JP3662333B2

JP3662333B2 - 蛍光化抗血清およびＩｇＧ画分

Info

Publication number: JP3662333B2
Application number: JP07242696A
Authority: JP
Inventors: 雅貴治部
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1995-03-27
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 2005-06-22
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: JPH095324A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原として実質的に蛍光性でない色素に対する抗血清、抗体、およびＩｇＧ画分であって、該色素と混合することにより、蛍光性となる前記抗血清、抗体、およびＩｇＧ画分に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内での代謝物質や環境中での汚染物質の変化の過程において微量物質の分析方法として従来から分光分析法がよく利用されている。特に吸収スペクトル分析、蛍光スペクトル分析法は、測定方法が簡便であり広く使用されている。
【０００３】
吸収スペクトル分析法は、後に説明する蛍光分析法に比較して検出感度は低いけれども、測定対象物質が紫外可視部の光吸収を持つものが多いため広く利用されてきた。
【０００４】
すなわち、吸光分析において吸光度（Absorbance）と測定対象物質の濃度ｃは次の式にしたがう。
【０００５】
吸光度＝ｌｏｇ（Ｉ₀／Ｉ）＝εｃｌ
Ｉ₀：入射光の強度、
Ｉ：試料を通過した光の強度
ε：測定対象物質の吸光度係数、
ｌ：光路長
式が示すように、吸光度の測定で得られるのは入射光と透過光の比であり、これは光源強度や検出器の感度を上げても変化することはない。
【０００６】
これに対し、被測定物質が蛍光性であれば、蛍光分析法を利用でき、この場合は、励起光をあてたときに物質が発する光の量を測るものであり、それゆえ光源を強くしたり検出器の感度を上げることで測定の感度を向上させることが出来る。
【０００７】
すなわち、蛍光として放出される光の強度Ｆと蛍光物質の濃度ｃ、励起光強度Ｉ₀との間には
Ｆ＝ΦＩ₀（１−１０^-ε^cl）
Ｉ₀：入射光の強度、
ε：測定対象物質の吸光度係数、
ｌ：光路長、
Φ：蛍光の量子収率
の関係があり入射光の強度に比例する。
【０００８】
さらに測定対象物質が多成分からなる混合物試料中に含まれている場合は、吸光度の測定では、夾雑物の吸収スペクトルが分析対象物質の吸収スペクトルと重なる場合が多く、分析対象物質の吸光度だけを選択的に測定することは困難である。
【０００９】
一方測定対象物質が多成分からなる混合物試料中に含まれている場合であっても、蛍光分析法では、蛍光性でない侠雑物は無視できるし、また蛍光性の供雑物が共存する場合でも、励起波長と蛍光波長を選択することにより分析対象物質だけを選択的に測定することが可能である。
【００１０】
それゆえ、検出感度および混合物の測定可能性の点からは蛍光分析法が吸光分析法に比較して優れている。
【００１１】
従って、従来から、蛍光分析法の高感度測定が可能であるという利点と、抗原抗体反応における高選択性を利用する分析技術として、蛍光色素に対する抗体の調整が行なわれてきた。これらの抗体は、色素と反応して色素の蛍光強度を減少させるか、増加させる。
【００１２】
そこで、これらの蛍光強度の変化を用いて、これら色素の特異的定量分析が行われてきた。
【００１３】
しかしながら、上記の抗原抗体反応を利用した高感度高選択的蛍光分析技術は分析対象物が実質的に蛍光性でない場合は使用できないという本質的な制限があった。
【００１４】
一方、通常の測定条件下においては実質的に蛍光性でない色素が、特殊な条件下では、蛍光測定が可能となること、すなわち蛍光性となることが知られている。
【００１５】
例えば、マラカイトグリーンは通常蛍光性でないが、グリセリン中で蛍光性となることが知られている。このことは、溶媒等の影響により、色素分子の構造が固定され、その結果色素分子が蛍光性となると説明されている。
【００１６】
さらに、生体内には多くの蛍光物質が存在し、これらの蛍光（自家発光）は、生体試料の蛍光測定の際にバックグラウンドとなり、検出感度を減少させ得るものであり、また、タイタープレートを用いた蛍光免疫測定の場合においても、プレートのプラスチック材質が発する蛍光も同様にバックグラウンドとなり、検出感度を減少させ得るものであり、これらは従来の高感度の蛍光測定を妨げる原因であった。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は以上の点に鑑み、通常の測定条件下においては実質的に蛍光性でない色素に特異的に結合し、その結合により色素分子の分子構造を固定することにより蛍光性を増大または発現させることが可能な抗体を見いだすことを目的とする。また、極めて低いバックグラウンド蛍光により、他の色素に比較して高感度の測定が可能となる蛍光色素を提供するものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る抗血清は、蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含むものであって、前記実質的に蛍光性でない色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とするものである。
