CN1920520A - 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 - Google Patents

检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱。该离心柱由上部分离管和下部收集管组成。上部分离管装有偶联小扁豆凝集素(LCA)的亲合介质，上部分离管底部是一个滤布，下部收集管中装有缓冲溶液。小扁豆凝集素(LCA)能与甲胎蛋白异质体糖链相结合。本发明还涉及了一种含有该预装离心柱的化学发光检测试剂盒和一种含有该预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及其制备、使用方法。应用该试剂盒可快速、简便的测定肝癌甲胎蛋白异质体的含量，准确的对肝癌进行早期诊断，为肝癌的预防、诊断、治疗提供支持。

Description

检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒
技术领域
本发明涉及了一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，还涉及了一种含有该预装离心柱的化学发光检测试剂盒和一种含有该预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及这些试剂盒的制备方法，属医疗产品技术领域，用于对肝癌的发生进行早期诊断。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内第四位常见的恶性肿瘤，每年大约有250 000名患者死于肝细胞癌，肝细胞癌的发病机制至今仍未清楚，其在临床上恶性度较高，死亡率在消化道恶性肿瘤中排第三位，所以早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。HCC是肿瘤病因学中的重要类型，肝硬化、病毒性肝炎、化学致癌物及环境因素等所造成的慢性肝脏损害都可诱发HCC。HCC恶性度高，容易复发及转移，预后差，而且早期诊断较困难，易于延误最佳治疗期。
甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)是一种糖蛋白，检测血液中的AFP含量是目前诊断肝癌最常见的手段。AFP在哺乳动物胚胎期由肝脏实质细胞和卵黄囊细胞合成，来源于内胚层的胃肠道粘膜细胞也可少量合成。正常情况下，AFP主要存在于胎儿循环中，随着胎儿发育成熟，AFP合成逐渐减少。出生时脐血中AFP浓度可达10～100mg/L，出生后一年降至正常成人水平。如果新生儿AFP明显升高提示新生儿肝炎、先天性胆道闭锁或有能分泌AFP的胚胎性恶性肿瘤。AFP作为早期肝癌诊断指标的缺点是在肝病和肝硬化疾病中也有相当的比例存在阳性结果，AFP轻度增高(20～200ng/ml)见于相当数量的慢性肝病患者，在肝硬化患者中11.7-44％AFP阳性。因此在分辨良性肝病和恶性肝肿瘤时，AFP作为早期肝癌筛查指标的价值大为降低。
凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。
Sumner和Howell于1936年首先从刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)种子纯化了伴刀豆凝集素-ConA(Con-A)。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推测ConA的血凝作用是与细胞表面糖作用的结果。
目前已有近千种植物被测得具有凝集素活性。植物中，不只种子中存在凝集素，根、茎、叶、皮、果实汁中也发现有凝集素。除植物外，其它生物，如各种真菌、某些病毒、无脊椎动物、脊椎动物及至人体的各种组织和器官中都存在凝集素。
凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖；麦胚凝集素(WGA)可专一结合唾液酸。
鉴定得最清楚的植物凝集素家族是豆科，包括刀豆蛋白凝集素ConA、小扁豆凝集素LCA等。
小扁豆：学名兵豆，从小扁豆中提取的凝集素LCA(Lens culinaris lectin)，可以特异结合岩藻糖基化聚糖。
随着生物化学及其相关分析技术的进展与应用，发现AFP分子与外源性凝集素的亲和力不同，即存在不均一性的糖链异质性。应用不同的凝集素亲和电泳可以把它们分成若干个组分，也可以用等电聚焦技术来分离AFP组分。AFP通过LCA亲和电泳可以分为三个部：AFP-L1(LCA非结合型)、AFP-L2(LCA弱结合型)、AFP-L3(LCA强结合型)。AFP-L1，来自良性肝病，是AFP的主要组分；AFP-L2来自孕妇；AFP-L3为HCC细胞所特有。因此由肝癌细胞合成、分泌的含岩藻糖苷化糖链的AFP异质体称为肝癌特异性AFP(AFP-L3)。
早在1970年，就有学者发现肝细胞癌患者血清AFP淀粉凝胶电泳时常出现不同的迁移率，而新生儿、胎儿的AFP电泳迁移率相同。当时认为系AFP所含的唾液酸含量不同所致，并提出AFP异质体(AFP Variants AFP-V)的概念。随后的研究表明，AFP的糖链结构存在不同程度的变异，而所谓的异质性主要是因为AFP所含碳水化合物不同所致。AFP异质体形成的确切机制还不十分清楚，其过程可能是这样的：增生的肝细胞及肝癌细胞于G1期和S期合成AFP，并将其分布于核周、内质网腔及高尔基分泌小囊中，位于粗面内质网及高尔基体中的AFP在糖基化转移酶参与下受到不同的糖基化修饰后分泌到循环中。由于糖基化的不同，导致了AFP异质性的差异。另一可能的原因是糖基化转移酶异常造成糖基化后AFP构象的改变。AFP的糖链结构能与多种凝集素相作用，与不同凝集素结合的AFP分子结构蛋白部分基本相同，但糖链部分有所差异。不同的糖链决定其与凝集素的亲和力。根据亲和性的不同，可将AFP异质体分为不同类型，如扁豆凝集素(LCA)亲和型、豌豆凝集素不亲和型，刀豆凝集素(ConA)亲和型和ConA不亲和型。另有一种分类方法是将电泳获得的区带从阳极开始以1、2、3编号，结合凝集素进行命名。如使用LCA则命名为AFP-L1(LCA非结合型)、AFP-L2(LCA弱结合型)、AFP-L3(LCA强结合型)；国内外研究已经证明AFP-L3是由肝癌细胞特异产生的。
