TW591230B - Method for improving the accuracy of the semi-quantitative determination of analyte in fluid samples - Google Patents

Description

591230 五、發明說明（l) 在測定可存在於生物流體中的臨床徵候物質之存在及/ 或濃度的分析中，通常使用各種分析步驟和裝置，該生物 流體為，例如，尿液、wh〇l e bl 〇〇d、血漿、血清、汗液 或唾液。此種物質通常被認為係分析物，並且可包括特異 結合夥伴，例如，抗體或抗原，藥品和荷爾蒙。一種試驗 裝置為所謂的浸量尺，其包含酶，該酶與分析物互相作 用’並將以產生使顏色改變之氧化還原染料的氧化作用之 方式與其反應，該顏色改變可與流體樣品中分析物的存在 或農度（在半定量方法中）有關。近來，曾發展出一種基於 免疫色層分離法原理操作的試驗條，在其中，標記抗體、 稱為分析物）係施用在吸收性物質條上，經由該吸收性物 質’試驗流體和標記抗體可藉由毛細作用流動。藉由條之 特，部份（即，捕掠區域）中的固定分析物（或其類似物^ 測量被特異結合物捕獲的標記抗體量，試驗樣品中的分 物濃度可半定量地測定。這種其中的標記物為酶且在 區域内置有能提供染色回應之受質的分析，非常完整地= 明於美國專利說明書4, 446, 232。在美國專利說明書 見 4，7 〇 3，0 1 7中说明的為一種類似分析，其中標記物為一 特殊物質，一旦該物質因固定分析物和顆粒標記抗體之 的特異結合力，而在捕掠區域内聚集時，其會提供一 見且可察覺之回應。 可 不同分析物之分析的臨床有效性可由測定第二種分 沒度來增加，該第二種分析物在生物流體中之濃度與 種分析物濃度有臨床關係。第二種分析物之最著名實例為

591230 五、發明說明（2) 肌酸酐，一種末端代謝物，當肌酸成為磷酸肌酸時，其被 使用作為肌肉收縮的能量來源。所產生之肌酸酐被腎臟絲 球體過濾，然後接著未再度被吸收，即排出成為尿液。為 增加尿液分析之靈敏度和使會導致尿液稀釋的尿液高流速 問題減至最小，所以在尿液蛋白質分析中使用分析物/肌 酸比例，來使尿液濃度正常化。普通的肌酸酐分析包括驗 性傑弗和班尼迪克-比贺（Jaffe and Benedict-Behre) 法，其係在高pH(通常在11·5至12·5範圍）下進行。最近， 發展出一種肌酸酐分析法，其中尿液樣品係在檸檬酸鹽。 一種氫過氧化物和一種可氧化染料的存在下，與銅離子接 觸，該可氧化染料係在氧游離基和假過氧化物存在下提供 染色回應。如W0 96/34271中說明的，肌酸酐定量作用亦 可免疫地完成。這些第二種分析物（其在體液中之濃度與 第一種分析物濃度有臨床關係）既不限於尿液中的肌酸針 也不限於尿液（可由本發明之方法分析的唯一體液）。因-此，例如，被測試的體液可為whole bi00d，而由於HbA 之視農度可調整為who 1 e bl 〇〇d’ s的總血色素，以校正 HbAlc分析中的偏差，所以第一種分析物可為，同 二種分析物為總血色素。類似於肌酸酐，菊粉（靜脈 為腎臟流的指示劑。其他可與作為第二 。酸、 同時分析的第-種分析物代表有隱血、： 葡萄糖。尿液中的IgG濃度可以作蛋白質和 素為基礎來校準。 了種分析物之蛋白 在㈣―96/3427 1中揭示的係一種測定目標（第一種）分析 C:\Program Files\Patent\55090.ptd 第 6 頁 591230 五、發明說明（5) 1 ----- I 士二，疋出第種分析物之未校正過濃度，接著的步驟 二確定是否該濃度在該分析物有效分析範圍之内。用語π 效分析Ι&圍”係指方法能夠精確㈣定的分析物濃度。例 所’在尿液中蛋白素的情形下，卩比估算的分析物濃度實 二士小（即，士少小三倍）的估算誤差為基礎的有效分析範 士3 0至Μ0毫克/升。如果做為第一種分析物之蛋白素的 測疋在該範圍之内，則測定第二種分析物（通常係肌酸酐） 並計算第一種分析物對第二種分析物之比（即，[蛋白 素]/[肌酸酐])，以提供測出水平，其之值表示尿液試驗 樣品中蛋白素的校正過濃度。 如果第一種分析物之未校正過濃度在該有效分析範圍之 外（即，小於3〇毫克/升或大於3〇〇毫克/升蛋白素），則不 測定第二種分析物濃度，但使用第二種分析物之正常濃度 f取代測定第一種對第二種分析物之比。用語”正常濃度,， 意指得自典型健康病人的預期生理學值。在肌酸酐的情形 中’該值為1,000毫克/升，因為人體通常每天排泄 毫克肌酸針和1升尿液，這和過去此藝之成比例法相反， 在該方法中’即使當第一種分析物濃度被測定出在有效分 析範圍之外時，仍使用第二種分析物之測出濃度，而不是 正常濃度。因為不允許不精確測定的值將額外的誤差加到 結果中，所以本發明之方法，在測定第一種分析物濃度 時，提供最大的精破度。 藉由下列實例進一步例舉說明實行本發明的方法。 一般實例

