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Hintergrund
der Erfindung
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Für gewöhnlich werden
in Tests verschiedene analytische Verfahren und Vorrichtungen verwendet,
um die Gegenwart und/oder Konzentration von klinisch bedeutsamen
Substanzen zu bestimmen, die in biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Urin,
Vollblut, Plasma, Serum, Schweiß oder
Speichel, vorhanden sein können. Diese
Substanzen werden üblicherweise
als Analyten bezeichnet und können
spezielle Bindungspartner umfassen, z.B. Antikörper oder Antigene, Medikamente
und Hormone. Eine Art von Testvorrichtung ist der so genannte Teststreifen,
der Enzyme enthält,
die mit dem Analyten wechselwirken und zwar auf eine Art und Weise, die
zur Oxidation eines Redoxfarbstoffs führt, um eine Farbveränderung
zu bedingen, die mit der Gegenwart oder bei semi-quantitativen Verfahren
mit der Konzentration des Analyts in der Flüssigkeitsprobe korreliert werden
kann. Eine neuere Entwicklung sind Teststreifen, die nach dem Prinzip
der Immunchromatographie funktionieren, bei welcher markierte, für den Analyten
spezifische Antikörper
auf einen Streifen absorbierenden Materials aufgetragen werden,
wodurch die Testflüssigkeit
und markierte Antikörper
aufgrund der Kapillarität fließen können. Durch
das Immobilisieren des Analyts (oder eines Analogons davon) in einem
speziellen Bereich des Streifens, d.h. der Einfangzone, und durch
die Messung der Menge eines markierten Antikörpers, der durch spezifische
Bindung eingefangen wird, kann die Konzentration des Analyts in
der Testprobe semi-quantitativ bestimmt werden. Diese Testart, bei
welcher die Markierung ein Enzym ist und ein Substrat für das Enzym
in der Einfangzone platziert ist, um eine Farbreaktion bereitzustellen,
wird in U.S.-Patent Nr. 4.446.232 detaillierter beschrieben. In
U.S.-Patent Nr. 4.703.017 wird ein ähnlicher Test beschrieben,
in welchem die Markierung ein partikuläres Material ist, welches nach
Aggregation in der Einfangzone aufgrund der spezifischen Bindung
zwischen dem immobilisierten Analyt und dem mit Teilchen markierten
Antikörper
eine sichtbare detektierbare Reaktion bereitstellt.
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Der
klinische Nutzen von Analysen auf verschiedene Analyten kann durch
die Bestimmung der Konzentration eines zweiten Analyts verstärkt werden,
dessen Konzentration in der biologischen Flüssigkeit klinisch mit jener
des ersten Analyts in Be ziehung steht. Das bemerkenswerteste Beispiel
für den
zweiten Analyten ist Kreatinin, der Endmetabolit bei Umwandlung
von Kreatin in Kreatinphosphat, welches als Energiequelle für die Muskelkontraktion
verwendet wird. Das produzierte Kreatinin wird von den Nierenglomeruli
filtriert und dann ohne Reabsorption in den Urin ausgeschieden.
Um die Empfindlichkeit von Urintests zu erhöhen und das Problem hoher Urin-Durchflussraten
zu minimieren, das Urinverdünnung
bedingt, werden in Urinproteintests Analyt/Kreatin-Verhältnisse
eingesetzt, um die Urinkonzentration zu normalisieren. Bekannte
Kreatinintests umfassen das alkalische Jaffe-Verfahren und das Benedict-Behre-Verfahren,
die bei hohem pH-Wert, typischerweise im Bereich von 11,5 bis 12,5,
durchgeführt
werden. Kürzlich
ist ein Kreatinintest entwickelt worden, bei welchem die Urinprobe
in Gegenwart von Citrat, einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren
Farbstoff, welcher in Gegenwart von Sauerstoffradikalen und einem
Pseudoperoxid eine Farbreaktion bereitstellt, mit Kupfer(II)-inen
kontaktiert wird. Die quantitative Bestimmung von Kreatinin kann
auch immunologisch erfolgen, wie in WO 96/34271 beschrieben. Diese
zweiten Analyten, deren Konzentration in der Körperflüssigkeitsprobe klinisch mit
der Konzentration des ersten Analyts verbunden ist, sind weder auf
Kreatinin im Urin beschränkt, noch
ist Urin die einzige Körperflüssigkeit,
die mithilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung getestet
werden kann. Es kann also z.B. die getestete Körperflüssigkeit Vollblut und der erste
Analyt HbA1c und der zweite Analyt Gesamthämoglobin
sein, da die offensichtliche HbA1c-Konzentration an
die Konzentration des Gesamthämoglobins
im Vollblut angepasst werden kann, um Abweichungen im HbA1c-Test
auszuschließen.