AFP异质体许多糖链的结构尚未完全明了。与LCA相结合的基础是AFP糖链岩藻糖基化(LCA与岩藻糖有较强的亲和力)，由于胚胎期AFP几乎无岩藻糖成分，因而可以认为这种分子糖链的异常是糖基化异常的反映。AFP-L3与LCA的结合位点是门冬酰胺连接的岩藻糖化的N-乙酰葡萄糖胺。含岩藻糖苷化糖链的AFP异质体是肝细胞特异分泌的，称为肝癌特异性AFP(AFP-L3)。
目前认为，通常所说的AFP异质体实际是指与LCA结合的AFP-L3，1999年第四届全国肝癌学术会议将其列为原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。被公认为是比单纯的AFP甲胎蛋白更为特异的原发性肝癌指标。
AFP异质体检测的临床意义：
1)鉴别肝癌与良性肝病。原发性肝癌患者AFP常升高，但许多良性肝脏疾病也可有AFP升高，单凭AFP结果有时很难区分良、恶性病变。此时AFP异质体检测就具有良好的临床意义，尤其对于AFP在30～400ng/ml之间者具有较好的价值。Yozhiaki对361例肝硬化进行了前瞻性研究，在53例AFP在30ug/L以上的患者中，2年以后21例发展为肝癌，确诊肝癌时39％的患者AFP在400ug/L以下。对比研究开始时肝细胞肝癌(HCC)组与非HCC组AFP测定值，未发现差异有显著性，研究发现病变时AFP异质体的类型有所不同，对HCC诊断LCA阳性率87.12％假阳性率21.5％，ConA阳性率89.17％，假阳性率17.15％。目前的研究结果把AFP-L3含量大于15％作为肝癌的阳性指标。
2)肝癌术后的监测。肝癌切除术后，血清AFP含量随之下降，其下降速度取决于体内残留AFP量及半衰期，一般2月内转阴，转阴时AFP异质体随之消失。如果AFP明显下降但不转阴，异质体变化不明显，则提示手术不彻底，可能还存在边缘残留、血管癌栓、卫星结节或转移等。如果异质体下降至25％以下，AFP和异质体浓度相对恒定，则可能是患者有肝炎或肝硬化所致。
3)胚胎异常发育及胎儿先天性疾患。正常妊娠期母体血清中AFP与胚胎中AFP处于平衡状态，一旦胎儿畸形或胎盘屏障发生异常，可导致胎儿血清渗入羊水中或羊水渗入母体血清，造成母体羊水或血清AFP急剧升高。但仅仅测定AFP总量有一定的局限性。实验表明神经管缺损、无脑儿或脊柱裂等。儿童肝母细胞瘤、胆道闭锁、性腺肿瘤、恶性畸胎瘤等可有AFP和/或AFP异质体的阳性。
AFP-L3是唯一由患者肝脏中癌细胞生成的蛋白。在加拿大和美国的一项多中心、前瞻性、双盲、长期临床试验中，对该检测方法进行了研究。结果显示AFP-L3％升高(15％以上)的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。根据已有的肝细胞癌肿瘤学实践指南，这些患者肝细胞癌发生率极端增高。
目前用于AFP异质体的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、亲和交叉免疫电泳法。亲和印迹法国外应用较多，国内则多采用亲和交叉免疫电泳技术，依染色法的不同，可分为：
考马斯亮兰法：电泳后的标本直接用考马斯亮兰染色，洗脱后观察峰带。方法简单，但干扰因素多，灵敏度约1000ug/L。
酶标法：用过氧化物酶标记的抗体与电泳后的标本一起温育、漂洗后用二氨基联苯胺显色，检测灵敏度可提高至50ug/L。
金银染色法：将电泳后的标本直接与金黄色葡萄球菌蛋白A2胶金温育，再用银显色液显色，得到的峰带清晰，灵敏度可达32ug/L。
放射自显影法：是我国迄今为止最常用的检测方法，灵敏度达31ug/L。其原理是将标本在含凝集素的凝胶中进行分离电泳，后在添加含125IAFP、抗AFP抗体的凝胶中进行二次电泳，电泳结束后将凝胶烘干，覆盖X线胶片爆光，冲洗成像。整个实验过程操作复杂，长期以来，国内只有少数临床实验室能够测定AFP异质体，少数城市能满足临床测定AFP异质体的要求，并且没有国产试剂供应。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该预装柱的诊断试剂盒。通过该试剂盒可以真实地检测出血清中甲胎蛋白异质体的含量水平，准确地诊断出早期原发性肝癌，具有极高的灵敏度，方法快速简便。
一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，该预装离心柱由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质，所述下部收集管中装有缓冲溶液，所述分离管底部有一滤布，使得琼脂糖颗粒无法穿过的滤布。
所述凝集素包括小扁豆凝集素LCA和刀豆凝集素Con-A。
所述亲合介质可采用琼脂糖凝胶sephrose 4B、琼脂糖凝胶sephrose 6B或琼脂糖凝胶sephrose FF，所述缓冲溶液为凝集素的活性保护液。
所述琼脂糖凝胶为sephrose 4B，缓冲液为凝集素的活性保护液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述滤布是能阻挡偶联有凝集素的亲合介质穿过而不阻挡液体和蛋白质穿过的滤布。
所述装有偶联扁豆凝集素的琼脂糖凝胶由以下步骤得到的：
采用Pharmacia公司经CNBr活化的Sepharose 4B和Sigma公司的LCA。
(1)将1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨胀，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗涤约30min；
(2)称取2mgLCA，溶于7.5mL偶联缓冲液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，与经洗涤的Sepharose 4B合并，以带塞的10mL试管上下颠倒混匀(室温，2h)；
(3)以10mL偶联缓冲液洗去未偶联的LCA，测定洗涤液中的LCAI含量，计得偶联率为98％；
(4)用0.2mol/L甘氨酸封闭剩余活化基因；
(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris缓冲液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗涤3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗涤1次，4℃暂存备用。