C:\Program Files\Patent\55090. ptd 第9頁 591230 五、發明說明（6) 在蛋白素為第一種分 濃度係為了，例如，;為第二種分析物(其 中，所選定的預先測定過測f的尿液分析法 蛋白素，其係尿液蛋白 23〇宅克/升至綱毫克/升 素試劑的比色結果等於3(^ 古有效分析範圍。如果蛋白 st Μ 0 hl· r ^ ^ ^ 、 〇 〇耄克/升，則可使用所產生 酐比。如果IΛ顏=肌酸野顏色）來選定蛋白素對肌酸 3〇〇 Μ广劑產生的結果小於30毫克/升或大於 、農Λ空:二Γ吏用肌酸酐試齊!，而藉由使用正常肌酸 疋蛋白素對肌酸酐比…方止在蛋白素分析之分 析範，之外的結果被使，因為在該範圍之外的結果有大 η ’幻糸不精確的。已知在分析範圍之外的具有精確 又之釔果為小於30毫克/升抑或大於3〇〇毫克/升，這係醫 學上重要的訊息。 _ 如果蛋白素試劑產生的結果在3〇毫克/升和3〇〇毫克/升 之間，則藉由使相應於由試驗樣品中蛋白素所產生之顏色 的結果除以相應於由肌酸酐試劑所產生之顏色的結果，來 選定比例。接著藉由選定顏色比例的比度（一種可藉由正 確汁劃過的反射比分光计來完成的測出水平）而使顏色比 轉變成蛋白素對肌酸酐的濃度比。

如果蛋白素濃度小於3 0毫克/升，則選定的極限值小於 30毫克/克，其表示每克肌酸酐有30毫克蛋白素。小於3〇 爱克/克被适為係健康人士的正常比。較低的結果（例如， 20或10¾克/克）不會改變其’因為極限表示所有值皆小於 30毫克/克。相反地，如果蛋白素濃度大於300毫克/升，

C:\Program Files\Patent\55090. ptd 第10頁 591230 五、發明說明（7) · 則選定的極限值大於30 0毫克/克，其表示所有的值皆大於 3〇〇毫克/克，小於30毫克/克和大於300毫克/克的結果在 此被認為在結果的權限外。 通常認為僅能測出在某些吸收比範圍之内的顏色，該範 圍通常為小於1· 〇至大於〇·1吸收比單位或大於1〇%至小於 99%反射比。因此，分光光度計和反射比計通常要預先設 _ 定以選定在該範圍之外的顏色，即測量計能測量的最接近 -顏色。例如，7%反射比被讀成1 〇%的反射比，同時在測定 作用中使用的就是該值。 樣品計算結果示於表1，其證明本方法較由兩種過去此 鲁 藝方法所得之比有較大的蛋白素和肌酸酐一玫性。 表1 比例方法 校正結果 的總數 備註 除法 70% 如實例1 顏色比法 79°/〇 如實例2 具有在結果權限外之 Cllt-oi ί的顏色比法 9 5% 如實例3 經由表1可決定’相較於以簡單除法或以未刪除結果權 限外的顏色比例法，以本發明之方法可得較大的分析精確鲁 度。 下列實例包括尿液條試劑’其通常包含顏色係經由目視 或儀器’而以反射比或吸收比讀出的比色分析。所產生之 顏色直接比例成分析物濃度。在蛋白素的情形中，所形成

