CN1682112A - 使用荧光化抗体的荧光分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用抗原抗体反应可简便、高灵敏度且实时连续地分析(包括图像)生物体内物质等的荧光分析方法。本发明的荧光分析方法包括：得到抗体色素溶液和含有测定对象物质的被检测体溶液的混合溶液的混合工序，上述抗体色素溶液含有各自具有预定浓度的抗体和色素，上述抗体的抗原结合部位的一部分识别色素，其余的一部分识别测定对象物质，上述色素被上述抗体识别，且与上述抗体结合时由非荧光性转为荧光性；用励起光照射上述混合溶液，测定由上述混合溶液发出的荧光的强度，得到测定值的测定工序；和基于预先求得的荧光强度和测定对象物质浓度的关系，由上述测定值求得上述测定对象物质的浓度的计算工序。

Description

使用荧光化抗体的荧光分析方法
技术领域
本发明涉及使用与抗体结合后从非荧光性转为荧光性的色素的荧光分析方法。
背景技术
对于学术研究或疾病的诊断、治疗而言，分析生物体内的生物体成份或各种化学物质(医药品、环境污染物等)是非常重要的。但是，用于分析这些物质的通常的现有方法需要复杂的、很花时间的用于采取体液、摘除组织或除去夹杂物的前处理，所以人们一直期望开发出可简便分析生物体内物质等的高灵敏度分析方法。
因此，作为使这类分析成为可能的方法之一，人们开发了使用荧光色素标识抗体的免疫测定法(immunoassay及immuno-metric-assay)。即，利用该免疫测定法，根据抗原抗体反应的特异的分子识别功能，使高选择性的分析成为可能，且即使不除去杂质，也可通过荧光分析选择性测量测定对象物。而荧光色素标识抗体通常使用预先以荧光色素标识过的抗体，根据抗原结合部位识别某一特定物(抗原)。另外，在日本特开平4-211363号公报中，揭示了具有两个抗原结合部位，其一由组织(tissue)纤维蛋白溶酶原激活剂惹起、而另一个由荧光物质等标记引起的二重特异性杂交(hybrid)单克隆抗体。另外，在日本特开平9-5324号公报中，揭示了相对于将非荧光色素附加于免疫性物质形成的抗原的抗体。另外，在日本特开平11-183477号公报中，还揭示了一种在胰岛素的存在下测定基于胰岛素及孔雀绿(MG)的结合物质(MG标识胰岛素)与将该结合物质作为抗原的抗MG-Ins抗体的抗原抗体反应的荧光强度变化的荧光免疫测定方法。
发明内容
本发明人发现：抗原抗体反应是不可逆的，这对本领域技术人员而言是技术常识(例如《荧光免疫分析》宫孔洁等，讲谈社Scientificp.57-58(1985)；K.Ichihara et al.，Clinica Chimica Acta Vol.98，p.87～100(1979)；等)，在现有的免疫测定法中，难以实时连续分析生物体内物质等的量的变化。
另外，本发明人还发现：在日本特开平11-183477号公报所述的MG标识胰岛素与抗MG-Ins抗体的抗原抗体反应时，在识别胰岛素的部位(胰岛素识别部位)，引起胰岛素和MG标识胰岛素的竞争反应，最终几乎所有的MG标识胰岛素占据胰岛素识别部位而达到稳定状态，即，胰岛素和MG标识胰岛素的竞争反应是不可逆反应；以及因此使用利用该抗原抗体反应的免疫测定法难以实时连续分析生物体内物质等的量的变化。
本发明就是鉴于上述现有技术所具有的问题而完成的发明，其目的是提供利用抗原抗体反应可简便、高灵敏度并能实时连续进行分析(包括图像)生物体内物质等的荧光分析方法。
本发明人为达成上述目的而深入研究后，结果发现：意想不到的是，在非荧光性色素单体及免疫性物质单体的存在下，使用本发明的发明人已申请的日本特开平9-5324号公报所述的抗体——即相对于将免疫物质附加在非荧光性色素而形成的抗原的抗体——的抗原抗体反应是可逆的，另外还发现：通过利用可逆的抗原抗体反应进行荧光分析，达成了上述目的，从而实现了本发明。
即，本发明涉及一种荧光分析方法，其特征在于，包括：得到抗体色素溶液与含有测定对象物质的被检测体溶液的混合溶液的混合工序，上述抗体色素溶液含有各自具有预定浓度的抗体和色素，上述抗体的抗原结合部位的一部分识别色素，其余的一部分识别测定对象物质，上述色素被上述抗体识别，且与上述抗体结合时由非荧光性转为荧光性；用励起光照射上述混合溶液，测定由上述混合溶液发出的荧光的强度，得到测定值的测定工序；以及基于预先求得的荧光强度和测定对象物质浓度的关系，由上述测定值求得上述测定对象物质的浓度的计算工序。
在本发明的荧光分析方法中，在上述抗体色素溶液和上述被测体溶液的混合溶液中，上述色素和上述测定对象物质通过抗原抗体反应分别与上述抗体结合，与抗体结合的色素由非荧光性转为荧光性。此时，由于色素与抗体的结合受到共存的测定对象物质的量的影响，所以由与抗体结合的色素发出的荧光的强度随着共存的测定对象物质的量而被阻碍或被增强。因此，在一定的溶液中，色素和抗体的量与荧光强度和测定对象物质浓度相关，根据该关系(检量线)，由荧光强度的实际测定值求得测定对象物质的浓度。因此，在本发明的荧光分析方法中，可通过抗原抗体反应的特异的分子识别机能进行选择性高的高灵敏度分析，且即使不除去夹杂物，利用不易受夹杂物影响的荧光分析也可有选择地简便测量测定对象物质。于是，本发明的抗原抗体反应，即识别上述抗体中的上述色素的部分和上述色素的结合反应，以及识别上述抗体中的上述测定对象物质的部分和上述测定对象物质的结合反应，与抗原抗体反应是不可逆的这一现有技术常识相反，是可逆的，上述抗体中的上述色素和识别上述测定对象物质的部分被上述色素、上述测定对象物质等占据，而未达到稳定状态，所以，利用与测定对象物质量的变动相应地改变荧光强度，而能实时连续地进行分析(包括图像)。
因此，在本发明的荧光分析方法中，在上述计算工序后，还可包括另将被测体溶液添加到上述混合溶液中混合，实行上述测定工序和上述计算工序，反复求得测定对象物质的浓度的连续分析工序。由于包括该连续分析工序，所以可实时连续分析测定对象物质的浓度。
另外，上述计算工序优选包括：根据随着上述被测体溶液的添加的体积变化修正上述测定值，得到荧光强度修正值的工序；根据预先求得的荧光强度修正值和混合溶液中的测定对象物质浓度的关系，由上述荧光强度修正值求得上述混合溶液中的测定对象物质的浓度的工序；由上述混合溶液中的测定对象物质浓度求得上述被测体溶液中的测定对象物质的浓度的工序。通过包括上述工序，即使在忽略伴随着被测体溶液的添加的混合溶液中的色素和抗体的浓度变化的情况下，也可修正为没有这样的浓度变化的状态，充分防止了分析精度的降低。
而且，本发明的荧光分析方法还可以包括：得到抗体色素溶液和含有预定浓度的测定对象物质的标准溶液的混合溶液的混合工序，上述抗体色素溶液含有各自具有预定浓度的抗体和色素，上述抗体的抗原结合部位的一部分识别色素，其余的一部分识别测定对象物质，上述色素被上述抗体识别，且与上述抗体结合时由非荧光性转为荧光性；用励起光照射上述混合溶液，测定由上述混合溶液发出的荧光的强度，得到测定值的测定工序；将标准溶液添加到上述混合溶液中混合，然后实行上述测定工序，反复求得荧光强度的测定值的连续测定工序；以及根据上述测定工序和上述连续测定工序中所得到的测定值和上述测定对象物质的添加量求得荧光强度和测定对象物质浓度的关系，制作检量线的工序。通过包括这样的工序，可高效率地得到荧光强度和测定对象物质浓度的关系，即检量线。