本发明提供了一种含有上述预装离心柱的化学发光试剂盒及其制作方法。
该化学发光试剂盒包括了检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱；包被了甲胎蛋白单克隆抗体的化学发光酶标板；阳性对照物、阴性对照物；酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体；底物溶液A、显色液B、清洗缓冲液、标准品。
本试剂盒的制作方法如下：
(1)包被：将普通高滴度的甲胎蛋白单克隆抗体(市售)用0.05M柠檬酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。化学发光酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板；
(2)阳性、阴性对照物：
阳性对照物：收集肝癌病人腹水，过滤除菌、分装；
阴性对照物：收集正常人血清，过滤除菌、分装；
(3)酶标记单抗：本试剂盒中的酶标单克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体而制备的，步骤如下：
a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/m；
b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；
c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗AFP-L3单克隆抗体；
(4)辅助试剂的配制方法如下：
a)底物溶液A：1.0ml EDTA(1.0×10-2M)1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)、0.2ml Tween20(1％)；
b)显色液B：luminol 5.0×10-4Mol/L；
c)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)：PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；
(5)将预装离心柱、包被了甲胎蛋白单克隆抗体的化学发光酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体、底物溶液A、显色液
B、清洗缓冲液、标准品共同包装，得到试剂盒。
本发明还提供了一种含有上述预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及其制作。
该试剂盒包括了检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱；包被了甲胎蛋白单克隆抗体的酶标板；阳性对照物、阴性对照物；酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体；底物溶液A、显色液B、反应终止液、清洗缓冲液、标准品。
本试剂盒的制作方法如下：
(1)包被：将普通高滴度的甲胎蛋白单克隆抗体(市售)用0.05M碳酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。酶标板是聚苯乙烯酶标板，可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板；
(2)阳性、阴性对照物：
阳性对照物：收集肝癌病人腹水，过滤除菌、分装；
阴性对照物：收集正常人血清，过滤除菌、分装；
(3)酶标记单抗：本试剂盒中的酶标单克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体而制备的，步骤如下：
a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml；
b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；
c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗AFP-L3单克隆抗体；
(4)辅助试剂的配制方法如下：
a)底物溶液A：磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；
b)显色液B：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
c)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)：PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；
d)反应终止液：2mol/L硫酸；
(5)将预装离心柱、包被了甲胎蛋白单克隆抗体的酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体、底物溶液A、显色液B、清洗缓冲液、反应终止液、标准品共同包装，得到试剂盒。
本发明克服了以往检测方法操作步骤烦琐、耗时长、需要配套设备多等缺点，操作者只需要离心和温育等简单操作，在2小时内就可以完成检测，直接定量计算出血样标本中所含的甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的含量，方法简便，检测快捷，结果准确，为肝癌的预防、诊断、治疗提供了支持。
附图说明
附图为本发明预装离心柱的剖面结构示意图。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。
参见附图，本发明提供的一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，由位于上部的分离管1和位于下部的收集管3组成，通常可以采用将分离管插接到收集管上的方式实现两者的连接，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质4(为图面清晰起见，图中标注的是用于装亲合介质的管内空间，没有绘出介质实物)，所述下部收集管中装有缓冲溶液(为图面清晰起见，图中标注的是用于装缓冲溶液的管内空间，没有绘出溶液实物)，所述分离管底部主要是一滤布，该滤布采用能阻挡偶联有凝集素的亲合介质穿过而不阻挡液体和蛋白质穿过的滤布，以便在离心分离时，分离出来的液体和蛋白质能够透过该滤布进入下面的收集管。可以使用现有的这种滤布，并通过在分离管底部设置一个夹持塑料垫圈，将滤布固定住。。
