CN115078712A - 一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备及应用 - Google Patents

一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备及应用，包括以下步骤：(1)以柠檬酸和硫脲为碳量子点合成原料通过微波反应制备绿色荧光碳量子点；(2)将碳量子点通过活化酯法与鸡卵白蛋白偶联制备荧光供体探针；(3)将待测物抗体与金纳米粒子以物理吸附的方式偶联制备荧光受体探针；(4)按顺序依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘贴于PVC背板上；(5)所述的硝酸纤维素膜上分别包被有荧光供体探针‑待测物抗原混合物构成的检测线和荧光供体探针构成的质控线；(6)将荧光受体探针与待测样品混合后滴加于样品垫，通过毛细管作用向吸水垫层析，待测物抗原与待测物竞争结合荧光受体探针；(7)通过365nm紫外灯照射观察检测线处荧光强度。本发明具有特异性高、灵敏度好、操作简便及可实现定量检测的优点。

Description

一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种碳量子点荧光淬灭免疫层析快速检测技术，特别是一种以绿色碳量子点为荧光供体探针的小分子待测物的荧光淬灭免疫层析试纸条，属于免疫层析检测技术领域。
背景技术
基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析技术因其独特的识别形式以及其特异性、可逆性及反应阶段性等优异的特点得到了广泛的关注及研究，并逐渐成为临床疾病诊断的重要检测手段。免疫诊断技术也与生化诊断和分子诊断技术构成了体外诊断的三大领域。在世界粮农组织(FAO)的推荐下，免疫分析方法也被逐渐应用于食品安全检测分析领域，并已成为了食品安全检测的重要组成部分。包括ELISA，化学发光酶免疫分析，荧光免疫分析，免疫层析传感分析(ICS)在内的各种免疫测定已被广泛用于现场快速检测农产品和动物产品中的食品污染物残留[1-3]。
在众多免疫分析技术手段中，结合了多种标记手段的免疫层析分析方法因具有操作简单、检测时间短、便携以及可视化等多种优点，已逐渐被开发并作为快速筛选工具被广泛应用于食品安全领域[4]。而随着纳米技术的发展，免疫层析分析方法由传统胶体金标记手段实现比色分析而逐渐向由其他多种形式的比色、荧光及荧光淬灭等标记手段实现对待测物的快速及高灵敏检测[5,6]。其中，比色分析的优点在于无需任何信号捕捉技术即可通过肉眼实现对待测物的定性半定量检测分析，在现场快速筛查过程中具有一定优势，目前比色分析的主要标记材料多为金属纳米粒子、染色微球等[2]。但因肉眼分辨比色信号能力较差以及背景干扰大等原因，其灵敏度已无法满足痕量污染物的检测需求。荧光分析的优点在于基于荧光信号的输出在具有高灵敏度的同时可以避免基质干扰。以上两种分析方法在应用于食品中小分子待测物检测时，均以颜色或荧光信号消失 (turn-off)作为检测限(LOD)或检测临界值(cut-off值)，且信号强度随待测物含量的增加而降低，本实验将该信号输出模式称为“turn-off”模式。相较于以上两种分析方法，基于荧光共振能量转移(FRET)的荧光淬灭分析方法在食品中小分子待测物检测时以荧光信号的出现(turn-on)作为LOD或cut-off值，其信号强度随待测物含量的增加而逐渐增加，因此而具有更高的检测灵敏度[9]。但在构建荧光淬灭体系的过程中，荧光供体和荧光受体探针的匹配成为了其关键限制因素。目前荧光分析的主要标记材料多为荧光微球(FM)，量子点(QD)和上转换纳米粒子(UCNP)[7,8]等。但是，半导体量子点和稀土UCNP具有原料稀少，价格昂贵，合成工艺复杂，生物毒性较大等缺点。与这些材料相比，碳量子点(CDs)不仅具有毒性低，生物相容性好的优点，而且具有光稳定性好，功能简单，成本低廉和大量合成的优势。