另外，上述检量线制作工序优选包括：根据随着添加上述标准溶液的体积变化修正上述测定值，得到荧光强度修正值的工序；算出上述混合溶液中的测定对象物质的浓度的工序；求得上述荧光强度修正值和上述混合溶液中的测定对象物质浓度的关系的工序。通过包括上述工序，即使在忽略伴随着被测体溶液的添加的混合溶液中的色素和抗体的浓度变化的情况下，也可修正为没有这样的浓度变化的状态，充分防止了检量线的精度的降低。
另外，本发明的上述色素优选为具有三苯甲烷结构的色素或具有二苯甲烷结构的色素，更优选为孔雀绿或金胺O(槐黄)。
另外，本发明的上述抗体优选为(i)以上述色素和上述测定对象物质的结合物质为抗原形成的抗体，或(ii)将利用抗体识别且在与上述抗体结合时由非荧光性转为荧光性所必要的结构与上述色素共通的色素与上述测定对象物质的结合物质用作抗原而形成的抗体，这样的抗体和色素的组合更优选为(i)上述抗体为将孔雀绿和上述测定对象物质的结合物质作为抗原而形成的抗体，上述色素是孔雀绿的组合，或(ii)上述抗体是将孔雀绿和上述测定对象物质的结合物质作为抗原而形成的抗体，上述色素是金胺O。
另外，利用本发明的荧光分析方法的上述测定对象物质优选为选自应成为免疫测定对象的蛋白质、荷尔蒙、维生素、菌体、环境污染物质、医药品。
附图说明
图1为作为抗原的MG-测定对象物质复合体的示意图。
图2为抗原识别部位识别MG和测定对象物质两者的状态示意图。
图3为MG和抗体的抗原抗体反应的示意图。
图4为测定对象物质和抗体的抗原抗体反应的示意图。
图5为抗体、MG和测定对象物质三者的抗原抗体反应示意图。
图6A及图6B分别为测定对象物质对抗体-MG间的抗原抗体反应的影响的示意图。
图7为MG-抗体半衰期长于测定对象物质-抗体的示意图。
图8为本发明的检量线的制作方法的优选实施方式的流程图。
图9为本发明的荧光分析方法的优选实施方式的流程图。
图10为抗MG-Ins血清的抗体值的曲线图。
图11为抗MG-Ins Fab和MG反应后的MG荧光光谱图。
图12为MG浓度和MG荧光强度的关系曲线图。
图13为胰岛素浓度和MG荧光强度的关系(检量线)曲线图。
图14为抗MG-Ins IgG和AO反应后的AO荧光光谱图。
图15为胰岛素浓度和AO荧光强度的关系(检量线)曲线图。
图16为反复添加胰岛素和抗胰岛素IgG后的AO荧光强度变化曲线图。
具体实施方式
下面，参照附图详细说明本发明的荧光分析方法的优选实施方式。另外，在附图中，对相同或相当的部分标柱相同符号。
色素
本发明所用的色素无特别限制，只要是在水等通常溶剂中为非荧光性，当与后述抗体结合时转为荧光性的物质即可。另外，本发明中的非荧光性是指实质上为非荧光性，在通常的测定条件下显示不出荧光光谱或仅显示出极弱的荧光，优选为实质上利用市售装置等不能进行荧光分析(荧光分光分析)的色素(西川泰治等《荧光磷光分析法》、共立出版社，30页，1984年)。该实质上显示不出荧光性的色素优选为荧光量子收率在特定条件下小于1％的色素，更优选为荧光量子收率在特定条件下为0.01％以下的色素。
另外，在本发明中，“当色素与抗体结合时由非荧光性转为荧光性”是指当实质上非荧光性的色素与抗体结合时变成荧光性(荧光性增高)，通过得到用通常荧光分析所得灵敏度之上的分析灵敏度，使荧光分析成为可能，优选为从色素的荧光量子收率在通常的测定条件下为极小的状态(例如0.01％以下)，利用本发明的处理而与抗体结合(相互作用)，变化到荧光量子收率大的状态(例如1％以上)。
在本发明中，色素从非荧光性转为荧光性时的荧光强度的增加优选为荧光量子收率至少增加10倍以上，更优选为至少增加100倍以上，特别优选为至少增加1000倍以上。
另外，本发明中可用的色素不一定必须在可见光区域有吸收(在350nm以上有极大吸收)，也可以是紫外区域有吸收(在350nm以下具有极大吸收)或吸收带延及可见光区域的色素。
可用在本发明中的色素的分子结构无特别限制，可使用含有各种发色团(chromophore)的色素，优选使用pH值在中性附近含有稳定的发色团的色素。
这样的色素优选为例如分子结构中具有三苯甲烷骨架的色素(例如参照讲谈社Scientific社，大河原信编《色素手册》)，这样的三苯甲烷系色素特别优选为具有下述化学结构的孔雀绿(MG)。
Figure A0382235900101
另外，这样的色素还优选为例如分子结构中具有二苯甲烷骨架的色素(例如参照讲谈社Scientific社，大河原信编《色素手册》)，这样的二苯甲烷系色素特别优选为具有下述化学结构的金胺O(AO)。
Figure A0382235900102
当使用这样的孔雀绿或金胺O时，可得到约1000倍以上的荧光量子收率的增加。另外，除这些色素外，还可优选利用CCVJ(9-(二氰乙烯基)久洛尼定)系色素、ANS(苯胺基萘)系色素、TNS(对甲苯胺基萘)系色素、DNP(2，4-二硝基苯)系色素。
另外，孔雀绿在水溶液中基本上无荧光，当与抗MG抗体结合后变成荧光性。本发明人推测，这是因为孔雀绿的分子内运动因抗体而受到抑制，结果孔雀绿在吸收励起光后与在水溶液中时相比，在分子内运动的热过程(＝非辐射过程)中回到基态的概率相对减少，在辐射过程中失去活性的概率(＝发出荧光)相对增加。这一推论适于具有同样化学结构或同样失活过程的所有色素(二苯甲烷系色素、三苯甲烷系色素)。此外，还可从其它方面了解到机理不同但也是利用抗体显著增强荧光强度的色素(Tomomichi Iwaki et al.，Biochemistry 1993，Vol.32，p.7589-7592；蛋白核酸酶另册《荧光测定原理及其在生物体系中的应用》小野寺昌彦(金冈佑一等编集)共立出版，1974年，p.189-197)。
测定对象物质
可适用于本发明的荧光分析方法的测定对象物质无特别限制，只要是与上述色素结合的物质(复合体)能起到抗原的功能的物质即可。另外，本发明的测定对象物质本身不一定必须是免疫性物质。即，通常，相对于免疫耐受性-低抗原性物质得不到抗体，但在本发明中，因为使用人工化合物的色素与测定对象物质结合的复合体作为抗原而得到抗体，所以，即使测定对象物质本身是免疫耐受性-低抗原性物质，与色素的复合体成为免疫性的可能性很高，可通过后述方法得到抗体。
因此，在本发明的荧光分析方法中，除无机离子或有机离子之外的广泛物质可适用为测定对象物质，其中优选为选自应成为免疫测定对象的蛋白质(胰岛素等)、激素、维生素、菌体、环境污染物质及医药品的物质作为测定对象物质。
另外，只要测定对象物质本身在成为抗原时具有足够大的分子量(通常约为5000以上)，则所有这样的测定对象物质均可调制后述抗体。即，即使测定对象物质对免疫的动物而言是免疫耐受性物质(是该动物品种的生物体内成份的情况等)，也可调制后述抗体。这是因为本发明的抗原不是测定对象物质本身，而且是交联人工制品色素的人工制品。
另外，即使测定对象物质本身在成为抗原时不具备足够的分子量，也可调制再通过共价键与相对于色素和测定对象物质的复合体具备抗原性的担体交联的物质，将该物质用作抗原。在该情况下，也得到了抗原识别部位形成识别色素和测定对象物质两者的形态的下述抗体。
抗体
本发明所用的抗体是其抗原结合部位的一部分识别色素且余下的部分识别测定对象物质的抗体。即，本发明的抗体的一个抗原结合部位在空间上被分解为多个部分，其中的一部分识别色素，而余下的部分识别测定对象物质。这样的一个抗原结合部位具有多个不同机能的技术是现有技术中不存在的、而由本发明人初次发现的技术。
这样的本发明的抗体优选为以本发明的荧光分析方法中所用的色素和测定对象物质的结合物质为抗原而形成，例如在分析所用的色素是孔雀绿时，上述抗体优选为将孔雀绿和测定对象物质的结合物质作为抗原而形成的抗体。