实施例1：检测肝癌甲胎蛋白异质体的酶联免疫定量检测试剂盒的制作：
该试剂盒(96人份)组成包括：
AFP-L3阴性、阳性对照物各1瓶；
AFP单克隆抗体包被板(96孔)1块；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP单克隆抗体1瓶，6ml/瓶；
AFP标准品1瓶；
底物溶液A、显色液B各1瓶，5ml/瓶；
反应终止液1瓶，5ml/瓶；
清洗缓冲液(20×浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体操作如下：
1.制备AFP-阴性、阳性对照物：
1)收集血清：从医院或血站获得健康正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存备用；
2)分装：
AFP-L3阳性对照物：肝癌阳性病人腹水，在无菌条件下分装入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃；
阴性对照物：正常人血清，经检定为AFP阴性。取多份以上血清合并成批，经60℃1小时处理后，过滤除菌。在无菌的条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.制作AFP单克隆抗体包被板：
a)包被：
酶标板采用进口或国产的12×8可拆条板。将AFP单克隆抗体用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液2％BSA封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；
b)制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗AFP单克隆抗体：
抗AFP单克隆抗体可以商品化购得。
3.单克隆抗体的标记：
1)酶的氧化(全过程避光)：
a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；
b)称取NaIO4 5mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌；
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟；
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌；
f)室温静置30分钟；
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)单克隆抗体的准备及标记(避光)：
a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次；
b)将单克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5CB中透析6小时以上，前两个小时换液一次；
c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；
d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗AFP单克隆抗体
a)完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3；
b)4℃静置1小时；
c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮；
d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀；
e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀；
f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀；
g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；
h)提纯的HRP-单克隆抗体对PBS透析过夜；
i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-单克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标抗单克隆抗体。
4)分装：用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标抗AFP-L3单克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.辅助试剂的配制：
1)底物溶液A：磷酸-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装；
2)显色液B：TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装；
3)反应终止液：2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分装；
4)清洗缓冲液(20倍浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
实施例2：检测肝癌甲胎蛋白异质体的化学发光检测试剂盒的制作
该试剂盒(48人份)组成包括：
AFP-L3阴性、阳性对照各1瓶；
AFP单克隆抗体包被板(96孔)1块；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP单克隆抗体1瓶，6ml/瓶；
AFP标准品1瓶
底物溶液A、显色液B各1瓶，5ml/瓶；
清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体操作如下：
1.制备AFP-阴性、阳性对照物：