Intravenös
verabreichtes Inulin ist wie Kreatinin ein Indikator für den renalen
Fluss. Typische andere erste Analyten, die in Zusammenhang mit Kreatinin
als zweitem Analyten getestet werden können, sind okkultes Blut, Leukozyten,
Protein und Glucose. Die IgG-Konzentration
im Urin kann basierend auf Albumin als zweitem Analyten korrigiert
werden.
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WO
96/34271 offenbart eine Vorrichtung zur Bestimmung eines (ersten)
Zielanalyts und Kreatinin in einer Flüssigkeitsprobe, wobei diese
Vorrichtung über
einen Teststreifen zur Detektion von Kreatinin und einen zweiten
Teststreifen zur Detektion des Zielanalyts verfügt. Die Kreatininkonzentration
kann kolorimetrisch oder mithilfe des spezifischen Einfangens markierter
Kreatinin-Bindungspartner bestimmt werden. Die Konzentration des
Zielanalyts wird basierend auf der Konzentration der Probe korrigiert,
wobei diese Korrektur entweder manuell oder mithilfe eines vorprogrammierten
Reflexionsvermögensmessers
durchgeführt
werden kann.
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Die
Systeme nach Stand der Technik zur Korrektur der Bestimmung der
Konzentration eines ersten Analyts basierend auf der Konzentration
des zweiten Analyts umfassen entweder die direkte Bestimmung des Verhältnisses
der Farbreaktion des ersten Analyts zu jener des zweiten Analyts
oder zuerst das Konvertieren der Farbreaktionen in Konzentrationswerte
und die arithmetische Bestimmung des Verhältnisses dieser Werte. Die
direkte Festlegung der Verhältnisse
der Farbreaktionen erfolgt durch das Konvertieren von Farbe in numerische
Werte, wie z.B. Absorptionsvermögen
oder Reflexionsvermögen.
Diese direkten Verhältnisverfahren
zur Korrektur semi-quantitativer Ergebnisse von Analytenbestimmungen
sind von der Einschränkung
betroffen, dass sie keine großen
Fehler bei den Berechnungen berücksichtigen,
die auftreten, sobald ein Verfahren das Ende seines analytischen
Bereichs erreicht. Die vorliegende Erfindung erhöht die Genauigkeit semi-quantitativer
Verfahren, in welchen das Verhältnis
zweier Analyten bestimmt wird, indem Fehler in der Berechnung berücksichtigt
werden, die auftreten, sobald ein Verfahren das Ende seines analytischen
Bereichs erreicht.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein in Anspruch 1 definiertes Verfahren.
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Beschreibung der Erfindung
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Der
erste Schritt bei der Ausführung
der vorliegenden Erfindung dient dazu, die unkorrigierte Albuminkonzentration
zu bestimmen. Dies kann durch Auftragen der Flüssigkeitsprobe auf einen Teststreifen
erfolgen, entweder im Falle einer Enzymreaktion direkt auf jenen
Abschnitt des Streifens, auf welchem sich die Reagenzien befinden,
oder im Fall eines immunchromatographischen Streifens auf ein Probenapplikationspad,
das in fluider Verbindung mit der Einfangzone des Teststreifens
steht, sodass die Probe durch Kapillarwirkung in die Einfangzone
fließen
kann. In jedem Fall kann die Farbänderung, die durch die Wechselwirkung
des Analyts in der Testflüssigkeit
mit den Reagenzien des Streifens verursacht wird, durch einen Vergleich
der Farbe mit einer Standard-Farbenskala oder genauer mithilfe eines
Reflexionsvermögensmessers
manuell abgelesen werden.
