KR101027213B1

KR101027213B1 - 형광화 항체를 이용한 형광 분석 방법

Info

Publication number: KR101027213B1
Application number: KR1020057002976A
Authority: KR
Inventors: 마사키 지브
Original assignee: 하마마츠 포토닉스 가부시키가이샤
Priority date: 2002-09-19
Filing date: 2003-09-18
Publication date: 2011-04-06
Also published as: ATE439593T1; DE60328808D1; JP4266367B2; EP1550871B1; CN100552452C; WO2004027424A1; AU2003264497A1; CN1682112A; EP1550871A1; JPWO2004027424A1; EP1550871A4; KR20050058431A

Abstract

본 발명은 항원 항체 반응을 이용하여 생체내 물질 등을 간편하고 고감도로, 아울러 실시간으로 연속적으로 분석(이미징을 포함함)하는 것이 가능한 형광 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 형광 분석 방법은 항원 결합 부위의 일부가 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 항체 및 상기 항체에 의해 인식되고 상기 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 색소를 각각 소정의 농도로 함유하는 항체 색소 용액과 측정 대상 물질을 함유하는 피검체 용액의 혼합 용액을 얻는 혼합 공정; 상기 혼합 용액에 여기광을 조사하고, 상기 혼합 용액으로부터 발생되는 형광의 강도를 측정하여 측정치를 얻는 측정 공정; 및 미리 구한 형광 강도와 측정 대상 물질 농도의 관계에 근거하여 상기 측정치로부터 상기 측정 대상 물질의 농도를 구하는 산출 공정을 포함한다.

Description

형광화 항체를 이용한 형광 분석 방법 {FLUORESCENCE ANALYSIS METHOD WITH THE USE OF FLUORESCENT ANTIBODY}

본 발명은 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 색소를 이용한 형광 분석 방법에 관한 것이다.

생체내의 생체 성분이나 여러 가지의 화학물질(의약품, 환경오염 물질 등)을 분석하는 것은 학술 연구나 질병의 진단·치료에 있어서 매우 중요하다. 그러나, 이들 물질을 분석하기 위한 일반적인 종래 방법은 체액의 채취나 조직의 적출, 나아가 불순물을 제거하기 위한 복잡하고 시간이 걸리는 전처리를 필요로 하기 때문에, 생체내 물질 등을 간편하면서도 고감도로 분석하는 것이 가능한 분석 방법의 개발이 요구되어 왔다.

그 때문에, 이러한 분석을 가능하게 하는 방법의 하나로서 형광 색소 표지 항체를 이용한 면역 측정법(이뮤노 어세이 및 이뮤노 메트릭 어세이)이 개발되고 있다. 즉, 이러한 면역 측정법에 의하면, 항원 항체 반응에 의한 특이적 분자 인식 기능에 의해 선택성이 높은 분석이 가능해짐과 함께, 형광 분석에 의해 불순물을 제거하지 않고도 측정 대상 물질을 선택적으로 측정하는 것이 가능해진다. 그리고, 형광 색소 표지 항체로는 미리 형광 색소로 표지된 항체가 일반적으로 사용 되어 항원 결합 부위에 의해 하나의 물질 (항원)이 특이적으로 인식된다. 또한, 일본 특개평 4-211363호 공보에 있어서는 두 개의 항원 결합 부위를 가지고 있어, 그 한편이 티슈 플라스미노겐 액티베이터(tissue plasminogen activator)에 대해 야기되고 다른 한편이 형광 물질 등의 라벨(label)에 대해 야기되는 이중 특이성의 하이브리드 모노클로날(hybrid monoclonal) 항체가 개시되어 있다. 또한, 일본 특개평 9-5324호 공보에 있어서는 비형광성 색소를 면역성 물질에 부가하여 형성한 항원에 대한 항체가 개시되어 있다. 또한, 일본 특개평 11-183477호 공보에 있어서는 인슐린 및 말라카이트그린(MG)의 결합 물질(MG 표지 인슐린)과 이 결합 물질을 항원으로 하는 항 MG-Ins 항체의 항원 항체 반응에 근거하는 형광 강도의 변화를 인슐린의 존재하에 측정하는 형광 면역 측정 방법이 개시되어 있다.

본 발명자는 항원 항체 반응은 비가역적이라는 것이 당업자의 기술 상식이고(예를 들면, 「플루오로이뮤노어세이」 미야이 키요시 등, 코단샤 사이언티픽 p.57-58(1985); K. Ichihara et a1., Clinica Chimica Acta Vol.98, p.87-100 (1979); 등), 종래의 면역 측정 방법으로는 생체내 물질 등의 양의 변동을 실시간으로 연속하여 분석하는 것이 곤란하다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자는 일본 특개평 11-183477호 공보에 기재된 MG 표지 인슐린과 항 MG-Ins 항체의 항원 항체 반응에 즈음해서는 인슐린을 인식하는 부위(인슐린 인식 부위)에서 인슐린과 MG 표지 인슐린의 경합 반응이 일어나 최종적으로 거의 모든 MG 표지 인슐린이 인슐린 인식 부위를 차지하여 정상 상태에 이르게 된다는 것, 즉 인슐린과 MG 표지 인슐린의 경합 반응이 비가역 반응이라는 것, 및 그 때문에 이러한 항원 항체 반응을 이용한 면역 측정 방법으로는 생체내 물질 등의 양의 변동을 실시간으로 연속하여 분석하는 것이 곤란하다는 것을 발견하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술이 가지는 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 항원 항체 반응을 이용하여 생체내 물질 등을 간편하면서도 고감도로, 또한 실시간으로 연속적으로 분석(이미징을 포함함)하는 것이 가능한 형광 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 상기 목적을 달성하기 위하여 열심히 연구를 거듭한 결과, 본 발명자가 발명하여 이미 특허 출원하고 있는 일본 특개평 9-5324호 공보에 기재된 항체, 즉 비형광성 색소를 면역성 물질에 부가하여 형성한 항원에 대한 항체를 비형광성 색소 단체 및 면역성 물질 단체의 존재하에 이용한 항원 항체 반응이 놀랄만하게도 가역적이라는 것을 발견하고, 아울러 이와 같은 가역적인 항원 항체 반응을 이용하여 형광 분석을 실시함으로써 상기 목적이 달성되는 것을 발견하기에 이르러 본 발명에 도달하였다.

즉, 본 발명은 항원 결합 부위의 일부가 색소를 인식하고 또한 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 항체 및 상기 항체에 의해 인식되는 한편 상기 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 색소를 각각 소정의 농도로 함유하는 항체 색소 용액과 측정 대상 물질을 함유하는 피검체 용액의 혼합 용액을 얻는 혼합 공정, 상기 혼합 용액에 여기광을 조사하고 상기 혼합 용액으로부터 발생되는 형광의 강도를 측정하여 측정치를 얻는 측정 공정 및 미리 구해진 형광 강도와 측정 대상 물질 농도의 관계에 기초하여 상기 측정치로부터 상기 측정 대상 물질의 농도를 구하는 산출 공정을 포함하는 형광 분석 방법에 있다.

본 발명의 형광 분석 방법에서는 상기 항체 색소 용액과 상기 피검체 용액의 혼합 용액중에서 상기 색소와 상기 측정 대상 물질이 각각 항원 항체 반응에 의해 상기 항체에 결합하고 항체에 결합한 색소는 비형광성으로부터 형광성으로 변한다. 이때, 항체에 대한 색소의 결합은 공존하는 측정 대상 물질의 양에 영향을 받기 때문에, 항체에 결합한 색소에 의해 발생된 형광의 강도는 공존하는 측정 대상 물질의 양에 따라 저해 또는 증강된다. 그 때문에, 색소와 항체의 양이 일정한 용액에서는 형광 강도와 측정 대상 물질 농도가 상관하는 것이 되고, 이러한 상관관계(검량선)에 근거하여 실제 형광 강도의 측정치로부터 측정 대상 물질의 농도가 구해진다. 따라서, 본 발명의 형광 분석 방법에서는 항원 항체 반응에 의한 특이적 분자 인식 기능에 의해 선택성이 높은 고감도의 분석이 가능함과 함께, 불순물의 영향을 받기 어려운 형광 분석에 의해 불순물을 제거하지 않고서도 측정 대상 물질을 선택적으로 간편하게 측정하는 것이 가능해진다. 그리고, 본 발명에 따른 항원 항체 반응, 즉 상기 항체에 있어서의 상기 색소를 인식하는 부분과 상기 색소의 결합 반응 및 상기 항체에 있어서의 상기 측정 대상 물질을 인식하는 부분과 상기 측정 대상 물질의 결합 반응은 항원 항체 반응은 비가역적이라는 종래의 기술 상식에 반해 가역적이고, 상기 항체에 있어서의 상기 색소 및 상기 측정 대상 물질을 인식하는 부분이 상기 색소나 상기 측정 대상 물질로 채워져 정상 상태에 이르는 것은 없기 때문에, 측정 대상 물질의 양의 변동에 대응하여 형광 강도가 변동하는 것을 이용하여 실시간으로 연속적으로 분석(이미징을 포함함)하는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명의 형광 분석 방법에 있어서, 상기 산출 공정 이후 다시 피검체 용액을 상기 혼합 용액에 첨가하여 혼합하고 상기 측정 공정 및 상기 산출 공정을 실행하여 측정 대상 물질의 농도를 반복적으로 구하는 연속 분석 공정을 더 포함하고 있어도 무방하다. 이러한 연속 분석 공정을 포함함으로써 측정 대상 물질의 농도를 실시간으로 연속적으로 분석하는 것이 가능하게 된다.

또한, 상기 산출 공정은 상기 피검체 용액의 첨가에 수반되는 체적 변화에 따라 상기 측정치를 보정하여 형광 강도 보정치를 얻는 공정과, 미리 구하여져 있는 형광 강도 보정치와 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도의 관계에 기초하여 상기 형광 강도 보정치로부터 상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도를 구하는 공정과, 상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도로부터 상기 피검체 용액 중의 측정 대상 물질의 농도를 구하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 공정을 포함함으로써, 피검체 용액의 첨가에 수반되는 혼합 용액 중의 색소 및 항체의 농도 변화를 무시할 수 없는 경우에도 그러한 농도 변화가 없는 상태로 보정되어 분석 정도의 저하가 충분히 방지된다.