1)收集血清：从医院或血站获得正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存备用；
2)分装：
AFP-L3阳性对照物：肝癌阳性病人腹水，在无菌条件下分装入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃；
阴性对照血清：正常人血清，经检定为AFP阴性。取多份以上血清合并成批，经60℃1小时处理后，过滤除菌。在无菌的条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.制作AFP单克隆抗体包被板：
a)包被：
化学发光酶标板采用进口或国产的12×8可拆条板。将步骤1)AFP单克隆抗体用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；
b)制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗AFP单克隆抗体：
抗AFP单克隆抗体可以商品化购得。
3.单克隆抗体的标记：
1)酶的氧化(全过程避光)：
a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；
b)称取NaIO4 5mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌；
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟；
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌；
f)室温静置30分钟；
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)单克隆抗体的准备及标记(避光)：
a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次；
b)将单克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5CB中透析6小时以上，前两个小时换液一次；
c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；
d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗AFP-L3单克隆抗体：
a)完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低1/3；
b)4℃静置1小时；
c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮；
d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀；
e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀；
f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀；
g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；
h)提纯的HRP-单克隆抗体对PBS透析过夜；
i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-单克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标抗单克隆抗体。
4)分装：用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标抗AFP单克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.辅助试剂的配制：
1)底物溶液A：1.0ml EDTA(1.0×10-2M、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)和0.2ml Tween20(1％)
2)显色液B：luminol 5.0×10-4Mol/L；
3)清洗缓冲液(20倍浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
实施例3：预装离心柱的制备和使用
1、预装离心柱由离心柱和填充介质组成，离心柱由上部的离心管和下部的收集管组成，二者套在一起，组成离心柱。
2、离心柱填充材料的制备：采用Pharmacia公司经CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的LCA，按以下步骤偶联：
(1)将1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨胀，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗涤约30min；
(2)称取2mgLCA，溶于7.5mL偶联缓冲液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，与经洗涤的Sepharose 4B合并，以带塞的10mL试管上下颠倒混匀(室温，2h)；
(3)以10mL偶联缓冲液洗去未偶联的LCA。经测定洗涤液中的LCA I含量，计得偶联率为98％；
(4)用0.2mol/L甘氨酸封闭剩余活化基因；
(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris缓冲液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗涤3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗涤1次，4℃暂存备用。
3、在上部分离管中，加入一层滤布，并加一个塑料垫圈固定，该滤布的孔径小于琼脂糖，因此琼脂糖不能经过，但是蛋白质量和液体可以流过。取1mL已经偶联的凝集素sephrose 4B加入离心柱上部的离心管中。
4、加入1ml凝集素保存缓冲液，缓冲液经过上部离心管后主要保存于下面的收集管中，本发明预装离心柱下部收集管中的缓冲液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5