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Sobald
die unkorrigierte Albuminkonzentration bestimmt ist, wird im nächsten Schritt
sichergestellt, ob diese Konzentration innerhalb des nutzbaren analytischen
Bereichs für
diesen Analyten liegt. Der Terminus „nutzbarer analytischer Bereich" gibt jene Analytkonzentrationen
an, welche das Verfahren exakt messen kann. Der nutzbare analytische
Bereich ist 30 bis 300 mg/l basierend auf dem wesentlich kleineren
Fehler bei der Berechnung, d.h. zumindest dreimal kleiner als der
Konzentrationsbereich des gemessenen Analyts. Wenn die Bestimmung
von Albumin als erstem Analyt innerhalb dieses Bereichs liegt, wird
Kreatinin bestimmt und das Verhältnis
von Albumin zu Kreatinin, d.h. [Albumin]/[Kreatinin], berechnet,
um einen Ausgabewert bereitzustellen, dessen Wert für die korrigierte
Konzentration von Albumin in der Urinprobe steht.
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Wenn
die unkorrigierte Albuminkonzentration außerhalb des nutzbaren analytischen
Bereichs liegt, z.B. unter 30 mg/l oder über 300 mg/l, dann wird die
normale Kreatininkonzentration dazu verwendet, das Verhältnis von
Albumin zu Kreatinin zu bestimmen. Der Terminus „normale Konzentration" soll den erwarteten physiologischen
Wert beschreiben, der bei typischen gesunden Patienten erhalten
wird. Im Fall von Kreatinin beträgt
dieser Wert 1.000 mg/l, da der Körper
typischerweise 1.000 mg Kreatinin und 1 Liter Urin pro Tag ausscheidet.
Dies ist gegensätzlich
zu jenen Verfahren zur Verhältnisbestimmung
nach dem Stand der Technik, bei welchen die bestimmte, und nicht
die normale, Kreatininkonzentration sogar in jenen Fällen verwendet wird,
in welchen die Albuminkonzentration außerhalb des nutzbaren Bereichs
liegt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt größere Präzision bei
der Bestimmung der Albuminkonzentration bereit, da ungenau bestimmte
Werte nicht den zusätzlichen
zum Ergebnis addierten Fehler aufweisen dürfen.
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Das
Verfahren zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
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Allgemeines Beispiel:
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Bei
einer Urinanalyse, bei welcher Albumin bestimmt und Kreatinin verwendet
wurde, um den renalen Fluss zu korrigieren, wurde ein vorgegebener
Bereich von 30 mg/l bis 300 mg/l Albumin, der für einen Urinalbumintest nutzbare
analytische Bereich, festgelegt. Wenn das Albuminreagens ein kolorimetrisches
Ergebnis zur Folge hat, das 30 bis 300 mg/l entspricht, wird unter
Einsatz des Verhältnisses
der produzierten Farbwerte (Albuminfarbwert/Kreatininfarbwert) ein
Verhältnis
Albumin zu Kreatinin bestimmt. Wenn das Albuminreagens ein Ergebnis
unter 30 mg/l oder über
300 mg/l produziert, wird ohne Einsatz des Kreatininreagens mithilfe
einer normalen Kreatininkonzentration ein Verhältnis Albumin zu Kreatinin
bestimmt. Dies vermeidet die Verwendung von Ergebnissen, die außerhalb
des analytischen Bereichs für
einen Albumintest liegen, da Ergebnisse außerhalb dieses Bereichs große Fehler
aufweisen und ungenau sind. Es ist wohlbekannt, dass Ergebnisse, die
außerhalb
des analytischen Bereichs liegen, mit Messungenauigkeit entweder
unter 30 mg/l oder über
300 mg/l liegen, was eine aus medizinischer Sicht wichtige Information
ist.