C:\PrograraFiles\Patent\55090.ptd 第 11 頁 591230 五、發明說明（8) 之蛋白素試劑顏色愈多， 多。為使顏多絲姑a v存在於尿液樣品中的蛋白素愈 出水平。分批私+ 度所以選定顏色比度為測 濃度範圍。平被選定為表示典型估計誤差的 列表2中示出V白去/ 劑條的共同實際應肖，並在下 條顏色測定時，以標準方法肝/:1的。例如，當以蛋白素 的臨床樣u 7 & ’、 法測疋之值為30毫克/升蛋白素 沐樣可為20至39亳香/ 4，7 t 番白辛、'麓痄 但仍將選定30毫克/升的 蛋白素展度。估計誤差愈小，方法愈定量。 表2 J值蛋期白克/升）測出值肌酸酐（毫克/dL) #望濃度㈣ 期望濃度範圍 0 30 80 150 0 - 20 2 0-39· 9 40-119. 9 1 2 0- 1 99· 9 30 100 200 300 〇-64· 9 65.0-149· 150. 0-249. 250· 0-350. 實例1 -使兩種分析物成比例之過去此藝方法 使兩種分析物成比例之最普通方法; 列表3) —有表C如下

IH1I C:\ProgramFiles\Patent\55090.ptd 第 12 頁 m

591230 五、發明說明（9) mg蛋白素/克肌酸酐比例表 表3 選定測出値 蛋白素 0 mg/L_30 <30 mg/g 30-299 mg/g 30-299 mg/殍 300 mg/g <30 mg/g 30-299 mg/g 30-299 mg/g 30-299 mg/g <30 mg/g <30 mg/g 30-299 mg/g 30-299 mg/g <30 rng/g <30 mg/g <30 mg/g 30-299 mg/g

肌酸酐 30 mg/dL 100 mg/dL 200 mg/dL 300 mg/dL 條測出值 …”王π例測出值。期望>1 出比例係以母一個條之平均結果的除法為基礎，如表4所 >f> 0 表4 mg蛋白素/克肌酸酐比例表： 除每一個條的平均値 蛋白素

肌酸酐 30 mg/dL 100 mg/dL 200 mg/dL 300 mg/dL 0 100 __80 500 0 30 150 0 15 75 0 10 50 本方法導人誤差，因為每一個平均 範圍，並且該期望範圍之極限並不她θ…果表不一期望 个〜疋與選定的測出值一

C:\Program Files\Patent\55090. ptd 第13頁 591230 五、發明說明（10) 致。例如’30毫克/升蛋白素的低限為19.9毫克/升，而 100毫克/dL肌酸酐的上限為150毫克/dL。這些極限的期望 比例測出值為13毫克/克，其並不在30-299毫克/克選定範 圍内。即使如果試劑與標準方法1〇〇 %—致，該錯誤的選定 將係一不正確的比例結果。 本方法之誤差示於下列精確度表中，其中條之結果與 275個臨床樣品之標準值比較。所給予之蛋白素對肌酸酐 條測出值之選定的臨床樣品範圍非常地大於期望濃度範 圍，其使該方法錯誤和無效。測出值之兩種水平（即，小 於3 0毫克/克和大於30毫克/克）的正確結果總數為70%(225 之中的8 6和1 0 9 )，如能由1 8 5個總結果之中的7 6個結果測 出，超過35%的>30毫克/克樣品為錯誤地選定，該個結 果，對條而言係大於3 0毫克/克，而對標準方法而言係小 於30毫克/克。 ' 實例1之方法的成比例作用的精確度表 蛋白素 標準方法 肌酸酐浸量尺比例 <30毫克/克>30毫克/克總數 <3 0毫克/克 >30毫克/克 總數 86 76 4 109 90 185 162 1 13 275 實例2-過去此藝中已知之使兩種分析物成比例的另一種普 通方法係，將每一種個別試劑之結果轉換成要被測定之^

