DE3122305A1 - "immunologisch-diagnostisches verfahren zum nachweis und zur bestimmung von antikoerpern" - Google Patents

Description

• Immunologisch-diagnostisches Verfahren zum
• Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern Die Erfindung betrifft ein immunologisch-diagnostisches Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1.
• Der Enzymimmuntest (EIA* oder auch ELISA** genannt) wurde 1971 von ENGVALL und PERLMANN und VAN WEEMEN und SCHUURS in die Immunologie eingeführt. Diese beiden Arbeitsgruppen gelangten unabhängig voneinander zu der Erkenntnis, daß ein für immunologische Tests geeignetes Enzym an Antigene bzw. Antikörper gekoppelt werden kann und daß diese Komplexe,auch Konjugate genannt, die zugleich über immunologische und enzymatische Aktivität verfügen, ähnlich wie 125 die in Radioimmuntests eingesetzten I-Konjugate, zur Durchführung immunologischer-Tests an festen Trägern verwendet werden können. Mikrotiterplatten bzw. Meßküvetten aus Kunststoff werden als Träger bevorzugt eingesetzt. Für den Nachweis spezifischer Antikörper empfehlen ENGVALL und PERL-MANN das sogenannte indirekte "Sandwich-System".
• *) EIA - enzyme immune assay **)ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay Das Prinzip dieses Tests kann dahingehend beschrieben werden, daß man in einer ersten Teststufe ein spezifisches Antigen, gegen das man Antikörper nachweisen will, an rezeptiven "sitzes des Trägers passiv adsorbieren läßt.
• Nicht gebundenes Antigen wird bei anschließender Spülung entfernt. Da in der Regel eine Sättigung des Trägers mit Antigen nicht erreicht wird, und somit die Gefahr einer passiven bzw.
• unspezifischen Adsorption von Antikörpern im späteren Testverlauf besteht, müssen die unbesetzten "sites" für diese Antikörper gesperrt werden. Dies wird erreicht, indem die mit kantigen beschichteten (sensibilisierten) Träger.sowohl vor als auch während der Behandlung mit Serum bzw. Antikörpern mit sogenannten Blockern (Hemmern? behandelt werden, die-eine sterk kompetitive Wirkung gegenüber den Immunglobulinen haben und somit die freien. Rezeptoren selbst besetzen.
• Die Sensibilisierung des Trägers mit Antigen kann auch indirekt durchgeführt werden,-indem man den Träger zuerst mit einem spezifischen Antikörper passiv beschichtet.
• In einer zweiten Teststufe werden in Anwesenheit des Blockers Antikörper zugegeben, die im Falle, daß sie spezifisch gegen das auf dem Träger befindliche Antigen ausgerichtet sind, sich mit diesem in Form von Antigen-Antikörperkomplexen vereinigen. Bei anschließender Spülung der Träger werden die nicht an spezifischen Antigen absorbierten Antikörpermoleküle entfernt. Über einen im Verlauf des Testes auftretenden Antigenverlust, dessen Höhe im direkten Verhältnis zur vorgelegten Antigendosis steht, wurde berichtet. Auch wurde bekannt, daß an den freigewordenen "sitzes unspezifische Antikörper passiv gebunden und somit in irriger Weise positive Befunde vorgetäuscht werden. Durch Zusatz des kompetitiven Blockers wird erreicht, daß die unspezifische Adsorption des Antikörpers am Antigen-Träger stark unterdrückt wird bzw. gänzlich unterbleibt.
• Die Anwesenheit der Antikörper auf dem virusbeladenen Träger wird dadurch nachgewiesen, daß in einer dritten Teststufe ein gegen den zugesetzten Antikörper gerichteter zweiter Antikörper, der mit einem Enzym gekoppelt ist, zugesetzt wird, anschließend das entsprechende Substrat hinzugefügt und das Ablaufen der Antigen-Antikörperreaktion dadurch sichtbar gemacht wird, daß das Enzym und Substrat so ausgewählt werden, daß eine deutliche bzw. meßbare Farbreaktion stattfindet.