【００１９】
本発明に係るＩｇＧ画分は、蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含む抗血清中のＩｇＧ画分であって、前記実質的に蛍光性でない色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とするものである。
【００２０】
本発明に係る抗体は、蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体であって、前記実質的に蛍光性でない色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とするものである。
【００２１】
すなわち、本発明は、実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含む抗血清であって、前記抗血清または前記抗体と前記色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とする抗血清に係るものである。
【００２２】
また本発明は、実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含む抗血清中のＩｇＧ画分であって、前記ＩｇＧ画分と前記色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とするＩｇＧ画分に係るものである。
【００２３】
さらに本発明は、実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体であって、前記抗体と前記色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とする抗体に係るものである。
【００２４】
本発明の抗血清、抗体およびＩｇＧ画分においては、前記色素が、前記抗体と結合体を形成していない時には実質的に蛍光性でなく、前記抗体と結合体を形成することにより蛍光性となるものであることが好ましい。
【００２５】
また本発明の抗血清、抗体およびＩｇＧ画分においては、前記抗体が、実質的に蛍光性でない色素に結合し、その結合により前記色素の分子構造を固定することにより蛍光性を増大または発現させることが可能なものであることが好ましい。
【００２６】
また本発明の抗血清、抗体およびＩｇＧ画分においては、前記抗原が、免疫性物質に前記色素を付加して形成したものであることが好ましい。
【００２７】
さらに本発明の抗血清、抗体およびＩｇＧ画分においては、前記免疫性物質が、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清卵白アルブミン、ウシガンマグロブリン、ウマ血清グロブリン、ヒトガンマグロブリン、ヒツジガンマグロブリン、ウシチログロブリン、ブタチログロブリン、ヘモシアニン、合成ポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
【００２８】
本発明の抗血清、抗体およびＩｇＧ画分においては、前記色素が、トリフェニルメタン構造を有する色素であることが好ましい。
【００２９】
このようなトリフェニルメタン構造を有する色素としては、マラカイトグリーンが特に好ましい。
【００３０】
また本発明の抗血清、抗体およびＩｇＧ画分においては、前記色素が、ジフェニルメタン構造を有する色素であってもよい。
【００３１】
このようなジフェニルメタン構造を有する色素としては、オーラミンＯが特に好ましい。
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
（実質的に蛍光性でない色素）
本発明において使用可能な色素は、水中等通常の溶媒中で実質的に蛍光性を示さないもの、または蛍光性を示すが弱いものであれば特に制限されない。
【００３４】
すなわち、本発明において実質的に蛍光性でないとは、通常の測定条件では蛍光スペクトルを示さないか、もしくは極めて弱い蛍光のみ示し、実質的には市販の装置等により、蛍光分光分析ができないとされているものをいう（西川泰治等、”蛍光リン光分析法”、共立出版、３０ページ、１９８４年）。
【００３５】
本発明においては、蛍光量子収率が特定の条件で１％以下の場合は、ここでいう実質的に蛍光性を示さない色素であり、蛍光量子収率が特定の条件で１０^ー2％以下の場合は、特に実質的に蛍光性を示さない色素を意味する。
【００３６】
ただし、特別な測定条件、測定装置等により極微弱な蛍光を検出可能である場合においては、本発明において実質的に蛍光性でない色素が本発明に係る処理により蛍光性となり、蛍光分析が可能となるという意味は、該色素の蛍光量子収率が通常の測定条件では極めて小さい（例えば０．０１％以下）が、本発明に係る処理により抗体と相互作用することにより大きく変化する（例えば１％以上）ということを意味するものとする。
【００３９】
本発明においては、上記の蛍光量子収率増大が少なくとも１０倍以上であることが望ましいが、１００倍、さらには１０００倍以上（より好ましくは１００００倍以上）増加することが望ましい。
【００４０】
例えば、マラカイトグリーンについては、約１０００倍以上の蛍光量子収率の増加が得られ得る。
【００４１】
また本発明で使用可能な色素とは必ずしも可視部の吸収（３５０ｎｍ以上に吸収極大を有する）を有する必要はなく、紫外部（３５０ｎｍ以下に吸収極大を有する）の吸収を有するもの、または吸収バンドが可視部にまで及んでいるものでもよい。
