本发明试剂R1中还添加硫酸葡聚糖钠盐,有利于暴露可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗原结合位点,促进抗原抗体的特异性反应,进而提高试剂的准确度,同时硫酸葡聚糖钠盐本身促进脂蛋白酶分解乳糜微粒的作用,可进一步提高试剂抗干扰能力。
2、本发明采用的聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球的粒径分别为400nm、180nm、80nm,并且优化了三种粒径的胶乳微球的用量,同时添加分散剂海藻酸钠,使不同粒径胶乳微球均匀分散,避免不同粒径胶乳微球的沉降与凝聚,提高试剂的线性、灵敏度和稳定性。
3、本发明试剂R2中添加稳定剂羧甲基纤维素钠和羧甲基壳聚糖,提高了试剂中抗体和胶乳微球的结合稳定性,使试剂R2稳定性能优异。
4、本发明制备的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂稳定性好、准确度高、灵敏度高、线性范围广,明显优于市售的同类型产品。
附图说明
图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线;
图2为对比例1和对比例4试剂的相关性曲线;
图3为实施例1和对比例1、8、9、10提供的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明试剂盒测定血清中可溶性生长刺激表达基因2蛋白,测试条件为:
方法:终点法;主/副波长:600nm/700nm;温度:37℃;校正类型:非线性;校准方法:多点定标;反应方向:向上。
具体操作如表1所示。
表1可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂操作步骤
计算结果:
样本要求:
1.不溶血血清。
2.样本稳定性:标本2~8℃保存可稳定3天,-20℃保存可稳定2周。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1
pH 7.5
试剂R2包含以下组分:
pH 7.8
上述可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
a)试剂R1的配制:量取配制体积等体积的纯化水,称取适量的3-(N-吗啉基)丙磺酸、EDTA-2Na加入,调节pH至7.5,按配制体积计算并称取适量的氯化钠、聚乙二醇6000、磺化琥珀酸二环己酯钠盐、鼠李糖脂等,搅拌均匀即为试剂R1。
b)试剂R2的配制:量取配制体积等体积的纯化水,按配制体积计算并称取适量的4-羟乙基哌嗪乙磺酸加入,调节pH至7.8,按配制体积计算并称取适量的鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠等,搅拌均匀即为试剂R2。
其中鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球的制备方法为:取适量聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球加入100mmol/L MES缓冲液中,使其胶乳微球终浓度为2%,加入2mg/ml的N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺后重悬分散,加入8mg/ml的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDAC溶液,室温反应2小时;加入80mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液,4℃反应2h后离心,用100mmol/L、pH5.0的MES溶液洗涤两次;然后加入鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白单克隆抗体,在37℃孵育5小时,与胶乳微球进行偶联,形成抗体胶乳复合物;然后,加入适量的0.2%的BSA溶液在37℃条件下封闭3小时,再以12000rpm离心20分钟,去除上清,所得沉淀加入含50mmol/L的HEPES缓冲液洗涤、分散即得鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球。其中聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球的粒径分别为400nm、180nm、80nm,并且三种胶乳微球的体积比例为2:3:2。
实施例2
pH 7.5
试剂R2包含以下组分:
pH 7.5
上述所述的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例3
pH 7.0
试剂R2包含以下组分:
pH 7.8
上述所述的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的制备方法同实施例1。
对比例1
市售的化学发光可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒。
对比例2
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有磺化琥珀酸二环己酯钠盐,其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有鼠李糖脂,含有等量的槐糖脂,其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有硫酸葡聚糖钠盐,其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中胶乳微球的粒径全部为80nm,其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中胶乳微球的粒径全部为180nm,其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中胶乳微球的粒径全部为400nm,其它与实施例1相同。
对比例8
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含有羧甲基纤维素钠,其它与实施例1相同。
对比例9
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含有羧甲基壳聚糖,其它与实施例1相同。
对比例10
与实施例1中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含海藻酸钠,其它与实施例1相同。
性能验证
1、相关性实验
进行相关性试验,试验方案为:实施例1、对比例1、对比例4,同时检测了40个临床血清样本,对两组检测结果进行相关性分析,计算相关系数r;以对比例1检测结果作为靶值,分别计算40对数据的相对偏差(Bias%)。要求r不小于0.990,相对偏差不超过±10%。
表2相关性对比实验结果
表3对比例1分别与实施例1、对比例4的相关系数
相关系数r | |
实施例1和对比例1 | 0.9987 |
对比例4和对比例1 | 0.9698 |
由表2、表3和图1的可以看出,实施例1和对比例1的试剂测定血清样本最大值为4.18%,两种试剂的相关系数为0.9987,实施例1和对比例1的检测结果非常接近,因此本发明提供的实施例1检测试剂准确度较高;由表2、表3和图2可以看出,对比例4和对比例1检验结果偏差大,相关系数为0.9698,说明本发明试剂R1添加硫酸葡聚糖钠盐,有利于促进抗原抗体特异性结合,显著提高试剂的准确度。