또한, 본 발명의 형광 분석 방법은 항원 결합 부위의 일부가 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 항체 및 상기 항체에 의해 인식되고 상기 항체에 결합되면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 색소를 각각 소정의 농도로 함유하는 항체 색소 용액과 측정 대상 물질을 소정의 농도로 함유하는 표준 용액의 혼합 용액을 얻는 혼합 공정, 상기 혼합 용액에 여기광을 조사하여 상기 혼합 용액으로부터 발생되는 형광의 강도를 측정하여 측정치를 얻는 측정 공정, 다시 표준 용액을 상기 혼합 용액에 첨가하여 혼합한 후 상기 측정 공정을 실행하여 형광 강도의 측정치를 반복적으로 구하는 연속 측정 공정, 및 상기 측정 공정 및 상기 연속 측정 공정에서 얻은 측정치와 상기 측정 대상 물질의 첨가량에 기초하여 형광 강도와 측정 대상 물질 농도의 관계를 구하는 검량선 작성 공정을 추가로 포함하고 있어도 무방하다. 이러한 공정을 포함함으로써 형광 강도와 측정 대상 물질 농도의 상관관계, 즉 검량선을 효율 좋게 얻는 것이 가능해진다.

또한, 상기 검량선 작성 공정은 상기 표준 용액의 첨가에 수반되는 체적 변화에 따라 상기 측정치를 보정하여 형광 강도 보정치를 얻는 공정과, 상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도를 산출하는 공정과, 상기 형광 강도 보정치와 상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도의 관계를 구하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 공정을 포함함으로써 피검체 용액의 첨가에 수반되는 혼합 용액 중의 색소 및 항체의 농도 변화를 무시할 수 없는 경우에도 그러한 농도 변화가 없는 상태로 보정되어 검량선 정도의 저하가 충분히 방지된다.

또한, 본 발명과 관련되는 상기 색소로는 트리페닐메탄 구조를 가지는 색소 및 디페닐메탄 구조를 가지는 색소가 바람직하고, 말라카이트그린 또는 오라민 O 인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명과 관련되는 상기 항체로는 (ⅰ) 상기 색소와 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체, 혹은 (ⅱ) 항체에 의해 인식되고 상기 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하기 위하여 필요한 구조가 상기 색소와 공통되는 색소 및 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체인 것이 바람직하고, 이러한 항체와 색소의 조합으로는 (ⅰ) 상기 항체가 말라카이트그린과 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체이고 상기 색소가 말라카이트그린인 조합 혹은, (ⅱ) 상기 항체가 말라카이트그린과 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체이고 상기 색소가 오라민 O 인 조합인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 형광 분석 방법에 따르는 상기 측정 대상 물질로는 면역 측정의 대상이 될 단백질, 호르몬, 비타민, 균체, 환경오염 물질 및 의약품으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

도 1은 항원으로서의 MG-측정 대상 물질 복합체를 보여주는 모식도이다.

도 2는 항원 인식 부위가 MG와 측정 대상 물질의 모두를 인식한 상태를 보여주는 모식도이다.

도 3은 MG와 항체의 항원 항체 반응을 보여주는 모식도이다.

도 4는 측정 대상 물질과 항체의 항원 항체 반응을 보여주는 모식도이다.

도 5는 항체, MG 및 측정 대상 물질 3자(三者)간의 항원 항체 반응을 보여주는 모식도이다.

도 6a 및 도 6b는 각각 항체-MG 간의 항원 항체 반응에 미치는 측정 대상 물질의 영향을 보여주는 모식도이다.

도 7은 반감기는 MG-항체가 측정 대상 물질-항체보다 긴 것을 보여주는 모식도이다.

도 8은 본 발명에 따른 검량선 작성 방법의 매우 바람직한 한 실시예를 보여주는 플로우 차트이다.

도 9는 본 발명의 형광 분석 방법의 매우 바람직한 한 실시예를 보여주는 플로우 차트이다.

도 10은 항 MG-Ins 혈청의 항체값을 보여주는 그래프이다.

도 11은 항 MG-Ins Fab와 MG를 반응시켰을 때의 MG의 형광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.

도 12는 MG 농도와 MG 형광 강도의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 13은 인슐린 농도와 MG 형광 강도의 관계(검량선)를 보여주는 그래프이다.

도 14는 항 MG-Ins IgG 와 AO를 반응시켰을 때의 AO의 형광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.

도 15는 인슐린 농도와 AO 형광 강도의 관계(검량선)를 보여주는 그래프이다.

도 16은 인슐린과 항인슐린 IgG를 반복적으로 첨가했을 때의 AO의 형광 강도 변화를 보여주는 그래프이다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

이하, 도면을 참조하면서 본 발명의 형광 분석 방법의 매우 바람직한 실시형태에 대해 상세히 설명한다. 아울러, 도면 중 동일 또는 상당 부분에는 동일한 부 호를 붙이는 것으로 한다.

(색소)

본 발명에서 사용되는 색소는 물 등의 통상의 용매 중에서 비형광성이며, 후술하는 항체에 결합하면 형광성으로 변하는 것이면 되고, 특별히 제한되지는 않는다. 아울러, 본 발명에 있어서 "비형광성"이란 실질적으로 형광성이 아닌 것을 의미하며, 통상의 측정 조건에서는 형광 스펙트럼을 나타내지 않거나 지극히 약한 형광만 나타내어 실질적으로는 시판 장치 등에 의해 형광 분석(형광 분광 분석)을 할 수 없다고 간주되는 것이 바람직하다(니시카와 타이지 등, "형광 인광분석법", 공립출판, 30페이지, 1984년). 이러한 실질적으로 형광성을 나타내지 않는 색소로는 형광양자수율이 특정의 조건에서 1% 미만의 것이 바람직하고, 형광양자수율이 특정의 조건에서 0.O1% 이하인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서 색소가 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변한다는 것은, 실질적으로 형광성이 아닌 색소가 항체에 결합하면 형광성이 되어(형광성이 높아져) 통상의 형광 분석으로 얻을 수 있는 감도 이상의 분석 감도를 얻음으로써 형광 분석이 가능해지는 것을 의미하며, 색소의 형광양자수율이 통상의 측정 조건에서는 지극히 작은 상태(예를 들면 0.O1% 이하)로부터 본 발명에 따른 처리에 의해 항체와 결합(상호작용)함으로써 형광양자수율이 큰 상태(예를 들면 1% 이상)로 변화하는 것이 바람직하다.

상기에서, 색소가 비형광성으로부터 형광성으로 변할 때의 형광 강도의 증가는 형광양자수율이 적어도 1O 배 이상 증가하는 것이 바람직하고, 적어도 1OO 배 이상 증가하는 것이 더욱 바람직하며, 적어도 1,OOO 배 이상 증가하는 것이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명에서 사용 가능한 색소는 반드시 가시부의 흡수를 가질(35O nm 이상에서 흡수 최대치를 가진다) 필요는 없고, 자외부의 흡수를 가지는 것(35O nm 이하에서 흡수 최대치를 가진다), 또는 흡수 밴드가 가시부까지 미치고 있는 것이라도 무방하다.

본 발명에서 사용 가능한 색소의 분자 구조는 특히 제한되지 않으며, 여러 가지의 발색단(크로모포아)을 포함하는 것이 사용 가능하고, pH가 중성 부근에서 안정한 발색단을 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 색소로는, 예를 들면, 분자 구조중에 트리페닐메탄 골격을 가지는 색소(예를 들면, 코단샤 사이언티픽사, 대하원신편, 「색소 핸드북」 참조)인 것이 바람직하고, 이러한 트리페닐메탄계 색소로는 아래와 같은 화학 구조를 가지는 말라카이트그린(MG)이 특히 바람직하다.

또한, 이러한 색소로는 분자 구조 중에 디페닐메탄 골격을 가지는 색소(예를 들면, 코단샤 사이언티픽사, 대하원신신편 「색소 핸드북」참조)도 바람직하고, 이러한 디페닐메탄계 색소로는 아래와 같은 화학 구조를 가지는 오라민 O (AO)가 특히 바람직하다.

이러한 말라카이트그린이나 오라민 0 를 이용하면 약 1,OOO 배 이상의 형광양자수율 증가를 얻을 수 있다. 또한, 이러한 색소 이외에도 CCVJ (9-(dicyanovinyl)julolidine)계 색소, ANS (아닐리노 나프탈렌)계 색소, TNS (p-톨루이디닐나프탈렌)계 색소, DNP (2,4-디니트로페닐)계 색소도 바람직하게 이용 가능하다.

아울러, 말라카이트그린은 수용액 중에서는 거의 무형광이지만 항 MG 항체와 결합하면 형광성이 된다. 이것은 말라카이트그린의 분자내 운동이 항체에 의해 억제된 결과, 말라카이트그린이 여기광을 흡수한 후 수용액 중에 있는 경우에 비해 분자내 운동의 열적 과정(= 비복사(非輻射) 과정)에서 기저 상태로 돌아오는 확률이 상대적으로 감소하여, 복사 과정으로의 실활(= 형광을 발함)이 상대적으로 증가하기 때문이라고 본 발명자는 추측하고 있다. 이것은 동일한 화학 구조나 동일한 실활 과정을 가지는 색소 전반의 경우에 잘 들어 맞는다(디페닐메탄계 색소, 트리페닐메탄계 색소). 또한, 메카니즘은 다를 지라도 항체에 의해서 형광 강도가 현저하게 늘어나는 색소는 그 밖에도 알려져 있다(Tomomichi Iwaki et al., Biochemistry 1993, Vo1.32, p.7589-4592; 단백 핵산 효소 별책 「형광 측정의 원리와 생체계로의 응용」 소야사창언(小野寺昌彦) (금강우일타(金岡祐一他) 편집) 공립출판, 1974년, p.189-197).

(측정 대상 물질)

본 발명의 형광 분석 방법에 적용 가능한 측정 대상 물질로는 상기 색소와 결합한 물질(복합체)이 항원으로 기능하는 것이라면 되고, 특별히 제한되지는 않는다. 아울러, 본 발명에 따른 측정 대상 물질 자체는 반드시 면역성 물질일 필요는 없다. 즉, 면역 관용·저-항원성 물질에 대해서는 통상 항체를 얻을 수 없지만, 본 발명에서는 측정 대상 물질에 인공 화합물인 색소가 결합된 복합체를 항원으로 이용하여 항체를 얻기 때문에, 측정 대상 물질 자체가 면역 관용·저-항원성 물질이어도 색소와의 복합체는 면역성이 될 가능성이 높고, 후술하는 방법에 의해 항체를 얻는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명의 형광 분석 방법에서는 무기 이온이나 유기 이온을 제외한 광범위한 물질을 측정 대상 물질로 적용 가능하고, 그 중에서도 면역 측정의 대상이 될 단백질(인슐린 등), 호르몬, 비타민, 균체, 환경 오염물질 및 의약품으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 측정 대상 물질로서 바람직하다.

아울러, 측정 대상 물질 자체가 항원이 되기에 충분한 분자량(통상, 약 5,0OO 이상)을 가지는 것이라면, 그러한 측정 대상 물질 모두에 대해 후술하는 항체를 제조할 수 있다. 즉, 비록 측정 대상 물질이 면역되는 동물에 있어서 면역 관용인 물질(그 동물종의 생체내 성분인 경우 등)일 지라도, 후술하는 항체는 제조 가능하다. 왜냐하면, 본 발명과 관련되는 항원은 측정 대상 물질 자체가 아니고, 거기에 인공물인 색소가 결합된 인공 물질이기 때문이다.

