CN1729397A - 利用大环辅助配体检测prp的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测造成亚急性、传染性海绵状脑病的朊病毒病原体形式的方法，特征在于将游离的或与支持物结合的大环辅助配体(AML)加入到可能含有PrP^sc的生物学样品中，然后用抗PrP^sc抗体与所得的悬液反应，然后检测PrP的存在。

Description

利用大环辅助配体检测PRP的方法

本发明涉及检测造成亚急性、传染性、海绵状脑病的朊病毒病原体形式的方法。

天然或正常的朊病毒蛋白被命名为PrP或PrP^c，对于细胞朊病毒蛋白，其是在哺乳动物的淋巴和神经元细胞中广泛表达的糖蛋白。

PrP^c构象改变导致对蛋白酶K有抗性的蛋白病原体PrP^c的出现和传播。该蛋白病原体可被称为PrP^sc或PrP^res。PrP^sc在动物器官中的积累是许多疾病的源头，并特别是小型反刍动物的震颤病、麋鹿和羚羊的慢性恶病质病(或慢性消耗性病“CWD”)的源头、以及牛海绵状脑病(ESB)和人的克雅二氏症(MCJ)的源头。

感染了ESB的牛在2至6年的潜伏期后才有延迟表现并且病症发展缓慢，大大地减慢了流行病学模式的进展。ESB通过摄食传染人类，导致了一种新型克-雅二氏病(vMJC)的出现。

在发病以前看起来很健康的被感染动物体内，尤其是患病动物的血液或尿液中很难检测到蛋白病原体PrP^sc。目前，已确认人在摄取被感染组织时，用于人类消耗目的的动物中的PrP^sc将传染人类。因此，公共卫生的一个主要目标是通过检测PrP^sc的存在以避免这种传染：

-在人类要消费的动物中，为了将它们从食物链中去除，

-在要输入人体的血液捐献和血液衍生制品中。事实上，由于在脑失调前且在能够在临床上检测到揭示朊病毒疾病的征象之前，蛋白质病原体PrP^sc已经出现在血液和淋巴液中，因此对该疾病在人的生理病理学认识得很少，并由于不能进行在诸如绵羊中的实验性感染，缺少在血或其他生物学液体中的检测测试，使之不能被研究并由此来防止经由血液捐献的人至人的传染或在脑损伤开始前治疗感染的人；及

-在神经病学进程前的动物群中，由此使得在它们到屠宰厂前早早地消除感染的动物。

因此，检测生物学样品或动物体内PrP^sc的存在已经变得极为重要，几个研究组正在研制免疫检测方法(WO02/086511)。此外，为了治疗vMJC，联合使用肽、小分子或PrP^sc抑制剂的方法组成了热点研究的主题。然而，当生物样品中尤其在生物学液体中PrP^sc的含量很低时，现有技术的方法总是难以通过可靠的方式鉴定PrP^sc。

本发明因而涉及一种允许在稀释液中检测PrP蛋白的方法，尤其是检测PrP^sc的方法，其中所述蛋白不能用当前使用的方法检测，在发明人测试的119个样品中，检测达到了100％的可靠性。根据本发明的方法优选地使得对PrP^sc的检测被扩大4倍。

更精确地，本发明涉及一种检测PrP蛋白的方法，尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于将游离的或与支持物相连的大环辅助配体(AML)加入到可能含有PrP的生物学样品中，然后用抗PrP抗体与所得的悬液反应，然后检测PrP的存在。

可以通过本领域技术人员所知的方式来实现大环配体与支持物的连接，如通过吸附或共价键，优选共价键或者所谓的接枝(greffage)。

当试图进行检测PrP^sc时，本发明也可在接触AML之前或之后，包括用蛋白酶K处理样品的附加步骤。

通过检测抗PrP/PrP的抗体反应能识别PrP的存在，该方法能通过所属领域技术人员所知的任何手段来进行，尤其可通过三明治方法来进行，例如ELISA、免疫印迹、免疫微悬臂(micro-cantilever)检测、质谱或通过光学和光谱学分析。通过表面光度扫描技术来进行鉴定AML-PrP复合物，如扫描反射显微镜、近场扫描显微镜或共聚焦扫描显微镜。

根据本发明的优选实施方案，生物学样品来自动物，包括人。该样品优选来自脑、中枢神经系统或器官的组织，尤其是脾或肠。根据本发明的优选实施方案，该样品是生物学液体，尤其是脑脊液或血清。

术语“大环配体”指能与PrP结合的化合物，尤其能与PrP^sc结合的化合物，而且其能通过连续环化来构建形成大环。大环配体对本领域技术人员是已知的。可能以非限制性例子的方式引用的有环芳、间环芳(métacyclophanes)、环糊精、环(变色四酸)、球状配体(sphérands)和环[n]乙酸香根酯烯(cyclo[n]vératrylènes)。

大环辅助配体能有益地与空间毗邻或接近的位点结合，该位点用于与抗体结合并具有增强抗体-PrP^sc结合的作用。

大环辅剂有益地选自间环芳。在间环芳中，尤其好的是在酚侧官能化的对-磺酸基-杯芳烃(para-sulfonato-calix-arènes)。这些化合物可根据Da Silva等，J.Supramol.Chem.1，(2001)，135-138所述的方法获得。