• Auch hier wird durch Waschungen und Zusatz entsprechender Hemmstoffe eine unspezifische Adsorption des markierten Antikörpers an die Träger verhindert bzw. werden nicht an die Antigen-Antikörper-Komplexe gebundene Antikörpermoleküle entfernt.
• Der oben beschriebene bekannte Enzymimmuntest zur Bestimmung von Antikörpern wurde in den vergangenen zehn Jahren zwar bei einer großen Anzahl von Antigenen eingesetzt, er erwies sich aber als noch nicht zufriedenstellend.
• Die Genauigkeit der bisherigen Verfahren ist'unbefriedigend.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem Antikörper qualitativ und quantitativ genauer nachweisbar und bestimmbar sind.
• Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst.
• Ein spezielles vorteilhaftes Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung der Antikörper ist im Anspruch 2 angegeben. Die Konzentration der Antikörper kann auch ersetzt werden durch die Quadratwurzel des Produktes aus der Konzentration der Antikörper und der Konzentration der für die Beladung der Träger verwendeten Antigene, wobei der Meßwert y' durch den log des Quotienten aus'y' und der Antigen-Konzen£ration zu ersetzen ist.
• Beispiel: Enzymimmuntest zum Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern gegen Influenzavirus Der Enzymimmuntest wurde beispielsweise mit dem Analysator "FP-9 Analyser" der Firma Finnipipette bzw. mit dem Analysator "PR-50" der Firma Gilford durchgeführt. Die Küvetten (Träger) aus Polystyren wurden mit einem eiadaptierten Influenzavirusstamm B/England/2608/76 sensibilisiert. Das im embryonierten Hühnerei angezüchtete Virus wurde mittels der Bariumsulfatadsorptions-Technik einer Reinigung unterzogen und unmittelbar vor Beginn der Sensibilisierung in einem Sucrosegradienten bei 25.000 UpM fraktioniert. Mit Hilfe des herkömmlichen Hämmagglutinationstests (HA-Test) wurde der Antigengehalt der einzelnen Fraktionen bestimmt. Danach wurde festgestellte welche Fraktionen zusammen etwa 90 * der gesamten HA-Aktivit&t ausmachen. Diese Fraktionen wurden zusammengepcPlt (zusammengegeben) und anschließend auf die erwünschte HA-Dosis mit PBS-Puffer (pH 7,0) verdünnt. Die Beladung der Küvetten (Träger) mit Antigen erfolgte über Nacht bei 4"C. Nicht gebundenes Antigen wurde anschließend durch Spülung mit PBS-Puffer (pH 7,0) entfernt, die Küvetten dehydriert und in diesem Zustand über längere Zeit bei 40C aufgehoben.
• In diesem Enzymimmuntest wurden menschliche Serumproben mit bekannten herkömmlichen Titern (HI, ACU, KBR) gegen den Influenzavirusstamm-B/England/26O8/76 getestet. Zu Beginn der Testung wurden zuerst die mit Antigen nicht besetzten Rezeptoren der Kunststoffküvette ausgeschaltet, indem sie mit einem sogenannten Hemmer besetzt wurden, der die unspezifische Bindung von Immunglobulinen (mit dem Antigen nicht reagierende Immunglobuline vom Menschen oder-enzymmarkierte Immunglobuline vom Tier) an die antigen-freien Stellen verhindert. Als Hemmer wurde "Tween 20 (0,05 %) -BSA (1 t)" in PBS-Puffern gelöst eingesetzt. Die so präparierten Antigen-Träger wurden anschließend mit den einzelnen Verdünnungen einer geometrischen Serumverdünnungsreihe, die im gleichen Hemmer hergestellt wurde, 3 Stunden bei 370c inkubiert, ferner mit PBS-Puffer gespült und über Nacht mit einem durch alkalische Phosphatase markierten und ebenfalls im Hemmer verdünnten Antikörper (zweiter Antikörper) versetzt. Nach erneuter Spülung mit dem PBS-Puffer wurden die Küvetten mit dem in Diäthanolaminpuffer pH 9,8 gelösten Substrat Sigma 104/105 bei 370C inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde schließlich mit NaOH gestoppt. Danach wurde die Absorption des Umsatzproduktes (Reaktionsendprodukt) bei 405 nm gemessen.