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Wenn
das Albuminreagens ein Ergebnis zwischen 30 mg/l und 300 mg/l produziert,
wird ein Verhältnis bestimmt,
indem das Ergebnis, welches dem vom Albumin in der Testprobe gebildeten
Farbwert entspricht, durch das Ergebnis, das dem vom Kreatininreagens
gebildeten Farbwert entspricht, dividiert wird. Das Farbverhältnis wird
dann in das Verhältnis
der Konzentration von Albumin zu Kreatinin konvertiert, indem für einen speziellen
Grad des Farbverhältnisses
ein Ausgabewert bestimmt wird, der mithilfe eines gut programmierten Reflexionsspektrometers
erreicht werden kann.
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Wenn
die Albuminkonzentration unter 30 mg/ml beträgt, wird ein Schwellenwert
von unter 30 mg/g festgelegt, der für 30 mg Albumin pro Gramm Kreatin
steht. Unter 30 mg/g werden als ein für eine gesunde Person normales
Verhältnis
angesehen. Ein geringeres Ergebnis wie z.B. 20 oder 10 mg/g ändert dies
nicht, da der Schwellen wert alle Werte unter 30 mg/g repräsentiert.
Wenn die Albuminkonzentration jedoch über 300 mg/l liegt, wird ein
Schwellenwert von über
300 mg/g festgelegt, der alle Werte über 300 mg/g repräsentiert. Die
Ergebnisse unter 30 mg/g und über
300 mg/g werden hierin als Ergebnisse bezeichnet, die außerhalb
der Grenzen liegen.
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Es
ist allgemein bekannt, dass Farbwerte nicht nur innerhalb eines
bestimmten Absorptionsbereichs, typischerweise unter 1,0 bis über 0,1
Absorptionseinheiten oder über
10% bis unter 99% Reflexion, gemessen werden können. Aus diesem Grund sind
Spektralphotometer und Reflektometer typischerweise so programmiert,
dass sie der Farbe, die außerhalb
des Bereichs liegt, die nächstliegende
Farbe zuordnet, die das Messgerät
messen kann. Zum Beispiel wird eine Reflexion von 7% als eine Reflexion
von 10% gelesen, und dieser Wert wird bei der Bestimmung verwendet.
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In
Tabelle 1 ist eine Probenberechnung dargestellt, die zeigt, dass
das vorliegende Verfahren eine größere Übereinstimmung des Albumin-
und des Kreatininreagens zeigt als das Verhältnis, welches mithilfe der beiden
Verfahren nach dem Stand der Technik erhalten wurde. TABELLE
1
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Mithilfe
von Tabelle 1 kann festgestellt werden, dass mit dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung eine größere Genauigkeit
im Test erreicht werden kann als mit einfacher Division oder einem
Farbverhältnisverfahren,
welches die außerhalb
der Grenzwerte liegenden Ergebnisse nicht ausschließt.
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Die
folgenden Beispiele umfassen Urinstreifenreagenzien, die typischerweise
kolorimetrische Tests einschließen,
deren Farbwerte visuell oder instrumentell als Reflexions- oder
Absorptionsvermögen
abgelesen werden. Der produzierte Farbwert ist direkt proportional
zur Analytenkonzentration. Im Fall von Albumin liegt umso mehr Albumin
in der Urinprobe vor, je mehr Albuminreagenzfarbe gebildet wird.
Um einen Farbwert in Analytenkonzentration zu konvertieren, wird
einem speziellen Farbgrad ein Ausgabewert zugeordnet. Den Ausgabewerten
eines Analyts wird ein Konzentrationsbereich zugeordnet, welcher
den typischen Berechnungsfehler anzeigt. Dies ist ein für alle Urinreagensstreifen
typisches Verfahren und ist in der folgenden Tabelle 2 für Albumin-
und Kreatininreagenzien dargestellt. Zum Beispiel kann eine klinische
Probe mit einem Wert von 30 mg/ml Albumin mittels Standardverfahren
20 bis 39 mg/l, bestimmt mithilfe der Farbe des Albuminstreifens,
betragen, dieser Probe würde
aber trotzdem eine Albuminkonzentration von 30 mg/l zugeschrieben
werden. Je kleiner der Berechnungsfehler, desto quantitativer das
Verfahren.