大环辅助配体能有益地相应于下式(I)，

其中

R₁表示氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，其中R如下所定义，

R₂表示氢原子、R基、COR、Pol、CH₂Pol，其中Pol表示磷酸、硫酸、胺、铵、羧酸基团，而R如下所定义，

R₃表示氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，其中R如下所定义，

R₄表示氢原子、羟基、OR基团、OCH₂R基团或OCOR基团，其中R如下所定义，

Y是碳原子、氮或硫原子，

R₅和R₆各自独立地不存在或表示氢原子、CH₂基团或如下所定义的R，或

R₅和R₆一起表示氧或硫原子，

X表示CH₂基团或氧或硫原子，

m表示等于0或1的正整数，

R表示氢原子或烃链，该烃链为饱和或不饱和的、分枝或不分枝的、环或非环的、由卤素取代或未取代的，并带有极性或非极性官能团，

n是3至15之间的的正整数，及

取代基R₁至R₅、R、X、Y和正整数m可根据结构单元(les motifs)而具有不同性质。

所以，式I的化合物以连续结构单元形式出现，其特征在于具有苯环，并其中在以上定义的限制之内该环的取代基在一个结构单元与另一个结构单元中可能不同。

可根据本领域技术人员已知的技术来制备大环配体，例如Comprehensive Supramolecular Chemistry，Pergamon，Oxford，1996所述。

饱和或不饱和的、分枝或不分枝的、环或非环的、由卤素取代或未取代的，并带有极性或非极性官能团的烃链对本领域技术人员来说是熟知的。例如，烷基、烯基、芳基和饱和的环，如环己烷。非极性基团的例子有CF₃，而极性基团的例子有如上所定义的取代基Pol。

根据本发明的特定实施方案，大环辅助配体相应于以上通式I，并更精确地相应于以下通式Ia：

其中

每个R₂基各自独立地为硫酸基团或磷酸基团，

R₇是(CH₂)_r-Z基团，其中Z是COOEt、COOH、CN或NH₂基团，

r是1至20之间的正整数，

p是1至10之间的正整数，

n是2至10之间的正整数。

根据本发明的优选实施方案，大环辅助配体是p-磺酸基-杯-[4]-芳烃、p-磺酸基-杯-[6]-芳烃、p-磺酸基-杯-[8]-芳烃或它们的衍生物之一。

根据本发明的第二个实施方案，大环辅助配体相应于以上通式I，并更精确地相应于以下通式Ib：

其中

n是4至8之间的正整数，

每个R₂基各自独立地为硫酸基团或磷酸基团，

R₈表示(CH₂)_t-(CO)_s-(NH₂)基团或(CH₂)_t-COOH基团，其中t是0至6之间的正整数，s是0至6之间的正整数。

式Ib的杯芳烃最好是两个R₂基团的每一个都是硫酸基团，n是4、6或8，而R₈是氢原子、CH₂COOH、CH₂CONH₂基团或CH₂CH₂NH₂基团。

式Ib的杯芳烃优选是两个R₂基团的每一个都是硫酸基团，n是等于6的正整数，而R₇是(CH₂)₂-NH₂基团。

根据本发明的特定实施方案，本发明的配体接枝于固体支持物上。该支持物由能与配体带有的官能团形成键的官能团功能化。根据优选实施方案，固体支持物由NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)键或NH₂官能团功能化。该官能团能与配体上带有的官能团反应。在该实施方案中，尤其优选带有的官能团能反应从而与固体支持物的功能键形成键的杯芳烃，特别是带有NH₂或COOH键的杯芳烃。

本发明也涉及接枝于功能化支持物上的大环辅助配体，其中配体相应于以上定义的式Ib，其中n是4至8之间的正整数而且支持物是固体支持物类型，优选由NHS基团或NH₂基团功能化并优选是磁珠或微量培养板。这种接枝物保留了将来在蛋白质和配体间的相互作用以及立体化学呈递表位(épitote)从而能通过抗PrP抗体来检测。支持物上接枝物靶向的位点不同于用作与PrP相互作用的那些。

根据本发明的另一个实施方案，该大环辅助配体选自环糊精家族，尤其是相应于通式II的环糊精

其中

R₉表示氢原子或CH₂、OH、OR、OCOR、COR、CH₂Pol、OCH₂R、SR、NR、Pol基团，R如下所定义，

R₁₀和R₁₁各自独立表示氢原子或CH₂、OH、OR、OCOR、COR、CH₂Pol、OCH₂R、Pol基团，R如下所定义，

Pol表示磷酸、硫酸、胺、铵、羧酸基团，

R表示烃链，该烃链为饱和或不饱和的、分枝或不分枝的、环或非环的、由卤素取代或未取代的，并带有极性或非极性官能团，

n是6至8之间的正整数，

取代基R₉至R₁₁可根据结构单元的性质而不同。所以，式II的化合物以连续的n个结构单元的形式出现，其具有环，并在以上定义的范围之内，该环的取代基在一个结构单元与另一个结构单元中可能不同。

根据本发明的变体，所述大环辅助配体选自变色环四酸家族，尤其是相应于通式III的变色环四酸

其中

R₁₂和R₁₃各自独立表示氢原子或如下所定义的R或Pol基团，

R₁₄和R₁₅各自独立表示氢原子、CH₂基团或如下所定义的R基团，或

R₁₄和R₁₅一起表示氧或硫原子，

R₁₆和R₁₇各自独立表示氢原子或羟基或OR、OCH₂R、OCOR、SR、SCH₂R、SCOR基团，其中R如下所定义，

M表示氢原子或选自Na、K、Li、Cs、Rb、Mg和Ca的原子，

Pol表示磷酸、硫酸、胺、铵或羧酸基团，

R表示烃链，该烃链为饱和或不饱和的、分枝或不分枝的、环或非环的、由卤素取代或未取代的，并带有极性或非极性官能团，

n是3至15之间的正整数，

取代基R₁₂至R₁₇、M、Pol和R可根据结构单元的性质而不同。所以，式III的化合物以连续的n个结构单元的形式出现，特征是具有环，并在以上定义的限制之内，该环的取代基在一个结构单元与另一个结构单元中可能不同。

根据本发明的另一个实施方案，该大环辅助配体选自环[n]乙酸香根酯烯家族，相应于通式IV

其中

R₁₈表示氢原子或CH₂、OH、OR、OCOR、COR、CH₂Pol、OCH₂R、SR、NR、Pol基团，R如下所定义，

R₁₉、R₂₀、R₂₁和R₂₂各自独立表示氢原子或CH₂、OH、OR、OCOR、COR、CH₂Pol、OCH₂R、Pol基团，R如下所定义，

Pol表示磷酸、硫酸、胺、铵或羧酸基团，

R表示烃链，该烃链为饱和或不饱和的、分枝或不分枝的、环或非环的、由卤素取代或未取代的，并带有极性或非极性官能团，

n是1至10之间的正整数，

取代基R₁₈至R₂₂、R、Pol和R可根据结构单元的性质而不同。所以，式IV的化合物以连续的n个结构单元的形式出现，特征是具有环，并在以上定义的限制之内，该环的取代基在一个结构单元与另一个结构单元中可能不同。

本发明的其它主题内容包括大环辅助配体(AML)在检测生物学样品中PrP^sc朊病毒的应用，尤其是上式I、Ia或Ib的、游离的或与支持物结合的配体的应用。

本发明的主题内容还包括一种诊断由PrP^sc造成的疾病的试剂盒，疾病包括ESB、小反刍动物震颤病、克雅二氏症，其特征在于其包括使用大环辅助配体，尤其使用上式I、Ia或Ib的、游离的或与支持物结合的配体。

本发明的主题内容还有一种免疫定量PrP^sc的试剂盒，其特征在于其包括使用大环辅助配体，尤其使用上式I、Ia或Ib的、游离的或与支持物结合的配体。

本发明的其他优点和特征可通过阅读以下实施例来体现，所述实施例涉及生物学样品在存在游离或接枝的大环辅助配体时扩增检测PrP^sc。

参考这些实施例及其中的附图：

参考实施例1：

图1是用PrP^sc免疫印迹检测的比较实施例，一方面下述制备的特定大环辅助配体(AML1)加入到样品中，而另一方面AML1不加入到样品中。

图2所示的是检测PrP^sc的光密度曲线，一方面AML1加入到样品中，而另一方面AML1不加入到样品中。

图3所示的是在非接触模式中扫描探测显微镜(SPM)中的图像，干胶片上仅有重组蛋白朊病毒(recPrP)的为(A)，存在recPrP和ALM1的为(B)，以及仅有AML1的为(C)。

图4所示的是在非接触模式中扫描探测显微镜(SPM)中的图像，干胶片上的recPrP和AML成不同的比例：1/1000AML1/recPrP，1/100AML1/recPrP，1/10AML1/recPrP。

图5示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过温育牛重组PrP溶液并用过氧化物酶标记的抗PrP AC23抗体显色以后，通过接枝在活化胺平板(NHS)上的杯芳烃C6S的浓度函数获得该值。

图6示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过温育0.25μg/ml剂量的人重组PrP溶液并用过氧化物酶标记的抗PrP 8D11G12抗体直接显色以后，通过接枝在活化胺珠(NHS)上的杯芳烃C6S的浓度函数获得该值。

图7示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过用0.05％PBST稀释的人血清与接枝在活化胺珠(NHS)上的杯芳烃C6S接触温育并通过用过氧化物酶标记的抗PrP 8D11G12抗体直接显色而获得该值。

图8示出了一个示意图，其示出作为加热函数的光密度(DO)值，通过将接枝在活化胺平板(NHS)上的杯芳烃C6S与人脑脊髓液的MJC阳性(LCR+)和阴性(LCR-)样品接触，通过用碱性磷酸酶标记的抗PrP AC23抗体显色而获得该值。

图9示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过将接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烃C6S与从感染或未感染克雅二氏症的患者(MJC+/MJC-)脑中提取的PrP^sc接触，之后通过用碱性磷酸酶标记的抗PrP AC23抗体显色而获得该值。

图10示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过与未感染MJC的患者的LCR样品接触以后，其中样品稀释到1/2或1/6并没有用蛋白酶K消化，通过接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烃C6S的浓度函数获得该值。

图11示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过与未感染MJC(LCR-)或感染该病(LCR+)的患者的LCR样品接触以后，其中样品可能稀释到1/2(LCR+1/2或LCR-1/2)并没有用蛋白酶K消化，通过接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烃C6S的浓度函数获得该值。

图12示出了一个示意图，其示出光密度(DO)值，通过将接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烃C6S与未感染MJC(LCR-)或感染该病(LCR+)的患者的LCR样品接触以后，通过蛋白酶K的浓度函数获得该值。

实施例1  大环辅助配体的制备

1.1制备对-磺酸基-3，7-(2-羧基-甲氧基)-杯-[6]-芳烃(被称为AML1)

该大环辅助配体AML1具有通式V：

该配体如下合成：杯[6]芳烃的乙腈悬液在1当量碱(K₂CO₃)中搅拌回流。30分钟后，0.5当量烷基化剂(溴乙酸乙酯)加入到反应混合物中，保持回流并搅拌24小时。冷却悬液后，减压蒸去溶剂，所得固体溶于200ml CH₂Cl₂中并用盐酸溶液(1M)洗2次并用软化水洗1次。在硫酸镁(MgSO₄)上干燥后，减压蒸去有机溶剂，获得白色粉末。在硅石层析柱(洗脱液：CH₂Cl₂∶己烷；4∶1)上纯化该粉末。在¹H、¹³CRMN和电喷雾质谱中分析纯化的产物。在搅拌条件下与环境温度中用氢氧化钾在水∶乙醇(30∶70)混合溶液中皂化羧酸酯24小时。过滤形成的沉淀，然后用50ml盐酸(1M)和50ml水洗涤，然后在硅石层析柱(洗脱液氯仿∶甲醇∶乙酸；95∶5∶0.1％)上纯化，蒸去溶剂后得到白色结晶固体。在¹H、¹³C RMN和电喷雾质谱中分析该产物。用硫酸于50℃进行磺化24小时。用醚沉淀产物并获得白色结晶粉末形式的AML1。

1.2制备对-磺酸基-3，7-(2-氨基乙氧基)-杯-[6]-芳烃(被称为C6S)

该大环辅助配体C6S具有通式VI：

该配体按照Eric Da Silva和Anthony W.Coleman，Synthesis andComplexation Propertiex towards Amino Acids of Mono-Substitutedp-sulfonato-calix-[n]-aren，Tetrahedron 59(2003)7357-7364所述的方法制备。

1.3将配体C6S接枝到板或珠上

该配体与带有活性表面的固体支持物(珠或板)偶联。

接枝到板上：

“NHS活化板”的96孔板可得自Covalab公司(Lyon，France)。100μl配体溶液以不同浓度溶于50mM pH8.2的磷酸缓冲液中。在37℃温育2小时后用MilliQ水洗3遍孔(3×200μl)。使用前在环境温度下干燥板。

接枝方案：

以配体C6S的不同浓度制备几种板。这些板在全文中被定义为“C6S板”。

接枝到珠上：

4ml活化珠NHS溶液(2×10⁹个珠/ml；Dynabeads M270Amine，Dynals公司，Norway)等份分装于1ml管中。离心并通过磁性沉淀珠。弃上清液并用1ml水洗珠3次。用不同体积的杯芳烃的50mM pH8.2磷酸缓冲液溶液再加工(repris)珠底部。加入600μl、120μl、60μl和12μl的50mg/ml(50mM pH8.2的磷酸缓冲液)配体溶液。在环境温度下搅拌珠24小时。用18ΩMilliQ水洗3遍珠以去除未反应的配体。珠保存在1ml水中以再达到2×10⁹个珠/ml的初始浓度。珠溶液可以使用了。这些珠在全文中被定义为“C6S珠”。

在珠上接枝C6S的方案：

1.4将AML1接枝到修饰的无机表面上

1ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(ABCR公司)加入到50ml溶液(95％乙醇和5％H₂O)中5分钟。在搅拌条件下将硅板浸没在该溶液中4分钟。用乙醇冲洗硅板，然后将板置于130℃干燥15分钟。10μl 0.1M AML1的DMSO溶液在修饰的硅板上用偶联剂(DCC/HOBT)偶联。样品于23℃干燥12小时。

偶联方案：

实施例2：用未与固体支持物偶联的AML1检测PrP

2.1制备样品

用于说明图1和2例子的样品如下制备：

不含AML的样品：0.5g脑组织在4.5ml 5％的葡萄糖溶液中粉碎以获得10％重量/体积的悬液。向每100μl于5％葡萄糖中的10％脑匀浆(相当于10mg脑)中加入10μl的1μg蛋白酶K(Boehringer)。旋转振荡溶液，然后于37℃温育1小时。加入100μl变性Laemmli缓冲液后，于100℃加热混合物5分钟，于12000G离心5分钟，回收上清液以使之在SDS PAGE上迁移。

含AML的样品：0.5g脑组织在4.5ml 5％的葡萄糖溶液中粉碎以获得10％重量/体积的悬液。向每100μl于5％葡萄糖中的10％脑匀浆(相当于10mg脑)中加入1μl的0.1M AML。37℃1小时后，加入10μl的1.5μg蛋白酶K(Boehringer)。旋转振荡溶液，然后于37℃温育1小时。加入100μl变性Laemmli缓冲液后，于100℃加热混合物5分钟，于12000G离心5分钟，回收上清液以使之在SDS PAGE上迁。

2.2用免疫印迹检测的方法

如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685所述，在十二烷基硫酸钠的15％聚丙烯酰胺一维电泳凝胶(SDS PAGE)上迁移后，通过电泳将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并在环境温度下用识别氨基酸126-160位所形成的特异表位的单克隆抗体免疫印迹60分钟。二抗(1/5000)为抗小鼠免疫球蛋白重链和轻链(IgG H+L)的山羊抗体，其缀和了辣根过氧化物酶。

然后洗涤印迹并用化学发光法在胶片(Biomex light，Kodak)上用ECL试剂盒(Amersham)或用super Signal Ultra(Pierce)并用Fluor S.Multimager(BioRad)观察来检测信号。

图1是比较例，其显示用本发明的方法比缺少AML1时检测相同的蛋白质时，朊病毒的检测至少增加了4倍。缺少AML1时，超过1/8稀释度的没有检出PrP^sc。存在AML1时，在相同样品中检出PrP^sc可能性多至1/32稀释度。图2的结果显示了该检测。

2.3显微结果

用于在图3、4所报道的扫描探针显微镜实验中的样品如下制备：

仅包含大环辅助配体的样品：通过在新制分裂的云母上沉积10μlAML溶液和10μl水，由此制备包含大环辅助配体的样品(50mM)，并于37℃干燥24小时。

仅包含重组PrP蛋白(recPrP)的样品：通过在新制切割的云母上沉积10μl的1/10(v/v)AML1/recPrP、1/100(v/v)AML1/recPrP和1/1000(v/v)AML1/recPrP溶液和10μl水，由此制备包含recPrP的样品，并于37℃干燥24小时。

同时包含大环辅助配体和recPrP的样品：1)通过在新制分裂的云母上沉积1μl AML溶液和1000μl recPrP，由此制备同时包含大环辅助配体和recPrP的样品，并于37℃干燥24小时；2)通过在新切开的云母上沉积1μl AML溶液和100μl recPrP，由此制备同时包含大环辅助配体和recPrP的样品，并于37℃干燥24小时；3)通过在新切开的云母上沉积1μl AML溶液和10μl recPrP，由此制备同时包含大环辅助配体和recPrP的样品，并于37℃干燥24小时。

用装有100μm三脚扫描仪的Thermomicroscope Explorer AFM以非接触模式进行图像分析，分析利用锥形悬臂升高的共振频率(F₀＝320kHz)以扫描频率1Hz的硅探针进行。用SPMlab 5.1软件进行成像处理并不进行滤波。

图3、4指出仅有recPrP的胶片在环聚集中显示出特征结构。存在AML时，观察到的recPrP结构被持续修饰，并是AML数量的增加函数，并显示出被环绕的而且可能是正交微晶的结构单元。仅有大环辅助配体(AML1)的图像显示出相似但小于recPrP-AML胶片上结构单元的结构。

通过原子力显微术来进行其他实验。

表1所示的是接下来的通过粗糙度表面分析的分析。这些粗糙度测定的能扩展应用至表面光度测定法分析技术。

                                  表I

	仅有AML	AML/recPrP1/1000	AML/recPrP1/100	AML/recPrP1/10	仅有recPrP
						Ra(nm)	48	69,6	123,9	134,4	1,11
RMS(nm)	58,7	82,8	149	163,1	1,95
						平均高度	217,7	233,3	408,7	469,8	5,4
最大高度值	448,9	484,3	894,66	1056,9	43,17

$R_a=\frac{1}{N}\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}|z_i-\stackrel{\‾}{z}|$

式A

$\mathrm{RMS}=\sqrt{\frac{1}{N}}\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{<z_i-z>}^2$ 式B

$\mathrm{AvgHeight}=\frac{1}{N}\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{z}_i$ 式C

通过Thermomicroscope SPML5.01软件计算得到粗糙度值。平均粗糙度Ra定义为高度偏差的算术平均值(式A)，均方根粗糙度RMS定义为在平均图像值上的点和样品的平均高度(式C)的距离的平方的平均值的平方根(式B)。

实施例3：用接枝在固体支持物上的C6S检测重组PrP

3.1在板上检测牛重组PrP

a)方案

在该实验中所用的方案是与经典ELISA中所认识的方案相同。

根据实施例1，将于50mM PBS(磷酸缓冲液)中稀释的磺化杯-6-芳烃(C6S)接枝到活性胺板(NHS)上6小时。然后，在用PBST(PBSTween)(0.05％)(奶粉5％)溶液于环境温度下饱和1小时之前用蒸馏水冲洗板。冲洗后，浓度稀释到0.25μg/ml的重组牛蛋白朊病毒(PrP)溶液在0.05％PBST中沉积。在环境温度温育1小时。再冲洗板3次。然后与用0.05％PBST稀释到0.5μg/ml的标记有过氧化物酶的抗PrP抗体在环境温度温育1小时。所用的抗体识别由人PrP的氨基酸145-154位所确定的区域和动物PrP(AC23)的同源区域。最后，在又一次清洗后，加入显影剂OPD(邻-苯二胺)溶液，在环境温度下避光温育10分钟。加入H₂SO₄溶液终止反应。用分光光度计读取在495nm处的信号。

b)结果

图5显示了结果，其显示在纵座标上测到的光密度(DO)反映了由C6S捕获的PrP的量，而且在洗后仍旧被捕获。不同接枝得到的信号显示重组牛PrP很好地被C6S捕获。牛重组PrP与接枝到NHS板上的C6S固定在一起。

3.2在珠上检测重组人PrP

a)实验条件：

根据实施例1，NHS珠首先与用蒸馏水稀释的C6S溶液接触从而使C6S接枝到珠上。此后，用蒸馏水洗珠，然后用0.05％PBST洗。同时，制备剂量为0.25μg/ml的重组人PrP的0.05％PBST溶液。然后在每100μlPrP溶液中加入0、0.1、1、5和10μl珠溶液以产生一系列C6S珠。在37℃温育1小时，然后通过磁性从上清液中分离珠。根据与ELISA法近似的三明治方法，固定在珠上的PrP直接用标记的抗体定量。

在用0.05％PBST溶液冲洗珠后，标记过氧化物酶的显色抗体在37℃温育1小时。在又一次洗之前，通过磁性从上清液中分离珠，然后用温育了10分钟的OPD溶液显色。加入H₂SO₄溶液终止反应。所用的显色抗体是8D11G12(bioMérieux，France)。

用495nm分光光度计读取信号。

b)结果

图6显示了珠上的显色结果，其显示C6S正确接枝，在NHS支持物上没有丧失功能，但仍特别保留了它们捕获不同物种的重组PrP的性质，其甚至以可重复的方式放大用该蛋白质特定抗体获得的信号。

实施例4：用接枝在固体支持物上的C6S检测生理PrP

4.1珠上的人血清

a)方案：

根据实施例1，NHS珠首先与用蒸馏水稀释的C6S溶液接触以进行接枝。此后，用蒸馏水洗珠，然后用0.05％PBST洗。

用PBS稀释从而制备血清。同时，制备用作阳性和阴性对照的剂量为0.25μg/ml的人重组PrP的PBS溶液和0.05％的PBST溶液(奶粉5％)。

每250μl样品加入5μl含2×10⁹个珠/ml的珠液。在搅拌条件下，于37℃温育1小时。然后通过磁性从上清液中分离珠。固定在珠上的PrP直接用标记的抗体定量。

在珠上的显影使用与ELISA近似的方案。标记过氧化物酶的显色抗体在37℃温育1小时并在用0.05％PBST溶液洗珠之后轻轻搅拌。在重新洗之前，通过磁性从上清液中分离珠，然后用温育了10分钟的OPD溶液显色。加入H₂SO₄溶液终止反应。所用的显色抗体是8D11G12。

用495nm分光光度计读取信号。

b)结果

图7显示了结果，其显示：

-奶粉中的阴性对照能评估背景噪声，而0.25μg/ml PrP溶液中的阳性对照能验证试验功能并进行解释。

-接枝在NHS珠上的C6S捕获人血清中存在的生理PrP。另外，饱和板上的血清稀释程度增加到稀释程度从1/5到1/10时能更好地捕获。

c)结论

令人惊讶地，接枝在NHS珠上的C6S捕获人血清中存在的生理PrP。稀释血清使珠上获得的信号增强。

4.2在板上的液体人脑脊液(LCR)

a)实验条件：

LCR样品首先等体积分装在管中。2个稀释点：每个样品设立纯的和1/2。然后，它们进行3类热处理：56℃ 30分钟，75℃ 15分钟或95℃5分钟。同时对纯样品不加热设为对照。

根据实施例1，同时NHS板与在50mM PBS溶液中稀释的C6S溶液接触6小时进行接枝。

然后，用蒸馏水洗板，然后用0.05％PBST洗。

然后沉淀样品并在2-8℃并温育一夜。然后洗板6次。然后用在0.05％PBST中稀释到0.5μg/ml的生物素标记的抗PrP抗体的溶液在环境温度下温育1小时。所用的抗体是AC23。

在又冲洗一次之后，加入链霉抗生素-PAL(碱性磷酸酯酶)溶液，在环境温度下温育20分钟。最后一次洗板后，沉淀PNPP显影剂溶液并于37℃温育30分钟。用0.4N NaOH溶液终止反应。

用490nm滤光片，用405nm分光光度计读取信号。

b)结果

图8显示了结果，其显示在LCR中可定量生理PrP。

实施例5：用接枝在固体支持物上的C6S检测脑中的PrP^sc

5.1在板上检测

a)实验条件：

第一阶段包括获得PrP^sc，其从感染或未感染克雅二氏症(MJC)的患者脑中提取纯化而得。取260mg脑部样品，然后粉碎以获得在5％葡萄糖中的10％匀浆。然后用针头过滤粉碎物质。接着用蛋白酶K进行消化阶段，蛋白酶K的使用浓度是每100mg组织用20μg，在37℃进行1小时处理。然后加入650μl 30％Sarkosyl溶液。同时，于试管底部沉积一层400μl的蔗糖以用于超速离心。则样品沉积于该层中。装填完试管后盖上盖，然后在20℃以100,000rpm超速离心2小时。弃上清液并用吸水纸吸干试管壁。然后向底部加入Tris马来酸。然后将样品于95℃加热5分钟，然后以12,000rpm在20℃离心15分钟。样品保存于-80℃直至下次使用。用Western印迹确证该第一阶段的成功。

b)在杯-6-磺酸盐上测试

根据实施例1，用于50mM PBST溶液中稀释的C6S溶液处理6小时进行NHS板的接枝。在环境温度下，它们首先用含5％奶粉的0.05％PBST溶液饱和6小时。然后用0.05％PBST溶液洗3次。先前用Tris马来酸稀释的样品沉积于板上并在2-8℃温育一夜。然后用0.05％PBST洗板6次。在环境温度下，显色抗体溶液温育1小时。在一系列洗涤之后，链霉抗生物素-PAL温育20分钟。沉淀PNPP(对硝基苯磷酸)之前最后一次洗板，在37℃温育30分钟。然后加入苏打终止显色反应。

用490nm滤光片，用405nm分光光度计读取DO。

c)结果

结果如图9所示，其显示通过本发明的方法，利用由接枝在NHS板上的C6S捕获并用特异抗PrP蛋白的抗体检测，能令人惊讶地检测到患有克雅二氏症的患者样品的PrP^sc，其可由重组人PrP阳性对照和0.05％PBST阴性对照来验证。

实施例6：使用接枝在固体支持物上的C6S检测LCR中的PrP^sc

6.1制备样品

用脑脊液(LCR)样品来制备标本，LCR优选未溶血且没有细胞碎片。样品是匿名的并于-80℃冷冻保存在试管中，其中试管壁能轻微吸附蛋白质(“预润滑微离心管(Pre-lubricated micro centrifuge tube)1.7ml”，Marsh Biomedical Products，编号T6050G)。

它们分成2类：

一方面，样品呈MJC阳性。

这些是在尸体解剖时回收的死后LCR，尸体解剖是通过对脑室穿刺进行的，其中在脑组织中用Western印迹研究PrP^sc能够确诊MJC(某些病例)。在尸体解剖中，立即将所得的LCR装入前述试管而不进行前述的离心(除非样品出现很大量的细胞碎片)并将等份LCR冷冻于-80℃。

另一方面，样品呈MCJ阴性。它们有2种类型：

尸体解剖时回收的死后LCR，其中在脑组织中用Western印迹研究PrP^sc而排除MJC的诊断(MJC阴性对照)。

不受MJC影响的患者及来自侧脑室引流(DVE)的LCR。样品的存储条件与前述的那些一样。

6.2 ELISA法

a)分析原理

样品只在升高的温度下温育给定的时间，然后，冷却后，用与免疫分析(ELISA)相容的缓冲液(pH8的Tris马来酸缓冲液)将其稀释至1/2或1/5。在沉积于板C6S上前进行蛋白酶K消化，这时用蛋白酶K消化样品15分钟，然后以该方式沉积在板C6S上而无需前述的抑制。

因为考虑到用免疫学法展现配体/精制试剂的反应类型，所以即便捕获不是免疫学的，也可使用术语ELISA。

ELISA技术是免疫酶学定量技术，通过将底物转化为与样品中存在的抗原量成比例的可溶、可测产物，其允许定量要研究的抗原。在这所用的技术包括除了敏化容器之外与非竞争性经典ELISA三明治法相同的步骤。事实上，通过它们的胺官能团，用接枝在微板NHS基团上的磺化杯-6-芳烃替代了抗朊病毒捕获抗体。

将C6S固定在微板的容器底部并饱和抗原固定的非特异位点之后，沉积样品并温育板以使抗原与C6S结合。然后，洗几次后，加入朊病毒蛋白特异性的并标记的显色抗体。加入酶底物后，用比色法使观测形成的复合物，即酶底物转化成有色产物，用微板读数仪(自动分光光度计)来测定其光吸收。

b)操作模式

1体积的LCR于75℃在干燥的不锈钢水池中温育15分钟。冷却后，样品用0.2M pH8的Tris马来酸缓冲液稀释5倍(加入4体积的缓冲液)，并将样品直接沉积于预先用C6S处理的敏化的微板上，或用蛋白酶K于37℃消化15分钟，然后再沉积在微板上。

按以下时间顺序列举接下来的免疫分析阶段：

1.根据上述方法将于50mM PBST溶液中稀释的磺化杯-6-芳烃C6S以一个浓度范围或以固定的浓度在环境温度下在活化胺板(NHS)上进行接枝6小时。

2.然后用0.05％PBST洗板三次，然后于37℃用含5％奶粉的0.05％PBST饱和1小时。

3.洗涤后，按照上述分析原理制备的100μl LCR在小槽中进行沉积；于37℃温育板1个半小时。

4.洗涤后，100μl显色抗体(0.5μg/ml AC23-HRP，HRP辣根过氧化物酶或0.5μg/ml AC23-生物素)在小槽中进行沉积。于环境温度下温育板1小时。

5.洗涤后，将形成的复合物显色：

5.1如果显色抗体与生物素偶连，则100μl用0.05％PBST缓冲液稀释到1/20000的SA-PAL溶液在小槽中进行沉积。于环境温度下温育板20分钟。洗涤后，100μl PNPP在小池中沉积。于37℃温育板10至30分钟。温育后，每个小槽加入0.4N的50μl NaOH来终止显色反应。然后用450nm滤光片，用405nm分光光度计测量光密度。

5.2如果显色抗体与过氧化物酶偶联，则100μl OPD在小槽中进行沉积。在黑暗中于环境温度下温育板10分钟。

温育后，每个小槽加入1.8N的50μl H₂SO₄来终止显色反应。然后用分光光度计测量在495nm处的光密度。

b)结果

1.确证接枝在微板上的磺化单胺杯-6-芳烃(C6S)与脑脊液(LCR)朊病毒蛋白的缔合：

未患有克雅二氏症的患者的脑脊液于75℃加热15分钟，然后用与ELISA免疫显色相容的缓冲液稀释到1/2或1/6。样品不用蛋白酶K消化，并在1.8至18μg/ml的浓度范围在接枝C6S的板上沉积。温育后，用0.5μg/ml偶连了过氧化物酶的AC23抗体来确保对捕获在C6S上的抗原进行免疫显色。结果如图10所示。

结果显示C6S迅速与LCR中的朊病毒蛋白形成组合物，因为可以从固定在容器底部的C6S第一个浓度上观察到信号。

2.确证C6S不使用蛋白酶K与异源病理朊病毒蛋白的缔合：

未患有MJJ的患者的LCR(LCR-)和患有MCJ的患者(MJC+)的LCR不进行稀释或稀释到1/2，进行不同类型的热处理。然后将它们沉积在接枝了7.2μg/ml C6S的板上。洗涤后，用偶联了生物素的抗朊病毒抗体AC23来确保进行免疫显色。

结果如图11所示。

这些结果显示了未用蛋白酶K处理的朊病毒蛋白吸附在接枝在板上的C6S上，阳性样品比阴性样品更有效。不同的加热处理轻微影响了朊病毒蛋白吸附在未稀释的C6S上的效果，当样品稀释后，影响更大。所以，测试条件希望是将朊病毒蛋白吸附在异源MN C6S上，因而该条件似乎是稀释样品并于95℃处理5分钟。

3.确证C6S与使用了蛋白酶K的异源病理朊病毒蛋白的缔合：

在分析前处理中，于37℃进行蛋白酶K消化15分钟，然后于37℃将消化混合物于C6C板上捕获1小时。接下来用0.05％PBS Tween缓冲液连续洗以确保去除剩余的蛋白酶K。