591230 五、發明說明（11) 析物濃度。該轉換作用係，藉由使具有已知濃度的標準 =與未知樣品比較，並選定與兩種樣品之顏色差異有關ς 濃度為未知數而達成。接著，可使分析物濃度被除，以〜 到濃度比例。該以具有高度精確度之比色分析法處理= 法非常普通。但是，使用該具有較低精確度之比色分 的？法(例如，尿液浸量尺法)有一缺點，因為其較溶：： 有較小的分析範圍，該溶液法可得到稀釋物並可適 試劑，以限制誤差增加的干擾。這些定量法有大大超0 望被達到之濃度的分析範圍。 超過/月 如下列表5所示，該成比例法之結果僅稍佳於實例丨 之方法。兩種測出值水平的正確結果總數為 "郝 79〇/〇(.125 + 93:0_ 79)。 275 表5 貝例2之方法的成比例作用之精確度表 蛋白素 標準方法 肌酸酐浸量尺比例 <30毫克/克 230毫克/克總數 125 3 7 20 9 3 I45 130 162 1 13 275 <30毫克/克 ^30毫克/克 總數 實例3 本發明之成比例法使用 兩種試劑所形成之顏色與個別試

C:\Program Files\Patent\55090. ptd 第15頁 591230 五、發明說明（12) 劑所形成之顏色的相除結果。

最初，將對第一種分析物靈敏的試劑之顏色轉換成第一 種分析物濃度’即，一種被指定為測出值的比色度。檢查 該測出水平，而如果該水平在有效分析範圍之外，則使用 的係藉由使用第二種分析物之正常值，而選定之比例。例 如，產生結果為小於30毫克/升或大於3 0 0毫克/升尿液的 蛋白素試劑被指定為測出比例，其不參考肌酸酐試劑結果 且不以1，000毫克/升的正常肌酸值取代。濃度小於3〇毫克 /升的蛋白素被選定為<30毫克/克比例，而大於3〇〇毫克/ 升的蛋白素被指定為〉3 0 0毫克/克比例。該選定假設平均 肌酸酐排泄量為1，〇 〇 〇毫克/升。如果第一種分析物之測出 值在有效分析範圍之内，則使對第一種分析物靈敏之試劑 所形成的顏色除以對第二種分析物靈敏之試劑所形成的顏 色。接著’將顏色比轉換成濃度比，如表6 、 表6 測出值* 顏色比 <30 <1.5 30-300 1. 5 至3 >300 >3 *毫克蛋白素/克肌酸酐 ϋ f，產生80毫克/升結果的蛋白素試劑係以蛋白素和 肌酸試劑的比為基礎，來選定測出比例，在該产，、， 1.7的顏色比將被指定成30_ 3 0 0毫克/克的出月=， 下列表7顯示本方法較任何一種前述方法有較匕大例的__致

591230 五、發明說明U3) 一 --- 性。較大的一致性係由於排除了經常在試劑測出範圍末 處（即，超過最小或最大測出水平）觀察到的較大誤差， 分析範圍之外的結果有較大的誤差和錯誤。對任何要成比 例之試劑而言，可將最小或最大之測出水平之一或兩者排 除。在表7中，兩種測出水平（即，小於3〇毫克/克或大於 30毫克/克）的正確結果總數為95%。其可藉由正確測得之 樣品數（14 9 + 11 2 )除以樣品之總數2 7 5而得之。 表7 貝例3之方法的成比例作用的精確度表 蛋白素 標準方法 肌酸酐浸量尺比例 <30毫克/克 230毫克/克總數 <3 0毫克/克 23 0毫克/克 總數 149 13 1 1 12 150 125 162 113 275

Claims (1)

