JPS61155757A - 微量蛋白定量法 - Google Patents
微量蛋白定量法Info
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- JPS61155757A JPS61155757A JP27828284A JP27828284A JPS61155757A JP S61155757 A JPS61155757 A JP S61155757A JP 27828284 A JP27828284 A JP 27828284A JP 27828284 A JP27828284 A JP 27828284A JP S61155757 A JPS61155757 A JP S61155757A
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- protein
- molybdenum
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、蛋白、特に尿蛋白の微量比色定量法に関する
。
。
健康な人でも毎日尿中に２０〜８０■の蛋白質を排泄す
るといわれているが、この排泄される蛋白質は通常粒子
が小さく糸球体を通過し易いアルブミンが主体である。
るといわれているが、この排泄される蛋白質は通常粒子
が小さく糸球体を通過し易いアルブミンが主体である。
一方、溶血がひどく血漿内に赤血球のヘモグロビンが多
量Ｉこ遊出しこれが腎糸球体から漏れた）、あるいは腎
臓や尿路に炎症がある場合など番こは白血球を尿中に放
出するので。
量Ｉこ遊出しこれが腎糸球体から漏れた）、あるいは腎
臓や尿路に炎症がある場合など番こは白血球を尿中に放
出するので。
グロブリンを主体とする尿蛋白となる。尿蛋白は一般に
次のような場合に高値となり腎疾患の重要な指針となる
。
次のような場合に高値となり腎疾患の重要な指針となる
。
（り急性、および慢性腎炎、ネフローゼ。
（２）心不全による腎の口直、その他。
（３）熱性蛋白尿。
（４）化学薬品中毒、細菌性中毒。
（５）白血病、紫斑病。
（６）狭窄、Ｊ＠石、腫瘍による尿管の閉塞。
（７）脳腫瘍、癲痛、その他中枢神経系疾患、精神感動
。
。
（８）膿、血液、精液などの混入。
（９）卵など分子量の小さい蛋白質の多量摂散。
０ｑ激しい運動、熱い湯又は冷水に長時間つかった後に
現われる一過性のもの。
現われる一過性のもの。
０υ体位性および若年性蛋白尿。
現在、一般に行なわれて論る尿蛋白測定を主体とする微
量蛋白定量法としては下記の如き方法がある。
量蛋白定量法としては下記の如き方法がある。
（１）スルホサリチル酸法（鋭敏度 ０．００２％）（
透明法４〜５１Ｒ１＋ スルホサリチル酸２゜Ｗ／Ｖ
％溶液２〜３滴−白色混濁又は沈澱を生ずれば蛋白陽性
） （２）煮沸試験法（鋭敏度 約ｏ、ｏｏｓチ）（透明法
５ＩＲ１を１〜２分間煮沸し、混濁を生じたならば熱時
５俤酢酸、又は７０％硝酸を１〜３滴添加し、混濁が不
変又は増加した場合は蛋白陽性）（３）Ｒｏｂｅｒｓ法
（鋭敏度 ０．００３ ％ ）（試料と硫酸マグネシウ
ムの硝５！溶液とを等容混合し境界面に日輪が生ずれば
蛋白陽性）（４）試験紙法（鋭敏度 ０．０３％）（テ
トラブロムフェノールブルーの蛋白呈色［−利用） （５）ツマシーブリリアントブルー法 （鋭敏度 ０．００１％） （色素と蛋白の結合による高感度測定法で、試料５０μ
Ｊ＋ＣＢＢ−Ｇ２５（１１液３＃ｌ／→５９５ｎｍの吸
光度を測定） （６）トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法（検体（
原振）２ｉＪ＋蒸留水２−＋トリクロル酢酸（１０１ｇ
液）混和後３．００ Ｏｒｐｍで５分以上遠心後上清を
捨てる。沈澱にビウレット試薬（ＮａＯＨ４ｔｓ、酒石
酸カリウムナトリウム結晶４、５ ’Ｉｔ、 Ｃｕ５
Ｏ＜ ・５ ＨｔＯ０，５ｔｓ−ヨウ化カリウム ０．
５％）２ｍ／十蒸留水２ｄ混和後、３７℃。
透明法４〜５１Ｒ１＋ スルホサリチル酸２゜Ｗ／Ｖ
％溶液２〜３滴−白色混濁又は沈澱を生ずれば蛋白陽性
） （２）煮沸試験法（鋭敏度 約ｏ、ｏｏｓチ）（透明法
５ＩＲ１を１〜２分間煮沸し、混濁を生じたならば熱時
５俤酢酸、又は７０％硝酸を１〜３滴添加し、混濁が不
変又は増加した場合は蛋白陽性）（３）Ｒｏｂｅｒｓ法
（鋭敏度 ０．００３ ％ ）（試料と硫酸マグネシウ
ムの硝５！溶液とを等容混合し境界面に日輪が生ずれば
蛋白陽性）（４）試験紙法（鋭敏度 ０．０３％）（テ
トラブロムフェノールブルーの蛋白呈色［−利用） （５）ツマシーブリリアントブルー法 （鋭敏度 ０．００１％） （色素と蛋白の結合による高感度測定法で、試料５０μ
Ｊ＋ＣＢＢ−Ｇ２５（１１液３＃ｌ／→５９５ｎｍの吸
光度を測定） （６）トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法（検体（
原振）２ｉＪ＋蒸留水２−＋トリクロル酢酸（１０１ｇ
液）混和後３．００ Ｏｒｐｍで５分以上遠心後上清を
捨てる。沈澱にビウレット試薬（ＮａＯＨ４ｔｓ、酒石
酸カリウムナトリウム結晶４、５ ’Ｉｔ、 Ｃｕ５
Ｏ＜ ・５ ＨｔＯ０，５ｔｓ−ヨウ化カリウム ０．
５％）２ｍ／十蒸留水２ｄ混和後、３７℃。
３０分間加温しｓ ４ ｏ ｎｍで比色）これらの内、
スルホサリチル酸法、煮沸試験法、Ｒｏｂｅｒｓ 法
は、比濁法又はそれに準する方法で多量の試料を必要と