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Beispiel
1 – Verfahren
zur Festlegung des Verhältnisses
zweier Analyten nach Stand der Technik
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Das
häufigste
Verfahren zur Festlegung des Verhältnisses zweier Analyten ist
die Verwendung einer Tabelle, von der Werte abgelesen werden können (Tabelle
3, siehe unten). TABELLE
3 Tabelle des Verhältnis
mg Albumin/Gramm Kreatinin: zugeteilter Ausgabewert
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Jeder
Kombination aus Ausgabewerten der Teststreifen wird ein erwarteter
Verhältnis-Ausgabewert zugeordnet.
Das erwartete Verhältnis
der Ausgabewerte basiert auf der in Tabelle 4 dargestellten Division
des Durchschnittsergebnisses jedes Teststreifens. TABELLE
4 Tabelle des Verhältnisses
mg Albumin/Gramm Kreatinin: Durchschnittswert der Division jedes Streifens
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Dieses
Verfahren führt
einen Fehler ein, da jeder durchschnittliche Ausgabewert einen erwarteten
Bereich repräsentiert
und die Extremwerte der erwarteten Bereiche nicht immer mit der
zugeteilten Leistung übereinstimmen.
Zum Beispiel zeigen 30 mg/l Albumin einen geringen Extremwert von
19,9 mg/l und 100 mg/dl Kreatinin einen hohen Extremwert von 150
mg/dl. Der für
diese Extremwerte erwartete Ausga bewert beträgt 13 mg/g, was nicht innerhalb
des zugeordneten Bereichs von 30–299 mg/g liegt. Diese fehlerhafte
Zuordnung wäre
ein falsches Verhältnisergebnis,
sogar bei 100%iger Übereinstimung
der Reagenzien mit den Standardverfahren.
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Der
Fehler dieses Verfahrens wird in der folgenden Funktionstabelle
dargestellt, in welcher die Ergebnisse der Teststreifen mit Standardwerten
von 275 klinischen Proben verglichen werden. Der Bereich der klinischen
Proben, die einem bestimmten Streifenausgabewert von Albumin zu
Kreatinin zugeordnet ist, ist weit größer als der erwartete Konzentrationsbereich,
der dieses Verfahren ungenau und wirkungslos macht. Die Gesamtzahl
der korrekten Ergebnisse für
zwei Ausgabewerte, d.h. unter 30 mg/g und über 30 mg/g, beträgt 70 %
(86 und 109 von 225), wobei mehr als 35 der Proben mit > 30 mg/g falsch zugeordnet
wurden, wie durch die 76 Ergebnisse der 185 Gesamtergebnisse, die
mittels Streifen über
30 mg/g und mittels Standardverfahren unter 30 mg/g betragen, bestimmt
werden kann.
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Funktionstabelle
zur Verhältnisbestimmung
mithilfe des Verfahrens aus Beispiel 1
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Beispiel
2 – Ein
weiteres bekanntes Verfahren nach dem Stand der Technik zur Bestimmung
des Verhältnisses
zweier Analyten ist die Konversion des Ergebnisses jedes einzelnen
Reagens in Konzentrationen des zu detektierenden Analyts. Diese
Konversion wird durch den Vergleich einer Standardprobe, die über eine bekannte
Konzentration verfügt,
mit einer unbekannten Probe durchgeführt. Der unbekannten Probe
wird in Bezug auf die Farbwertdifferenzen der beiden Proben eine
Konzentration zugeordnet. Die Konzentrationen der Analyten können dann
dividiert werden, um ein Konzentrationsverhältnis herzustellen. Dieser
Ansatz ist in kolorimetrischen Test verfahren, die einen hohen Grad
an Genauigkeit aufweisen, sehr häufig.
Die Verwendung dieses Verfahrens gemeinsam mit kolorimetrischen
Testverfahren, die einen geringeren Genauigkeitsgrad aufweisen,
z.B. Urinteststreifenverfahren, hat jedoch einen Nachteil, da kolorimetrische
Verfahren einen kleineren analytischen Bereich abdecken als Lösungsverfahren,
die eine Verdünnung
und zeitlich abgestimmte Hinzufügung
von Reagenzien ermöglichen,
um Interferenzen einzuschränken,
welche die Fehlerhäufigkeit
erhöhen. Diese
quantitativen Verfahren verfügen über analytische
Bereiche, die über
die Konzentrationen, von denen erwartet wird, dass sie auftreten,
hinausgehen.