1. 591230 Ί ^ 1 ,.：.--· > : []\y^ -：^ ί- l~y . ‘Π 丁^號 87116038_年 β 月曰 4正_ J .......·’ :“一一—一·1—」 六、申請蓴利範圊 1 . 一種針對體液樣品中第一種分析物（其在流體樣品中 之濃度係欲求取者）和第二種分析物（其在體液樣品中之濃 度係與第一種分析物濃度有臨床關係）濃度之比色分析 法，其中第一種分析物對第二種分析物之比例係用於校正 樣品中第一種分析物濃度之測定，其包括： a)測定第一種分析物之未校正濃度； b )測定第一種分析物之未校正濃度是否在對於此分析 物之有用分析範圍之内或之外； c )如果第一種分析物之未校正濃度係在此分析物之有 用分析範圍内，則接著測定第二種分析物之濃度和經由 將得自第一種分析物之回應除以得自第二種分析物之回 應，而定出第一種分析物對第二種分析物之比例，並選定 該比例之測出水平，該測出水平相當於藉由將第一種分析 物之未校正濃度除以第二種分析物濃度所校正而得之第一 種分析物濃度， d)如果第一種分析物之未校正濃度係在此分析物有用 分析範圍之外，則接著以步驟a)中測出之第一種分析物之 未校正濃度和第二種分析物之正常濃度為基礎來指定第一 種分析物對第二種分析物之比例。 2 .根據申請專利範圍第1項之分析法，其中體液為尿 液，而第二種分析物可用於校正腎臟流量之改變。 3. 根據申請專利範圍第2項之分析法，其中第一種分析 物為蛋白素，而第二種分析物為肌酸酐。 4. 根據申請專利範圍第1項之分析法，其中第一種分析

   O:\55\55090-920812.ptc 第19頁 591230 _案號87116038_^二年？月 日 修正_ 六、申請專利範圍 物/第二種分析物對係為隱血/肌酸酐；白血球/肌酸酐； 蛋白質/肌酸酐；葡萄糖/肌酸酐或I g G /肌酸酐。 5 .根據申請專利範圍第1項之分析法，其在如申請專利 範圍第1項所定義之步驟（a )至（d)之前包括步驟： 1 )提供一吸收物質試驗條，流體樣品可流經此試驗 條，該試驗條包含供第一種分析物之比色測定用之第一個 區域和供第二種分析物之比色測定用之第二個區域；以及 2 )經由以流體樣品處理之，而使試驗條展色，以致流 體樣品可接觸第一個和第二個區域； 其中藉由讀出試驗條之第一個區域中之顏色改變，而 測定步驟（a)之第一種分析物之未校正濃度；且藉由讀取 試驗條之第二個區域，而測定步驟（c)之第二種分析物之 濃度，並經由將得自第一種分析物之顏色回應除以得自第 二種分析物之顏色回應，而指定步驟（c)之第一種分析物 對第二種分析物之比例。 6 .根據申請專利範圍第5項之分析法，其中體液為尿 液，而第二種分析物可用於校正腎臟流量上之改變。 7.根據申請專利範圍第6項之分析法，其中第一種分析 物為蛋白素，而第二種分析物為肌酸酐。 8 .根據申請專利範圍第1項之分析法，其在如申請專利 範圍第1項所定義之步驟（a)至（d)之前包括： 1 )提供一種由物質所組成之試驗條，該物質使得流體 樣品以及分析物和對分析物之經標記結合夥伴能藉由毛細 作用，而流經於其中，試驗條包括下列彼此呈流體相通之

   O:\55\55090-920812.ptc 第20頁 591230 _案號87116038_年P月 日 修正___ 六、申請專利範圍 區域： i )供施加流體樣品之吸收區域； i i )包含對第一種分折物之特異結合夥伴之區域， 該結合夥伴帶有可目視偵測標記之微粒子； i i i )包含呈固定形式之第一種分析物之第一種試劑 區域；和 i v )能提供可測知之染色回應之第二種試劑區域， 其強度係與流體樣品中第二種分析物濃度成比例； 2 )將流體樣品施加於試驗條之吸收區域，並使其藉由 毛細作用而沿著試驗條流動； 其中步驟（a)之第一種分析物之未校正濃度係測定為 來自微粒子標記之可目測信號強度之函數，且經由將得自 第一種分析物之顏色回應除以得自第二種分析物之顏色回 應，而指定步驟（c )之第一種分析物對第二種分析物之比 例。 9 .根據申請專利範圍第8項之分析法，其中體液為尿 液，第一種分析物為蛋白素，而第二種分折物為肌酸酐。 1 0.根據申請專利範圍第3項之分析法，其中體液樣品為 尿液樣品，且 藉由比色方式測定第一種分析物之未校正濃度；以及 步驟（d)之第一種分析物之未校正濃度係在此分析物有用 分析範圍之外表示蛋白素之未校正濃度小於30毫克/升或 大於3 0 0毫克/升，且第二種分析物之正常濃度為以1，0 0 0 毫克/升。

   O:\55\55090-920812.ptc 第21頁