し、しかも定量分析に適用するには精度的に限界がある
。一方りマシープＩＪ ＩＪアントブルー法は比色法で
あるが、検量線が湾曲することや、セル、試験管等の汚
染があることなどから多数検体を連続処理するにはそぐ
わｆ、ｈものとされて（八る。
スルホサリチル酸法、煮沸試験法、Ｒｏｂｅｒｓ 法
は、比濁法又はそれに準する方法で多量の試料を必要と
し、しかも定量分析に適用するには精度的に限界がある
。一方りマシープＩＪ ＩＪアントブルー法は比色法で
あるが、検量線が湾曲することや、セル、試験管等の汚
染があることなどから多数検体を連続処理するにはそぐ
わｆ、ｈものとされて（八る。
又、トリクロル酢酸沈澱によるビウレ・ント法は。
沈澱分離操作を必要とするので操作が繁雑であシ実用的
ではない。
ではない。
一方１分析化学ＶＯ１，３２３７９〜３８６（１９８３
Ｈこよれば、ピロガロールレッドとモリブデン酸塩混合
物（ＰＲ−モリブデン錯体）に蛋白（アルブミン）を添
加するとλｍａｘが長波長側にシフトし蛋白を高感度で
比色定量することが可能であるとの記載がある。しかし
ながら１文献記載の試薬に試料として健常人の尿（スル
ホサリチル酸法で陰性）を使用して蛋白濃度を測定する
と殆んどの検体で吸光度が試薬ブランクよシ低値となり
蛋白濃度として負値が算出される現象に遭遇する。従っ
て、この方法をそのまま人尿検体を試料とした尿蛋白の
測定に適用することは不可能である。
Ｈこよれば、ピロガロールレッドとモリブデン酸塩混合
物（ＰＲ−モリブデン錯体）に蛋白（アルブミン）を添
加するとλｍａｘが長波長側にシフトし蛋白を高感度で
比色定量することが可能であるとの記載がある。しかし
ながら１文献記載の試薬に試料として健常人の尿（スル
ホサリチル酸法で陰性）を使用して蛋白濃度を測定する
と殆んどの検体で吸光度が試薬ブランクよシ低値となり
蛋白濃度として負値が算出される現象に遭遇する。従っ
て、この方法をそのまま人尿検体を試料とした尿蛋白の
測定に適用することは不可能である。
かかる状況に鑑み１本発明者らはモリブデンと錯体を形
成し、更に蛋白の存在で波長がシフトする色素を用いる
尿蛋白の測定法の実用化について鋭意研究を重ねた結果
１色素及びモリブデンを主成分とする測定試薬中に予め
モリブデンと結合し得るキレート剤を添加するか、又は
前記色素とは反応せず、試料中に共存が予想されるシュ
ウ酸。
成し、更に蛋白の存在で波長がシフトする色素を用いる
尿蛋白の測定法の実用化について鋭意研究を重ねた結果
１色素及びモリブデンを主成分とする測定試薬中に予め
モリブデンと結合し得るキレート剤を添加するか、又は
前記色素とは反応せず、試料中に共存が予想されるシュ
ウ酸。
クエン酸、リン酸、及びこれらの塩と結合し得る金属イ
オンを添加することによシ１．その目的を達成し得るこ
とを見出し本発明を完成するに到った。
オンを添加することによシ１．その目的を達成し得るこ
とを見出し本発明を完成するに到った。
即ち１本発明はモリブデンと錯体を形成し、さらに蛋白
の存在で波長がシフトする色素を使用した微量蛋白定量
法に於て、試薬中にあらかじめモリブデンと結合するキ
レート剤を添加するか、又は前記色素とは反応せず、試
料中に共存が予想されるシュウ酸、クエン酸、リン酸及
びこれらの塩と結合し得る金属イオンを添加することを
特徴とする微量蛋白定量法である。
の存在で波長がシフトする色素を使用した微量蛋白定量
法に於て、試薬中にあらかじめモリブデンと結合するキ
レート剤を添加するか、又は前記色素とは反応せず、試
料中に共存が予想されるシュウ酸、クエン酸、リン酸及
びこれらの塩と結合し得る金属イオンを添加することを
特徴とする微量蛋白定量法である。
本発明は、ピロガロールレッド、ピロカテコールバイオ
レット等の色素がモリブデンと錯体を形成し、この錯体
が蛋白と結合して波長が長波長側にシフトすることを利
用して蛋白、特に尿蛋白の比色定量を行うに当シ、試料
中に存在し、負値の原因となるギレート剤、即ち有機酸
又は／及びリン酸塩類、又はこれらと同じ作用をもつキ
レート剤を予め試薬中に添加しておくか、又は前記色素
とは反応せず、試料中に共存が予想されるシュウ酸、ク
エン酸、リン酸、及びこれらの塩と結合し得る金属イオ
ンを添加しておくことによシ、正常尿が負値を示す現象
を回避し、極めて高精度に尿中蛋白の測定を行うことを
可能なら【７めたものである。
レット等の色素がモリブデンと錯体を形成し、この錯体
が蛋白と結合して波長が長波長側にシフトすることを利
用して蛋白、特に尿蛋白の比色定量を行うに当シ、試料
中に存在し、負値の原因となるギレート剤、即ち有機酸
又は／及びリン酸塩類、又はこれらと同じ作用をもつキ
レート剤を予め試薬中に添加しておくか、又は前記色素
とは反応せず、試料中に共存が予想されるシュウ酸、ク
エン酸、リン酸、及びこれらの塩と結合し得る金属イオ
ンを添加しておくことによシ、正常尿が負値を示す現象
を回避し、極めて高精度に尿中蛋白の測定を行うことを
可能なら【７めたものである。
１ｉ１０チ、ヒロガ口−ルレッド、ピロカテコールバイ
オレット等の色素類は、モリブデンと錯体を形成して着
色する（或いは着色が増す）が、モリブデンと結合力の
ある他のキレート剤が存在すると。
オレット等の色素類は、モリブデンと錯体を形成して着
色する（或いは着色が増す）が、モリブデンと結合力の
ある他のキレート剤が存在すると。
モリブデンの一部はこれら色素類との結合から離れ他の