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Die
Ergebnisse dieses Verfahrens der Verhältnisbestimmung sind wie in
der folgenden Tabelle 5 dargestellt nur geringfügig besser als die des in Beispiel
1 diskutierten Verfahrens. Die Gesamtzahl der korrekten Ergebnisse
für zwei
Ausgabewerte beträgt
79% ((125 + 93)/275 = 0,79).
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TABELLE
5 Funktionstabelle
zur Verhältnisbestimmung
mithilfe des Verfahrens aus Beispiel 2
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BEISPIEL 3
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verhältnisbestimmung nützt das
dividierte Ergebnis jenes Farbwerts, der durch zwei Reagenzien gebildet
wird, in Kombination mit den von den einzelnen Reagenzien gebildeten
Farbwerten.
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Anfänglich wird
der Farbwert des Reagens, das empfindlich auf Albumin reagiert,
in die Albuminkonzentration konvertiert, d.h. einem speziellen Farbgrad
wird ein Ausgabewert zugeordnet. Der Ausgabewert wird untersucht,
und wenn dieser Wert außerhalb
des nutzbaren analytischen Bereichs liegt, wird dieser dazu verwendet,
unter Einsatz des Normalwerts von Kreatinin ein Verhältnis zuzuordnen.
Zum Beispiel wird einem Albuminreagens, das ein Ergebnis von unter
30 mg/l oder über
300 mg/l Urin produziert, ein Ausgabewert zugeordnet, ohne auf das
Ergebnis des Kreatininreagens Bezug zu nehmen und stattdessen den
normalen Kreatininwert von 1000 mg/l einzusetzen. Albumin in einer
Konzentration von unter 30 mg/l wird ein Verhältnis von < 30 mg/g zugeordnet, und Albumin in
einer Konzentration von über
300 mg/l wird ein Verhältnis
von > 300 mg/g zugeordnet.
Diese Zuordnung geht von einer durchschnittlichen Kreatininexkretion
von 1.000 mg/l aus. Wenn der Ausgabewert des ersten Analyts innerhalb
des nutzbaren analytischen Bereichs liegt, wird der Farbwert, der
vom Reagens gebildet wird, welches gegenüber dem ersten Analyt empfindlich
ist, durch den Farbwert dividiert, der vom Reagens gebildet wird,
das gegenüber
dem zweiten Analyt empfindlich ist. Das Verhältnis der Farbwerte wird dann
in eine in Tabelle 6 dargestellte Verhältniskonzentration konvertiert. TABELLE
6
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Zum
Beispiel wird einem Albuminreagens, das ein Ergebnis von 80 mg/l
produziert, basierend auf dem Farbverhältnis von Albumin- und Kreatinreagenzien
ein Ausgabewert zugeordnet, bei welchem einem Farbverhältnis von
1,7 ein Ausgabewert von 30–300
mg/g zugeordnet wird.
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Die
folgende Tabelle 7 zeigt, dass dieses Verfahren größere Übereinstimmung
als jedes andere der zuvor beschriebenen Verfahren aufweist. Die
größere Übereinstimmung
ist auf das Ausschließen
des größeren Fehlers
zurückzuführen, der
oft bei einem Reagens an den beiden Enden des Ausgabebereichs, d.h.
beim Überschreiten
des geringsten oder höchsten
Ausgabewerts, zu beobachten ist. Ergebnisse außerhalb des analytischen Bereichs
weisen große
Fehler auf und sind ungenau. Sowohl der geringste als auch der höchste Ausgabewert
oder beide können
für jedes
beliebige Reagenz, dessen Verhältnis
zu bestimmen ist, ausgeschlossen werden. In Tabelle 7 beträgt die Gesamtzahl
der korrekten Ergebnisse für
zwei Ausgabewerte, d.h. unter 30 mg/g oder über 30 mg/g, 95 %. Dies kann
mithilfe der Division der Zahl der korrekt bestimmten Proben (149
+ 112) durch 275, der Gesamtzahl der Proben, bestimmt werden. TABELLE
7 Funktionstabelle zur Verhältnisbestimmung
mithilfe des Verfahrens aus Beispiel 3