또한, 측정 대상 물질 자체는 항원이 되는데 충분한 분자량을 가지지 않는 경우일 지라도, 색소와 측정 대상 물질의 복합체에 대해 항원성을 가지는 담체를 추가적으로 공유결합으로 가교한 것을 제조하여, 이것을 항원으로서 이용하면 된다. 이 경우에도, 항원 인식 부위가 색소와 측정 대상 물질 양자(兩者)를 인식하는 형태를 하고 있는 하기의 항체를 얻을 수 있다.

(항체)

본 발명에서 사용되는 항체는 그 항원 결합 부위의 일부가 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 것이다. 즉, 본 발명에 따른 항체는 하나의 항원 결합 부위가 공간적으로 복수의 부분에 분해되어 있어 그 일부가 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식한다. 이와 같이, 하나의 항원 결합 부위에 복수의 다른 기능을 갖게 한 기술은 종래에는 존재하지 않고 본 발명자에 의해 처음으로 발명된 것이다.

이러한 본 발명에 따른 항체는 본 발명의 형광 분석 방법에서 사용되는 색소와 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하여 매우 적합하게 형성되며, 예를 들면, 분석에 이용되는 색소가 말라카이트그린인 경우, 상기 항체는 말라카이트그린과 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체인 것이 바람직하다.

또한, 분석에 이용되는 색소와 항체를 얻기 위한 색소는 반드시 동일할 필요는 없으며, 항체에 의해 인식되고 항체와 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하기 위해 필요한 구조가 양자에게 공통되는 색소를 이용해도 무방하다. 이러한 구조가 공통되는 색소의 조합으로는 말라카이트그린과 오라민 0 의 조합을 들 수 있다. 따라서, 예를 들면, 분석에 이용되는 색소가 오라민 O 인 경우, 상기 항체는 말라카이트그린과 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체라도 무방 하다.

(색소와 측정 대상 물질의 복합체(항원)의 제작)

본 발명에 따른 상기 색소와 측정 대상 물질의 복합체(항원)의 제작 방법에 대해서는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 상기의 측정 대상 물질과 색소를 소정 시간 교반 혼합하고, 겔 여과 크로마토그라피를 이용하여 색소와 측정 대상 물질의 복합체인 항원의 분획을 분리하는 것이 가능하다.

또한 필요한 경우에는, 예를 들면, 면역 반응을 이용하는 정제 수단을 이용하여 얻게 되는 항원을 정제하는 것도 가능하다(천도굉일랑(川島紘一郞)(역) 「이뮤노 어세이 입문」, 남산당, 7O페이지, 1987년). 또한, 얻게 되는 항원의 농도는 예를 들면, 로우리(Lowry) 법으로 정량 가능하다.

(항혈청의 제작)

본 발명에 따른 상기 항체는 하기에 설명된 면역 공정으로 바람직하게 제작 가능하다.

즉, 본 발명에 따른 상기 항체는 면역 동물에 상기 복합체(항원)를 투여한 후 면역 동물로부터 혈액을 채취하고, 상기 혈액으로부터 항혈청을 분리함으로써 제작 가능하다. 상기 복합체(항원)를 투여하는 면역 동물은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 토끼, 모르모트 등이 매우 적합하게 사용 가능하다. 또한, 사용 가능한 면역 아주반트(adjuvant)도 특별히 제한되는 것은 아니지만, 일반적인 프로인트 불완전 아주반트, 알루미늄 아주반트 등이 매우 적합하게 사용 가능하다. 또한, 사용 가능한 면역 주사법에 대해서도 특별한 제한은 없지만, 예를 들면, 모르모트에 대해 피하 주사, 복강내 주사 등이 매우 적절하게 사용될 수 있다. 또한, 항혈청의 생산 확인 및 채취와 관련하여, 필요하면 추가 면역을 실시하여 시험 채취를 실시한 후 항체값을 조사함으로써 행할 수 있다.

채취된 항혈청을 분리하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 일반적인 방법, 예를 들면 채혈 혈액을 응고시킨 후 원심분리에 의해 혈청을 분리하는 것이 가능하다. 얻게 된 항혈청의 상기 복합체(항원)에 대한 특이적 항체 활성은 바람직하게는 효소 면역 반응 등으로 측정 가능하다(도설 형광 항체법-그 원리와 기술 및 응용 1」 천생명저(川生明著), p.135-138, soft science사, 1983년).

(IgG 분획의 제작)

본 발명에서는 상기 항혈청 중의 항체를 이용해도 되지만, 항혈청을 정제하여 얻게 되는 IgG 분획을 항체로 이용해도 무방하다. 이러한 항혈청으로부터 IgG 분획을 정제하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 염석법, 겔여과법, 이온교환크로마토그라피법 등이 사용 가능하고, 특히 단백질 A 법이 바람직하게 사용 가능하다. 얻게 된 IgG 분획을 다시 원심법에 의해 농축하여도 되며, 이와 같이 하여 IgG 분획을 소정의 농도로 조정 가능하다.

(항원 결합성 프래그먼트(fragnent)(Fab)의 제작)

본 발명에서는 상기 IgG 분획으로부터 제조한 항원 결합성 프래그먼트(Fab)를 항체로 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 항원 결합성 프래그먼트(Fab)를 이용하면 측정 대상 물질과의 면역 복합체 침전 생성이 보다 확실하게 방지되는 경향이 있다. 이러한 IgG 분획으로부터 항원 결합성 프래그먼트(Fab)를 제조하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 소화 효소(소화 효소 파파인 등)를 이용하여 IgG 분획을 소화시켜 항원 결합성 프래그먼트(Fab)를 얻는 것이 가능하다. 또한, 얻게 된 항원 결합성 프래그먼트(Fab)를 단백질 A 법과 같은 면역 침강법 등에 의해 정제하는 것이 바람직하고, 다시 원심법에 의해 농축하여도 된다. 이와 같이 하여 항원 결합성 프래그먼트(Fab)를 소정의 농도로 조정 가능하다.

(본 발명의 형광 분석 방법의 원리)

본 발명의 형광 분석 방법에서는 전술한 항체, 색소 및 측정 대상 물질을 용액 중에 혼합시키면 색소와 측정 대상 물질이 각각 항원 항체 반응에 의해서 항체에 결합하고 항체에 결합한 색소는 비형광성으로부터 형광성으로 변하게 된다. 그 때, 항체에 대한 색소의 결합은 공존하는 측정 대상 물질의 양의 영향을 받게 되어 항체에 결합한 색소에 의해 발생되는 형광의 강도는 공존하는 측정 대상 물질의 양에 따라 저해 또는 증강된다. 또한, 본 발명에 따른 항원 항체 반응은 "항원 항체 반응은 비가역적이다"라는 종래의 기술 상식에 반해 가역적이고, 측정 대상 물질 양의 변동에 대응하여 형광 강도가 변동한다. 이러한 본 발명의 형광 분석 방법의 원리는 하기와 같다고 본 발명자는 추측하고 있다. 아울러, 본 발명에서 사용되는 색소를 대표하여 말라카이트그린(이하, "MG"라 약칭함)을 이용했을 경우를 예를 들어 설명한다.

한편, MG는 단독으로 항원으로 하기에는 분자량이 너무 작으므로, 항 MG 항체를 얻는 경우에는 보다 분자량의 큰 물질(담체)에 MG를 공유결합으로 가교시킨 화합물이 항원으로 동물에 투여된다. 그 때, 담체로서 측정 대상 물질을 선택하 면, 항원은 MG와 측정 대상 물질의 공유결합에 의한 복합체(도 1에 표시된 MG-측정 대상 물질 복합체)로 된다. 이렇게 해서 얻게 되는 항체(IgG 등)에는 도 2에 나타난 바와 같이 그 항원 인식 부위가 MG와 측정 대상 물질 양자를 인식하는 형태를 하고 있는 것이 포함된다.

상기 항체와 MG를 용액 중에서 혼합하면 항원 항체 반응이 일어나, 도 3에 나타난 바와 같이 MG는 항체의 항원 결합 부위에(비공유결합적으로) 결합하게 된다. 상기 결합의 해리 속도 정수를 kd-MG로 한다. 한편, 측정 대상 물질을 상기 항체와 용액 중에서 혼합했을 경우에도 동일하게 도 4에 나타낸 바와 같이 측정 대상 물질은 항체의 항원 결합 부위에(비공유결합적으로) 결합한다. 상기 해리 속도 정수를 kd-anal 이라 한다. 그러나, MG와 측정 대상 물질 모두 항원(즉, MG-측정 대상 물질 복합체)의 일부분에 지나지 않기 때문에, MG 단독과 항체의 결합(이하, 「MG-항체 결합」 이라 함), 측정 대상 물질 단독과 항체의 결합(이하, 「측정 대상 물질-항체 결합」 이라 함)의 각각은 원래의 항원인 MG-측정 대상 물질 복합체와 항체의 결합보다 약하다고 추측된다. 즉, MG-측정 대상 물질 복합체와 항체의 결합의 해리 속도 정수를 kd-Ag 라 하면, 해리 속도 정수가 작은 것이 해리하기 어려운, 즉 결합이 강한 것이기 때문에, 각 해리 속도 정수의 관계는

kd-Ag < kd-MG

kd-Ag < kd-anal

가 된다.

이후, 상기 항체, MG 및 측정 대상 물질의 3자(三者)를 혼합하면, 도 5에 나 타낸 바와 같이 MG와 측정 대상 물질 모두 항체의 항원 결합 부위와 결합하게 된다. 그리고, MG와 측정 대상 물질 모두가 항원 결합 부위에 들어갔을 때가, MG-측정 대상 물질 복합체가 항체에 결합한 도 2에 표시된 상태에 가깝기 때문에, 가장 안정하다고 추측된다. 그러나, 이때 MG-항체 결합에 측정 대상 물질이 영향을 미칠 가능성이 있고, 측정 대상 물질-항체 결합에 MG가 영향을 미칠 가능성도 있다. 그 반응속도론은, 항원 결합 부위내에서 MG와 측정 대상 물질 각각이 차지하는 위치(어느 쪽이 보다 안쪽에 있을까)와 각각의 해리 속도 정수로부터 결정된다고 추측된다. 예를 들면, MG가 측정 대상 물질보다 안쪽 위치에 결합한다면, 측정 대상 물질이 먼저 항체와 결합하면 도 6A에 나타낸 바와 같이 MG의 결합이 저해되는 반면, 먼저 MG가 결합하면 도 6B에 나타낸 바와 같이 MG의 결합은 그 후의 측정 대상 물질의 결합에 의해 MG 단독의 경우일 때보다 안정화되어 증강된다. 이러한 증강은 MG-항체 결합의 kd-MG가 외관상 작아진 것에 대응된다. 즉, 이러한 외관상 해리 속도 정수를 kd-MG'로 하면, kd-MG' < kd-MG가 된다. 그리고, kd-MG 및 kd-anal 가 동일한 정도라면, 이러한 저해와 증강은 큰 차이 없이 일어난다고 추측된다.

그러나, 양자에게 차이가 있는 경우, 저해와 증강 중 어느 쪽이 우위에 있게 된다. 일반적으로, 항원 항체 복합체의 반감기 t_1/2 은 t_1/2 = O.693/kd 로 구해진다. 즉, kd 가 작은 것이 반감기가 길다. 따라서, kd-MG < kd-anal 의 경우에는 도 7에 나타낸 바와 같이 반감기는 MG-항체 결합인 때 보다 길어진다. 이럴 경우, 도 6a에 표시되는 저해가 일어나도, 비교적 단시간내에 측정 대상 물질이 항체로부터 해리해 버리게 되고, 그 후 MG가 결합하여 보다 긴 반감기로 MG-항체 결합을 계속 형성하게 된다. 그리고, 거기에는 측정 대상 물질이 결합할 수 있게 되어 결과적으로 증강이 일어나게 된다(kd-MG' < kd-MG 가 됨). 반대로, kd-anal < kd-MG (MG의 해리가 빠름)의 경우에는, MG가 결합하더라도 측정 대상 물질이 결합하고 증강을 받기 전에 항체로부터 해리해 버리게 되므로, 증강이 일어나기 어려워져 저해가 지배적으로 된다.

실제로는, 얻게 된 항체에서 kd-MG와 kd-anal의 대소 관계는 가지각색이라고 추측되고, 모노클로날 항체의 경우에는 각 항체 클론으로, 폴리클로날 항체의 경우에는 포함되는 각 모노클로날 항체의 총체로서 저해와 증강의 어느 쪽이 일어난다고 추측된다.

본 발명은 이러한 현상을 이용하는 것이다. 즉, MG-항체 결합에 착안하면, MG와 항체를 일정량 유지했을 경우, 저해 혹은 증강의 정도는 공존하는 측정 대상 물질의 양에 의존하게 되고, 그것은 MG의 형광 강도의 변화로 나타나게 된다. 따라서, MG의 형광 강도 변화를 측정함으로써 측정 대상 물질의 검출·정량이 가능하게 된다.

그리고, 본 발명에 따른 상기 항원 항체 반응은 "항원 항체 반응은 비가역적이다"라는 종래의 기술 상식에 반해 가역적이다. 그 때문에, 측정 대상 물질의 양의 변동에 대응하여 MG의 형광 강도가 변동하게 되고, 그 형광 강도 변화를 측정함으로써 측정 대상 물질을 실시간으로 연속적으로 분석하는 것이 가능해진다.

(검량선의 작성)

본 발명의 형광 분석 방법과 관련하여, 실시료의 측정에 우선하여 형광 강도와 측정 대상 물질 농도간의 관계를 나타내는 검량선을 미리 작성해 두는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 검량선 작성 방법의 매우 적합한 실시예에 대하여 도 8에 나타나 있는 플로우 차트(flow chart)에 근거하여 상세히 설명한다.

도 8에 표시된 플로우 차트와 관련하여, 먼저 항원 결합 부위의 일부가 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 상기 항체와, 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 상기 색소를 각각 소정 농도(항체 농도 : Y μM , 색소 농도 : Z μM) 함유하는 항체 색소 용액 A ㎖를 제조한다(S1O1). 또한, 이용하는 용매는 특별히 제한되는 것은 아니지만, pH 가 중성 부근(바람직하게는 pH 6.5∼7.5)의 완충액인 것이 바람직하고, 이러한 용매로는 예를 들면 인산 완충 생리식염수를 들 수 있다.

그리고, 상기 항체 색소 용액을 형광 측정용 셀(cell)에 넣어 이용하는 색소 등에 따라 여기 광파장 및 형광 파장을 각각 소정치로 설정한 형광 분광 광도계에 세팅한다. 이때, 차수 n 의 초기치를 n = 1 로 설정한다(S1O2). 아울러, 셀 홀더(holder)의 온도를 일정 온도에 유지하는 것이 바람직하고, 유지 온도는 25∼37℃ 범위내의 온도인 것이 바람직하다. 또한, 셀 중의 용액을 소정 시간 교반시키는 것이 바람직하다.

이후, 측정 대상 물질을 소정 농도(X μM) 함유하는 표준 용액 B_n ㎖를 셀 중의 용액에 첨가하고, 얻게 되는 혼합 용액을 소정 시간 교반하여 색소 및 측정 대상 물질과 항체의 항원 항체 반응을 진행하게 한다(S103, 혼합 공정). 아울러, 표준 용액에 이용되는 용매도 특별히 제한되는 것은 아니지만, 항체 색소 용액에 이용된 용매와 동일하게 pH 가 중성 부근인 완충액(예를 들면, 인산 완충 생리식염수)인 것이 바람직하다.

계속하여, 셀 중의 혼합 용액에 소정의 여기 광파장을 가지는 여기광을 조사하고, 그 혼합 용액으로부터 발생되는 소정의 형광 파장을 가지는 형광의 강도를 측정하여 측정치 I_n을 얻게 된다(S1O4, 측정 공정). 아울러, 여기광의 조사 및 형광 강도를 측정하는 구체적인 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 형광 강도 측정치 I_n으로는 소정의 측정 시간 동안의 형광 강도의 평균치나 적분치가 매우 적합하게 얻어진다. 또한, 측정 대상 물질 미첨가 상태의 형광 강도를 블랭크로 하여 실제 형광 강도 측정치로부터 블랭크 값을 공제한 값을 형광 강도의 측정치 I_n이라고 해도 무방하다(단, 이 경우에는 실제 측정치에 대해 표준 용액 등의 첨가에 수반되는 체적 변화에 따른 보정을 마친 후 블랭크 값을 공제하는 것으로 한다).

그리고, 이와 같이 하여 얻을 수 있는 형광 강도 측정치 I_n을 상기 표준용액의 첨가에 수반되는 체적 변화에 따라 보정하여, 항체 농도가 Y μM 이고 색소 농도가 Z μM 인 용액에 있어서의 형광 강도에 상당하는 형광 강도 보정치 I_n' 을 산출한다(S1O5). 아울러, 형광 강도의 체적 변화를 보정할 때의 계산식은 하기의 수식 (1):

(1)

이고, 차수 n = 1 일 경우에는

I₁' = I₁ × {(A + B₁) / A} (1)'

가 된다.

또한, 형광 강도를 측정한 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n' μM 을 산출한다(S1O6). 아울러, 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도를 산출할 때의 계산식은 하기의 수식(2):

(2)

이고, 차수 n = 1 일 경우에는

X₁' = X × {B₁ / (A + B₁)} (2)'

가 된다.

이와 같이 하여 차수 n = 1 일 경우의 형광 강도 보정치 I_n' 및 측정 대상 물질 농도 X_n' 을 얻은 후, 차수 n 에 1 을 부가하고(S1O8), 전술한 표준 용액 B_n ㎖를 첨가 혼합(S1O3), 형광 강도 측정치 I_n 을 취득(S1O4), 형광 강도 보정치 I_n' 의 산출(S105) 및 측정 대상 물질 농도 X_n' 의 산출(S1O6)을 재차 수행하여 차수 n = 2 일 경우의 형광 강도 보정치 I_n' 및 측정 대상 물질 농도 X_n' 을 얻는다. 아울 러, 차수 n = 2 일 경우에는 상기 수식 (1)은

I₂' = I₂ × {(A + B₁ + B₂) / A} (1)"

가 되고, 상기 수식 (2)는

X₂' = X × {(B₁ + B₂) / (A + B₁ + B₂)} (2)"

가 된다.

또한, 이와 같이 얻을 수 있는 형광 강도 보정치 I_n' 가 표준 용액을 첨가해도 변화되지 않게 될 때까지, 즉 (I_n' - I_n-l')의 값이 설정치(예를 들면, 0) 이하가 될 때까지(S1O7), 상기 S1O8 → S1O3 → S1O4 → S105 → S1O6 → S1O7 을 반복하여(연속 측정 공정), 차수 n 이 1 로부터 n 일 경우의 형광 강도 보정치 I_n' 및 측정 대상 물질 농도 X_n' 을 각각 얻는다.

그리고, 이와 같이 하여 얻을 수 있는 차수 n 이 1 로부터 n 일 경우의 형광 강도 보정치 I_n' 및 측정 대상 물질 농도 X_n' 에 근거하여, 형광 강도 보정치 I_n' 과 측정 대상 물질 농도 X_n' 의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다(S1O9, 검량선 작성 공정). 아울러, 이들 수치를 검량선화 하는 구체적인 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 최소이승법 등의 공지의 방법을 적당히 이용하여 보다 정도가 높은 검량선을 얻을 수 있다.

(실시료의 측정) 본 발명의 형광 분석 방법의 매우 적합한 실시형태에 대하여, 도 9에 나타낸 플로우 차트에 근거하여 상세히 설명한다.

도 9에 나타낸 플로우 차트와 관련하여, 먼저 검량선을 작성했을 경우와 동일하게 항원 결합 부위의 일부가 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 상기 항체와, 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 상기 색소를 각각 소정 농도(항체 농도 : Y μM , 색소 농도 : Z μM) 함유하는 항체 색소 용액 A ㎖를 제조한다(S2O1). 아울러, 이용하는 용매는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 검량선의 작성에 이용한 용매와 동일하게 pH가 중성 부근인 완충액(예를 들면, 인산 완충 생리식염수)이 바람직하다. 또한, 항체 색소 용액 중의 항체 농도 및 색소 농도가 검량선을 작성했을 때와 마찬가지로 각각 Y μM , Z μM 가 되도록 한다.

그리고, 상기 항체 색소 용액을 형광 측정용 셀에 넣어 검량선을 작성했을 때와 동일하게 여기광 파장 및 형광 파장을 각각 소정치로 설정한 형광 분광 광도계에 세팅한다. 이때, 차수 n 의 초기치를 n = 1 로 설정한다(S2O2). 아울러, 셀 홀더의 온도는 검량선을 작성했을 때와 동일한 온도로 유지하는 것이 바람직하고, 보관 유지 온도는 25∼37℃ 범위내의 온도인 것이 바람직하다. 또한, 셀 중의 용액을 소정 시간 교반시키는 것이 바람직하다.

다음으로, 피검체 용액 B_n ㎖를 셀 중의 용액에 첨가하고, 얻어진 혼합 용액을 소정 시간 교반하여 색소 및 측정 대상 물질과 항체의 항원 항체 반응을 진행시킨다(S203, 혼합 공정). 아울러, 피검체 용액으로는 측정 대상이 되는 체액 등을 그대로 이용해도 되지만 용매에 의해 소정 배율로 희석한 용액이어도 무방하다. 이러한 희석에 이용되는 용매도 특별히 제한되는 것은 아니지만, 항체 색소 용액에 이용한 용매와 동일하게 pH가 중성 부근인 완충액(예를 들면, 인산 완충 생리식염수)인 것이 바람직하다.

다음으로, 셀 중의 혼합 용액에 소정의 여기광 파장을 가지는 여기광을 조사하고, 그 혼합 용액으로부터 발생되는 소정의 형광 파장을 가지는 형광의 강도를 측정하여 측정치 I_n 을 얻는다(S2O4, 측정 공정). 아울러, 여기광의 조사 및 형광 강도 측정의 구체적인 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 검량선을 작성했을 때와 마찬가지로 형광 강도 측정치 I_n 으로는 소정의 측정 시간 중의 형광 강도의 평균치나 적분치가 매우 적합하게 얻어진다.

그리고, 이와 같이 하여 얻을 수 있는 형광 강도 측정치 I_n 을 상기 피검체 용액의 첨가에 수반되는 체적 변화에 따라 보정하고 항체 농도가 Y μM 이고 색소 농도가 Z μM 인 용액에 있어서의 형광 강도에 상당하는 형광 강도 보정치 In' 을 산출한다(S2O5). 아울러, 형광 강도의 체적 변화를 보정할 때의 계산식은 하기의 수식 (3):

(3)

이고, 차수 n = 1 일 경우에는

I₁' = I₁ × {(A + B_l) / A} (3)'

가 된다.

다음으로, 미리 구하여진 형광 강도 보정치 I_n' 과 측정 대상 물질 농도 X_n' 의 관계를 보여주는 검량선에 근거하여, 형광 강도 보정치 I_n' 으로부터 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n' μM 을 구한다(S2O6).

그리고, 이와 같이 하여 구한 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n' 으로부터 상기 피검체 용액 B_n ㎖ 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n μM 을 산출할 수 있다(S207). 아울러, 피검체 용액 중의 측정 대상 물질 농도를 산출할 때의 계산식은 하기의 수식 (4):

(4)

이고, 차수 n = 1 일 경우에는

X₁ = {X₁' × (A + B_l)} / B_l (4)'

가 된다. 또한, 본 실시형태에 있어서는 상기 형광 강도 보정치 I_n' 의 산출(S2O5), 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n' 의 산출(S2O6) 및 피검체 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n 의 산출(S2O7)은 본 발명에 따른 산출 공정에 상당한다.

이와 같이 하여 피검체 용액 중의 측정 대상 물질 농도 X_n 을 측정할 수 있지만, 상술한 대로 본 발명에 따른 항원 항체 반응은 가역적이기 때문에 하기와 같이 다른 피검체 용액을 연속적으로 측정하는 것도 가능하다. 즉, 다른 피검체 용 액을 측정할 필요가 있는 경우에는(S2O8) 차수 n 에 1 을 부가하고(S2O9), 전술한 피검체 용액 B_n ㎖의 첨가 혼합(S2O3), 형광 강도 측정치 I_n 의 취득(S204), 형광 강도 보정치 I_n' 의 산출(S205), 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n' 의 산출(S206) 및 피검체 용액 중의 측정 대상 물질의 농도 X_n 의 산출(S2O7)을 재차 수행하고, 2 번째(차수 n = 2) 피검체 용액 중의 측정 대상 물질 농도 X_n 를 측정할 수 있다. 아울러, 차수 n = 2 일 경우에는 상기 수식 (3)은

I₂' = I₂ × {(A + B₁ + B₂) /A} (3)"

가 되고, 상기 수식 (4)는

X₂ = {X₂' × (A + B_l + B₂) - (X₁ × B_l)} / B₂ (4)"

가 된다.

그리고, 다시 다른 피검체 용액을 측정할 필요가 없어질 때까지(S2O8) 상기의 S2O9 → S2O3 → S2O4 → S2O5 → S2O6 → S207 → S2O8 을 반복함으로써(연속 분석 공정), 복수(차수 n 이 1 로부터 n)의 피검체 용액 중의 측정 대상 물질 농도 X_n 을 연속적으로 측정할 수 있다. 아울러, 이러한 측정 대상 물질 농도의 연속적인 측정은 항체가 측정 대상 물질에 대해서 포화하는 등과 같이 피검체 용액을 첨가해도 형광 강도가 변화하지 않게 될 때까지 반복하는 것이 가능하다.

이상에서 설명한 본 실시형태의 형광 분석 방법에 있어서는 항원 항체 반응을 이용하기 때문에, 그 특이적 분자 인식 기능에 의해 선택성이 높은 고감도의 분 석이 가능하고, 또한 형광 분석에 의해 불순물을 제거하지 않고서도 측정 대상 물질을 선택적으로 간편하게 측정하는 것이 가능하다. 그리고, 항원 항체 반응은 비가역적이라는 종래의 기술 상식에 반해 본 발명에 따른 항원 항체 반응은 가역적이기 때문에, 측정 대상 물질의 양의 변동에 대응해 형광 강도가 변동(증강 또는 저해)하는 것을 이용하여 실시간으로 연속적으로 분석하는 것이 가능하다.

(실시예)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 일탈하지 않는 범위에서 각종 변경이 가능하다.

실시예 1 [항 MG-Ins 항체의 Fab와 MG를 이용한 인슐린의 정량]

(1-1) 시약 및 실험동물

실시예에서 사용한 주된 시약 및 실험동물은 하기와 같다. 말라카이트그린(MG, Aldrich Chemical Company, Inc.제), 말라카이트그린이소티오시아네이트(MGITC, Molecular Probes Inc.제), 오라민 0 (AO, Aldrich Chemical Company, Inc.제), 디메틸설폭사이드(DMSO, 와코우준약공업(和光純藥工業)(주)제), 인슐린(돼지, 와코우준약공업(주)제), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, 와코우준약공업(주)제), 항돼지 인슐린 항체(면역 동물 Guinea Pig, Sigma제), 모르모트(Crj; Hartley, 수컷, 3 주령, SPF, 체중 225∼24O g, 일본 챨스리버(주)제), 마취제(NEMBUTAL Sodium Solution, 50 ㎎/㎖, 다이나폿토(주)제), RAS (Ribi Adjuvant System MPL + TDM + CWS Emulsion, R-73O (RIBI Immuno Chem Research,Inc.제), O.1 M 인산 완충액(PB, pH 7.O), 항원 코팅용 완충액(5O mM 탄산나트륨 완충액, pH 8.4(+) NaN₃), 세정용 완충액(인산 완충 생리식염수, pH 7.2(+) O.O5% Tween 20), 블로킹용 완충액(인산 완충 생리식염수, pH 7.2 O.5% Gelatin), 96-웰 마이크로타이터 플레이트(ELISA TESTPLATE F-FORM 2X8 F-STRIPS BINDUNG, greiner제), 퍼옥시다제 표지 염소 항모르모트 IgG 항체(Peroxidase 표지 Goat 항 Guinea Pig IgG 항체, ORGANON TEKNIKA CORPORATION Cappel Research Product제), 시료 전처리용 카트리지(원심 농축용 MINICENT-30 또는 ULTRACENT-30, 도오소(주)제, 분획 분자량 3O,OOO 달톤), 정색시약 키트(ABTS Peroxidase Substrate System, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.제), 고정화 파파인(Sigma제).

(1-2) 사용 기기

실시예에서 사용한 주된 기기는 하기와 같다. 플레이트 리더 (BIO-RAD MODEL 3550 MICROPLATE READER), 원심기(HITACHI SCRI8B, 히타치제작소제), 원심기 로터(RPR-18-3, 히타치제작소제), 원심기(Labnet FORCE 7 , Labnet International Inc.제), 원심기(KOKUSAN MODEL H-103RS, 국산원심기(주)제), 볼텍스 믹서(AUTOMATIC MIXER S-100, TAITEC(주)제), 형광 분광 광도계(Fluorolog, instruments S.A.Inc.제), 써큘레이터(BU150P , 야마토 과학(주)제), 마이크로 회전자(정내성송당(井內盛宋堂)제), 형광 측정용 셀(정내성송당제), 고속 액체 크로마토그래피(LaChrom 시스템 인터페이스 D-7OOO, UV 검출기 D-740O, 펌프 D-71OO, 데갓서 D-761O, 히타치제작소제).

(1-3) 공통 실험법(단백질 시료의 원심 농축 및 단백 정량의 방법)

단백질을 포함한 시료는 시료 전처리용 카트리지(ULTRACENT-30 또는 MINISENT-30)와 원심기(HITACHI SCR18B 또는 Labnet Force 7)를 이용하여 3,OOO x g 에서 원심 농축하였다. 용매의 치환도 원심 농축시에 동시에 수행하였다.

또한, 시료의 단백질 농도는 시판되는 시약 키트(BCA Protein Assay Reagent Kit, PIERCE제) 및 표준 단백질 용액(말 IgG 표준액, 농도 2 ㎎/㎖, ImmunoPure Horse IgG Standard, PIERCE제)을 이용하여 BCA 법으로 정량하였다. 즉, 단백질 시료(필요에 따라 PB 로 희석한 것), 표준 단백질 용액 희석 계열(25∼1,5OO ㎍/㎖), 및 PB(검량선용 블랭크 시료) 각각 25 ㎕ 씩을 용량 1.5 ㎖의 에펜도프 튜브에 넣고 거기에 시약 키트의 반응액(BCA Protein Assay Reagent Kit 매뉴얼(Pierce)제에 따라 필요량을 제조) 50O ㎕를 첨가하여 교반시키고, 37℃에서 3O∼6O 분간 가온하였다. 그 후, 각 에펜도프 튜브로부터 3OO ㎕ 씩을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 분주하고, 플레이트 리더로 595 nm 의 흡광도를 측정하였다. 그리고, 표준 단백질 용액 희석 계열의 농도-흡광도의 관계로부터 작성한 검량선을 이용하여 단백질 시료의 단백 농도를 구하였다.

(1-4) 항원(MG-Ins 복합체)의 제조

항원이 되는 말라카이트그린(MG)과 인슐린(Ins)의 공유결합물(MG-Ins 복합체)의 제조와 정제를 하기와 같이 수행하였다. 즉, 인슐린 4.7 ㎎ 및 말라카이트그린 이소티오시아네이트(MGITC) O.6 ㎎ (2O ㎕의 디메틸술폭시드에 용해)을 2 ㎖의 0.1 M 탄산나트륨 완충액(pH 9.8)에 용해시키고, 용기를 알루미늄 호일로 차광 하여 4℃에서 하룻밤동안 교반시켰다. 상기 반응으로 말라카이트그린 이소티오시아네이트는 인슐린의 아미노기에 결합하여 MG-Ins 복합체를 얻을 수 있다. 다음으로, 미반응 성분을 제거하기 위하여, 얻어진 반응액을 O.1 M 인산 나트륨 완충액(PB, pH 7.O)으로 평형화시킨 겔 여과 칼럼(Econo-Pac 10DG, BIO-RAD제)에 적용하여, 4 ㎖의 PB 로 칼럼으로부터 용출하여 MG-Ins 분획(약 1.2 ㎎/㎖)을 얻었다.

(1-5) 면역에 의한 항혈청의 제조

MG-Ins 분획 33O ㎕와 생리식염수 1.7 ㎖를 RAS의 바이알(vial)에 첨가하고, 볼텍스 믹서로 격렬하게 교반하여, 항원과 아주반트의 현탁액을 제조하였다.

이어서, 모르모트 4 마리를 마취제(NEMBUTAL)로 마취시키고(투여량 15 ㎖/㎏), 경부에 상기 현탁액을 한 마리 당 O.5 ㎖(피하 주사(O.1 ㎖ × 4 군데) 및 복강내 투여(O.1 ㎖)) 투여하였다. 상기 첫회 면역 후, 동량의 항원을 아주반트와 함께 1 주 간격으로 3 회 투여하여 추가 면역을 실시하였다.

마지막 추가 면역으로부터 1 주일 후, 모르모트를 에테르 마취 후에 개복하여 신장 대정맥에서 전혈을 채혈하였다. 그리고, 취한 혈액을 1O ㎖ 시험관에 담아 부화기 내에서 37℃로 가온하여 혈병을 형성시켰다. 그 후, 원심기(KOKUSAN MODEL H-103RS)에서 원심분리(3,OOO rpm, 4℃, 1O min)를 실시하여 혈병을 분리하여 항혈청을 얻었다.

(1-6) 항체값의 측정

효소 면역 측정법에 의해 항혈청의 항체값을 측정하였다. 즉, 먼저 MG-Ins 분획 7OO ㎕에 항원 코팅용 완충액 6.3 ㎖를 첨가하고 96-웰 마이크로타이터 플레 이트의 각 웰에 O.1 ㎖ 씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤동안 정치시켜 항원(MG-Ins 복합체)을 플레이트의 각 웰 내면에 흡착 코팅시켰다. 그 후, 플레이트 내의 항원 용액을 제거하고, 각 웰에 O.1 ㎖의 세정용 완충액을 첨가하여 웰 내를 세정하였다. 상기 세정 작업을 3 회 실시한 후, 비특이 흡착을 막기 위하여 블로킹용 완충액 O.1 ㎖를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤동안 정치시켰다. 그 후, 블로킹용 완충액을 제거하고, 다시 세정용 완충액에 의한 세정을 3 회 실시하였다.

이어서, 항혈청을 PB 로 희석하여 희석 계열(희석 배율 : 5OO∼32,OOO 배)을 제조하였다. 또한, 대조로서 항원 미투여 모르모트 혈청을 PB 로 5 배 희석한 것을 제조하였다. 상기 대조 항체값에 대하여, 상기 항혈청 희석 계열이 나타내는 항체값은 실질적으로는 1OO∼6,40O 배 희석된 항체값에 상당한다. 이들 항혈청 희석 계열 및 대조 혈청 희석액 각 0.1 ㎖ 을 상기 플레이트의 각 웰에 첨가하여 4℃에서 하룻밤동안 정치시켜 항원 항체 반응을 진행시켰다.

이와 같이 하여 항원 항체 반응을 진행시킨 상기 플레이트로부터 항혈청 희석 계열 및 대조 혈청 희석액을 제거하고, 세정용 완충액 O.1 ㎖를 이용한 세정 조작을 3 회 수행하였다. 다음으로, 퍼옥시다제 표지 염소 항모르모트 IgG 항체의 1,OOO 배 희석액(PB 로 희석)을 각 웰에 O.1 ㎖ 씩 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 정치시켰다. 그 후, 세정용 완충액 0.1 ㎖를 이용한 세정 과정을 3 회 실시하고, 퍼옥시다제의 효소 활성을 보여주는 정색시약(2,2'-azino-di[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate, ABTS)의 반응액(시약 키트 ABTS Peroxidase Substrate System 의 메뉴얼에 따라 제조) O.1 ㎖를 각 웰에 분주하고, 37℃에서 3O 분간 가 온하여 효소 반응을 진행하였다. 그 후, SDS 의 1% 수용액을 각 웰에 O.1 ㎖ 첨가하여 효소 반응을 정지시키고, 각 웰의 흡광도(4O5 nm)를 플레이트 리더로 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.

도 1O에 나타난 결과로부터 자명한 바와 같이, 각 모르모트의 항혈청은 각각 8OO 배 혹은 1,60O 배 희석까지도 대조 혈청보다 강한 항체 활성을 나타내고 MG-Ins 복합체에 특이적인 항혈청을 얻을 수 있었음이 확인되었다. 이러한 모르모트 4 마리의 항혈청을 혼합한 것(이하, "항 MG-Ins 혈청" 이라 함)을 이하의 실험에 사용하였다.

(1-7) 항 MG-Ins IgG 분획의 제조

IgG 와 특이적으로 결합하는 단백질인 단백질 A 를 고정한 수지(rProtein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech AB제) O.7 ㎖를 플라스틱제 칼럼(내경 약 7 ㎜, 길이 약 8 ㎝)에 충전하고(이하, "단백질 A 칼럼" 이라 함), 3 ㎖의 PB 로 세정하였다.

이후, 항 MG-Ins 혈청 1 ㎖를 PB 1 ㎖로 희석하고, 5 ㎖의 일회용 주사기에 장착한 카트리지형 필터(O.45 μ, 마이쇼리디스크 W-25-5, 도오소(주))를 통해 미립자를 제거하였다. 이것을 단백질 A 칼럼에 첨가하여 IgG를 단백질 A 에 결합시킨 후, 10 ㎖의 PB 를 칼럼에 흘려주어 단백질 A 와 결합하지 않는 성분을 세정해 제거하였다. 다음으로, 4 ㎖의 O.1 M 구연산 완충액(pH 4.0)을 단백질 A 칼럼에 흘려주어 IgG를 단백질 A 로부터 해리시켜 항 MG-Ins IgG 분획을 얻었다. 아울러, 단백질 A 칼럼에 1O ㎖의 PB를 흘려주어 상기 칼럼을 재생시켰다. 얻게 된 항 MG- Ins IgG 분획을 원심 농축함과 동시에 PB 에 용매 치환시켰다. 필요에 따라 상기의 조작을 반복하고, 이후의 실험에 필요한 양만큼의 항 MG-Ins IgG 분획을 제조하였다.

(1-8) 항 MG-Ins IgG 분획으로부터의 항원 결합성 프래그먼트(Fab)의 제조, 분리 정제

소화 효소 파파인으로 IgG를 소화시켜 Fab 를 제조하였다. 구체적으로, 먼저 고정화 파파인 8.7 ㎎ 을 용량 2.2 ㎖의 에펜도프 튜브에 넣고 2O0 ㎕의 PB 를 첨가하여 교반시킨 후 원심분리하여 상청액을 제거하여 고정화 파파인을 세정하였다. 상기 세정 과정을 2 회 반복한 후, 1 ㎖의 2O mM 인산 완충액 (pH 7.O, (+) 1O mM EDTA (+) 2O mM 시스테인)에 고정화 파파인을 현탁시켰다. 거기에 다시 5OO ㎕의 2O mM 인산 완충액과 50O ㎕의 항 MG-Ins IgG 분획(IgG 농도 약 4.5 ㎎/㎖)의 혼합액을 더해 시스테인의 최종 농도를 1O mM 로 하여 37℃로 가온하고 수 시간 동안 진탕하여 효소 반응을 진행하였다. 그 후, 효소 반응액을 가볍게 원심분리하여 상청액을 분리하고, 얻은 상청액을 단백질 A 칼럼에 첨가하여 소화되지 않은 IgG를 단백질 A 에 결합시켰다. 그 다음, 1O ㎖의 PB를 단백질 A 칼럼에 흘려주어 분리한 후 원심 농축하여 항 MG-Ins 항체의 Fab(이하, "항 MG-Ins Fab"라 함)를 포함한 분획(5.20 ㎎/㎖, 34.7 μM as IgG = 69.3 μM as Fab)을 얻었다.

(1-9) 항 MG-Ins Fab와 결합한 말라카이트그린의 형광스펙트럼 측정

항 MG-Ins Fab 에 MG를 항원 항체 반응으로 결합시켰을 때의 MG의 형광 스펙트럼을 하기와 같이 측정하였다. 즉, 항 MG-Ins Fab 농도가 0.955 μM, MG 농도가 O.9O7 μM 이 되도록 양 성분을 혼합하고(용매는 인산 완충 생리식염수 (pH 7.2, PBS)), 25℃에서 5 분간 교반시켜 항원 항체 반응을 진행하였다. 그 다음, 형광 분광 광도계를 이용하여 여기광 파장 620 nm, 형광 파장 63O∼750 nm, 밴트패스 폭은 여기측, 형광측 모두 5 nm 의 조건으로 상기 혼합 용액으로부터 발생하는 형광 스펙트럼을 측정하였다. 얻게 된 형광 스펙트럼의 그대로의 데이터로부터 동일한 조건에서 측정한 인산 완충 생리식염수의 백그라운드(background)를 공제하고, 다시 장치 함수에 의한 보정을 가한 형광 스펙트럼을 도 11에 나타내었다. 수용액 중에서는 실질적으로 무형광인 말라카이트그린이 항 MG-Ins Fab와 결합하여 형광성으로 변한 것이 확인되었다.

또한, 항 MG-Ins Fab 농도를 1 μM 로 하고, MG 농도를 O∼O.9 μM 의 범위에서 변화시켜 상기와 동일하게 형광 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 아울러, 세로축은 MG가 발하는 형광의 강도치(1 초당 평균치, CPS : count per second)이다.

도 12에 나타난 결과로부터, 항체와 색소의 상대량의 바람직한 값, 즉 색소가 항체에 대해서 포화되는 일 없이 비교적 강한 색소의 형광을 얻을 수 있는 값으로서, 항 MG-Ins Fab 농도 1 μM 에 대하여 MG 농도 O.4 μM 을 하기의 정량에서 채택하였다. 이러한 상대치는 폴리클로날 항체를 조정할 때마다 다를 가능성이 있고, 또한 동일한 폴리클로날 항체 유래일 경우에도 조정한 Fab의 정제 순도에 의해서 외관상 다를 가능성이 있다.