キレート剤と結合し、この為試薬盲検値が低下する。試
薬中にキレート剤を徐々に添加していくと盲検値は添加
量に従って徐々に低下【５．ある添加量を越えると試料
に由来するキレート剤が混入されてきてももはやそれＮ
上に低下する現象が殆んど認められなくなシ負値を示さ
なくなる。
キレート剤と結合し、この為試薬盲検値が低下する。試
薬中にキレート剤を徐々に添加していくと盲検値は添加
量に従って徐々に低下【５．ある添加量を越えると試料
に由来するキレート剤が混入されてきてももはやそれＮ
上に低下する現象が殆んど認められなくなシ負値を示さ
なくなる。
又同様に試薬中にアルミニウムイオン、セリウムイオン
等を添加すると試料中のキレート剤（シュウ酸、クエン
酸、リン酸等）はアルミニウムイオン、セリウムイオン
等と結合してモリブデンとは結合しなくなシ（又は結合
する割合が少なくなシ）負値を回避することができる。
等を添加すると試料中のキレート剤（シュウ酸、クエン
酸、リン酸等）はアルミニウムイオン、セリウムイオン
等と結合してモリブデンとは結合しなくなシ（又は結合
する割合が少なくなシ）負値を回避することができる。
従って、測定試薬中に予めモリブデンと結合し得るキレ
ート剤、若しくはアルミニウムイオン、セリウムイオン
等の金属イオンを添加しておくことによシ、正常尿が負
値を示す現象は解消されると同時に、モリブデンと結合
するキレート剤やアルミニウムイオン。
ート剤、若しくはアルミニウムイオン、セリウムイオン
等の金属イオンを添加しておくことによシ、正常尿が負
値を示す現象は解消されると同時に、モリブデンと結合
するキレート剤やアルミニウムイオン。
セリウムイオン等を含んだ状態の高濃度の蛋白含有試料
についても正確な測定が可能となる。
についても正確な測定が可能となる。
本発明者らは、モリブデンと錯体を形成し、更に蛋白の
存在で波長がシフトする色素を使用した尿蛋白の定量法
に於て、これまで解明されていなかった正常尿が負値を
示す原因について究明し。
存在で波長がシフトする色素を使用した尿蛋白の定量法
に於て、これまで解明されていなかった正常尿が負値を
示す原因について究明し。
その解決方法として１本発明者ら独自の知見に基いて上
記結論を導き出し本発明に到達した。
記結論を導き出し本発明に到達した。
本発明の方法によれば、正常尿が負値を示すこともなく
、検量線は直線性に優れ定量性が良好であり再現性も良
好である。又、クマシーブＩＪ ＩＪアントブルー法の
ように、セルや試験管等を汚染するようなこともないの
で多数検体を連続処理するのにも適【、ており、自動分
析装置への適用が可能である。
、検量線は直線性に優れ定量性が良好であり再現性も良
好である。又、クマシーブＩＪ ＩＪアントブルー法の
ように、セルや試験管等を汚染するようなこともないの
で多数検体を連続処理するのにも適【、ており、自動分
析装置への適用が可能である。
本発明に於て用いられるキレート剤としては。
エチレンジアミン四酢ｍ（ｇＤＴＡ ）、 ヒドロキシ
エチルエチレンジアミン三酢１！！（ＥＤＴＡ−ＣＩＷ
）、エチレンジアミンニ酢１！！（ＥＤＤＡ）、イミノ
ニ酢＠（ＩＤＡ）、ニトリロプロピオン酸（ＮＴＰ）。
エチルエチレンジアミン三酢１！！（ＥＤＴＡ−ＣＩＷ
）、エチレンジアミンニ酢１！！（ＥＤＤＡ）、イミノ
ニ酢＠（ＩＤＡ）、ニトリロプロピオン酸（ＮＴＰ）。
ニトリロ三酢＆（ＮＴＡ）、 ヒトＯキシエチルイミ
ノニ酢１！！（ＨＩＤＡ）、 クエン１１！、 酒石酸
、シュウ６１． １−ヒドロキシエタン１．１−ジホス
ホン酸、ビロリン酸、ヘキサメタリン酸、トリポリリン
酸、メタリン酸等が挙けられる。その麻加量は添加する
キレート剤によプ異なるが１通常０．００１〜１％の範
囲で蛋白測定条件下でのそのキレート剤のキレート生成
定数や溶解度を考慮して適宜選択すれば良い。又、これ
らは単独で用いても２種類以上の混合物で用いても良く
、又溶解性を増す為にこれらをナトリウム、カリウム、
リチウム等のアルカリ金属塩やアンモニウム塩等として
塩の型で添加してもＰ１１＃ 又本発明に使用可能な金属イオンとしては、アルミニウ
ムイオン、セリウムイオン（■、■）等が適当である。
ノニ酢１！！（ＨＩＤＡ）、 クエン１１！、 酒石酸
、シュウ６１． １−ヒドロキシエタン１．１−ジホス
ホン酸、ビロリン酸、ヘキサメタリン酸、トリポリリン
酸、メタリン酸等が挙けられる。その麻加量は添加する
キレート剤によプ異なるが１通常０．００１〜１％の範
囲で蛋白測定条件下でのそのキレート剤のキレート生成
定数や溶解度を考慮して適宜選択すれば良い。又、これ
らは単独で用いても２種類以上の混合物で用いても良く
、又溶解性を増す為にこれらをナトリウム、カリウム、
リチウム等のアルカリ金属塩やアンモニウム塩等として
塩の型で添加してもＰ１１＃ 又本発明に使用可能な金属イオンとしては、アルミニウ
ムイオン、セリウムイオン（■、■）等が適当である。
本発明に於て使用可能な色素としては、モリブデンの存
在下アルブミンと定量的に錯体を形成するピロガロール
レ・ノド（ＰＲ）、ブロムピロガロールレッド、ビロカ
テコールパイオレ・ノド（ＰＶ）、ｏ−ヒドロキシヒド
ロキノンフタシン。ガレイン等の色素が挙げられる。こ
れら色素類の使用量は通常Ｑ、 ００５〜０．０１ ％
である。
在下アルブミンと定量的に錯体を形成するピロガロール
レ・ノド（ＰＲ）、ブロムピロガロールレッド、ビロカ