另外，分析中所用的色素不一定必须与用于得到抗体的色素相同，也可使用利用抗体识别且与抗体结合时由非荧光性转为荧光性所必需的结构两者共通的色素。这样的结构共通的色素的组合可举出孔雀绿和金胺O的组合。因此，例如当分析中所用的色素是金胺O时，上述抗体可为孔雀绿和测定对象物质的结合物质作为抗原而形成的抗体。
色素和测定对象物质的复合体(抗原)的制作
本发明的上述色素和测定对象物质的复合体(抗原)的制作方法无特别限制，例如可在规定时间搅拌混合上述测定对象物质和色素，使用凝胶过滤色谱法分离色素和测定对象物质的复合体的抗原组分。
而且，在需要时，可通过使用例如利用免疫反应的精制手段精制所得到的抗原(川岛紘一郎(译)《免疫测定入门》，南山堂，第70页，1987年)。另外，所得抗原的浓度可用例如Lowry法定量。
抗血清的制作
本发明的上述抗体可以用下述免疫工序制作。
即，本发明的上述抗体可通过将上述复合体(抗原)投药给免疫动物，然后从免疫动物身上采取血液，由该血液分离抗血清而制作。对服用上述复合体(抗原)的免疫动物无特别限制，可使用兔子、天竺鼠等。另外，可使用的免疫佐剂也无特别限制，例如可优选使用通常的弗罗因德氏不完全佐剂、铝佐剂等。且对可用的免疫注射法也无特别限制，例如，对于天竺鼠，可优选使用皮下注射、腹腔内注射等。另外，抗血清的产生确认和采取如有需要可通过实施追加免疫，进行试验采取，研究抗体价来进行。
对分离采取的抗血清的方法无特别限制，可用通常的方法，例如使采取的血液凝固后，利用离心分离来分离血清。对所得抗血清的上述复合体(抗原)有特异性的抗体活性可优选用酶免疫反应等测定(图解《荧光抗体法——原理、技术及应用》川生明著，p.135～138、SoftScience社(1983))。
IgG组分的制作
在本发明中，可使用上述抗血清中的抗体，也可使用精制抗血清而得的IgG组分作为抗体。对由这样的抗血清精制IgG组分的方法无特别限制，可优选使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法等，特别是可优选使用蛋白质A法。还可利用离心法进一步浓缩所得IgG组分，这样可将IgG组分调至规定浓度。
抗原结合性片段(Fab)的制作
在本发明中，更优选将由上述IgG组分调制的抗原结合性片段(Fab)用作抗体。当使用抗原结合性片段(Fab)时，有更可靠地防止生成与测定对象物质与免疫复合体的沉淀的趋势。对由这样的IgG组分调制抗原结合性片段(Fab)的方法无特别限制，例如可使用消化酶(消化酶木瓜酶等)消化IgG组分，得到抗原结合性片段(Fab)。另外，优选通过蛋白质A法等免疫沉降法等精制所得抗原结合性片段(Fab)，也可进一步通过离心法浓缩。这样可将抗原结合性片段(Fab)调至预定浓度。
本发明的荧光分析方法的原理
在本发明的荧光分析方法中，当在溶液中混合上述抗体、色素和测定对象物质时，通过色素和测定对象物质分别与抗原抗体的反应而与抗体结合，与抗体结合的色素由非荧光性转为荧光性。此时，色素与抗体的结合受共存的测定对象物质的量的影响，与抗体结合的色素发出的荧光强度根据共存的测定对象物质的量而被阻碍或被增强。且与现有技术的抗原抗体反应是不可逆的常识相反，本发明的抗原抗体反应是可逆的，根据测定对象物质的量的变动而改变荧光强度。本发明人推测，该本发明的荧光分析方法的原理如下所述。并以代表本发明所用的色素的使用孔雀绿(以下表示为MG)的情况为例进行说明。
由于MG单独用作抗原时分子量过小，所以在得到抗MG抗体时，将MG与分子量更大的物质(担体)以共价键交联的化合物作为抗原投药给动物。此时，当选择担体作为测定对象物质时，抗原通过MG和测定对象物质的共价键而成为复合体(如图1所示的MG-测定对象物质复合体)。这样所得的抗体(IgG等)中含有图2所示的其抗原识别部位识别MG和测定对象物质两者的形态的物质。
当在溶液中混合该抗体和MG时，引起抗原抗体反应，如图3所示，MG与抗体的抗原结合部位(非共价键)结合。该键的离解速度常数为kd-MG。另一方面，与在溶液中混合测定对象物质和该抗体时同样，如图4所示，测定对象物质在抗体的抗原结合部位(非共价键)结合。该离解速度常数为kd-anal。但由于MG和测定对象物质都仅是抗原(即MG-测定对象物质复合体)的一部分，所以发明人推测：MG单独和抗体的结合(以下称为“MG-抗体结合”)、测定对象物质单独和抗体的结合(“以下称为“测定对象物质-抗体结合”)都比最初的抗原MG-测定对象物质复合体和抗体的结合弱。即，当MG-测定对象物质复合体和抗体的结合的离解速度常数为kd-Ag时，离解速度常数小的一方难以离解，即，因为结合强，所以各离解速度常数的关系为：
                kd-Ag＜kd-MG
                kd-Ag＜kd-anal
接着，在混合该抗体、MG及测定对象物质三者后，如图5所示，MG和测定对象物质都与抗体的抗原结合部位结合。而当MG和测定对象物质二者容纳于抗原结合部位时，因为与MG-测定对象物质复合体结合于抗体的图2所示状态接近，所以发明人推测最为稳定。但此时，测定对象物质有可能对MG-抗体结合造成影响，MG也有可能对测定对象物质-抗体结合造成影响。所以发明人推测：其反应速度论由MG和测定对象物质各自在抗原结合部位内所占位置(哪个更靠内)和各自的离解速度常数决定。例如，当MG结合于比测定对象物质更靠近内部的位置时，在测定对象物质先与抗体结合时，如图6A所示，MG的结合受到阻碍，另一方面，如果MG先结合，如图6B所示，通过此后的测定对象物质的结合，MG的结合与MG单独的情况相比，稳定化进一步增强。这种增强与MG-抗体结合的kd-MG表观上的减小一致。即，当该表观离解速度常数为kd-MG′时，kd-MG′＜kd-MG。于是，当kd-MG、kd-anal程度相同，就推测该阻碍和增强发生很大差别。
但当两者不同时，阻碍和增强有一方占优势。通常抗原抗体复合体的半衰期t1/2用t1/2＝0.693/kd求得。即，kd小的一方半衰期长。因此，在kd-MG＜kd-anal时，如图7所示，MG-抗体结合的半衰期变得更长。则即使发生图6A所示的阻碍，测定对象物质也在较短时间内从抗体离解，然后MG结合，以更长的半衰期继续形成MG-抗体结合。于是，测定对象物质可与该位置结合，引起其结果增强(成为kd-MG′＜kd-MG)。而当kd-anal＜kd-MG(MG的一方离解快)时，即使MG结合，在测定对象物质结合并受到增强以前也会从抗体上离解，所以难以引起增强而由阻碍支配。
本发明人推测：实际上kd-MG和kd-anal的大小关系随所得抗体而各不相同，单克隆抗体时为各抗体克隆，多克隆抗体时为所含的各单克隆抗体的总体发生阻碍、增强的任一方面。
本发明利用的就是该现象。即，当注目于MG-抗体结合时，在MG和抗体保持在一定量的情况下，阻碍或增强的程度依赖于共存的测定对象物质的量，这表现在MG的荧光强度的变化上。因此，通过测定MG的荧光强度变化，可检测、定量测定对象物质。
于是，本发明的上述抗原抗体反应与现有技术的抗原抗体反应是不可逆的常识相反，是可逆的。因此，根据测定对象物质的量的变动而变动MG的荧光强度，通过测定其荧光强度变化，可实时连续分析测定对象物质。
检量线的制作
本发明的荧光分析方法优选为在实际试料测定以前，预先求得表示荧光强度和测定对象物质的关系的检量线。根据图8所示的流程图详细说明本发明的检量线的制作方法的优选实施方式。