目前，微波法合成绿色碳量子点为荧光供体探针、金纳米颗粒为荧光受体探针的小分子待测物光热荧光淬灭免疫层析分析技术还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种碳量子点荧光淬灭免疫层析快速检测试纸条，为了实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种以荧光碳量子点为荧光供体、金纳米粒子为荧光受体的小分子待测物的荧光淬灭免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、包被荧光供体探针-待测物抗原混合物的硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有由荧光供体探针-待测物抗原混合物构成的检测线和荧光供体探针构成的质控线，两条线间隔距离为4-6mm；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫各交叠区的长度分别为0.8-1.3mm，试纸条宽3.0-4.0mm；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫各交叠区的长度分别为1mm。
本发明还公开了上述金纳米颗粒为荧光受体探针的小分子待测物的光热定量免疫层析试纸条的具体技术，包括如下步骤：
(1)通过微波合成法以柠檬酸和硫脲为原料制备绿色荧光碳量子点；
(2)将碳量子点通过活化酯法与鸡卵白蛋白偶联制备荧光供体探针；
(3)将待测物抗体吸附于金纳米颗粒表面制备荧光受体探针；
(4)按顺序依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘贴于PVC背板上；
所述的硝酸纤维素膜上分别包被有荧光供体探针-待测物抗原混合物构成的检测线和荧光供体探针构成的质控线；将荧光受体探针与待测样品混合后滴加于样品垫，通过毛细管作用向吸水垫层析，待测物抗原与待测物竞争结合荧光受体探针。365nm 紫外灯照射观察检测线处荧光强度。
优选的，碳量子点的制备方法为：在搅拌下将5g柠檬酸和7g硫脲添加到25mL水中。不断搅拌后，将混合物置于家用微波炉(800瓦)中7分钟，直到溶液从无色变为深棕色为止，表明反应物发生了碳化。冷却至室温后，添加25mL水以溶解产物。
优选的，金纳米颗粒-待测物抗体(Au-Ab)荧光受体探针的制备步骤为：
(a)取800μL 25μg/mL金纳米颗粒溶液,向其中添加6μL 0.2mol/L K2CO3溶液及 10μL 0.65mg/mL待测物抗体加入到上述溶液中混合均匀，室温下静置1h。
(b)向步骤(a)得到的混合溶液中加入10μL 20％BSA及5μL 10％PEG-20000，混匀后室温下静置30min；
(c)将安道管配平，4℃条件下，12000rpm离心步骤(b)得到的溶液15min，弃去上清，溶液复溶至80μL 0.5％BSA，0.5％PVP，1％Tween 20及0.5％PEG200混合液中待用。
优选的，将用PBS溶液稀释后的荧光供体探针包被于硝酸纤维素膜上作为质控线，包被量分别为0.7μL/cm，将用PBS溶液稀释后的荧光供体探针-待测物抗原混合物包被于硝酸纤维素膜上作为检测线，包被量分别为0.7μL/cm，37℃烘干，斩切为宽为3.7mm 的试纸条，封装备用。
本发明试纸条的使用方法为：取5μL制备的Au-Ab标记物，添加于100μL样品溶液中，混合后滴在样品垫上，在365nm紫外灯照射后，用肉眼在10分钟内获得视觉结果。
本发明中检测待测物的金复合物光热定量免疫层析快速检测技术的原理如下：
将与Au-Ab标记物混合的样品溶液滴到样品垫上，并且由于毛细力而向吸收垫的方向上方流动。在待测物阴性样品中，Au-Ab探针被检测线的待测物抗原捕获，产生明显的红色线，并且在365nm紫外灯照射后，吸收检测线处绿色碳量子点的荧光，导致肉眼无法观测到检测线处的荧光，而质控线处因没有荧光受体探针，绿色量子点的荧光不被吸收，从而产生明显绿色荧光条带。然而，当检测到待测物阳性样品溶液时，待测物与检测线5上的待测物抗原竞争与Au-Ab探针结合，红色线颜色随样品中待测物浓度的增加而变浅直至消失，检测线处荧光出现。
当通过肉眼进行可视化半定量检测时，以试纸条上检测线荧光强度的变化作为结果判断标准：若待测样品试纸条检测线无荧光，则判断为阴性样品，即不含待测物；若待测样品试纸条检测线可观察到绿色荧光，则判断为阳性样品，即待测样品中含有待测物；阳性结果和阴性结果，质控线均显明显绿色荧光，若质控线绿色荧光条带消失，则试纸条检测失效。
与现有国内外小分子物质免疫吸附检测技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1、本发明通过简单一步法制备了具有高荧光强度的荧光供体探针；
2、本发明将该探针应用于免疫层析分析技术上，与金纳米颗粒荧光受体探针结合实现了待测物的荧光淬灭检测；
3、本发明可用于小分子待测物的高灵敏度和定量检测；
4、本发明准确性好、灵敏度高，适用于大量样品的快速筛选，可作为食品中小分子待测物快速检测的有效筛检手段。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明检测试纸条的组装示意图。
图2为本发明荧光供体探针的制备示意图。
图3为本发明以绿色荧光碳量子点为荧光供体探针、金纳米颗粒为荧光受体探针的小分子待测物的荧光淬灭免疫层析试纸条检测示意图(A：阴性样品检测结果，B：阳性样品检测结果)。
图4为相机拍摄邻苯二甲酸二甲酯检测结果(待测物的浓度分别为0、10、20、和50μg/L)。
图5为荧光淬灭免疫层析试纸条检测白酒中邻苯二甲酸二甲酯检测结果
附图标记说明：
1.样品垫、2.结合垫、3.硝酸纤维素膜4.吸水垫、5.检测线、6.质控线、7.PVC 背板
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造，但所举实例不作为对本发明的限定。
实施例l(制备实施例)
荧光淬灭免疫层析分析试纸条及制备技术
1.绿色荧光碳量子点的制备
在搅拌下将5g柠檬酸和7g硫脲添加到25mL水中。不断搅拌后，将混合物置于家用微波炉(800瓦)中7分钟，直到溶液从无色变为深棕色为止，表明反应物发生了碳化。冷却至室温后，添加25mL水以溶解产物。
2.荧光供体探针的制备
取1mg碳量子点溶于1mL MES缓冲液中，向其中加入100μL 10mg/mL EDC溶液及50μL 10mg/mL鸡卵白蛋白(OVA)溶液，室温下避光震荡4h后通过10KD超滤膜超滤离心去除未结合碳量子点。
3.金纳米颗粒-待测物抗体(Au-Ab)荧光受体探针的制备
如图1所示，选择物理吸附的方式制备Au-Ab。
(1)取800μL 25μg/mL金纳米颗粒溶液,向其中添加6μL 0.2mol/L K2CO3溶液及4 μL 0.65mg/mL待测物抗体加入到上述溶液中混合均匀，室温下静置1h。
(2)向其中加入16μL 20％BSA及8μL 10％PEG-20000，混匀后室温下静置30min。
(3)将安道管配平，4℃条件下，12000rpm离心40min，弃去上清，溶液复溶至80μL0.5％BSA，0.5％PVP，1％Tween 20及0.5％PEG200混合液中待用。
4.邻苯二甲酸二甲酯包被原的制备
(1)取10 mg OVA于小玻璃瓶中，用1mL PBS(pH 7.4)溶液溶解。
(2)另取2.78mg DMP半抗原溶于100μL DMF中，待完全溶解后，在搅拌状态下以 5μL/min的速度将半抗原溶液加入到蛋白溶液中，加入溶液时分多点加入以混合均匀。
(3)将10μL戊二醛与10μL PBS混合，加入到上述反应体系中，加入时间不超过2min，室温避光反应1h后，至于44℃搅拌反应过夜。
(4)用PB透析72h除去多余的戊二醛，透析结束后每管1mL分装，置于4℃下保存。
5.硝酸纤维素膜的包被
用双维平面划膜仪将步骤2制备的荧光供体探针和步骤4制备的待测物包被原用PBS溶液分别稀释为0.1mg/mL后混合，包被于硝酸纤维素膜3上作为检测线5，包被量为0.7μL/cm；将用PBS溶液稀释为0.05mg/mL后的荧光供体探针包被于硝酸纤维素膜 3上作为质控线6，包被量为0.7μL/cm，37℃烘干，斩切为宽为3.7mm的试纸条，封装备用。
6.试纸条的组装
将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4按图1所示的顺序依次粘附在PVC背板7上，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫个交叠区的长度分别为1mm。切成 3.7mm宽的小条，真空封装。
7.检测步骤
用移液枪吸取100μL待检样品提取液于离心管中，并加入5μL Au-Ab，混匀后，滴加到试纸条的加样孔里，365nm激光照射下用肉眼在10min内获得视觉结果。
8.结果判定
当通过肉眼进行可视化半定量检测时，以试纸条上检测线5颜色的变化作为结果判断标准：若待测样品试纸条检测线5没有荧光，则判断为阴性样品，即不含待测物；若待测样品试纸条检测线5颜色与质控线6颜色一致，则判断为阳性样品，即待测样品中含有待测物；阳性结果和阴性结果，质控线6均显绿色荧光条带，若质控线6绿色荧光条带消失，则试纸条检测失效。
实施例2(应用实施例)
邻苯二甲酸二甲酯光热定量免疫层析技术的使用技术
1.白酒样品的预处理
准确移取白酒5mL置于试管中，提取前在沸水浴中放置一段时间以除去白酒中的乙醇，向其中加入5mL的正己烷，充分震荡2min混匀提取，将2mL上清液氮气吹干后，用400μLPBS复溶备用。
2.检测步骤
用移液枪吸取100μL待检样品提取液于离心管中，并加入5μL Au-Ab，混匀后，滴加到试纸条的加样孔里，365nm激光照射下用肉眼在10min内获得视觉结果。
3.结果判定
向邻苯二甲酸二甲酯阴性的白酒样品中添加邻苯二甲酸二甲酯制备含有2、5和10μg/kg邻苯二甲酸二甲酯的样品，利用步骤1白酒的预处理方法处理样品，并通过步骤2 进行检测，结果如图5所示。结果表明该方法用于白酒中邻苯二甲酸二甲酯的检测灵敏度为2μg/kg。
以上所述技术及实例仅为充分说明本发明的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的变换和替换，都在本发明的保护范围内。
以上所述仅为本发明创造的技术原理，仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过微波合成法以柠檬酸和硫脲为原料制备绿色荧光碳量子点；
(2)将碳量子点通过活化酯法与鸡卵白蛋白偶联制备荧光供体探针；
(3)将待测物抗体吸附于金纳米颗粒表面制备荧光受体探针；
(4)按顺序依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘贴于PVC背板上；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有荧光供体探针-待测物抗原混合物构成的检测线和荧光供体探针构成的质控线；将荧光受体探针与待测样品混合后滴加于样品垫，通过毛细管作用向吸水垫层析，待测物抗原与待测物竞争结合荧光受体探针，365nm紫外灯照射观察检测线处荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备，其特征在于，步骤(1)所述碳量子点的制备方法为：在搅拌下将5g柠檬酸和7g硫脲添加到25mL水中，不断搅拌后，将混合物置于家用微波炉，800瓦7分钟，直到溶液从无色变为深棕色为止，表明反应物发生了碳化，冷却至室温后，添加25mL水以溶解产物。
3.根据权利要求1所述的一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备，其特征在于，步骤(2)所述荧光供体探针的制备方法为：取1mg碳量子点溶于1mL MES缓冲液中，向其中加入100μL 10mg/mL EDC溶液及50μL 10mg/mL鸡卵白蛋白溶液，室温下避光震荡4h后通过10KD超滤膜超滤离心去除未结合碳量子点。
4.根据权利要求1所述的一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备，其特征在于，步骤(3)所述荧光受体探针的制备包括如下步骤：
(1)取800μL 25μg/mL金纳米颗粒溶液，向其中添加6μL 0.2M K2CO3溶液及4μL 0.65mg/mL待测物抗体加入到上述溶液中混合均匀，室温下静置1h；
(2)向其中加入16μL 20％BSA及8μL 10％PEG-20000，混匀后室温下静置30min；
(3)将安道管配平，4℃条件下，8000rpm离心40min，弃去上清，溶液复溶至80μL0.5％BSA，0.5％PVP，1％Tween 20及0.5％PEG200混合液中待用。
5.权利要求1所述一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备得到的试纸条，包括样品垫、结合垫、包被荧光供体探针-待测物抗原混合物的硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有由荧光供体探针-待测物抗原混合物构成的检测线和荧光供体探针构成的质控线，两条线间隔距离为4-6mm；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫各交叠区的长度分别为0.8-1.3mm，试纸条宽3.0-4.0mm；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫各交叠区的长度分别为1mm。
6.权利要求1所述一种碳量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的制备得到的试纸条，用于检测食品中小分子物质。
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