テコールパイオレ・ノド（ＰＶ）、ｏ−ヒドロキシヒド
ロキノンフタシン。ガレイン等の色素が挙げられる。こ
れら色素類の使用量は通常Ｑ、 ００５〜０．０１ ％
である。
又これら色素類と錯体を形成するモリブデンは。
通ｔモリブデン酸のアンモニウム塩、若しくはアルカリ
金属塩として用いられるがこれらに限定されるものでは
ない。その使用量は例えばモリブデン酸塩の場合、モリ
ブデン酸イオンの濃度として通常０．ＯＱ ５− Ｑ
、０１ ’Ａ程度が用いられる。
金属塩として用いられるがこれらに限定されるものでは
ない。その使用量は例えばモリブデン酸塩の場合、モリ
ブデン酸イオンの濃度として通常０．ＯＱ ５− Ｑ
、０１ ’Ａ程度が用いられる。
表１１ｃＰ Ｒ−Ｍｏｂ４処方ｌこ於けるキレート剤の
添加効果を示す。キレート剤の添加によシ正常尿での測
定値が負値より正値となることが判る。又。
添加効果を示す。キレート剤の添加によシ正常尿での測
定値が負値より正値となることが判る。又。
キレート剤種や添加量を選択すれば、アルブミンに対す
る感度も上昇しさらにアルブミンとグロブリンの発色比
も改善される。
る感度も上昇しさらにアルブミンとグロブリンの発色比
も改善される。
以下余白
表２に Ｐ Ｖ −ＭＯＯ４処方に於け、るキレート剤
の添加効果を示す。表１同様キレート剤の添加により正
常尿での測定値が負値よシ正値となシ、添加するキレー
ト剤の種類と量を選択すれば、アルブミンに対する感度
が上昇しアルブミンとグロブリンの発色比も改善される
。
の添加効果を示す。表１同様キレート剤の添加により正
常尿での測定値が負値よシ正値となシ、添加するキレー
ト剤の種類と量を選択すれば、アルブミンに対する感度
が上昇しアルブミンとグロブリンの発色比も改善される
。
」
ヲ
７ ｃ
中
瓢
霧 邂
藁 堪
表３に Ｐ Ｒ−Ｍｏｂ、 処方に於けるアルミニウ
ムイオン及びセリウムイオンの添加効果を示す。
ムイオン及びセリウムイオンの添加効果を示す。
又１表４にＰ ｙ −Ｍｏｂ４ 処方に於けるアルミ
ニウムイオン及びセリウムイオンの添加効果を示す。
ニウムイオン及びセリウムイオンの添加効果を示す。
ｂずれもキレート剤を添加した場合と同様正常尿での負
値を回避している。
値を回避している。
表 ３
Ｐ Ｒ−ＭＯ０４法 アルミニウムイオン、セリウム
イオンの添加効果 ！！４ Ｐ Ｖ −ＭＯ０４法 アルｉ二９ムイオン、セリウ
ムイオンの添加効果 （測定方法は表２の場合に準する。） ３１１図にＰ Ｖ −Ｍｏｂ４ 処方に於てキレート
剤としてＥＤＴＡＣＯ，ｎ７優）を選択し１人アルブミ
ンを使用して作成した慣ｆｌ！＆を示す、尚、キレート
剤の添加量 ０．０３ ｓ、 ｏ、ｏ ４％、０．０５
１０．０６憾の場合もはぼ同様の結果が得られる。即ち
、添加する中レート剤の量によプ、試薬ブランク値は僅
かに変動するが測定籠に影響を与えるほどではＰ〜まし
てや尿中に含まれるキレート剤の量（通常クエン酸で３
〜２０■／に９／ｄ轟ｙ、クエン酸で０．３〜０．７
ｑ７ｋｇ／ ｄａｙ８に存在する。）程度では殆んど影
響を受けない。いずれの場合もＥＤＴＡの添加にも拘わ
らず良好な検量線が得られ、それによシ定量性は何ら損
なわれｆｉ：ｔＬｑｒ。
イオンの添加効果 ！！４ Ｐ Ｖ −ＭＯ０４法 アルｉ二９ムイオン、セリウ
ムイオンの添加効果 （測定方法は表２の場合に準する。） ３１１図にＰ Ｖ −Ｍｏｂ４ 処方に於てキレート
剤としてＥＤＴＡＣＯ，ｎ７優）を選択し１人アルブミ
ンを使用して作成した慣ｆｌ！＆を示す、尚、キレート
剤の添加量 ０．０３ ｓ、 ｏ、ｏ ４％、０．０５
１０．０６憾の場合もはぼ同様の結果が得られる。即ち
、添加する中レート剤の量によプ、試薬ブランク値は僅
かに変動するが測定籠に影響を与えるほどではＰ〜まし
てや尿中に含まれるキレート剤の量（通常クエン酸で３
〜２０■／に９／ｄ轟ｙ、クエン酸で０．３〜０．７
ｑ７ｋｇ／ ｄａｙ８に存在する。）程度では殆んど影
響を受けない。いずれの場合もＥＤＴＡの添加にも拘わ
らず良好な検量線が得られ、それによシ定量性は何ら損
なわれｆｉ：ｔＬｑｒ。
以上述べた如く１本発明は微量蛋白、特に尿蛋白の改良
された測定法、即ち、定量性、再現性に優れた高精度の
測定法で有）、且つ又、セルや試験管等の汚染もないの
で自動分析装置への適用が可能な優れた測定法を提供す
るものであり、斯業に貢献するところ甑めて大である、 以下番こ実施例を示すが１本発明はこれら実施例により
何ら限定されるものではない。
された測定法、即ち、定量性、再現性に優れた高精度の
測定法で有）、且つ又、セルや試験管等の汚染もないの
で自動分析装置への適用が可能な優れた測定法を提供す
るものであり、斯業に貢献するところ甑めて大である、 以下番こ実施例を示すが１本発明はこれら実施例により
何ら限定されるものではない。
実施例１
試薬
ピロガロールレッド ２０１ｖモリブ
デン酸アンモニウム ３−（１１＃９シユウ
酸ソーダ １０（１〜アニオン系
界面活性剤 １００Ｍ９グリシン
７．５ｇこれらを水９００ａ
ｉ／に溶解してＨ（ｌでｐ ｆ（２，５とし、全量を１
１とした。
デン酸アンモニウム ３−（１１＃９シユウ
酸ソーダ １０（１〜アニオン系
界面活性剤 １００Ｍ９グリシン
７．５ｇこれらを水９００ａ
ｉ／に溶解してＨ（ｌでｐ ｆ（２，５とし、全量を１
１とした。
操作法
５倍希狙尿２０μｌに試液１．２５ ａｅｊを加え、測
定波長６００ ／ ６６０ ｎ ｍ反応時間１１分の測