试验二 稳定性实验
对实施例1和对比例1、8、9、10提供的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂进行稳定性试验,试验方案为:对实施例1和对比例1、8、9、10提供的试剂,一起放入37℃水浴箱中,每天检测靶值为78.7±2.5ng/ml的质控品,并监测质控品测定变化。
表4试剂热稳定性验证结果(质控)
由表4和图3可以看出,与对比例1相似,本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下12天内稳定性较好;而对比例8、9、10试剂在37℃水浴条件下12天样本值明显降低,实施例1的试剂盒稳定性优于对比例8、9、10试剂盒的稳定性,说明本发明在试剂R2中添加羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖和海藻酸钠,有利于提高试剂提高R2的稳定性。
试验三抗干扰实验
配制不同浓度水平的甘油三酯样本和乳糜干扰样本,用实施例1和对比例1、2、3、4提供的试剂,测定添加不同浓度干扰物质样本,以水平1样本中可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定结果为基值,计算干扰样本中可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定值与基值的偏差%,偏差%≥±10%为有干扰。结果见表5和表6
表5甘油三酯干扰实验测定结果
表6乳糜微粒干扰实验测定结果
结果显示:实施例1与对比例1相似,待测样本中甘油三酯的浓度为13.5mmol/L、乳糜为1000mg/dL时,对可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定结果没有干扰。对比例2和对比例3,待测样本中甘油三酯的浓度为7.8mmol/L、乳糜为800mg/dL时,就会对可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定结果产生干扰;对比例4,待测样本中甘油三酯的浓度为13.5mmol/L、乳糜800mg/dL时,对可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定结果会产生干扰。因此添加磺化琥珀酸二环己酯钠盐、鼠李糖脂、硫酸葡聚糖钠盐对消除乳糜和血脂的干扰具有重要作用。
试验四线性实验
取可溶性生长刺激表达基因2蛋白高值样本为400ng/mL,并进行梯度稀释,配制6个不同浓度的样本,依次为0ng/ml、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL,用实施例1及对比例试剂1、5、6、7、10提供的试剂进行检测,每个浓度水平各样本分别测定3次,分别取其平均值。检测结果如表7所示:
表7试剂线性验证结果
由表7可以看出,与对比例1相似,本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化,线性相关系数达到0.9997,说明实施例1线性范围较好,而对比例5、6、7线性较差,但对比例5采用小粒径胶乳微球,线性相对较好。对比例10尽管采用不同粒径的胶乳微球,但未添加海藻酸钠分散剂,线性也较差,因此采用不同粒径胶乳微球同时添加分散剂能协同提高试剂的线性范围。
试验五灵敏度实验
分别用实施例1、对比例1、5、6、7、10的提供的试剂测定已知浓度在5.6ng/ml的样本,记录吸光度变化(ΔA)。检测结果见表8:
表8分析灵敏度对比实验结果
通过检测数据可知,实施例1测定试剂盒的吸光度变化与对比例1试剂盒相似,说明本发明试剂盒的具有较好的分析灵敏度。对比例5、6灵敏度较差,对比例7采用大粒径胶乳微球,灵敏度较高,对比例10尽管采用不同粒径的胶乳微球,但未添加海藻酸钠分散剂,灵敏度也是较低,因此采用不同粒径胶乳微球同时添加分散剂能协同提高试剂的分析灵敏度。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例,但是对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (4)
1.一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒由以下成分组成,该试剂盒含有试剂R1和试剂R2;
试剂R1包含以下组分:
3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液 50-200mM
氯化钠 8.5g/L
聚乙二醇6000 5g/L
硫酸葡聚糖钠盐 3g/L
EDTA-2Na 2g/L
表面活性剂 0-4g/L
叠氮钠 1g/L
试剂R2包含以下组分:
4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液 50-100mM
鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球 5-100mg/L
稳定剂 0-10 g/L
分散剂 0-5g/L
叠氮钠 1g/L
所述试剂R1的pH为6.5-8.0;所述试剂R2的pH为6.0-8.0;
所述试剂R1中的表面活性剂为磺化琥珀酸二环己酯钠盐和鼠李糖脂,且质量比为1:1;
所述试剂R2中的稳定剂为羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖,且质量比为1-3:2-3;
所述试剂R2中的分散剂为海藻酸钠。
2.一种权利要求1所述的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球的制备方法为:取适量聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球加入100mmol/L MES缓冲液中,使其胶乳微球终浓度为2%,加入2mg/ml的 N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺后重悬分散,加入8mg/ml的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDAC溶液,室温反应2小时;加入80mg/ml 的N-羟基琥珀酰亚胺溶液,4℃反应2h后离心,用100mmol/L、pH5.0的MES溶液洗涤两次;然后加入鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白单克隆抗体,在37℃孵育5小时,与胶乳微球进行偶联,形成抗体胶乳复合物;然后,加入适量的0.2%的BSA溶液在37℃条件下封闭3小时,再以12000rpm离心20分钟,去除上清,所得沉淀加入含50mmol/L的HEPES缓冲液洗涤、分散即得鼠抗人可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体包被胶乳微球。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,聚苯乙烯-甲基丙烯酸胶乳微球的粒径分别为400nm、180nm、80nm,并且三种胶乳微球的体积比例为2:3:2。
4.一种权利要求1所述的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白的浓度。
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