在图8所示的流程图中，首先，调制分别以规定浓度(抗体浓度：YμM、色素浓度：ZμM)含有抗原结合部位的一部分识别色素且余下的一部分识别测定对象物质的上述抗体和与抗体结合时由非荧光性转为荧光性的上述色素的抗体色素溶液Aml(S101)。另外，所用溶剂无特别限制，优选为pH为中性附近，优选为pH6.5～7.5的缓冲液，这样的溶剂可举出例如磷酸缓冲生理盐水。
然后将该抗体色素溶液加入荧光测定用容器，设置(set)在根据使用的色素等分别设定励起光波长及荧光波长为规定值的荧光分光光度计中。这时，设定次数n的初值为n＝1(S102)。另外，优选保持吸收池座(cell holder)的温度为一定温度，保持温度优选为在25～37℃范围内的温度。另外，优选以规定时间搅拌容器中的溶液。
再将含有规定浓度(XμM)测定对象物质的标准溶液Bnml添加到容器中的溶液中，搅拌所得混合溶液规定时间，进行色素及测定对象物质和抗体的抗原抗体反应(S103，混合工序)。另外，标准溶液中所用的溶剂无特别限制，与抗体色素溶液中所用的溶剂一样，优选为pH为中性附近的缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水)。
接着，用具有规定励起光波长的励起光照射容器中的混合溶液，测定由该混合溶液发出的具有规定荧光波长的荧光的强度，取得测定值In(S104，测定工序)。另外，对励起光的照射及荧光强度的具体测定方法无特别限制，荧光强度测定值In优选为取得规定测定时间中的荧光强度的平均值或积分值。另外，还可将未添加测定对象物质的状态下的荧光强度作为空白值，将实际荧光强度测定值减去空白值的值作为荧光强度的测定值In(且此时，相对于实际测定值，在实施根据随着添加标准溶液等的体积变化的修正后，减去空白值)。
然后根据随着添加上述标准溶液的体积变化修正如上所述得到的荧光强度测定值In，算出与抗体浓度为YμM且色素浓度为ZμM的溶液中的荧光强度相当的荧光强度修正值In′(S105)。另外，修正荧光强度的体积变化时的计算式为下式(1)：
I n ′ = I n × { ( A + Σ n - 1 n B n ) / A } - - - ( 1 )
当次数n＝1时，为
I1′＝I1×{(A+B1)/A}           (1)′
另外，算出测定荧光强度后的混合溶液中的测定对象物质的浓度Xn′μM(S106)。另外，计算混合溶液中的测定对象物质浓度时的计算式为下式(2)：
X n ′ = X × { Σ n - 1 n B n / ( A + Σ n - 1 n B n ) } - - - ( 2 )
当次数n＝1时，为
X1′＝X×{B1/(A+B1)}        (2)′
这样得到次数n＝1时的荧光强度修正值In′及测定对象物质浓度Xn′后，次数n加1(S108)，再进行上述标准溶液Bnml的添加混合(S103)、荧光强度测定值In的取得(S104)、荧光强度修正值In′的计算(S105)及测定对象物质浓度Xn′的计算(S106)，得到次数n＝2时的荧光强度修正值In′及测定对象物质Xn′。另外，次数n＝2时，上述式(1)变为：
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A}         (1)″
当次数n＝2时，为
X2′＝X×{(B1+B2)/(A+B1+B2)}    (2)″
反复进行S108→S103→S104→S105→S106→S107(连续测定工序)，至这样得到的荧光强度修正值In′即使添加标准溶液也无变化为止，即(In′-In-1′)的值为设定值(例如零)以下(S107)为止，分别得到次数n从1～n时的荧光强度修正值In′及测定对象物质浓度Xn′。
然后根据这样得到的次数n从1～n时的荧光强度修正值In′及测定对象物质浓度Xn′，制作表示荧光强度修正值In′及测定对象物质浓度Xn′的关系的检量线(S109，检量线制作工序)。另外，对将这些数值绘成检量线的具体方式无特别限制，适当利用最小二乘法等公知方法可得到精度更高的检量线。
实际试料的测定
根据图9所示的流程图详细说明本发明的荧光分析方法的优选实施方式。
在图9所示的流程图中，首先，与制作检量线时一样，调制分别以规定浓度(抗体浓度：YμM、色素浓度：ZμM)含有抗原结合部位的一部分识别色素且余下的一部分识别测定对象物质的上述抗体和与抗体结合时由非荧光性转为荧光性的上述色素的抗体色素溶液Aml(S201)。另外，所用溶剂无特别限制，与制作检量线时所用的溶剂一样，优选为pH为中性附近的缓冲液，例如磷酸缓冲生理盐水。另外，抗体色素溶液中的抗体浓度及色素浓度与制作检量线时一样，分别为YμM、ZμM。
然后将该抗体色素溶液加入荧光测定用容器，与制作检量线时一样，设置在分别将励起光波长及荧光波长设定为规定值的荧光分光光度计中。这时，设定次数n的初值为n＝1(S202)。另外，优选保持吸收池座的温度与制作检量线时同样的温度，保持温度优选为在25～37℃范围内的温度。另外，优选以规定时间搅拌容器中的溶液。
再将被测体溶液Bnml添加到容器中的溶液中，搅拌所得混合溶液规定时间，进行色素及测定对象物质和抗体的抗原抗体反应(S203，混合工序)。另外，被测体溶液也可直接使用作为测定对象的体液等，也可为用溶剂稀释到规定倍的溶液。该稀释中所用溶剂无特别限制，与抗体色素溶液中所用的溶剂一样，优选为pH为中性附近的缓冲液，例如磷酸缓冲生理盐水。
接着，用具有规定励起光波长的励起光照射容器中的混合溶液，测定由该混合溶液发出的具有规定荧光波长的荧光的强度，取得测定值In(S204，测定工序)。另外，对励起光的照射及荧光强度的具体测定方法无特别限制，与制作检量线时一样，荧光强度测定值In优选为取得规定测定时间中的荧光强度的平均值或积分值。
然后根据随着添加上述标准溶液的体积变化修正如上所述得到的荧光强度测定值In，算出与抗体浓度为YμM且色素浓度为ZμM的溶液中的荧光强度相当的荧光强度修正值In′(S205)。另外，修正荧光强度的体积变化时的计算式为下式(3)：
I n ′ = I n × { ( A + Σ n = 1 n B n ) / A } - - - ( 3 )
当次数n＝1时，为
I1′＝I1×{(A+B1)/A}      (3)′
然后根据表示预先求得的荧光强度修正值In′和测定对象物质浓度Xn′的关系的检量线，由荧光强度修正值In′求出混合溶液中的测定对象物质的浓度Xn′μM(S206)。
于是，可由这样求得的混合溶液中的测定对象物质的浓度Xn′算出上述被测体溶液Bnml中的测定对象物质的浓度XnμM(S207)。另外，计算被测体溶液中的测定对象物质浓度时的计算式为下式(4)：
X n = { X n ′ × A + Σ n = 1 n B n ) - Σ n = 1 n - 1 X n B n } / B n - - - ( 4 )
当次数n＝1时，为
X1＝{X1′×(A+B1)}/B1        (4)′
另外，在本实施方式中，上述荧光强度修正值In′的计算(S205)、混合溶液中的测定对象物质浓度Xn′的计算(S206)及被测体溶液中的测定对象物质的浓度Xn的计算(S207)相当于本发明的计算工序。
这样就可测定被测体溶液中的测定对象物质浓度Xn，由于如上所述，本发明的抗原抗体反应是可逆的，所以使如下所述地连续测定其它被测体溶液成为可能。即，当需要测定其它被测体溶液时(S208)，次数n加1(S209)，再进行上述标准溶液Bnml的添加混合(S203)、荧光强度测定值In的取得(S204)、荧光强度修正值In′的计算(S205)、混合溶液中的测定对象物质浓度Xn′的计算(S206)及被测体溶液中的测定对象物质的浓度Xn的计算(S207)，就可测定第二次(次数n＝2)的被测体溶液中的测定对象物质浓度Xn。另外，次数n＝2时，上述式(3)变为：
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A}              (3)″
上述式(4)变成：
X2＝{X2′×(A+B1+B2)-(X1×B1)}/B2    (4)″
然后反复进行上述S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208(连续分析工序)，至无需测定其它被测体溶液(S208)为止，就可连续测定多个(次数n为1～n)被测体溶液中的测定对象物质浓度Xn。另外，这样的测定对象物质浓度的连续测定可反复进行，直至抗体相对于测定对象物质饱和等即使添加被测体溶液荧光强度也不再变化的程度。
由于在上述本实施方式的荧光分析方法中利用抗原抗体反应，所以可通过特异的分子识别机能进行高选择性的高灵敏度分析，且通过荧光分析，即使不除去夹杂物也可有选择地简便测量测定对象物质。而且，因为本发明的抗原抗体反应与现有技术的抗原抗体反应是不可逆的常识相反，是可逆的，所以利用对应于测定对象物质的量的变动改变荧光强度(增强或阻碍)，就可进行实时连续分析。
实施例
下面，根据实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例，在不脱离本发明的技术构思的范围内，可进行各种变更。
实施例1：使用抗MG-Ins抗体的Fab和MG的胰岛素的定量
(1-1)试药及实验动物
实施例所用的主要试药及实验动物如下。孔雀绿(MG，AldrichChemical Company，Inc.制)、孔雀绿异硫氰酸酯(MGITC，MolecularProbes Inc.制)、金胺O(AO，Aldrich Chemical Company，Inc.制)、二甲亚砜(DMSO，和光纯药工业(株)制)、胰岛素(猪，和光纯药工业(株)制)、SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，和光纯药工业(株)制)、抗猪胰岛素抗体(免疫动物Guinea Pig，Sigma制)、天竺鼠(Crj；Hartley，雄性，三周，SPF，体重225～240g，日本Chars-River(株)制)、麻醉剂(NEMBUTAL Sodium Solution，50mg/ml，Dynabot(株)制)、RAS(Ribi Adjuvant System MPL+TDM+CWS Emulsion，R-730(RIBI Immuno Chem Research，Inc.制)、0.1M磷酸缓冲液(PB，pH7.0)、抗原涂敷用缓冲液(50mM碳酸钠缓冲液，pH8.4(+)NaN3)、清洗用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水，pH7.2(+)0.05％Tween20)、阻挡用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水，pH7.2，0.5％Gelatin)，96孔微量滴定板(ELISATESTPLATEF-FORM 2X8 F-STRIPS BINDUNG，greiner制)、过氧化物酶标识山羊抗天竺鼠IgG抗体(Peroxidase标识Goat抗Guinea PigIgG抗体，ORGANON TEKNIKA CORPORATION Cappel ResearchProduct制)、试料前处理用筒(离心浓缩用MINICENT-30或ULTRACENT-30、东曹(株)制、分组分子量30000道尔顿)、显色试药套件(ABTS Peroxidase Substrate System，Kirkegaard & PerryLaboratories Inc.制)、固定化番木瓜蛋白酶(Sigma制)。
(1-2)使用仪器
实施例所用的主要机器如下。读卡机(BIO-RAD MODEL 3550MICROPLATE READER)、离心机(HITACHI SCR18B，日立制作所制)、离心机转子(RPR-18-3，日立制作所制)、离心机(Labnet FORCE7，Labnet International Inc.制)、离心机(KOKUSAN MODEL H-103RS，国产离心机(株)制)、涡流搅拌机(AUTOMATIC MIXER S-100，TAITEC(株)制)、荧光分光光度计(Fluorolog，instruments S.A.Inc.制)、循环机(BU150P，YAMATO科学(株)制)，小转子(孔内盛荣堂制)、荧光测定用容器(孔内盛荣堂制)、高速液体色谱仪(LaChrom系统接口D-7000，UV检测器D-7400，泵D-7100，脱气器D-7610、日立制作所制)。
(1-3)共通实验法(蛋白质试料的离心浓缩及蛋白定量的方法)
含有蛋白质的试料使用试料前处理用筒(ULTRACENT-30或MINISENT-30)和离心机(HITACHI SCR18B或Labnet Force7)，在3000xg下离心浓缩。溶剂取代也在离心浓缩时同时进行。
另外，试料的蛋白质浓度使用市售的试药套件(BCA Protein AssayReagent Kit，PIERCE制)及标准蛋白质溶液(马IgG标准液，浓度2mg/ml，ImmunoPure Horse IgG Standard，PIERCE制)，并用BCA法定量。即，将蛋白质试料(根据需要用PB稀释的物质)、标准蛋白质溶液稀释系列(25～1500μg/ml)及PB(检量级用空白试料)各25μl加入容量1.5ml的埃彭道夫管，向其中添加试药套件的反应液(根据BCA Protein Assay Reagent Kit Manual(Pierce制)调制必要量)500μl并搅拌，在37℃下加温30～60分钟。然后从各埃彭道夫管将300μl分注到96孔微量滴定板，用读卡机测定595nm的吸光度。然后根据标准蛋白质溶液稀释系列浓度-吸光度的关系制成的检量线求得蛋白质试料的蛋白浓度。
(1-4)抗原(MG-Ins复合体)的调制
如下所述进行抗原的孔雀绿(MG)和胰岛素(Ins)的共有结合物(MG-Ins复合体)的调制和精制。即，将胰岛素4.7mg及孔雀绿异硫氰酸酯(MGITC)0.6mg(溶于20μl的二甲亚砜)溶于2ml的0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.8)，用铝轮给容器遮光，在4℃下搅拌一夜。在该反应中，孔雀绿异硫氰酸酯与胰岛素的氨基结合，得到MG-Ins复合体。然后，为除去未反应成份，将所得反应液供至经0.1M磷酸钠缓冲液(PB，pH7.0)平衡过的凝胶过滤柱(Econo-Pac 10DG，BIO-RAD制)，用4ml的PB使未反应成份从柱中溶出，得到MG-Ins组分(约1.2mg/ml)。
(1-5)利用免疫调制抗血清
将MG-Ins组分330μl和生理盐水1.7ml添加到RAS的小药瓶中，用涡流搅拌机剧烈搅拌，调制抗原和佐剂的乳液。
再用麻醉剂(NEMBUTAL)麻醉(投药量15ml/kg)4只天竺鼠，将上述乳液在每只的颈部投药0.5ml(皮下注射(0.1ml×4个位置)，在腹腔投药0.1ml。在该初次免疫后，以一周的间隔，将等量的抗原和佐剂投药三次，进行追加免疫。
在最后的追加免疫一周后，将用醚麻醉的天竺鼠开腹，由肾大静脉采全血。再将所得血液采集到10ml试管中，在孵卵器中加温到37℃，使之形成血饼。然后用离心机(KOKUSAN MODEL H-103RS)进行离心分离(3000rpm、4℃、10min)分离血饼，得到抗血清。
(1-6)抗体价的测定
利用酶免疫测定法测定抗血清的抗体价。即，首先将抗原涂敷用缓冲液6.3ml添加到MG-Ins组分700μl中，分注到96孔微量滴定板的各孔中0.1ml，在4℃下静置一夜，使抗原(MG-Ins复合体)吸附涂敷在板的各孔内面。然后除去板内的抗原溶液，将0.1ml的清洗用缓冲液添加至各孔，以清洗孔内。进行三次该清洗操作后，为防止非特异吸附，将阻挡用缓冲液0.1ml添加到各孔中，在4℃下静置一夜。然后除去阻挡用缓冲液，再进行三次利用清洗用缓冲液的清洗。
再用PB稀释抗血清，调制稀释系列(稀释倍数：500～32000倍)。再调制用PB稀释5倍未投放抗原的天竺鼠的血清，作为对照。相对于该对照物的抗体价，该抗血清稀释系列所显示的抗体价实质上相当于100～6400倍稀释的抗体价。将该抗血清稀释系列及对照血清稀释液各0.1ml添加到上述板的各孔中，在4℃下静置一夜，进行抗原抗体反应。
从这样进行抗原抗体反应的上述板中除去抗血清稀释系列和对照血清稀释液，进行三次利用清洗用缓冲液0.1ml的清洗操作。然后在各孔中分别添加0.1ml过氧化物酶标识山羊抗天竺鼠IgG抗体的1000倍稀释液(用PB稀释)，在4℃下静置一夜。然后，进行三次利用清洗用缓冲液0.1ml的清洗操作，将显示过氧化物酶的酶活性的显色试剂(2，2′-连氮-二[3-乙基-苯基噻唑啉]磺酸酯，ABTS)的反应液(根据试药套件ABTS Peroxidase Substrate System的指南调制)0.1ml分注到各孔中，在37℃下加温30分钟进行酶反应。然后将SDS的1％水溶液0.1ml添加到各孔中，使酶反应停止，用读卡机测定各孔的吸光度(405nm)。所得结果如图10所示。
由图10所示结果可知：各天竺鼠的抗血清分别稀释到800倍或1600倍，显示出强于对照血清的抗体活性，得到MG-Ins复合体特异的抗血清。将这样的四只天竺鼠的抗血清的混合物(以下称为“抗MG-Ins血清”)用于下述实验。
(1-7)抗MG-Ins IgG组分的调制
将固定了与IgG特异结合的蛋白质Protein A的树脂{rProtein ASepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech AB制)}0.7ml填充于塑料制柱(内径约7mm、长约8mm)中(以下称为“蛋白质A柱”)，用3ml的PB清洗。
然后用1ml的PB稀释抗MG-Ins血清1ml，通过安装在5ml可任意使用的注射器上的筒型过滤器(0.45μ、W-25-5、东曹(株)制)除去微粒。将其添加到蛋白质A柱中，使IgG与蛋白质A结合，然后使10ml的PB流过柱，清洗除去没有与蛋白质A结合的成份。再使4ml的0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.0)流过蛋白质A柱，使IgG从蛋白质A离解，得到抗MG-Ins IgG组分。再使10ml的PB流过蛋白质A柱，再生该柱。在离心浓缩所得抗MG-Ins IgG组分时溶剂取代PB。根据需要，反复上述操作，调制后述实验所需量的抗MG-Ins IgG组分。
(1-8)来自抗MG-Ins IgG组分的抗原结合性片段(Fab)的调制、分离精制
用消化酶番木瓜蛋白酶消化IgG，调制Fab。即，首先，将固定化的番木瓜蛋白酶8.7mg加入容量2.2ml的埃彭道夫管中，添加200μl的PB，搅拌后进行离心分离，除去上清液，清洗固定化番木瓜蛋白酶。反复进行两次该清洗后，使固定化番木瓜蛋白酶悬浊在1ml的20mM磷酸缓冲液(pH7.0，(+)10mM EDTA(+)20mM半胱氨酸)中。再添加500μl的20mM磷酸缓冲液和500μl的抗MG-Ins IgG组分(IgG浓度约4.5mg/ml)的混合液，使半胱氨酸的最终浓度为10mM，加温到37℃，振荡数小时，进行酶反应。然后进行酶反应液的轻度离心分离，采集上清，将所得上清添加到蛋白质A柱中，使未消化的IgG与蛋白质A结合。然后再使10ml的PB流过蛋白质A柱，进行采取，再离心浓缩，得到含有抗MG-Ins抗体的Fab(以下称为“抗MG-Ins Fab”)的组分(5.20mg/ml，34.7μM as IgG＝69.3μM as Fab)。
(1-9)与抗MG-Ins Fab结合的孔雀绿的荧光光谱的测定
如下所示，测定利用抗原抗体反应使MG与抗MG-Ins Fab结合时的MG的荧光光谱。即，将两成份混合，使抗MG-Ins Fab浓度为0.955μM、MG浓度为0.907μM(溶剂为磷酸缓冲生理盐水(pH7.2，PBS))，在25℃下搅拌5分钟，进行抗原抗体反应。然后使用荧光分光光度计在励起光波长620nm、荧光波长630～750nm、励起光侧和荧光侧的带通宽均为5nm的条件下，测定由上述混合溶液发出的荧光光谱。所得荧光光谱的未处理数据减去相同条件下测定的磷酸缓冲生理盐水的本底以及增加利用装置函数的修正值的荧光光谱如图11所示。确认水溶液中基本上无荧光的孔雀绿与抗MG-Ins Fab结合转为荧光性。
另外，使抗MG-Ins Fab浓度为1μM、MG浓度在0～0.9μM的范围内变化，同上所述地测定荧光光谱。所得结果如图12所示。另外，纵轴是MG发出的荧光的强度值(每秒平均值，CPS：count per second)。
根据图12所示的结果，抗体和色素的相对量的优选值，即色素相对于抗体不饱和且得到较强色素荧光的值，在以下定量中，相对于抗MG-Ins Fab浓度1μM采用MG浓度0.4μM。另外，每次与每次的调整多克隆抗体时的该相对值有可能不同，另外，即使来自相同的多克隆抗体，也有可能因调整的Fab的精制纯度，表观上呈现不同。
(1-10)使用抗MG-Ins Fab和孔雀绿的胰岛素的定量
[1-10-1]检量线的制作
如下所示，制作相对于一定量(1μM)的抗MG-Ins Fab和一定量(0.4μM)的MG的表示胰岛素浓度和荧光强度的关系检量线。另外，所用胰岛素形成含锌的多分子缔合体，所以事前溶于含有最终浓度为0.1％的SDS的PB中，使该缔合体离解。然后，将所得胰岛素溶液供至用PBS平衡过的凝胶过滤柱(Fast Desaliting column HR 10/10，Pharmacia制)，在下述定量中，使用从该胰岛素溶液中除去SDS的产物。
(1)将荧光分光光度计设定为励起光波长620nm、荧光波长650nm，保持吸收池座的温度在一定温度(25℃)。
(2)调制含有1μM(Y＝1μM)的抗MG-Ins Fab和0.4μM(Z＝0.4μM)的MG的2ml(A＝2ml)抗体色素溶液(溶剂为磷酸缓冲生理盐水)(pH7.2、PBS)(S101)。
(3)将所得抗体色素溶液加入荧光测定用标准容器内，将该容器设置在荧光分光光度计中，用小转子搅拌容器中的溶液30秒。并将次数设为初值(n＝1)(S102)。
(4)将26.5μM(X＝26.5μM)的胰岛素标准溶液(溶剂为PBS)10μl(B1＝0.01ml)添加到容器中的溶液中，用小转子搅拌5分钟，进行抗原抗体反应(S103)。
(5)用励起光照射容器中的溶液，测定从该溶液中发出的MG的荧光强度30秒，求得荧光强度每秒平均值(荧光强度测定值：I1)(S104)。另外，将胰岛素浓度为0μM时的荧光强度作为空白值，实际测定值减去空白值为测定值。
(6)用下述计算式修正(根据随着添加标准溶液的体积变化的修正)所得荧光强度测定值(I1)，求得体积变化修正值(荧光强度修正值：I1′)(S105)。
I1′＝I1×{(A+B1)/A}    (1)′
(7)由胰岛素标准溶液的浓度(X)，使用下述计算式求得测定荧光强度的混合溶液的胰岛素浓度(胰岛素浓度修正值：X1′)(S106)。
X1′＝X×{B1/(A+B1)}    (2)′
(8)次数n加1(S108)，再重复上述(4)～(7)(S103→S104→S105→S106)，求得次数n＝2时的荧光强度修正值I2′及胰岛素浓度修正值(X2′)。另外，次数n＝2时，使用下述计算式。
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A}         (1)″
X2′＝X×{(B1+B2)/(A+B1+B2)}    (2)″
(9)重复上述(8)(S108→S103→S104→S105→S106→S107)，至所得荧光强度修正值In′即使添加标准溶液也不变化、即(In′-In-1′)值至零以下(S107)的程度，分别求得次数n为1～n时的荧光强度修正值(In′)及胰岛素浓度修正值(Xn′)。另外，使用下述计算式。
I n ′ = I n × { ( A + Σ n = 1 n B n ) / A } - - - ( 1 )
X n ′ = X × { Σ n = 1 n B n / ( A + Σ n = 1 n B n ) } - - - ( 2 )
将次数n为1～n时相对于(10)所得的胰岛素浓度修正值(Xn′)的荧光强度修正值(In′)绘成图，制成胰岛素浓度为0～1.8μM范围的检量线(S109)。所得检量线如图13所示。
由图13所示结果可确认：使用抗MG-Ins Fab和孔雀绿时，随着胰岛素浓度的增加，孔雀绿的荧光强度也增加，即，可确认引起荧光增强。且由于在胰岛素浓度修正值(Xn′)和荧光强度修正值(In′)之间，在0～1.7μM的范围内有正线性相关关系，所以可通过测定孔雀绿的荧光强度对该范围的胰岛素浓度定量，且即使胰岛素浓度在约为0.13μM的这样的低浓度下也可进行定量，检测灵敏度(约0.1μM)高。
[1-10-2]实际试料的测定
使用上述所得检量线，如下所述地对实际试料中的胰岛素浓度定量。实际试料的被测体溶液是体液、其浓缩液或用PBS等稀释的溶液。
(11)将荧光分光光度计设定为励起光波长620nm、荧光波长650nm，保持吸收池座的温度在一定温度(25℃)。
(12)调制含有1μM(Y＝1μM)的抗MG-Ins Fab和0.4μM(Z＝0.4μM)的MG的2ml(A＝2ml)抗体色素溶液(溶剂为磷酸缓冲生理盐水)(pH7.2、PBS)(S201)。
(13)将所得抗体色素溶液加入荧光测定用标准容器内，用荧光分光光度计调整该容器，用小转子搅拌容器中的溶液30秒。另外，次数设定为初值(n＝1)(S202)。
(14)将被测体溶液20μl(B1＝2.020ml)添加到容器中的溶液中，用小转子搅拌5分钟，进行抗原抗体反应(S203)。
(15)用励起光照射容器中的溶液，测定从该溶液中产生的MG的荧光强度30秒，求得荧光强度每秒钟的平均值(荧光强度测定值：I1)(S204)。另外，将被测体溶液未添加时的荧光强度作为空白，实际的测定值减去空白的值用作测定值。
(16)用下述计算式修正(按照伴随着添加被测体溶液的体积变化的修正)所得荧光强度测定值(I1)，求得体积变化修正值(荧光强度修正值：I1′)(S205)。
I1′＝I1×{(A+B1)/A}    (3)′
(17)根据表示预先求得的荧光强度修正值(In′)和胰岛素浓度修正值(Xn′)的关系的检量线，由上述荧光强度修正值(I1′)求得混合溶液中的胰岛素浓度(X1′)(S206)。
(18)由所得混合溶液中的胰岛素浓度(X1′)，使用下述计算式求得被测体溶液中的胰岛素浓度(X1)(S207)。
X1＝{X1′×(A+B1)}/B1     (4)′
结果确认：这样求得的被测体溶液中的胰岛素浓度(X1)为0.26μM，与用其它方法(BCA法)求得的被测体溶液中的胰岛素浓度一致。
(19)然后，在需要测定其它被测体溶液时(S208)，次数n加1(S209)，再次重复上述(14)～(18)(S203→S204→S205→S206→S207)，可求得其它被测体溶液中的胰岛素浓度(X2)。另外，当次数n＝2时，使用下述计算式。
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A}              (3)″
X2＝{X2′×(A+B1+B2)-(X1×B1)}/B2    (4)″
(20)重复上述(S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208)，至无需测定其它被测体溶液(S208)，由此可连续测定多个(次数n为1～n)被测体溶液中的胰岛素浓度(Xn)。另外，这样的连续测定可反复多次，直至抗体相对于胰岛素饱和等即使添加被测体溶液荧光强度也不发生变化的程度。另外，采用下述计算式。
I n ′ = I n × { ( A + Σ n = 1 n B n ) / A } - - - ( 3 )
X n = { X n ′ × ( A + Σ n = 1 n B n ) - Σ n = 1 n - 1 X n B n } / B n - - - ( 4 )
实施例2：使用抗MG-Ins抗体的Fab和AO的胰岛素的定量
在水溶液中实质上呈无荧光的金胺O(AO)的化学结构的一部分与孔雀绿(MG)的化学结构是共通的。因此本发明人推测：AO也与抗MG-Ins IgG和抗MG-Ins Fab进行交叉反应转为荧光性。另外本发明人推测：因为AO的尺寸小于MG分子，所以与抗体的结合弱，kd大，因此，AO的kd有可能大于胰岛素的kd，此时，与实施例1相反，因胰岛素的存在而引起荧光阻碍，在胰岛素浓度和荧光强度之间的反比例关系可以成立。因此，根据这样的胰岛素浓度和荧光强度间的反比例关系，可定量胰岛素，代替MG使用AO进行下述试验。
(2-1)与抗MG-Ins IgG结合的金胺O的荧光光谱的测定
如下所示，测定以抗原抗体反应使AO与抗MG-Ins IgG结合时的AO的荧光光谱。即，将两成份混合，使抗MG-Ins IgG浓度为1μM、AO浓度为1μM的混合(溶剂为磷酸缓冲生理盐水(pH7.2、PBS))，在25℃下搅拌5分钟，进行抗原抗体反应。然后使用荧光分光光度计，在励起光波长400nm、荧光波长450～650nm、励起光侧和荧光侧的带通宽均为5nm的条件下，测定由上述混合溶液发出的荧光光谱。所得荧光光谱的未处理数据减去相同条件下测定的磷酸缓冲生理盐水的本底，加上利用装置函数的修正值的荧光光谱如图14所示。结果确认：在水溶液中实质上无荧光的金胺O也与抗MG-Ins IgG结合转为荧光性。
(2-2)使用抗MG-Ins Fab和金胺O的胰岛素的定量
[2-2-1]检量线的制作
除使抗MG-Ins Fab浓度为2μM，使用0.4μM的金胺O代替0.4μM的孔雀绿，励起光波长400nm、荧光波长520nm外，与上述[1-10-1]一样，制作胰岛素浓度在0～7.7μM范围的检量线。所得检量线如图15所示。
由图15所示结果确认：当使用抗MG-Ins Fab和金胺O时，随着胰岛素浓度增加，金胺O的荧光强度减少，即，引起荧光阻碍。而且由于在胰岛素浓度修正值(Xn′)和荧光强度修正值(In′)之间，在0～4.23μM的范围内存在负线性相关关系，所以可通过测定金胺O的荧光强度对该范围的胰岛素浓度定量，且即使胰岛素浓度在约为0.13μM的这样的低浓度下也可进行定量，检测灵敏度(约0.1μM)高。另外，本发明人推测：胰岛素浓度高于4.23μM的高浓度区域内AO荧光强度达到一定值的理由是因为作为抗MG-Ins Fab的基础的抗MG-Ins IgG是多克隆抗体，含有与AO结合非常强的IgG。
[2-2-2]实际试料的测定
除使用上述所得检量线，使抗MG-Ins Fab浓度为2μM，使用0.4μM的金胺O代替0.4μM的孔雀绿，励起光波长400nm、荧光波长520nm之外，与上述[1-10-2]一样求得被测体溶液中的胰岛素浓度(X1)。结果确认：这样求得的被测体溶液中的胰岛素浓度(X1)为0.26μM，与通过其它方法(BCA法)求得的被测体溶液中的胰岛素浓度一致。
另外，除上述改变之外，与上述[1-10-2]一样，重复上述S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208至无需测定其它被测体溶液，由此可连续测定多个(次数n为1～n)被测体溶液中的胰岛素浓度(Xn)。另外，这样的连续测定可反复多次，直至抗体相对于胰岛素饱和等即使添加被测体溶液荧光强度也不发生变化的程度。
(2-3)抗原抗体反应可逆性的验证试验
应当确认：反复将胰岛素和抗猪胰岛素IgG(以下称为“抗胰岛素IgG”)添加到含有抗MG-Ins Fab和金胺O的溶液中，在同一试料内改变游离胰岛素的浓度时，本发明的方法的测定值也随之发生变化，即，本发明的抗原抗体反应是可逆的，且能进行实时分析。在与上述[2-2-1]同样的测定条件下测定荧光强度，所得结果如图16所示。
首先，调制含有2μM的抗MG-Ins Fab和0.4μM的金胺O的2ml的PBS溶液，加入荧光测定用容器内，测定AO荧光强度，此时的荧光强度为相对值1。
再将胰岛素添加到该容器中的溶液内，使浓度为1.26μM，搅拌5分钟后测定荧光强度，AO荧光强度的相对值减少到0.97。
再向该溶液中添加一定量(0.135μM)的抗胰岛素IgG，同样进行搅拌后测定荧光强度，AO荧光强度的相对值回复到大约为1。这是因为抗胰岛素IgG和胰岛素结合，使溶液中变得不存在游离胰岛素，所以荧光强度恢复到原值。
然后向该溶液内再添加胰岛素，使浓度变成2.39μM，同样搅拌后测定荧光强度，AO荧光强度的相对值再次减少，但将抗胰岛素IgG分两次添加到该溶液中后(第一次：0.128μM、第二次：0.127μM)，AO荧光强度的相对值得到恢复。然后再次将胰岛素添加到该溶液内，使浓度变成3.37μM，同样搅拌后测定荧光强度，AO荧光强度的相对值减少。
由图16所示结果可确认：本发明的抗原抗体反应是可逆的，本发明的方法的测定值(荧光强度)随着测定对象物量的改变可逆地变动(增加-减少)，且由于本发明的方法的测定值(荧光强度)相对于测定对象物的量有相关关系，所以通过测定荧光强度的变动，可实时测量测定对象物。
产业可利用性
利用本发明就可提供利用抗原抗体反应简便、高灵敏度且实时地连续分析(包括图像)生物内物质等的荧光分析方法。

Claims (12)

1.一种荧光分析方法，其特征在于，包括：
得到抗体色素溶液和含有测定对象物质的被检测体溶液的混合溶液的混合工序，所述抗体色素溶液含有各自具有预定浓度的抗体和色素，所述抗体的抗原结合部位的一部分识别色素，其余的一部分识别测定对象物质，所述色素被所述抗体识别，且与所述抗体结合时由非荧光性转为荧光性；
用励起光照射所述混合溶液，测定由所述混合溶液发出的荧光的强度，得到测定值的测定工序；和
基于预先求得的荧光强度与测定对象物质浓度的关系，由所述测定值求得所述测定对象物质的浓度的计算工序。
2.如权利要求1所述的荧光分析方法，其特征在于，还包括：
在所述计算工序后，将被测体溶液再次添加到所述混合溶液中混合，实行所述测定工序及所述计算工序，反复求得测定对象物质的浓度的连续分析工序。
3.如权利要求1或2所述的荧光分析方法，其特征在于，所述计算工序包括：
根据随着所述被测体溶液的添加的体积变化修正所述测定值，得到荧光强度修正值的工序；
根据预先求得的荧光强度修正值和混合溶液中的测定对象物质浓度的关系，由所述荧光强度修正值求得所述混合溶液中的测定对象物质的浓度的工序；和
由所述混合溶液中的测定对象物质浓度求得所述被测体溶液中的测定对象物质的浓度的工序。
4.如权利要求1～3任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，还包括：
得到抗体色素溶液和含有预定浓度的测定对象物质的标准溶液的混合溶液的混合工序，所述抗体色素溶液含有各自具有预定浓度的抗体和色素，所述抗体的抗原结合部位的一部分识别色素，其余的一部分识别测定对象物质，所述色素被所述抗体识别，且与所述抗体结合时由非荧光性转为荧光性；
用励起光照射所述混合溶液，测定由所述混合溶液发出的荧光的强度，得到测定值的测定工序；
将标准溶液再次添加到所述混合溶液中混合，然后实行所述测定工序，反复求得荧光强度的测定值的连续测定工序；和
根据所述测定工序和所述连续测定工序中所得的测定值和所述测定对象物质的添加量求得荧光强度和测定对象物质浓度的关系，制作检量线的工序。
5.如权利要求4所述的荧光分析方法，其特征在于，所述检量线制作工序包括：
根据随着添加所述标准溶液的体积变化修正所述测定值，得到荧光强度修正值的工序；
算出所述混合混合溶液中的测定对象物质的浓度的工序；和
求得所述荧光强度修正值和所述混合溶液中的测定对象物质浓度的关系的工序。
6.如权利要求1～5任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述色素选自具有三苯甲烷结构的色素或具有二苯甲烷结构的色素。
7.如权利要求1～5任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述色素是孔雀绿或金胺O。
8.如权利要求1～7任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，
所述抗体是将所述色素和所述测定对象物质的结合物质作为抗原形成的抗体，或是将利用抗体识别的、且在和所述抗体结合时由非荧光性转为荧光性所必要的结构与所述色素共通的色素与所述测定对象物质的结合物质作为抗原，而形成的抗体。
9.如权利要求1～8任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述抗体是将孔雀绿和所述测定对象物质的结合物质作为抗原而形成的抗体，所述色素是孔雀绿。
10.如权利要求1～8任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述抗体是将孔雀绿和所述测定对象物质的结合物质作为抗原而形成的抗体，所述色素是金胺O。
11.如权利要求1～8任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述抗体是由精制抗血清而得到的IgG组分调制的抗原结合性片段。
12.如权利要求1～11任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述测定对象物质为选自应作为免疫测定对象的蛋白质、荷尔蒙、维生素、菌体、环境污染物质、医药品的任一种。
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