定条件で日立７２６型自動分析装置で測定した。
定波長６００ ／ ６６０ ｎ ｍ反応時間１１分の測
定条件で日立７２６型自動分析装置で測定した。
本実施例に於すて直線性を調べた結果を稟２図に、再現
性を調べた結果を表５に、従来法（トリクロル酢酸沈＃
ｌこよるビウレット法）との相関図を第３図に夫々示す
。第２図よシ明らかな如く。
性を調べた結果を表５に、従来法（トリクロル酢酸沈＃
ｌこよるビウレット法）との相関図を第３図に夫々示す
。第２図よシ明らかな如く。
この条件下で少なくとも１２ Ｑ ＯＷ９／ ｄｌ！ま
では直線性を示す。又１表５より明らかな如く再現性も
良好でセル汚染等、従来の比色定量法であるツマシーブ
リリアントプル−法にみられ友欠点は全て解消されてい
ることが判る。又、第３図より明らかな如く１本法とト
リクロル酢酸沈澱によるビウレット法とは相関係数０．
９９６とよい相関を示して層る。（Ｙ ＝ １．０３Ｘ
−ｇ、３＋ ）表 ５ 実施例２ 試薬 ピロカテコールバイオレット ３０”９モリ
ブデン酸アンモニウム ４０■塩化ナトリウ
ム ５．８ＩＥＤＴＡ−２Ｎａ
５００１１９ト リ ト ン
Ｘ−４０５３，９ これらを水９００縦に浴解徽Ｈ（Ｊ でｐ Ｈ２，０
とし全量を１）とした。
では直線性を示す。又１表５より明らかな如く再現性も
良好でセル汚染等、従来の比色定量法であるツマシーブ
リリアントプル−法にみられ友欠点は全て解消されてい
ることが判る。又、第３図より明らかな如く１本法とト
リクロル酢酸沈澱によるビウレット法とは相関係数０．
９９６とよい相関を示して層る。（Ｙ ＝ １．０３Ｘ
−ｇ、３＋ ）表 ５ 実施例２ 試薬 ピロカテコールバイオレット ３０”９モリ
ブデン酸アンモニウム ４０■塩化ナトリウ
ム ５．８ＩＥＤＴＡ−２Ｎａ
５００１１９ト リ ト ン
Ｘ−４０５３，９ これらを水９００縦に浴解徽Ｈ（Ｊ でｐ Ｈ２，０
とし全量を１）とした。
操作法
５＋１！ｒ希釈尿２０ ａｌに試Ｑ １．２５ Ｍを加
え、測定波長 ６６ Ｇ ／ ７００ ｎ ｍ反応時間
１１分の細足条件で日立７２６型自動分析装置で測定し
た。
え、測定波長 ６６ Ｇ ／ ７００ ｎ ｍ反応時間
１１分の細足条件で日立７２６型自動分析装置で測定し
た。
本実施例と従来法（トリクロル酢酸沈澱によるビウレッ
ト法）との相関図を第４図に示す。第４関を示している
。（Ｙ ＝１．０４Ｘ’−１’１．Ｃｉ’ｌ ）
ト法）との相関図を第４図に示す。第４関を示している
。（Ｙ ＝１．０４Ｘ’−１’１．Ｃｉ’ｌ ）
第１図は、ＰＶ−ＭＯＯ，処方に於てキレート剤として
ＥＤＴＡ（０，０７％）を選択し１人アルブミンを使用
【、て作成した検量線を示し、横軸の各蛋白濃度につい
て得られ几吸元度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした
点を結んだものである。 第２図は、実施例１に於いて直線性を調べた結果を示し
たものであシ、横軸の各希釈系列について求めた蛋白濃
度（１１９／ ａｔ ）を縦軸に沿ってプロットした点
を結、んだもの〒ある。 第３図は、実施例１に於ける本法で得られた蛋白濃度側
定直と従来法（トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法
）で得られ几蛋白濃度測定直との相関を表わし、横軸Ｘ
は従来法に於ける蛋白濃度測定＠Ｃｌｍ９７ｄｌ）を、
縦軸Ｙは本法に於ける蛋白濃度測定＠（〜／ａｌ）を夫
々表わす。 第４図は、実施例２に於ける本法で得られた蛋白濃度側
定直と従来法（トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法
）で得られた蛋白濃度測定籠との相関を表わし、横軸Ｘ
は従来法に於ける蛋白濃度測定ｌ１Ｌｃｌｊ９７ｄｌ）
を、縦軸Ｙは本法に於ける蛋白濃度測定［（ダ／ｄｌ）
を夫々表わす。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第 ２ 図 第 ３１３￥１ 従 来 決 （Ｖｄ＋）第４１！１ 従 来 法 （′Ｖｄ１）手続補正
書 １． 事件の表示 ２ 発明の名称 １ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便書号 ５４１ １Ｍｆｆ１ 置 ａ３−ｚｔｏ−ｓｓｖ＋４、補正命令
の日付 自悠 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書１６頁に記載の表３を以下のとおり補正す
る。 「 表 ３ＰＲ−Ｍｏ０
４法 フルミニラムイオン。セリウムイオンの添加効果 」 以上 手続補正書 昭和６０年 ５月２に日゛ １ 事件の表示 日ａ湘 ５ Ｃ１１４−季手を今うシ艶ゆし２り５２ｇ
２子λ 発明の名称 徴１１１史を法 遍絡先 置 ｏ３−ｚｔｏ−ｓｓ７１ 自沁 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書９頁２０行目から１０頁１行目にかけて記
載の「自動分析装置への適用が可能である。」を「自動
分析装置への適用が可能であり、又試験紙に適用するこ
とも可能である。」と補正する。 （２）明細書１８頁７行目に記載の「高精度の測定法で
有り、」を［高精度の測定法であって、試験紙に適用す
ることも可能であり、」と補正する。 （３）明細書２１頁９行目から２２頁６行目にかけて記
載の「実施例２」の後に「実施例３」を以下のとおり追