结果如图12所示。

结果显示用蛋白酶K消化后光密度差异偏向于MJC的阳性样品。从测试的蛋白酶K的第一个浓度(0.5μg/ml)可看到该差异。

d)结论

根据本发明，使得在LCR中检测朊病毒蛋白变得可能。事实上，以一种不可预期的方式，在不用蛋白酶K消化的情况下，存在磺化的杯-6-芳烃可增加总(细胞和病理)PrP的可检测度，优选检测PrP^sc。用蛋白酶K消化样品后在捕获中用这些C6S就能够检测LCR的PrP^sc，产生了信号，该信号在未患有MJC的患者中分离的LCR和患有MJC的患者中分离的LCR之间有显著差异。

Claims (18)

1.一种检测PrP尤其是检测PrP^sc方法，特征在于将游离的或与支持物相连的大环辅助配体(AML)加入到可能含有PrP的生物学样品中，然后用抗PrP^sc抗体与所得的悬液反应，鉴定PrP的存在。

2.权利要求1所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于其包括在与AML接触之前或之后用蛋白酶K处理样品的额外步骤。

3.权利要求1或2所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于所述生物学样品来自包括人的动物。

4.权利要求3所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于所述样品是组织或生物学液体，尤其是脑脊液或血清。

5.权利要求1至4之任一所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于该固体支持物优选以NHS基团或NH₂基团官能化并优选是磁珠或微量培养板。

6.权利要求1至5之任一所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于所述大环辅助配体结合与PrP^sc和抗体的结合位点在空间上毗邻或邻近的位点。

7.权利要求1至6之任一所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于所述大环辅助配体选自间环芳，尤其是杯芳烃。

8.权利要求7所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于优选的杯芳烃是在酚侧官能化的对-磺酸基-杯-芳烃，优选是对-磺酸基-杯-[4]-芳烃、对-磺酸基-杯-[6]-芳烃、对-磺酸基-杯-[8]-芳烃或它们的一种衍生物。

9.权利要求7或8所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于所述大环辅助配体相应于如下通式(I)，

其中

R₁表示氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，其中R如下所定义，

R₂表示氢原子、R基、COR、Pol、CH₂Pol，其中Pol表示磷酸、硫酸、胺、铵、羧酸基团，而R如下所定义，

R₃表示氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，其中R如下所定义，

R₄表示氢原子、羟基、OR基团、OCH₂R基团或OCOR基团，其中R如下所定义，

Y是碳原子、氮原子或硫原子，

R₅和R₆各自独立地不存在或表示氢原子、CH₂基团或如下所定义的R，或

R₅和R₆一起表示氧或硫原子，

X表示CH₂基团或氧或硫原子，

m表示等于0或1的正整数，

R表示氢原子或烃链，该烃链为饱和或不饱和的、分枝或不分枝的、环或非环的、由卤素基团取代或未取代的，并带有极性或非极性官能团，

n是3至15之间的正整数，并且

取代基R₁至R₅、R、X、Y和正整数m可根据结构单元而具有不同性质。

10.权利要求9所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于该大环辅助配体相应于以下通式(Ia)：

其中

每个R₂基团各自独立地为硫酸基团或磷酸基团，

R₇是(CH₂)_r-Z基团，其中Z是COOEt、COOH、CN或NH₂基团，

r是1至20之间的正整数，

p是1至10之间的正整数，

n是2至10之间的正整数。

11.权利要求9所述的方法，特征在于该配体相应于以下式(Ib)：

其中

n是4至8之间的正整数，

每个R₂基团各自独立地为硫酸基团或磷酸基团，

R₈表示(CH₂)_t-(CO)_S-(NH₂)基团或(CH₂)_t-COOH基团，其中t是0至6之间的正整数，而s是0至6之间的正整数。

12.权利要求11所述的方法，特征在于该配体是式(Ib)的杯芳烃，其中两个R₂基团的每一个都是硫酸基团，n是4、6或8，而R₈是氢原子、CH₂COOH基团、CH₂CONH₂基团或CH₂CH₂NH₂基团。

13.权利要求11所述的方法，特征在于两个R₂基团的每一个都是硫酸基团，n是等于6的正整数，而R₇是(CH₂)₂-NH₂基团。

14.权利要求7至12之任一所述的检测PrP尤其是检测PrP^sc的方法，特征在于该杯芳烃结合于官能化的支持物，尤其是被NHS或NH₂官能化的支持物。

15.一种接枝在官能化的支持物上的大环辅助配体，其中配体相应于式(Ib)

其中

n是4至8之间的正整数，

每个R₂基各自独立地为硫酸基团或磷酸基团，

R₈表示(CH₂)_t-(CO)_s-(NH₂)基团或(CH₂)_t-COOH基团，其中t是0至6之间的正整数，而s是0至6之间的正整数，

并且支持物是固体支持物类型，优选被NHS基团或NH₂基团官能化并优选是磁珠或微量培养板。

16.大环辅助配体、尤其是游离或与支持物结合的、如权利要求9、10和15定义的式(I)、(Ia)或(Ib)的配体在制备一种组合物中的应用，该组合物用于检测生物学样品尤其是生物学液体中的生理或病理的、牛或人或其它物种的PrP、重组PrP或PrP^sc。

17.一种诊断试剂盒，用于由PrP^sc造成的ESB类型疾病、小反刍动物颤抖病、克雅二氏症，特征在于其包含游离或与支持物结合的大环辅助配体、尤其是如权利要求9、10和15定义的式(I)、(Ia)或(Ib)的配体。

18.一种免疫学定量PrP^sc的试剂盒，特征在于其包含游离或与支持物结合的大环辅助配体、尤其是如权利要求9、10和15定义的式(I)、(Ia)或(Ib)的配体。

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