本发明的试剂盒的质量检测方法是：
1)准确性：10份正常阴性质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，无假阳性出现。5份肝癌AFP阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。
2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份肝癌阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于10％。
3)检测灵敏度：根据AFP标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为5ng/ml。
4)特异性：取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于5％。采用本发明提供的检测肝癌甲胎蛋白异质体的化学发光检测试剂盒进行甲胎蛋白异质体AFP-L3含量检测的方法是：
本发明提供的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的方法，包括下述步骤：
(1)预装离心柱的准备：取下预装离心柱下部的收集管，将其中的液体倒掉或吸出。将收集管装回预装柱，4℃进行离心，3000转10分钟，将收集管中的液体倒掉或吸出；
(2)待测血清的制备：加入待检测血清200ul，待该血清完全流入介质中，将预装离心柱扣上盖子，放入温箱温育1小时。预装离心柱离心2000转10分钟，收集管中的血清待检测；
(3)抗原-抗体反应：在试剂盒提供的包被板的微孔中分别双孔加入50ul阳性、阴性对照血清和待测血清样品，使用记号笔标记成1、2系列。1系列加样孔中加入未离心处理的标本，2系列加样孔中加入从预装离心柱收集管中收集的血清标本，同时加入酶标单克隆抗体，37℃水浴保温30分钟。取出板，甩掉孔中液体。PBST洗板操作4次；
(4)显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，在10分钟内读值；
(5)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.95时本次测定有效；
(6)测量、计算：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出待测血清样品的AFP和AFP-L3浓度；
(7)结果判断：
阳性质控血清：(孔1-孔2)÷孔1≥15％时，本次测定有效；
阴性对照血清：(孔1-孔2)÷孔1≤15％时，本次测定有效；
当上述两条同时满足时，可以给出本次测定有效的肯定结论。
待检测血清：(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，说明其中甲胎蛋白异质体AFP-L3含量较高，为肝癌阳性。
采用本发明提供的检测肝癌甲胎蛋白异质体的酶联免疫定量检测试剂盒进行甲胎蛋白异质体AFP-L3含量检测的方法是：
(1)预装离心柱的准备：取下预装离心柱下部的收集管，将其中的液体倒掉或吸出。将收集管装回预装柱，4℃进行离心，3000转10分钟，将收集管中的液体倒掉或吸出；
(2)待测血清的制备：加入待检测血清200ul，待该血清完全流入介质中，将预装离心柱扣上盖子，放入温箱温育1小时。预装离心柱离心2000转10分钟，收集管中的血清待检测；
(3)抗原-抗体反应：在试剂盒提供的包被板的微孔中分别双孔加入50ul阳性、阴性对照血清和待测血清样品，使用记号笔标记成1、2系列。1系列加样孔中加入未离心处理的标本，2系列加样孔中加入从预装离心柱收集管中收集的血清标本，同时加入酶标单克隆抗体，37℃水浴保温30分钟。取出板，甩掉孔中液体。PBST洗板操作4次；
(4)显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟。加入终止液50ul，酶标仪读值；
(5)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.95时本次测定有效；
(6)测量、计算：根据待测样品的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的AFP和AFP-L3浓度。
(7)结果判断：
阳性质控血清：(孔1-孔2)÷孔1≥15％时，本次测定有效；
阴性对照血清：(孔1-孔2)÷孔1≤15％时，本次测定有效；
当上述两条同时满足时，可以给出本次测定有效的肯定结论。
待检测血清：(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，说明其中甲胎蛋白异质体AFP-L3含量较高，为肝癌阳性。
采用本发明提供的试剂盒对肝癌病人阳性样品的检测结果：
为判断本发明化学发光检测试剂盒和酶联免疫试剂盒与临床肝癌检测结果的符合率，取本发明的两种试剂盒进行了对比检测实验。采用北京地坛医院病毒研究室提供的标本进行对比检测：50份已知原发性肝癌阳性标本，83份体检健康血清，100份肝硬化血清、100份肝炎，肝病标本均为AFP阳性标本。分别用化学发光检测试剂盒及酶联免疫定量检测试剂盒进行检测，结果见表1。
表1.在不同标本中检出率比较
  血清来源   例数       阳性数(阳性比例)
  AFP阳性(大于20ng)   AFP-V含量(≥15％)
  50份原发性肝癌阳性标本83份健康人100份肝硬化   5083100   100％0100％   91％07％
  100份肝炎   100   100％   6％
本实验结果表明，本发明对于原发性肝癌的符合率高达91％，在肝硬化中的特异性高达93％，在肝炎中的特异度高达94％。
本发明试剂盒对甲胎蛋白阳性的乙肝慢性大三阳肝炎标本和原发性肝癌标本的检测分析：
从北京301医院收集的原发性肝癌样本5份，慢性肝炎大三阳标本5份，采用本发明提供的化学发光检测试剂盒进行检测，结果见表2。
表2采用化学发光检测试剂盒对甲胎蛋白阳性的乙肝慢性大三阳肝炎标本和原发性肝癌标本的检测
  原发性肝癌   P1   P2   P3   P4   P5
  原样本   39791   242513   13278   256786   78432