加する。 「実施例３ 試薬 ピロガロールレッド １００ｍｇモリブ
デン酸アンモニウム １５０ｍｇ酒 石
酸 ２．５
ｇグリシン ７．５ｇこ
れらを水９００１に溶解してＨＣｌでｐ）ｌ ２．５と
し全量を１１とした。この試液をろ紙に含浸さ・乾燥し
て試験紙とした。 使用法 上記ろ紙に試料２０ＩＬｉを滴下した。３０秒１に現わ
れた青色を肉眼比色した。アルブミングロブリンともｌ
Ｏｓ＋ｇ／ｄｉまで検出可能であ−た。ノ 以上 １ 手続補正書 昭和ｌ０年 ダ刀２ｑ日 １、 事件の表示 討利５９年材鴫第２９と２ｇ２号 λ 発明の名称 １ 補正をする者 事件どの関係 特許出履人 １錨装置 （１３−２７０４５７１ 表 補正命令の日付 自 大 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、及び図面。 ６、補正の内容 （１）明細書９頁７行目に記載の「含んだ状態の」を「
含んだ試薬を用いて」と補正する。 （２）明細書９頁７行目から同頁８行目にかけて記載の
「蛋白含有試料についても」を「蛋白含有試料について
測定しても」と補正する。 （３）明細書１７頁１４行目に記載の「検量線を示す、
」の後に「（Ｊ１１定方法は表２の場合に準する。）」
を挿入する。 （４）明細書２２頁頁ｔ行目に記載の「吸光度Ｃ０Ｄ）
Ｊを「吸光度（水対＠）Ｊと補正する。 （５）第１図、及び第２図を別紙のとおり補正する以上 手続補正書 昭和ｌρ年 ｒ月２２日 鳳 事件の表示 葡湘ｓｃ年材杵臘集ｚｌ’Ｈ２ｇ２号 λ 発明の名称 ・ 工 補正をする者 事件との関係 特許出麗人 遍緬先’ｆｆ：Ｌ ０３−２１０４５１１屯 補正命令
の日付 自 他 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、。 ６、補正の内容 （１）明細書！！頁８行目ニ記載ｔｙ） ｒ Ｏ，００
５ＮＯ，０１ＸＪヲｒＯ，０００５〜０．１＄Ｊ ト補
正する。 （２）明細書１１１１４行目に記載＋７） ｒｏ、００
５Ｍ０．０１＄Ｊヲｒｏ、０００５〜０．１１」Ｊ−補
正する。 以上
ＥＤＴＡ（０，０７％）を選択し１人アルブミンを使用
【、て作成した検量線を示し、横軸の各蛋白濃度につい
て得られ几吸元度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした
点を結んだものである。 第２図は、実施例１に於いて直線性を調べた結果を示し
たものであシ、横軸の各希釈系列について求めた蛋白濃
度（１１９／ ａｔ ）を縦軸に沿ってプロットした点
を結、んだもの〒ある。 第３図は、実施例１に於ける本法で得られた蛋白濃度側
定直と従来法（トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法
）で得られ几蛋白濃度測定直との相関を表わし、横軸Ｘ
は従来法に於ける蛋白濃度測定＠Ｃｌｍ９７ｄｌ）を、
縦軸Ｙは本法に於ける蛋白濃度測定＠（〜／ａｌ）を夫
々表わす。 第４図は、実施例２に於ける本法で得られた蛋白濃度側
定直と従来法（トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法
）で得られた蛋白濃度測定籠との相関を表わし、横軸Ｘ
は従来法に於ける蛋白濃度測定ｌ１Ｌｃｌｊ９７ｄｌ）
を、縦軸Ｙは本法に於ける蛋白濃度測定［（ダ／ｄｌ）
を夫々表わす。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第 ２ 図 第 ３１３￥１ 従 来 決 （Ｖｄ＋）第４１！１ 従 来 法 （′Ｖｄ１）手続補正
書 １． 事件の表示 ２ 発明の名称 １ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便書号 ５４１ １Ｍｆｆ１ 置 ａ３−ｚｔｏ−ｓｓｖ＋４、補正命令
の日付 自悠 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書１６頁に記載の表３を以下のとおり補正す
る。 「 表 ３ＰＲ−Ｍｏ０
４法 フルミニラムイオン。セリウムイオンの添加効果 」 以上 手続補正書 昭和６０年 ５月２に日゛ １ 事件の表示 日ａ湘 ５ Ｃ１１４−季手を今うシ艶ゆし２り５２ｇ
２子λ 発明の名称 徴１１１史を法 遍絡先 置 ｏ３−ｚｔｏ−ｓｓ７１ 自沁 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書９頁２０行目から１０頁１行目にかけて記
載の「自動分析装置への適用が可能である。」を「自動
分析装置への適用が可能であり、又試験紙に適用するこ
とも可能である。」と補正する。 （２）明細書１８頁７行目に記載の「高精度の測定法で
有り、」を［高精度の測定法であって、試験紙に適用す
ることも可能であり、」と補正する。 （３）明細書２１頁９行目から２２頁６行目にかけて記
載の「実施例２」の後に「実施例３」を以下のとおり追
加する。 「実施例３ 試薬 ピロガロールレッド １００ｍｇモリブ
デン酸アンモニウム １５０ｍｇ酒 石
酸 ２．５
ｇグリシン ７．５ｇこ
れらを水９００１に溶解してＨＣｌでｐ）ｌ ２．５と
し全量を１１とした。この試液をろ紙に含浸さ・乾燥し
て試験紙とした。 使用法 上記ろ紙に試料２０ＩＬｉを滴下した。３０秒１に現わ
れた青色を肉眼比色した。アルブミングロブリンともｌ