(1-10) 항 MG-Ins Fab와 말라카이트그린을 이용한 인슐린의 정량

[1-1O-1] 검량선의 작성

일정량(1 μM)의 항 MG-Ins Fab와 일정량(O.4 μM)의 MG에 대하여 인슐린 농도와 형광 강도의 관계를 보여주는 검량선을 하기와 같이 작성하였다. 아울러, 사용한 인슐린은 아연을 포함하여 몇 분자의 회합체를 형성하고 있기 때문에, 사전에 최종 농도 O.1% 의 SDS 를 포함하는 PB 에 용해시켜 상기 회합체를 해리시켰다. 그 후, 얻은 인슐린 용액을 PBS 로 평형화한 겔 여과 칼럼(Fast Desaliting column HR 10/10, Pharmacia제)에 적용하고, 상기 인슐린 용액으로부터 SDS 를 제거한 것을 하기의 정량에 이용하였다.

(1) 형광 분광 광도계를 여기광 파장 620 nm, 형광 파장 650 nm 로 설정하고, 셀 홀더의 온도를 일정 온도(25℃)로 유지하였다.

(2) 1 μM (Y = 1 μM)의 항 MG-Ins Fab와 0.4 μM (Z = 0.4 μM)의 MG를 포함하는 2 ㎖ (A = 2 ㎖)의 항체 색소 용액(용매는 인산 완충 생리식염수(pH 7.2, PBS))을 제조하였다(S1O1).

(3) 얻은 항체 색소 용액을 형광 측정용 표준 셀에 넣고 그 셀을 형광 분광 광도계에 세팅하고, 셀 중의 용액을 마이크로 회전자로 3O 초간 교반시켰다. 아울러, 차수는 초기치(n = 1)로 설정하였다(S1O2).

(4) 셀 중의 용액에 26.5 μM (X = 26.5 μM)의 인슐린 표준 용액(용매는 PBS)을 1O ㎕(B_l = 0.O1 ㎖) 첨가하고, 마이크로 회전자로 5 분간 교반시켜 항원 항체 반응을 진행하였다(S1O3).

(5) 셀 중의 용액에 여기광을 조사하고 그 용액으로부터 발생하는 MG의 형광 강도를 30 초간 측정하여 형광 강도 1 초당 평균치(형광 강도 측정치 : I₁)를 구하였다(S104). 아울러, 인슐린 농도 O μM 일 경우의 형광 강도를 블랭크로 하여 실제 측정치로부터 블랭크를 공제한 값을 측정치로서 이용하였다.

(6) 얻은 형광 강도 측정치(I₁)를 하기와 같은 계산식을 이용하여 보정(표준 용액의 첨가에 수반되는 체적 변화에 대응한 보정)하여 체적 변화 보정치(형광 강도 보정치 : I₁')를 구하였다(S1O5).

I₁' = I_l × {(A + B_l) / A} (1)'

(7) 인슐린 표준 용액의 농도(X)로부터, 하기와 같은 계산식을 이용하여 형광 강도를 측정한 혼합 용액 중의 인슐린 농도(인슐린 농도 보정치 : X₁')를 구하였다(S106).

X_l' = X × {B_l / (A + B_l)} (2)'

(8) 차수 n 에 1 을 부가하고(S1O8), 상술한 (4)∼(7)(S103 → S1O4 → S105 → S106)을 재차 반복하여, 차수 n = 2 일 경우의 형광 강도 보정치(I₂') 및 인슐린 농도 보정치(X₂')를 구하였다. 아울러, 차수 n = 2 의 경우에는 하기의 계산식을 이용하였다.

I₂' = I₂ × {(A + B₁ + B₂) / A} (1)"

X₂' = X × {(B_l + B₂) / (A + B₁ + B₂)) (2)"

(9) 얻게 된 형광 강도 보정치 I_n'이 표준 용액을 첨가하더라도 변화하지 않게 될 때까지, 즉 (I_n' - I_n-l')의 값이 "0" 이하가 될 때까지(S1O7), 상기 (8) (S1O8 → S1O3 → S1O4 → S1O5 → S1O6 → S1O7)을 반복하여 차수 n 이 1 로부터 n 일 때의 형광 강도 보정치(I_n') 및 인슐린 농도 보정치(X_n')를 각각 구하였다. 아울러, 하기의 계산식을 사용하였다.

(1)

(2)

(10) 얻게 된 차수 n 이 1 로부터 n 일 경우의 인슐린 농도 보정치(X_n')에 대한 형광 강도 보정치(I_n')를 도면에 좌표하여 인슐린 농도가 O∼1.8 μM 인 범위에 대한 검량선을 작성하였다(S1O9). 얻은 검량선을 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 결과로부터, 항 MG-Ins Fab와 말라카이트그린을 이용했을 경우에는 인슐린 농도의 증가에 수반하여 말라카이트그린의 형광 강도도 증가하고 있어 형광의 증강이 일어났음이 확인되었다. 그리고, 인슐린 농도 보정치(X_n')와 형광 강도 보정치(I_n') 간에 O∼1.7 μM 범위에서 정(正)의 상관관계가 있는 것으로부터, 말라카이트그린의 형광 강도를 측정함으로써 상기 범위의 인슐린 농도 정량이 가능하다는 것이 확인되었다. 또한, 인슐린 농도가 약 O.13 μM 정도인 저농도일 때도 정량 가능하고, 검출 감도(약 O.1 μM)도 높은 것이 확인되었다.

[1-1O-2] 실시료의 측정

상기에서 얻은 검량선을 이용하여, 실시료 중의 인슐린 농도 정량을 하기와 같이 수행하였다. 아울러, 실시료의 피검체 용액은 체액, 그 농축액, 또는 PBS 등으로 희석한 것이다.

(11) 형광 분광 광도계를 여기광 파장 620 nm, 형광 파장 650 nm 로 설정하고, 셀 홀더의 온도를 일정 온도(25℃)로 유지하였다.

(12) 1 μM (Y = 1 μM)의 항 MG-Ins Fab와 O.4 μM (Z = 0.4 μM)의 MG를 포함하는 2 ㎖ (A = 2 ㎖)의 항체 색소 용액(용매는 인산 완충 생리식염수(pH 7.2, PBS))을 제조하였다(S2O1).

(13) 얻게 된 항체 색소 용액을 형광 측정용 표준 셀에 넣고 그 셀을 형광 분광 광도계에 세팅하고, 셀 중의 용액을 마이크로 회전자로 3O 초간 교반하였다. 아울러, 차수는 초기치(n = 1)로 설정하였다(S2O2).

(14) 셀 중의 용액에 피검체 용액을 20 ㎕ (B_l = 2.O2O ㎖) 첨가하고, 마이크로 회전자로 5 분간 교반하여 항원 항체 반응을 진행하였다(S2O3).

(15) 셀 중의 용액에 여기광을 조사하고 그 용액으로부터 발생하는 MG의 형광 강도를 3O 초간 측정하여 형광 강도의 1 초당 평균치(형광 강도 측정치 : I_l)를 구하였다(S2O4). 아울러, 피검체 용액 미첨가시의 형광 강도를 블랭크로 하여 실제 측정치로부터 블랭크를 공제한 값을 측정치로 이용하였다.

(16) 얻게 된 형광 강도 측정치(I_l)를 하기와 같은 계산식을 이용하여 보정(피검체 용액의 첨가에 수반하는 체적 변화에 따른 보정) 하고 체적 변화 보정치(형광 강도 보정치 : I_n')를 구하였다(S205).

I₁' = I₁ × {(A + B₁) / A} (3)'

(17) 미리 구한 형광 강도 보정치(I_n')와 인슐린 농도 보정치(X_n')의 관계를 나타내는 검량선에 근거하여, 상기 형광 강도 보정치(I_l')로부터 혼합 용액 중의 인슐린 농도(X₁')를 구하였다(S2O6).

(18) 얻게 된 혼합 용액 중의 인슐린 농도(X₁')로부터, 하기와 같은 계산식을 이용하여 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X₁)를 구하였다(S2O7).

X₁ = {X₁' × (A + B₁)} / B1 (4)'

이와 같이 구한 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X₁)는 O.26 μM 이었으며, 다른 방법(BCA 법)에 의해 구한 피검체 용액 중의 인슐린 농도와 일치하는 것으로 확인되었다.

(19) 다음으로, 다른 피검체 용액을 측정할 필요가 있는 경우에는(S208), 차수 n 에 1 을 부가하고(S2O9), 상술한 (14)∼(18)(S2O3 → S204 → S2O5 → S2O6 → S2O7)를 다시 반복함으로써 다른 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X₂)를 구할 수 있었다. 아울러, 차수 n = 2 일 경우에는 하기의 계산식을 이용하였다.

I₂' = I₂ × {(A + B_l + B₂) / A} (3)"

X₂ = {X₂' × (A + B_l + B₂) - (X₁ × B₁)} / B₂ (4)"

(20) 또 다른 피검체 용액을 측정할 필요가 없어질 때까지(S2O8) 상기의 S209 → S2O3 → S2O4 → S205 → S2O6 → S2O7 → S2O8 을 반복함으로써, 복수(차수 n 이 1 로부터 n)의 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X_n)를 연속적으로 측정할 수 있었다. 아울러, 이러한 연속적인 측정은 항체가 인슐린에 대하여 포화되는 등과 같이 피검체 용액을 첨가해도 형광 강도가 변화하지 않을 때까지 반복하는 것이 가능하였다. 또한, 하기의 계산식을 이용하였다.

(3)

(4)

실시예 2 [항 MG-Ins 항체의 Fab와 AO를 이용한 인슐린의 정량]

수용액 중에서 실질적으로 무형광인 오라민 0 (AO)는 그 화학 구조의 일부가 말라카이트그린(MG)의 화학 구조와 공통적이다. 그 때문에, AO 도 항 MG-Ins IgG 및 항 MG-Ins Fab와 교차 반응하여 형광성으로 변할 것이라고 본 발명자는 추측하였다. 또한, AO 는 MG 보다 분자의 크기가 작기 때문에, 항체와의 결합이 약하게 kd 가 클 것이라고 본 발명자는 추측하였다. 그 때문에, AO의 kd 가 인슐린의 kd 보다 클 가능성이 있고, 그 경우에는 실시예 1 과는 반대로 인슐린의 존재에 의해 형광의 저해가 일어나게 되어 인슐린 농도와 형광 강도 간에 부(負)의 상관관계가 성립할 수 있을 것이라고 본 발명자는 추측하였다. 그래서, 이러한 인슐린 농도와 형광 강도 간의 부의 상관관계에 근거하여 인슐린을 정량하도록 MG 대신 AO를 이용하여 하기의 시험을 수행하였다.

(2-1) 항 MG-Ins IgG 와 결합한 오라민 O 의 형광 스펙트럼 측정

항 MG-Ins IgG 에 AO를 항원 항체 반응으로 결합시켰을 때의 AO의 형광 스펙트럼을 하기와 같이 측정하였다. 즉, 항 MG-Ins IgG 농도가 1 μM, AO 농도가 1 μM 이 되도록 양 성분을 혼합하고(용매는 인산 완충 생리식염수(pH 7.2, PBS)), 25℃에서 5 분간 교반하여 항원 항체 반응을 진행하였다. 그 후, 형광 분광 광도계를 사용하여 여기광 파장 4OO nm, 형광 파장 45O∼65O nm, 밴트패스 폭은 여기측, 형광측 모두 5 nm 의 조건으로 상기 혼합 용액으로부터 발생되는 형광 스펙트럼을 측정하였다. 얻게 된 형광 스펙트럼의 그대로의 데이터로부터 동일한 조건으로 측정한 인산 완충 생리식염수의 백그라운드를 공제하고, 다시 장치 함수에 의한 보정을 가한 형광 스펙트럼을 도 14에 나타내었다. 수용액 중에서는 실질적으로 무형광인 오라민 O 도 항 MG-Ins IgG 와 결합하여 형광성으로 변했음이 확인되었다.

(2-2) 항 MG-Ins Fab와 오라민 0 를 이용한 인슐린의 정량

[2-2-1] 검량선의 작성

항 MG-Ins Fab 농도를 2 μM 로 하고, O.4 μM 의 말라카이트그린 대신 O.4 μM 의 오라민 0 를 이용하여 여기광 파장을 4OO nm, 형광 파장을 52O nm 로 변경한 것을 제외하고는 상기 [1-1O-1]과 동일한 방법으로 인슐린 농도가 O∼7.7 μM 인 범위에 대한 검량선을 작성하였다. 얻게 된 검량선을 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 결과로부터, 항 MG-Ins Fab와 오라민 0 을 이용할 경우에는 인슐린 농도의 증가에 따라 오라민 O 의 형광 강도가 감소하여, 결과적으로 형광의 저해가 일어났음이 확인되었다. 그리고, 인슐린 농도 보정치(X_n')와 형광 강도 보정치(I_n') 간에는 O∼4.23 μM 의 범위에서 부의 직선적 상관관계가 있는 것으로부터, 오라민 O 의 형광 강도를 측정함으로써 상기 범위의 인슐린 농도의 정량이 가능하다는 것이 확인되었다. 또한, 인슐린 농도가 약 O.13 μM 정도인 저농도일 경우에도 정량 가능하고, 검출 감도(약 0.1 μM)도 높은 것이 확인되었다. 아울러, 인슐린 농도가 4.23 μM 보다 고농도인 영역에서 AO 형광 강도가 일정한 수치에 도달한 이유로는 항 MG-Ins Fab 의 공급원인 항 MG-Ins IgG 가 폴리클로날 항체이기 때문에 AO 와의 결합이 매우 강한 IgG 가 포함되어 있었기 때문인 것으로 본 발명자는 추측하였다.

[2-2-2] 실시료의 측정

상기에서 얻게 된 검량선을 이용하여 항 MG-Ins Fab 농도를 2 μM 로 하고, O.4 μM 의 말라카이트그린 대신 O.4 μM 의 오라민 0 를 이용하여, 여기광 파장을 4OO nm, 형광 파장을 52O nm 로 변경한 것 이외에는 전술한 [1-1O-2]의 경우와 동일한 방법으로 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X₁)를 구하였다. 이와 같이 하여 구한 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X₁)는 O.26 μM 이었으며, 다른 방법 (BCA 법)에 의해 구한 피검체 용액 중의 인슐린 농도와 일치하고 있음이 확인되었다.

또한, 상기와 같이 변경한 점 이외에는 전술한 [1-1O-2]와 동일한 방법으로, 다른 피검체 용액을 측정할 필요가 없어질 때까지 상기의 S2O9 → S2O3 → S2O4 → S2O5 → S2O6 → S2O7 → S2O8 을 반복함으로써, 복수(차수 n 이 1 로부터 n)의 피검체 용액 중의 인슐린 농도(X_n)를 연속적으로 측정할 수 있었다. 아울러, 이러한 연속적인 측정은 항체가 인슐린에 대해 포화하는 등과 같이 피검체 용액을 첨가해도 형광 강도가 변화하지 않을 때까지 반복하는 것이 가능하다.

(2-3) 항원 항체 반응의 가역성에 대한 검증 시험

항 MG-Ins Fab와 오라민 O 를 포함하는 용액에 인슐린 첨가 및 항-돼지 인슐린 IgG (이하, "항인슐린 IgG" 라 함) 첨가를 반복적으로 수행하여, 유리된 인슐린 농도를 동일한 시료내에서 변동시켰을 경우에 본 발명에 따른 방법의 측정치가 거기에 부합하여 변화하는 지 여부, 즉 본 발명에 따른 항원 항체 반응이 가역적으로 실시간 분석이 가능한 지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 아울러, 측정 조건은 전술한 [2-2-1]과 동일하게 형광 강도 측정을 수행하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

먼저, 2 μM 의 항 MG-Ins Fab와 O.4 μM 의 오라민 0 을 포함하는 2 ㎖의 PBS 용액을 제조하고, 형광 측정용 셀에 넣어 AO 형광 강도를 측정한 후, 그 때의 형광 강도를 상대치 1 로 정하였다.

그 후, 상기 셀 중의 용액의 농도가 1.26 μM 이 되도록 인슐린을 첨가하고 5 분간 교반한 후 형광 강도를 측정하였을 때, AO 형광 강도의 상대치는 약 O.97 로 감소하였다.

다음으로, 상기 용액에 항인슐린 IgG를 일정량(O.135 μM) 첨가하고 동일하게 교반한 후 형광 강도를 측정하였을 때, AO 형광 강도의 상대치는 거의 1 로 회복되었다. 이것은 항인슐린 IgG 와 인슐린이 결합하여 유리 인슐린이 용액 중에 존재하지 않게 되었기 때문에 AO 형광 강도가 원래로 돌아온 것이다.

계속하여, 상기 용액의 농도가 2.39 μM 이 되도록 인슐린을 재첨가하고 동일하게 교반한 후 형광 강도를 측정하였을 때 AO 형광 강도의 상대치는 다시 감소하였지만, 상기 용액에 다시 항인슐린 IgG를 2 회로 나누어 첨가한 경우(1 회째 : 0.128 μM, 2 회째 : O.127 μM) AO 형광 강도의 상대치는 회복되었다. 그리고, 다시 상기 용액의 농도가 3.37 μM 이 되도록 인슐린을 첨가하고 동일하게 교반한 후 형광 강도를 측정하였을 때, AO 형광 강도의 상대치는 감소하여 있었다.

도 16에 나타난 결과로부터, 본 발명에 따른 항원 항체 반응은 가역적이고, 본 발명의 방법의 측정치(형광 강도)는 측정 대상물의 양의 변동(증가-감소)에 가역적으로 따르고 있음이 확인되었다. 또한, 본 발명의 방법의 측정치(형광 강도)가 측정 대상물의 양에 대하여 상관관계가 있는 것으로부터, 형광 강도의 변동을 측정함으로써 측정 대상물을 실시간적으로 계측할 수 있음이 확인되었다.

본 발명에 의하면, 항원 항체 반응을 이용하여 생체내 물질 등을 간편하고 고감도로, 게다가 실시간 연속적으로 분석(이미징을 포함함)하는 것이 가능한 형광 분석 방법을 제공하는 것이 가능해 진다.

Claims

하나의 항원 결합 부위 중 일부가 특이적 분자 인식에 의해 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 항체 및 상기 항체에 의해 인식되고 상기 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 색소를 각각 소정의 농도로 함유하는 항체 색소 용액과 측정 대상 물질을 함유하는 피검체 용액의 혼합 용액을 얻는 혼합 공정;

상기 혼합 용액에 여기광을 조사하고, 상기 혼합 용액으로부터 발생되는 형광의 강도를 측정하여 측정치를 얻는 측정 공정; 및

미리 구한 형광 강도와 측정 대상 물질 농도의 관계에 근거하여 상기 측정치로부터 상기 측정 대상 물질의 농도를 구하는 산출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항에 있어서,

상기 산출 공정 후에 다시 피검체 용액을 상기 혼합 용액에 첨가하여 혼합하고, 상기 측정 공정 및 상기 산출 공정을 실행하여 측정 대상 물질의 농도를 반복적으로 구하는 연속 분석 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 산출 공정은 상기 측정치를 상기 피검체 용액의 첨가에 수반하는 체적 변화에 따라 보정하여 형광 강도 보정치를 얻는 공정과,

미리 구한 형광 강도 보정치와 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도의 관계에 근거하여 상기 형광 강도 보정치로부터 상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질의 농도를 구하는 공정과,

상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도로부터 상기 피검체 용액 중의 측정 대상 물질의 농도를 구하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

하나의 항원 결합 부위 중 일부가 특이적 분자 인식에 의해 색소를 인식하고 나머지 일부가 측정 대상 물질을 인식하는 항체 및 상기 항체에 의해 인식되고 상기 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하는 색소를 각각 소정의 농도로 함유하는 항체 색소 용액과 측정 대상 물질을 소정의 농도로 함유하는 표준 용액의 혼합 용액을 얻는 혼합 공정;

상기 혼합 용액에 여기광을 조사하고, 상기 혼합 용액으로부터 발생되는 형광의 강도를 측정하여 측정치를 얻는 측정 공정;

다시 표준 용액을 상기 혼합 용액에 첨가하고 혼합한 후 상기 측정 공정을 실행하여 형광 강도 측정치를 반복적으로 구하는 연속 측정 공정; 및

상기 측정 공정 및 상기 연속 측정 공정으로 얻게 된 측정치와 상기 측정 대상 물질의 첨가량에 근거하여, 형광 강도와 측정 대상 물질 농도의 관계를 구하는 검량선 작성 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 4항에 있어서,

상기 검량선 작성 공정은 상기 측정치를 상기 표준 용액의 첨가에 수반하는 체적 변화에 따라 보정하여 형광 강도 보정치를 얻는 공정과,

상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도를 산출하는 공정과,

상기 형광 강도 보정치와 상기 혼합 용액 중의 측정 대상 물질 농도의 관계를 구하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 색소는 트리페닐메탄 구조를 가지는 색소 및 디페닐메탄 구조를 가지는 색소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 색소는 말라카이트그린 또는 오라민 O 인 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 항체는 상기 색소와 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체, 또는 항체에 의해 인식되고 상기 항체에 결합하면 비형광성으로부터 형광성으로 변하기 위해서 필요한 구조가 상기 색소와 공통되는 색소와 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체인 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 항체는 말라카이트그린과 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체이고, 상기 색소는 말라카이트그린인 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 항체는 말라카이트그린과 상기 측정 대상 물질의 결합 물질을 항원으로 하는 항체이고, 상기 색소는 오라민 O 인 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 항체는 항혈청을 정제하여 얻은 IgG 분획으로부터 제조한 항원결합성 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 측정 대상 물질은 면역 측정의 대상이 되는 단백질, 호르몬, 비타민, 균체, 환경오염 물질 및 의약품으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 분석 방법.