  预装柱离心处理后样本   4317   60090   5632   46721   25782
  下降幅度≥15为AFP-V阳性 89％ 75％ 57％ 81％ 67％
  非肝癌   N1   N2   N3   N4   N5
  原样本   49837   33884   27780   144838   287269
  预装柱离心处理后样本   47990   34778   26669   159522   279387
  下降幅度≥15为AFP-V阳性 3.7％ -2.6％ 3.9％ -10.1％ 2.7％
两类标本进行AFP-L3定量检测，原发性肝癌5份，大三阳慢性肝炎5份，检测结果如表所示。结果显示，本发明AFP-L3定量检测时，可以清楚分辨出大三阳慢性肝炎和原发性肝癌之间AFP-L3含量的不同。

Claims (10)

1、一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，其特征在于其由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质，上部分离管底部有一滤布，所述下部收集管中装有缓冲溶液。
2，如权利要求1所述的检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，其特征在于所述凝集素为小扁豆凝集素LCA或刀豆凝集素Con-A。
3、如权利要求1所述的检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，其特征在于所述亲合介质采用琼脂糖凝胶sephrose 4B、琼脂糖凝胶sephrose 6B、或琼脂糖凝胶sephrose FF，所述缓冲溶液为凝集素的活性保护液。
4、如权利要求1所述的检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，其特征在于所述滤布是能阻挡偶联有凝集素的亲合介质穿过而不阻挡液体和蛋白质穿过的滤布。
5、如权利要求3所述的检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，其特征在于所述装有偶联扁豆凝集素的琼脂糖凝胶通过以下步骤获得：
(1)将Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗涤；
(2)称取LCA，溶于偶联缓冲液中，与经洗涤的Sepharose4B合并混匀；
(3)用偶联缓冲液洗去未偶联的LCA，测定洗涤液中的LCA含量，计得偶联率为98％；
(4)用甘氨酸封闭剩余活化基因，洗涤，4℃暂存备用。
6、如权利要求1所述的检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱，其特征在于下部收集管中的缓冲液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH7.5。
7、一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的化学发光检测试剂盒，包括下列组件：
(1)检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱；
(2)包被了甲胎蛋白单克隆抗体的化学发光酶标板；
(3)阳性对照物、阴性对照物；
(4)酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体；
(5)底物溶液A、显色液B、清洗缓冲液、标准品，
所述检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质，所述下部收集管中装有缓冲溶液。
8、如权利要求7所述的试剂盒，其制作方法包括以下步骤：
(1)高滴度的甲胎蛋白单克隆抗体包被到酶标板吸附过夜；
(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；
(3)收集肝癌病人腹水，过滤除菌、分装，即获得阳性对照物。收集正常人血清，过滤除菌、分装，即获得阴性对照物；
(4)获得酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体；
(5)将预装离心柱、包被了甲胎蛋白单克隆抗体的化学发光酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体、底物溶液A、显色液B、清洗缓冲液、标准品共同包装，得到试剂盒。
9、一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的酶联免疫定量检测试剂盒，包括下列组件：
(1)检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱；
(2)包被了甲胎蛋白单克隆抗体的酶标板；
(3)阳性对照物、阴性对照物；
(4)酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体；
(5)底物溶液A、显色液B、清洗缓冲液、反应终止液、标准品，
所述检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质，所述下部收集管中装有缓冲溶液。
10、如权利要求9所述的试剂盒，其制作方法包括以下步骤：
(1)高滴度的甲胎蛋白单克隆抗体(市售)包被到酶标板吸附过夜；
(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；
(3)收集肝癌病人腹水，过滤除菌、分装，即获得阳性对照物。收集正常人血清，过滤除菌、分装，即获得阴性对照物。
(4)获得酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体；
(5)将预装离心柱、包被了甲胎蛋白单克隆抗体的酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的抗甲胎蛋白单克隆抗体、底物溶液A、显色液B、清洗缓冲液、反应终止液、标准品共同包装，得到试剂盒。
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