Ｏｓ＋ｇ／ｄｉまで検出可能であ−た。ノ 以上 １ 手続補正書 昭和ｌ０年 ダ刀２ｑ日 １、 事件の表示 討利５９年材鴫第２９と２ｇ２号 λ 発明の名称 １ 補正をする者 事件どの関係 特許出履人 １錨装置 （１３−２７０４５７１ 表 補正命令の日付 自 大 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、及び図面。 ６、補正の内容 （１）明細書９頁７行目に記載の「含んだ状態の」を「
含んだ試薬を用いて」と補正する。 （２）明細書９頁７行目から同頁８行目にかけて記載の
「蛋白含有試料についても」を「蛋白含有試料について
測定しても」と補正する。 （３）明細書１７頁１４行目に記載の「検量線を示す、
」の後に「（Ｊ１１定方法は表２の場合に準する。）」
を挿入する。 （４）明細書２２頁頁ｔ行目に記載の「吸光度Ｃ０Ｄ）
Ｊを「吸光度（水対＠）Ｊと補正する。 （５）第１図、及び第２図を別紙のとおり補正する以上 手続補正書 昭和ｌρ年 ｒ月２２日 鳳 事件の表示 葡湘ｓｃ年材杵臘集ｚｌ’Ｈ２ｇ２号 λ 発明の名称 ・ 工 補正をする者 事件との関係 特許出麗人 遍緬先’ｆｆ：Ｌ ０３−２１０４５１１屯 補正命令
の日付 自 他 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、。 ６、補正の内容 （１）明細書！！頁８行目ニ記載ｔｙ） ｒ Ｏ，００
５ＮＯ，０１ＸＪヲｒＯ，０００５〜０．１＄Ｊ ト補
正する。 （２）明細書１１１１４行目に記載＋７） ｒｏ、００
５Ｍ０．０１＄Ｊヲｒｏ、０００５〜０．１１」Ｊ−補
正する。 以上
Claims (5)
- （１）モリブデンと錯体を形成し、さらに蛋白の存在で
波長がシフトする色素を使用した微量蛋白定量法に於て
、試薬中にあらかじめモリブデンと結合するキレート剤
を添加するか、又は前記色素とは反応せず、試料中に共
存が予想されるシュウ酸、クエン酸、リン酸及びこれら
の塩と結合し得る金属イオンを添加することを特徴とす
る微量蛋白定量法。 - （２）微量蛋白が尿蛋白である、特許請求の範囲第１項
記載の定量法。 - （３）キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤ
ＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、
イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロプロピオン酸（ＮＴ
Ｐ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルイ
ミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、クエン酸、酒石酸、シュウ酸
、１−ヒドロキシエタン１，１−ジホスホン酸、ピロリ
ン酸、ヘキサメタリン酸、トリポリリン酸、メタリン酸
、及びこれらの塩類の内、１種又は２種以上である特許
請求の範囲第１項又は第２項記載の定量法。 - （４）金属イオンがアルミニウムイオン又は／及びセリ
ウムイオンである特許請求の範囲第１項又は第２項記載
の定量法。 - （５）色素がピロガロールレッド又はピロカテコールバ
イオレットである特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
れかに記載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27828284A JPS61155757A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 微量蛋白定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27828284A JPS61155757A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 微量蛋白定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61155757A true JPS61155757A (ja) | 1986-07-15 |
| JPH0453265B2 JPH0453265B2 (ja) | 1992-08-26 |
Family
ID=17595175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27828284A Granted JPS61155757A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 微量蛋白定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61155757A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0349843A2 (en) * | 1988-07-05 | 1990-01-10 | Miles Inc. | Composition and method of assaying aqueous liquids for specific gravity |