• Es sollen nachfolgend die Ergebnisse einer Testung mit 23 menschlichen Serumproben mit bekanntem HI-Titer zwischen 1:48 und 1:3072 an rezent hergestellten Küvetten beschrieben werden. Je Serum wurden 10 geometrisch abnehmende Verdünnungen (ab 1:250) hergestellt; je Verdünnung wurden drei Parallelproben gemäß Anspruch 4 ausgetestet. Die sukzesive Berechnung der einander teilweise überlappenden Regressionsgeraden wurde gemäß Anspruch 5 mit den drei höchsten Verdünnungen eingeleitet, deren spezifische Absorption A>0 war.
• Die höchste Serumverdünnung mit A>0 wurde mit dSn bezeichnet.
• Für den Serumverdünnungsbereich,der die höchsten drei Verdünnungen mit A>0 aufweist, wurden die Korrelationskoeffizienten an, bn und der Endpunkttiter dNo(n) berechnet.
• Sukzesiv wurden dann die Werte an-1' bn-1' dNo(n-1)' an-2' bzw dNo(n 2) usw. ermittelt. Die Mehrzahl der Regressionsgeraden zeigte einen Korrelationskoeffizienten r>0,9.
• Die so berechneten und zugeordneten dNo-Werte zeigten eine gute Korrelation zu den herkömmlichen HI-Titern, obwohl sie zueinander in einem indirekten (umgeke"hrt proportionalen) Verhältnis stehen. Die beste Korrelation wurde an den mit 125 HA sensibilisierten Küvetten beobachtet. Die Koeffizienten der Korrelation lagen zwischen r = 0,7518 (für dSo(n)und o(n) r = 0,9439 (für dSo(n-3)) Es stellte sich heraus, daß bei etwa 90 % der getesteten Seren, trotz sehr unterschiedlichen HI-Titern' dSo-(n) stets bei der Verdünnung 1:64.000 zu finden war. Deshalb wurde für sämtliche Seren die dSO-Gruppen dSO(64000) 1 dS0(32000) 1, dSo(16000) usw. zusammengestellt und die Korrelation dieser Wertgruppen zu HI-Titern untersucht. Die Korrelationskoeffizienten lagen höher, und zwar zwischen r = 0,8064 (dSo(64000)) und r = 0,9547 (dS0(8000)).
• Anders als die dS0-Werte standen die a-Werte im indirekten Verhältnis zu den Verdünnungsbereichen (anzan~14an~2 usw.
• bder,a-64000<a32000<a16000) und im direkten (direkt proportionalen) Verhältnis zu den HI-Titern. Die Korrelationder aWerte zu HI-Titern wurde besser bei Erhöhung der Antikörperkonzentration. Die besten Ergebnisse wurden an den mit 125 HA sensibilisierten Küvetten beobachtet (r = 0,8727 für a4000) Gut korrelierbar mit den HI-Titern.waren auch die Höchstwerte für a und b, die an diesen Küvetten ermittelt wurden (r = 0,9442 für die a-Höchstwerte).
• dS - und a-Werte sowie a-Höchstwerte, die mit den HI-o Titern am besten korrelieren, wurden (gemäß Anspruch 8) als optimale Titer diesem Enzymimmuntest zugrunde gelegt. In den später entnommenen Serumproben vom gleichen Spender (Patient) wurde in der Regel'ein Anstieg oder Rücklauf dieser Werte beobachtet.
• Die nach Anspruch 10 ermittelten aLWerte, die einen, Parameter darstellen, dessen Wert ein Maß für die Affinität der Antikörper zum Antigen ist, blieben bei den meisten Spendern über längere Zeit konstant; in einigen Fällen wurde ein Rücklauf des a'-Wertes im Zweitserum beobachtet.
• Zur Ermittlung relevanter a- und b-Werte gegenüber den HI-Titern wurden nicht nur frisch beladene Küvetten, sondern auch Küvetten eingesetzt, die bis zu 60 Tage bei 40C gelagert wurden. Die an den älteren Küvetten ermittelten Befunde zeigten - wie im Anspruch 14 beschrieben, daß Änderungen in der Gesamtaktivität des beladenen Trägers vorkommen und dazu führen, daß relevante a- und b-Werte nur noch mit höherer Antikörperverdünnung zu erreichen sind.
• Versuche mit älteren Küvetten haben gezeigt, daß der optimale Serumverdünnungsbereich im Rahmen eines Vorversuchs <jcmäß der Ansprüche 9 und 15 bestimmt werden kann. AlS-optimal gilt derjenige SerumverdUnnungsbereich, der bei einem der bei den Referenzseren zum höchsten, bei dem anderen zum tiefsten a-Wert führt. Dies geht auf die Erkenntnis zurück, daß beim Auftragen (halblogarithmisch) der. a-Werte als Funktion der HI-Titer die beste Korrelation zwischen dem A-Wert und dem HI-Titer dort vorkommt, wo auch die höchste Steigung festzusteller.
• ist. Der besondere Vorteil des Vortests mit zwei Referenzseren ].iegt darin, daß für den Haupttest unbekannte Seren lediglich in demjenigen Verdünnungsbereich zu testen sind, der für die vorhandene Gesamtaktivität des Antigent:rä,gers (Küvette) als optimal gefunden wurde.

Claims (15)

1. P a t e n t a n s p r ü c h e Immunologisch-diagnostisches Verfahren zun Nachweis und zur Bestimmung'von Antikörpern mit Hilfe bestimmter (bekannter) Antigene nach dem sogenannten indirekten Sandwich-Prinzip, bei dem die Antikörper zu den auf Trägern befindlichen Antigenen gegeben werden, die die Antikörper binden, bei dem ein zweiter Antikörper zugesetzt wird, der gegen den ersten Antikörper gerichtet und markiert ist und mit dem an das Antigen gebundenen Antikörper reagiert, und bei dem die an das Antigen gebundenen Antikörper über eine biochemische, chemische oder physikalische Aktivität der Markierung nachgewiesen werden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t daß die Antikörper einer zur Testung vorliegenden Flüssigkeit (Serum, Liquor, Urin, usw.) in an sich bekannter Weise in eine geometrische Verdünnungsreihe überführt werden, daß die einzelnen Verdünnungen-zu den auf den Trägern befindli-(y) chen Antigenen gegeben werden, daß der Wert einer der spezifischen Aktivität der Markierung zugeordneten physikalischen Meßgröße (z.B. Absorption) am Reaktionsendprodukt gemessen wird, daß der spezifische Wert der Meßgröße für die einzelnen Reaktionsendprodukte ermittelt wird, derart, daß der Reaktionsbackground (yR) durch eine Spezifizitätskontrolle nur mit dem markierten zweiten Antikörper ermittelt wird, d..h. eine Messung ohne Zugabe des Antikörpers durchgeführt wird, der vom Antigen gebunden wird, und der gemessene Reaktionsbackground (YR) von den Meßwerten (y) substrahiert wird spezifischen und daß aus den so erhaltenen Meßwerten (y'-; mit y' = y -ein Endpunkttiter (dN o) für y = 0 ermittelt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Meßwerte (y') als Funktion der Konzentration (x) der Antikörper, die vom Antigen gebunden werden, gemäß der Verdünnungsreihe-nach der Gleichung = = alog x + b aufgetragen werden, wobei a und b Koeffizienten der Regression (a für Anstieg und b für Verschiebung) sind, und daß der Endpunkttiter (dNo) nach Berechnung-der Regression ermittelt wird, wobei ist
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1.oder 2, d a du r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß der zweite Antikörper ein enzymmarkierter Antikörper ist.und daß als physikalische Meßgröße die Absorption der Reaktionsendprodukte (Substratumsatzes) photometrisch gemessen wird.
4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n.n z e i c h n e t , daß zur Einengung der Fehlerbreite Messungen an mehreren Parallelproben je Verdünnung durchgeführt werden.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, d a -d u r c h g e k e n n 2 e i c h n e t , daß im Bereich der Kurven der Funktion y' anlog x + b mehrere einander teilweise überlappende Regressionsgeraden sukzessiv berechnet werden, daß für die Berechnung der Regressionsgeraden die spezifischen Absorptionswerte (A-Werte) von jeweils drei aufeinanderfolgenden abnehmenden Verdünnungen der Verdünnungsreihe eingesetzt werden und daß für diese Berechnung mit den kleinsten A-Werten begonnen wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die berechneten a-, b-und dNO-Werte nach den jeweiligen drei aufeinanderfolgende abnehmende Verdünnungen aufweisenden Verdünnungsbereichen geordnet werden und daß die Korrelation der so geordneten Werte zu durch herkömmliche Verfahren ermittelten Titerwerten bestimmt wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d a -d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Korrelation der Höchstwerte für a und b zu herkömmlich ermittelten Titerwerten bestimmt wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die a-, b- und dNO-Werte mit der höchsten Korrelation zu den Titerwerten herkömmlicher Verfahren ermittelt werden und als (optimale)-Titerwerte dem Enzymimmuntest zugrunde gelegt werden.
9. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden.Ansprüche,-d ad u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Testung (Haupttest) mit nur drei aufeinanderfolgenden geometrisch steigenden Verdünnungen der Antikörper enthaltenden Flüssigkeit durchgeführt wird und für die Wahl des optimalen Verdünnuncjsbereiches ein Vortest mit zwei Antikörper enthaltenden Flüssigkeiten (Referenzproben) unternommen wird, wobei derjenige Verdünnungsbereich der Referenzproben als optimaler Verdünnungsbereich für den Haupttest genommen wird, der die höchste Differenz zwischen den a-Werten zeigt.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d-ad u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die mit Erhöhung der Antikörper-Konzentration in der Verdünnungsreihe zunehmenden a-Werte als Funktion des Mittelwertes dN aus den Werten des zugeordneten Verdünnungsbereiches nach der Gleichung a = anlog dN + b aufgetragen werden, wobei der Regressionskoeffizient a' den Anstieg der Geraden angibt und somit ein Parameter ist, dessen Wert ein Maß für die Affinität (Qualität) der Antikörper zum Antigen ist.
11. 11. Verfahren zur Herstellung von antigen-sensibilisierten Trägern, z.B. für das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Träger mit Antigenen oder mit freie Antigendeterminanten afweisencen Antigen-Antikörper-Komplexen sensibilisiert werden, wobei die Antigene bzw. die Antigen-Antikörper-Komplexe vom Träger selbst oder von einem am Träger gebundenen Antikörper gebunden werden.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Sensibilisierungsdosis, d.h. die zur Sensibilisierung bzw; Beladung der Träger vorgelegte Dosis Antigen, so gewählt wird, daß Titerwerte mit hoher Korrelation zu herkömmlich ermittelten Titerwerten und signifikante Werte für den Regressionskoeffizienten a' erhalten werden.
13. 13. Verfahren zur Herstellung von Antigen-Trägern nach Anspruch 11 oder 12, d a d u r c h g e k e n n z'e i c h -n e t , daß die sensibilisierten beladenen Träger dehydriert werden.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß der bei den dehydrierten Trägern mit der Zeit eintretende Abbau der Gesamtaktivität des beladenen Trägers dadurch kompensiert wird,-daß die Antikörper-Konzentration (Proben-Verdünnungsbereich) an die verringerte Aktivität angepaßt wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, d a d u r c h g e -k e n z e i c h n e t , daß der für die angepaßte Antikörper-Konzentration optimale Verdünnungsbereich in einem Vorversuch gemäß Anspruch 9 ermittelt wird.