【００４２】
本発明で使用可能な色素の分子構造は特に制限されず、種々の発色団（クロモファ）を含むものが可能である。
【００４３】
特に、pHが中性附近で安定な発色団を含むものが望ましい。
【００４４】
例えば、分子構造中にトリフェニルメタン骨格を有する色素が特に好ましく（例えば、講談社サイエンティフィック社、大河原信編「色素ハンドブック」参照）、さらに分子構造中にトリフェニルメタン骨格を有する色素であるマラカイトグリーン等が特に好ましく使用される。
【００４５】
またジフェニルメタン骨格を有する色素（例えば、講談社サイエンティフィック社、大河原信編「色素ハンドブック」参照）も好ましく使用可能である。ジフェニルメタン系の色素としては例えばオーラミン系色素が好適に使用可能である。特にオーラミンＯの使用が好ましい。
【００４６】
（免疫性物質）
本発明で使用可能な免疫性物質としては特に制限されない。
【００４７】
一般的に使用可能な、例えばアルブミン（ウシ血清、ヒト血清）、ウサギ卵白アルブミン、血清グロブリン（ウシガンマグロブリン、ウマ血清グロブリン、ヒトガンマグロブリン、ヒツジガンマグロブリン）、チログロブリン（ウシチログロブリン、ブタチログロブリン）、ヘモシアニン、合成ポリペプチド等が好適に使用可能である。
【００４８】
（実質的に蛍光性でない色素を有する抗原の作製）
本発明で、実質的に蛍光性でない色素を有する抗原の作製方法については特に制限されない。
【００４９】
例えば、上記免疫性物質と実質的に蛍光性でない色素を所定時間撹拌混合し、ゲル瀘過クロマトグラフィを用いて該色素を有する抗原の画分を分離することが可能である。
【００５０】
さらに必要な場合には例えば免疫反応を利用する精製手段を使用することにより精製することも可能である（川島紘一郎（訳）：”イムノアッセイ入門”、南山堂、７０ページ、１９８７）。
【００５１】
得られた該色素を有する抗原の濃度は例えばＬｏｗｒｙ法で定量可能である。
【００５２】
（抗血清作製）
本発明の抗体は、免疫工程で好ましく作製可能である。
【００５３】
免疫動物としては特に制限されないが、ウサギ、およびモルモットが好適に使用可能である。
【００５４】
本発明で使用可能な免疫アジュバントは特に制限されないが、一般的なフロイント不完全アジュバント、アルミニウムアジュバント等が好適に使用可能である。
【００５５】
本発明で使用可能な免疫注射法については特に制限はないが、例えばモルモットにおいては皮下注射、腹こう内注射等が好適に使用され得る。
【００５６】
本発明においては、抗血清の産生確認と採取については、必要ならば追加免疫を実施し、試験採取を行い抗体価を調べることにより行うことが可能である。
【００５７】
本発明において、採取された抗血清の分離には特に制限はなく、一般的な方法、例えば採決血液を凝固させた後、遠心分離により血清を分離することが可能である。得られた抗血清の抗体色素に対する特異的抗体活性は、酵素免疫反応等で好ましく測定可能である（”生物活性を用いる測定法”、丸善、新基礎生化学実験法６、９８ページ）。
【００５８】
（ＩｇＧ画分）
本発明においては、抗血清からのＩｇＧ画分の精製法は特に制限されない。塩析法、ゲル瀘過法、イオン交換クロマトグラフ法等が好ましく使用可能であり、特にプロテインＡ法が好ましく使用可能である。さらに得られたＩｇＧ画分はまた、遠心法により濃縮可能であり所定の濃度に調整可能である。
【００５９】
（蛍光スペクトル測定法）
本発明においては、上記抗血清または抗体と蛍光性でない色素を混合することにより、当該混合溶液が蛍光性となり、得られた混合液の蛍光スペクトルを種々の測定法で測定することが可能である（蛍光・リン光分析法、西川・平本著、共立出版、第２章４９〜９９ページ）。
【００６０】
特に、共存物の干渉を受けずに、色素からの蛍光のみを高感度で定量することが、対照混合物との蛍光差スペクトルを測定することにより可能となる。
【００６１】
本発明において発現する蛍光量子収率は、色素、免疫性物質、免疫動物、免疫工程、分離精製手段等に依存する。
【００６２】
さらに本発明により、発現した蛍光性を利用して色素の定量分析が可能となる。定量分析の限界は、上記量子収率に依存する。
【００６３】
（トリフェニルメタン系色素）
例えば、マラカイトグリーンについて次のように吸光度感度と蛍光検出による測定感度の比較が可能である。
【００６４】
マラカイトグリーンをＰＢＳに溶解し、４〜４０００ｎＭの濃度範囲の希釈系列を調製する。
【００６５】
これらの溶液の６１７ｎｍの吸光度を測定（日立５５７型二波長分光光度計、光路長１ｃｍ石英セル、対照ＰＢＳ）し（表１）、濃度−吸光度曲線を作成する（図６）。
【００６６】
表１
濃度（nM) 4 12 40 120 400 1200 4000
吸光度（617nm) 0 0 0.002 0.009 0.036 0.132 0.464
図に示されるように、４０〜４０００ｎＭの範囲で濃度ー吸光度の間に直線的な相関が得られたが、１２ｎＭ以下では測定できなかった。
【００６７】
一方、モルモット１由来の本発明のＩｇＧ画分を一定量（最終濃度０．２μＭ）添加し、色素濃度を０〜１２ｎＭの範囲に調節したマラカイトグリーンの希釈系列（ＰＢＳ溶液）を調製した。
【００６８】
これらの溶液の蛍光を測定（日立蛍光分光光度計８５０型、励起側光路長１ｃｍ石英セル、励起波長６１７ｎｍ，発光波長６５０ｎｍ、励起光と発光のバンドパス幅はともに５ｎｍ，光電子倍増管の利得はＨｉｇｈ，時定数は１．５秒、蛍光の積算時間は３０秒）し（表２）、濃度ー蛍光強度曲線を作成する（図５）。
【００６９】
蛍光強度は蛍光分光光度計の出力値（任意の相対値）で示した。
【００７０】
表２
濃度（nM) 0 0.04 0.12 0.4 1.2 4 12
蛍光強度（650nm) 0.026 0.026 0.034 0.066 0.18 0.487 1.22
図に示されるように、０．１２ｎＭ〜１２ｎＭの範囲で濃度ー蛍光強度に直線的な相関が得られ、この濃度範囲で定量分析可能であることが示される。
【００７１】
従って、吸光度測定では１２ｎＭは検出できないが、本発明の抗体を用いた蛍光検出では１２ｎＭよりさらに２桁低濃度の０．１２ｎＭまで定量性良く高感度（吸光度による感度の３００倍）で検出可能である。
【００７２】
（ジフェニルメタン系色素）
さらに、ジフェニルメタン系色素であるオーラミンＯ（ＡＯ）を用いた場合においても、ローダミンと同様の効果を示す。すなわちＡＯの吸収スペクトルにおいて抗ＭＧ−ＫＬＨＩｇＧ混合液は、吸収強度の減少及び長波長へのシフトが見られる（図７）。
【００７３】
またオーラミンＯは、抗ＭＧ−ＫＬＨＩｇＧと混合することにより蛍光性を発現する（図８）。蛍光強度は、マラカイトグリーン程度と推定される。
【００７４】
以上の結果は、本発明に係る抗ＭＧ−ＫＬＨＩｇＧが色素分子の少なくともジフェニルメタン基を認識して結合し得ることを示している。
【００７５】
（マラカイトグリーンを用いた低バックグラウンド蛍光に基づく測定）
生体内には多くの蛍光物質が存在する。例えば、レチノール（ビタミンＡ）
は４７０ｎｍ付近に（生化学事典東京化学同人１３７３ページ）、またリボフラビンは５３６ｎｍ付近に極大をもつ蛍光を発する（同１３５０ページ）。これらの蛍光（自家蛍光）は、生体試料の蛍光測定の際にバックグラウンドとなり、検出感度を減少させ得るものである。
【００７６】
また、タイタープレートを用いた蛍光免疫測定の場合においては、プレートのプラスチック材質が発する蛍光も同様にバックグラウンドとなり、検出感度を減少させ得るものである。
【００７７】
この場合、励起波長および蛍光波長を、これらのバックグラウンド蛍光の励起、蛍光波長からより短波長側またはより長波長側に設定できれば、バックグラウンド蛍光の影響を効果的に減少させることができる。
【００７８】
この目的においては、蛍光色素として、自家蛍光の波長から分離した励起、蛍光波長を持つ蛍光色素が有用となる。例えば、本発明で使用するマラカイトグリーンはその好適な色素の１つである。
【００７９】
実際、マラカイトグリーンは、血清中成分の蛍光免疫測定において以下に説明するように極めて有効な色素であることが示される。すなわち、被検物質に対する抗体にマラカイトグリーン（以下ＭＧ）を共有結合で標識し、その抗体に抗ＭＧ抗体を反応させ、発する蛍光スペクトルを観測することが可能となる。すなわち、抗ＭＧ抗体を用いれば、抗体に標識されたＭＧが蛍光標識として有用であることが示される。さらにこの際、試料のバックグラウンド蛍光量（タイタープレート等の種々のバックグラウンド蛍光）、スペクトルを、ＭＧの励起波長で観測した場合と、より短波長で励起した場合と比較することにより、ＭＧで標識した場合においては、極めて低いバックグラウンド蛍光のみであり、他の色素に比較して高感度の測定が可能となる。
【００８０】
【作用】
本発明によれば、実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含む抗血清と、さらにそのＩｇＧ画分を分離し、これら分離した抗血清またはＩｇＧ画分と該色素とを混合することで、色素分子が蛍光性を発現、または増大することとなる。この混合物からの蛍光を測定することにより、上記色素の微量分析が可能となる。抗ＭＧ抗体を用いれば、抗体に標識されたＭＧが蛍光標識として有用であることが示される。
【００８１】
さらに、マラカイトグリーン色素で標識した場合においては、試料のバックグラウンド蛍光量を有効に減少させることが可能となり、従って、他の色素と比較して、高感度の測定が可能となる。
【００８２】
【実施例】
以下、添付図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。
【００８３】
（１）マラカイトグリーン標識ヘモシアニン、およびマラカイトグリーン標識ウシ血清アルブミンの調整
ヘモシアニン（Keyhole Lympet Hemocyanin 、Calbiochem社製）（ＫＬＨ）９．６ｍｇを１０ｍｌ三角フラスコ中で、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１０ｍｌに溶解した。これにマラカイトグリーンイソチオシアネイト（ＭＧＩＴＣ、Molecular Probe 社製）６．５ｍｇを加え、遮光し４℃にて一昼夜撹拌した。
【００８４】
上記の反応液をゲル濾過クロマトグラフィ−（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化された Bio-Rad 社製 Econo-Pac 10DG）に供し、未反応のＭＧＩＴＣとＭＧ標識ＫＬＨ（以下ＭＧ−ＫＬＨ）を分離した。
【００８５】
得られたＭＧ標識ＫＬＨ画分の蛋白質濃度は２２０μｇ／ｍｌ（Ｌｏｗｒｙ法）であった。
【００８６】
ウシ血清アルブミン９．５ｍｇを１０ｍｌ三角フラスコ中で、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１０ｍｌに溶解した。これにマラカイトグリーンイソチオシアネイト（ＭＧＩＴＣ、Molecular Probe 社製）６．５ｍｇを加え、遮光し４℃にて一昼夜撹拌した。
【００８７】
上記の反応液をゲル濾過クロマトグラフィ−（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化された Bio-Rad 社製 Econo-Pac 10DG）に供し、未反応のＭＧＩＴＣとＭＧ標識ＢＳＡ（以下ＭＧ−ＢＳＡ）を分離した。
【００８８】
得られたＭＧ標識ＢＳＡ画分の蛋白質濃度は２３７μｇ／ｍｌ（Ｌｏｗｒｙ法）であった。
【００８９】
（２）実験動物への免疫
（ｉ）初回免疫
（１）で調整したＭＧ−ＫＬＨ溶液１．０ｍｌを生理食塩水１．０ｍｌで希釈し抗原溶液とした。これを０．２２μｍのフィルターをつけた注射器（５ｍｌ）を用い、無菌条件でＲＡＳ（Ribi Adjuvant System, Ribi社製）バイアルに注入した。その後、このバイアルを２分間激しく振揺し、抗原溶液とアジュバントとのエマルジョンを調整した。
【００９０】
得られたエマルジョンをモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ、メス、ＳＰＦ，ｎ＝３）に麻酔下（ネンプタール、投与量は８ｍｇ／モルモット）で、一匹あたり０．５ｍｌを投与した（後背部皮下に０．１ｍｌ×４カ所、腹腔内に０．１ｍｌ）。
【００９１】
（ｉｉ）追加免疫
初回免疫から３週間間隔で２回、初回と同じ抗原量およびアジュバントを用いて追加免疫を行った。
【００９２】
（３）抗血清の坑体価測定
（ｉ）抗体価測定の時期は以下の予備試験により決定した。
【００９３】
１回目の追加免疫の２週間後、心臓採血により、免疫したモルモットからそれぞれ血液０．５ｍｌを部分採取し、抗体価を測定し、追加免疫２週間後に十分な抗体価の上昇が見られることを確認した。
【００９４】
この結果、２回目の追加免疫から２週間後に全採血を行い、その後同様にして最終的な抗体価を測定した。
【００９５】
（ｉｉ）抗血清の調整
採血した血液をインキュベーター中にて３７℃で１時間放置し、血餅の生成を促進させた。ついで４℃で一夜放置し血餅を収縮させた後、遠心分離により抗血清を分離した。
【００９６】
得られた抗血清のマラカイトグリーンに対する特異的抗体活性を、以下のように酵素免疫測定法により確認した。
【００９７】
（ｉｉｉ）酵素免疫測定法
ＭＧ−ＫＬＨ溶液（ＫＬＨとして２２０μｇ／ｍｌ）１５０μｌを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）１５ｍｌに溶解し、プラスチック製の９６穴イムノタイタープレイト（greiner 社製、ＥＬＩＳＡ−ＰＬＡＴＥＦ−ｆｏｒｍ）の各ウェルに０．１ｍｌずつ分注した。これを４℃で一夜放置し、ＭＧ−ＫＬＨをタイタープレイト内壁に吸着させた。
【００９８】
このイムノタイタープレイトに洗浄液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．０５％Tween20 含む）を０．１ｍｌ／ウェル加えたのち排出した。この洗浄工程を３回繰り返した。つぎにブロッキング溶液（１％ゼラチンＰＢＳ）を０．１ｍｌ／ウェル加え、４℃で一夜放置した。
【００９９】
その後再び洗浄液で同様に洗浄し、抗血清の希釈溶液（１００〜６４００倍の希釈系）と、対照として免疫を施していないモルモットの血清（希釈せず）を各ウェルに０．１ｍｌ加えた。このタイタープレイトを室温下６時間静置し、抗原と抗体を反応させた。
【０１００】
その後前記の洗浄液で洗浄し、horseradish peroxidase標識ヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体溶液（最終濃度＝１６μｇ／ｍｌ、Cappel社製）を０．１ｍｌ／ウェル加え４℃で一夜放置し、抗血清由来のＩｇＧと酵素抗体を反応させた。
【０１０１】
その後洗浄液で同様に洗浄し、反応基質溶液（ABTS Peroxidase Substrate System, Kirkegaad & Perry Laboratories社製）を各ウェルに０．１ｍｌ添加した。これを３７℃で１０分間加熱し酵素反応を行わせた後、反応停止液（１％ＳＤＳ水溶液）を添加した。このイムノタイタープレイトをプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、モデル３５５０）にセットし、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１０２】
図１に、２回目の追加免疫から１週間後に全採血した血清について抗体価を測定した一例を示す。３２００倍希釈まで対照に比し有意な抗体活性を示すことが示されている。
【０１０３】
また、マラカイトグリーン標識ウシ血清アルブミン（ＭＧ−ＢＳＡ）に対しても抗体活性を示し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）には活性を示さなかったことから、本抗血清はマラカイトグリーンを特異的に認識することが示される。
【０１０４】
（４）ＩｇＧ画分の精製
得られた抗血清から、プロテインＡを用いてＩｇＧ画分を精製した。プロテインＡ固定カラム（抗体精製用プロテインＡカラムキットＡｍｐｕｒｅＰＡＫｉｔ、Amersham 社製）を使用し、本抗血清１ｍｌからＩｇＧ画分、約４ｍｌを得た。
【０１０５】
得られたＩｇＧ画分を試料前処理用カートリッジ（遠心濃縮用 ULTRACENT-10 東ソー（株）製）に１〜１．５ｍｌずつを入れ、４℃冷却下、５０００ｒｐｍで３０〜６０分遠心した。これを繰り返すことにより、約４ｍｌを最終的に０．７ｍｌまで濃縮した。
【０１０６】
（５）坑体とマラカイトグリーンとの反応
標準試料としてウシγグロブリンを用いて前記得られた濃縮ＩｇＧ画分の蛋白定量（Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）した。
【０１０７】
その結果は以下の通りである。
【０１０８】

この結果に従って抗血清をその蛋白質濃度がＩｇＧ画分と等しくなるように希釈した。この希釈液およびＩｇＧ画分それぞれの１００倍〜６４００倍希釈液を調整し、ＭＧ−ＫＬＨ，ＭＧ−ＢＳＡを吸着させた９６穴イムノタイタープレートの各ウェルに０．１ｍｌずづ添加し４℃で一夜放置し抗原抗体反応を行った。その後、抗体価の測定と同様の手順で酵素免疫反応を行い、抗血清とＩｇＧ画分の抗体活性を比較した。その結果を図２に示す。これによりＩｇＧ画分が抗血清に比べ著しく高い活性を示し、ＩｇＧ画分を精製したことにより比活性が上昇したことが分かる。
【０１０９】
（６）吸収スペクトル
上記蛋白濃度が最終的に２μＭ，またＭＧが４μＭになるように蛋白と色素の濃度を希釈調整し、さらにモルモットのγグロブリンを抗ＭＧ−ＫＬＨＩｇＧに対する対照（ブランクＩｇＧ）として、上記ＩｇＧ画分とＭＧの混合の吸収スペクトルを測定した（図３）。
【０１１０】
図３に示すように、ＭＧとブランクＩｇＧの混合液の吸収スペクトルはＭＧのみのスペクトルと吸収極大波長に変化はみられないが、抗ＭＧ−ＫＬＨ活性を持つＩｇＧ画分とＭＧの混合液は、ＭＧのみに比べ吸収極大波長が６〜７ｎｍ長波長側にシフトしていることがわかる。
【０１１１】
これは、抗ＭＧ−ＫＬＨがＭＧに特異的に結合し結合体を形成することにより、色素の電子状態が変化し、吸収極大波長がシフトしたものと考えられる。
【０１１２】
（７）蛍光スペクトル
さらに上記混合物の蛍光スペクトルを測定した（図４、ＨＩＴＡＣＨＩ８５０蛍光分光光度計（日立製）、励起波長６１７ｎｍ，蛍光波長６３０〜８００ｎｍ，バンドパス５ｎｍ（励起側、蛍光側）、ｓｃａｎ６０ｎｍ／分，時定数０．５秒、光電子倍増管利得ＬＯＷ）。
【０１１３】
図４は抗ＭＧ−ＫＬＨ活性を持つＩｇＧ画分とＭＧの混合液の蛍光スペクトル（励起光６１７ｎｍ、蛍光６３０〜８００ｎｍ）から、ブランクＩｇＧとＭＧの混合液の蛍光スペクトルを差し引いた差スペクトルであり、差スペクトルをとることで、セル自体の蛍光や溶媒のラマン散乱など蛍光分析で問題となるノイズを除去し、純粋に試料の蛍光スペクトルを得ることが可能となる。
【０１１４】
差スペクトルにより、抗ＭＧ−ＫＬＨＩｇＧ結合体のＭＧが蛍光性であることが明確に示される。すなわち、蛍光性でないＭＧがこの抗体と特異的に結合体を形成することにより蛍光性となることが示される。
【０１１５】
したがって、上記の処理により蛍光性となったＭＧを特異的に、かつ定量的に蛍光分析することが可能となる。
【０１１６】
（８）マラカイトグリーン使用によるバックグラウンド蛍光の減少
以下のように、被検物質に対する抗体にマラカイトグリーン（以下ＭＧ）を共有結合で標識し、その抗体に抗ＭＧ抗体を反応させ、発する蛍光スペクトルを観測し、これにより、抗ＭＧ抗体を用いることによりバックグラウンド蛍光が減少し、従って、抗体に標識されたＭＧが蛍光標識として極めて有用であることを示した。
【０１１７】
マウス血清成分をタイタープレートに結合させた試料を調製し、この試料のバックグラウンド蛍光量、スペクトルを、ＭＧの励起波長で観測した場合と、より短波長で励起した場合と比較した。
【０１１８】
以下にその手順と結果を詳しく記述する。
【０１１９】
（Ａ）蛍光免疫測定の蛍光標識としてのＭＧ
（ｉ）ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体へのＭＧの標識
リン酸緩衝化生理食塩水（２０ｍＭ、ｐＨ７．３、以下ＰＢＳとする）０．５ｍｌにウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ワコー製）１．０５ｍｇを溶解し、これに炭酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ９．０）９．５ｍｌを加え撹拌した。この溶液に、マラカイトグリーンソチオシアネート（ＭＧＩＴＣ、ＭＰＩｎｃ製）０．３ｍｇを溶解したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４０μｌを加え、反応混合液を調製した。これを遮光し、４℃にて一夜撹拌し、ＭＧＩＴＣをＩｇＧに共有結合させて標識した。
【０１２０】
この反応混合液を、ＰＢＳで平衡化した脱塩カラム（１０ＤＧ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に供し、ＰＢＳを溶離液としてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、未反応のＭＧＩＴＣを分離除去し、ＭＧ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（以下ＭＧ標識抗体という）の画分を得た。
【０１２１】
この画分１００μｌにＰＢＳ９００μｌを加え、同画分の１０倍希釈液を調製し、その吸収スペクトルを測定した。結果を図９に示した。対照にはＰＢＳを用いた。６２０ｎｍ付近に吸収極大が認められることにより、抗体にＭＧが標識されていることが確認された。
【０１２２】
（ｉｉ）ＭＧ標識抗体と抗ＭＧ抗体との反応および蛍光スペクトル
上記のＭＧ標識抗体の画分１００μｌに抗ＭＧ抗体画分５μｌ、ＰＢＳ８９５μｌを加え、室温下、１時間撹拌し、ＭＧと抗ＭＧ抗体の抗原抗体反応を十分、平衡化した。
【０１２３】
つぎにこの溶液の蛍光スペクトルを分光蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ８５０型）にて測定した。励起波長は６２０ｎｍ、発光波長は６３０〜７５０ｎｍ。励起側バンドパス５．０ｎｍ、発光側バンドパス５．０ｎｍ、スキャン速度６０ｎｍ／分、光電子倍増管ゲインはｈｉｇｈとした。
【０１２４】
結果を図１０の（ａ）に示す。６５０〜６６０ｎｍの間に極大を持つ蛍光が観測された。これにより、抗体に標識されたＭＧが蛍光性になったことが確認される。さらに図１０の（ｂ）はＭＧ標識抗体をブランク抗体（ＭＧと結合しない抗体）と反応させたときの蛍光スペクトルであるが、ほとんど蛍光を示さない。これにより、ＭＧ標識抗体と抗ＭＧ抗体の反応が特異的であることが示された。
【０１２５】
（Ｂ）血清のバックグラウンド蛍光量の比較
（ｉ）血清の調製
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、オス、ａｄｕｌｔ）より血液を採取し、室温３０分放置して血液を凝固させた。これを４℃にて一夜放置し、血液凝固でできた血餅を分離し、血清を採取した。
【０１２６】
（ｉｉ）タイタープレートへの血清成分の結合
マウス血清をプラスチック製タイタープレート（ｇｒｅｉｎｅｒ社製、９６穴）の各ウエルに５０μｌ入れ、室温で６時間放置し、血清成分をタイタープレートに結合させた。その後、同タイタープレートの各ウエルを洗浄用バファー（リン酸緩衝化生理食塩水、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）にて洗浄し、結合していない血清成分を除去した。
【０１２７】
（ｉｉｉ）バックグラウンド蛍光量の測定
（Ｂ）で調製したタイタープレートを分光蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ８５０型）のセルホルダー内にセットした。その際、タイタープレート底面を励起光・検出器両者に対し、ともに４５度かたむけた（図１１）。この配置により、タイタープレート底面で反射された励起光は直接、検出器にはいらないようにした。また、励起光照射や蛍光測定の妨げとなるタイタープレートの余分な部分はあらかじめ切断した。なお、ここで観察されるバックグラウンド蛍光は、血清中成分とタイタープレート材質の両者に由来する蛍光が重ね合わせられたものである。
【０１２８】
測定条件は以下の２通りである。
【０１２９】
図１２の（ａ）：励起波長４４０ｎｍ、蛍光波長４５０〜６００ｎｍおよび
図１２の（ｂ）：励起波長６２０ｎｍ、蛍光波長６３０〜７８０ｎｍであり（ａ）の場合は、ＣＣＪＶ（９−（２−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ）ｊｕｌｏｌｉｄｉｎｅ）の蛍光測定の条件であり、また、蛍光免疫測定で一般的に用いられる蛍光色素フルオレセインの測定条件（励起極大波長＝４８３．５ｎｍ、蛍光極大波長５２５ｎｍ、生化学事典、東京化学同人、１０９１ページ）にも近いものである。測定の結果、（ｂ）の場合は４４０ｎｍで励起した場合（ａ）に比べ、バックグラウンド蛍光量が著しく減少していることが明らかである。
【０１３０】
以上の結果から、蛍光測定にＭＧを用いる事は、ＣＣＪＶやフルオレセインを用いる場合に比較して、バックグラウンドレベルを極めて低減でき、高感度の測定が可能となるという利点を有すると結論できる。
【０１３１】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、実質的に蛍光性でない色素を抗原とした抗体を作製し、この抗体と該色素を混合することにより実質的に蛍光性でない色素を蛍光性とすることが可能となり、該色素の微量蛍光分析を可能とする。またＭＧを用いる事により、他の色素、ＣＣＪＶやフルオレセインを用いる場合に比較して、バックグラウンドレベルを極めて低減でき、高感度の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る坑マラカイトグリ−ン標識ヘモシアニン血清の抗体価を示す図である。
【図２】本発明に係る抗血清とＩｇＧ画分の抗体活性の比較を示す図である。
【図３】本発明に係る坑マラカイトグリ−ン標識ヘモシアニン血清からのＩｇＧ画分と、マラカイトグリ−ンの混合液の吸収スペクトルを示す図である。
【図４】本発明に係る坑マラカイトグリ−ン標識ヘモシアニン血清からのＩｇＧ画分と、マラカイトグリ−ンの混合液の蛍光差スペクトルを示す図である。
【図５】マラカイトグリーンの濃度−蛍光強度曲線を示す図である。
【図６】マラカイトグリーンの濃度−吸光度曲線を示す図である。
【図７】本発明に係る坑マラカイトグリ−ン標識ヘモシアニン血清からのＩｇＧ画分と、オーラミンＯの混合液の吸収スペクトルを示す図である。
【図８】本発明に係る坑マラカイトグリ−ン標識ヘモシアニン血清からのＩｇＧ画分と、オーラミンＯの混合液の蛍光差スペクトルを示す図である。
【図９】本発明に係るＭＧ標識マウスＩｇＧの吸収スペクトルを示す図である。
【図１０】ＭＧ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の蛍光スペクトルを示す図であり、（ａ）は本発明に係る抗ＭＧ抗体を反応させた場合の蛍光スペクトルを示す図であり、また（ｂ）はブランクを反応させた場合の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１１】本発明に係る分光光度計内のタイタープレートの配置を示す図である。
【図１２】マウス血清成分を結合させたタイタープレートのバッックグラウンド蛍光を示す図であり、（ａ）は励起光４４０ｎｍ、蛍光波長４５０〜６００ｎｍで測定した図であり、（ｂ）は励起光６２０ｎｍ、蛍光波長６３０〜７８０ｎｍで測定した図である。

Claims

実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含む抗血清であって、前記抗血清または前記抗体と前記色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とする抗血清。
前記色素が、前記抗体と結合体を形成していない時には実質的に蛍光性でなく、前記抗体と結合体を形成することにより蛍光性となるものであることを特徴とする請求項１記載の抗血清。
前記抗体が、実質的に蛍光性でない色素に結合し、その結合により前記色素の分子構造を固定することにより蛍光性を増大または発現させることが可能なものであることを特徴とする請求項１または２に記載の抗血清。
前記抗原が、免疫性物質に前記色素を付加して形成したものであることを特徴とする請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の抗血清。
前記免疫性物質が、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清卵白アルブミン、ウシガンマグロブリン、ウマ血清グロブリン、ヒトガンマグロブリン、ヒツジガンマグロブリン、ウシチログロブリン、ブタチログロブリン、ヘモシアニン、合成ポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項４に記載の抗血清。
前記色素が、トリフェニルメタン構造を有する色素およびジフェニルメタン構造を有する色素からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗血清。
前記色素が、マラカイトグリーンおよび／またはオーラミンＯであることを特徴とする請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の抗血清。
実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体を含む抗血清中のＩｇＧ画分であって、前記ＩｇＧ画分と前記色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とするＩｇＧ画分。
前記色素が、前記抗体と結合体を形成していない時には実質的に蛍光性でなく、前記抗体と結合体を形成することにより蛍光性となるものであることを特徴とする請求項８記載のＩｇＧ画分。
前記抗体が、実質的に蛍光性でない色素に結合し、その結合により前記色素の分子構造を固定することにより蛍光性を増大または発現させることが可能なものであることを特徴とする請求項８または９に記載のＩｇＧ画分。
前記抗原が、免疫性物質に前記色素を付加して形成したものであることを特徴とする請求項８〜１０のうちのいずれか一項に記載のＩｇＧ画分。
前記免疫性物質が、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清卵白アルブミン、ウシガンマグロブリン、ウマ血清グロブリン、ヒトガンマグロブリン、ヒツジガンマグロブリン、ウシチログロブリン、ブタチログロブリン、ヘモシアニン、合成ポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１１に記載のＩｇＧ画分。
前記色素が、トリフェニルメタン構造を有する色素およびジフェニルメタン構造を有する色素からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項８〜１２のうちのいずれか一項に記載のＩｇＧ画分。
前記色素が、マラカイトグリーンおよび／またはオーラミンＯであることを特徴とする、請求項８〜１３のうちのいずれか一項に記載のＩｇＧ画分。
実質的に蛍光性でない色素を有する抗原に対する抗体であって、前記抗体と前記色素との混合物が蛍光性を有することを特徴とする抗体。
前記色素が、前記抗体と結合体を形成していない時には実質的に蛍光性でなく、前記抗体と結合体を形成することにより蛍光性となるものであることを特徴とする請求項１５記載の抗体。
前記抗体が、実質的に蛍光性でない色素に結合し、その結合により前記色素の分子構造を固定することにより蛍光性を増大または発現させることが可能なものであることを特徴とする請求項１５または１６に記載の抗体。
前記抗原が、免疫性物質に前記色素を付加して形成したものであることを特徴とする請求項１５〜１７のうちのいずれか一項に記載の抗体。
前記免疫性物質が、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清卵白アルブミン、ウシガンマグロブリン、ウマ血清グロブリン、ヒトガンマグロブリン、ヒツジガンマグロブリン、ウシチログロブリン、ブタチログロブリン、ヘモシアニン、合成ポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１８に記載の抗体。
前記色素が、トリフェニルメタン構造を有する色素およびジフェニルメタン構造を有する色素からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１５〜１９のうちのいずれか一項に記載の抗体。
前記色素が、マラカイトグリーンおよび／またはオーラミンＯであることを特徴とする、請求項１５〜２０のうちのいずれか一項に記載の抗体。