| EP0658768A2 (en) * | 1993-12-17 | 1995-06-21 | Bayer Corporation | Reduction of background interferences in the molybdate-dye protein assay |
| WO1996030764A1 (de) * | 1995-03-24 | 1996-10-03 | Vorwerk & Co. Interholding Gmbh | Verfahren zur untersuchung von hausstaub |
| EP0877251A1 (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-11 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Dry analytical elements for the determination of protein |
| WO2005071420A1 (ja) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Arkray, Inc. | 蛋白質測定方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4651237B2 (ja) * | 2001-08-10 | 2011-03-16 | シスメックス株式会社 | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の安定化方法及び試薬 |
| JP6276611B2 (ja) * | 2014-02-28 | 2018-02-07 | 関東化學株式会社 | 試料中の総タンパク質の定量方法および該方法に使用する試薬 |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP27828284A patent/JPS61155757A/ja active Granted
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0349843A2 (en) * | 1988-07-05 | 1990-01-10 | Miles Inc. | Composition and method of assaying aqueous liquids for specific gravity |
| AU610412B2 (en) * | 1988-07-05 | 1991-05-16 | Miles Inc. | Composition and method of assaying liquids for specific gravity |
| US5055407A (en) * | 1988-07-05 | 1991-10-08 | Miles, Inc. | Composition and method of assaying aqueous liquids for specific gravity |
| EP0658768A2 (en) * | 1993-12-17 | 1995-06-21 | Bayer Corporation | Reduction of background interferences in the molybdate-dye protein assay |
| EP0658768A3 (en) * | 1993-12-17 | 1996-01-10 | Miles Inc | Reduction of background interference in the molybdate-dye process for determining proteins. |
| WO1996030764A1 (de) * | 1995-03-24 | 1996-10-03 | Vorwerk & Co. Interholding Gmbh | Verfahren zur untersuchung von hausstaub |
| US5981287A (en) * | 1995-03-24 | 1999-11-09 | Vorwerk & Co. Interholding Gmbh | Method for the investigation of house dust |
| EP0877251A1 (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-11 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Dry analytical elements for the determination of protein |
| WO2005071420A1 (ja) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Arkray, Inc. | 蛋白質測定方法 |
| US8460877B2 (en) | 2004-01-23 | 2013-06-11 | Arkray, Inc. | Method of protein measurement |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0453265B2 (ja) | 1992-08-26 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |