CN1887901A

CN1887901A - 人肿瘤m2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用

Info

Publication number: CN1887901A
Application number: CNA2006100612963A
Authority: CN
Inventors: 朱建安
Original assignee: ANQUN BIOENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Current assignee: Anqun Bioengineering Co., Ltd., Shenzhen
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2007-01-03
Anticipated expiration: 2026-06-23
Also published as: CN100554278C

Abstract

本发明为一种人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用。本发明的人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽，为序列表SEQ ID NO.1和SEQ NO.2所述的两种多肽片段之一。本发明的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体，由本发明的人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽制备而成。本发明的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体可应用于制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒。

Description

人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用

技术领域

本发明涉及一种人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽、相应的多克隆抗体及其在制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒上的应用。

背景技术

当前，肿瘤发病率不断提高，已发展成为临床三大死亡原因之一，全世界每年死于癌症的患者仅次于心血管患者。有关癌症诊断与治疗的问题，已经成为近二十年来医学界研究的一大重点。现代科学技术证明：肝癌、肺癌等恶性肿瘤要对其基本治愈几乎全靠及早发现、及早诊断和及早手术治疗。早期癌症的治愈率可以达到80％。但癌症的早期诊断比较困难，因为一方面临床上患者早期多无明显症状体征，另一方面实验室缺乏理想的敏感而特异的诊断指标。

目前肿瘤的常规检测主要有以下方法：

1、物理诊断：有X光、CT、核磁共振、B超、红外扫描等方法，但这类诊断方法只能发现直径1-2厘米以上的肿瘤。而一个肿瘤细胞从生成到倍增至如此大小，所需时间为五年甚至更长。组织细胞学的检查则需在物理学检查发现的基础上，方可取得标本(切片或手术)。所以物理学诊断和组织细胞学诊断往往只能发现中晚期肿瘤，难于达到早期发现的目的，且大多操作复杂，费用昂贵，需要施行手术，给病人带来痛苦，给机体造成损伤。而且，这是无症状人群不易接受的，不能或不便进行常规检测，常常造成诊断延误。

2、生物化学及免疫学诊断：是通过检测肿瘤发生、发展过程中所分泌的一些具有特异性的蛋白成分，即肿瘤标志物来实现的。但肿瘤的生长是一个极其复杂的多病因过程，仅靠一个指标进行诊断，灵敏性和准确度都不高。如：甲胎蛋白AFP被认为是最好的原发性肝癌指标，但其阳性率仅为60％-70％；癌胚抗原CEA鉴别消化道癌症的阳性率也仅为14％-35％；卵巢癌抗原CA-125诊断卵巢癌的灵敏度为46％，而且这些肿瘤标志物的含量随病程的发展而升高。所以其早期阳性检出率很低，有的甚至不可能。因此，单一肿瘤标志物的临床应用主要是预后和随访，并不适用于肿瘤的早期检测。

近几年的科学研究发现，血液中肿瘤M2型丙酮酸激酶PK(简称Tu M2-PK)的检测可用于癌症的筛查、诊断及跟踪治疗。

丙酮酸激酶PK是糖酵解途径的一个关键酶，在三磷酸核苷的合成过程中也起着决定性作用。哺乳类的PK有四种同工酶，分别为L型、R型、M1型和M2型，这四种同工酶的分布具有相对的组织特异性。M2型PK主要分布于肺组织、肾远曲小管、胚胎组织以及增殖或未分化的组织中。在正常细胞中，M2-PK主要以三聚体的形式存在，而在肿瘤细胞中，M2-PK大量表达并转变为主要以二聚体的形式存在。三聚体的M2-PK与磷酸烯醇丙酮酸PEP亲和力很高，而二聚体的M2-PK与PEP的亲和力则低的多，后者因此导致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞进行有氧糖酵解。目前的研究表明，几乎所有的不同组织来源的肿瘤均伴有M2-PK的过度表达，故称为肿瘤型M2-PK(Tumor M2-PK，Tu M2-PK)。另外发现，淋巴细胞中也含有少量的Tu M2-PK。

由于M2-PK的升高可见于大多数癌症患者。尽管不同组织来源的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，其血中M2-PK的平均水平存在着一定的差别，但作为肿瘤标志物，M2-PK是很有应用价值的。尤其是肾癌，长期以来一直未发现较特异的肿瘤标志物，M2-PK很可能成为目前唯一可用于临床诊断肾癌的生化指标。

综上所述，监测血液中肿瘤M2型丙酮酸激酶(TU M2-PK)可用于肿瘤的早期诊断、肿瘤预后判断、评价肿瘤治疗的疗效以及动态监测。

而监测血液中肿瘤M2型丙酮酸激酶(TU M2-PK)最理想的方法即是免疫测定，但必须制备针对Tu M2-PK的特异性抗体，因此寻找合适的具有免疫原性的多TU M2-PK肽片段，就成了重点。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对上述人肿瘤诊断和治疗的现状，提供具有免疫原性的TU M2-PK多肽片段，即提供人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽。

本发明的第二个目的在于将本发明的TU M2-PK多肽片段免疫动物，提供相应的多克隆抗体。

本发明的第三个目的在于将本发明的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体应用于制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒。

本发明的人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽，为如下两种多肽片段之一：

(1)Tyr-His-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Asn-Val-Arg-Glu-Ala-Thr-Glu-Ser，即序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；

(2)Tyr-Asp-Arg-Val-Phe-Ala-Ser-Phe-IIe-Arg-Ala-Ala-Asp，即序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

本发明的多肽片段1是人M2-PK蛋白N端第83-97位肽段的14个氨基酸残基，并在该肽段的N端加Tyr组成。肽段在N端加Tyr是为了通过BDB(双偶氮联苯胺二氯化物Bis-diazotizedbenzidinedichloride)交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原制备抗体，Y加在N端产生抗多肽C端抗体，Y也可加在C端，产生抗多肽N端抗体。

本发明的多肽片段2是人M2-PK蛋白N端第240-249位肽段的10个氨基酸残基，并在该肽段的N端加Tyr-Asp-Arg组成。肽段在240前加Asp、Arg是为了增强该肽段的亲水性，肽段在N端加Y是为了通过BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原制备抗体，Y加在N端产生抗多肽C端抗体，Y也可加在C端，产生抗多肽N端抗体。

上述两种M2-PK抗原决定簇多肽片段是按以下原则筛选出来的：

1、亲水；

2、抗原性强；

3、易于合成。

迄今为止我们的研究发现本发明的两种多肽片段具有如下功能：

1、具有免疫原性

2、与载体蛋白连接后作为抗原可刺激动物产生特异性的抗体。

3、用这两种多肽片段制备的抗体可特异性的与人M2-PK结合。

两种M2-PK抗原决定簇多肽片段的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇多肽。多肽的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原多肽的浓度。

将本发明的M2-PK抗原决定簇多肽与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物即可制备本发明的特异性的多克隆抗体。制备方法采用现有成熟技术，参见实施例二。

如前所述依次制得M2-PK抗原决定簇多肽片段和其特异性多克隆抗体后，即可将该多克隆抗体用于制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒。

将本发明的多克隆抗体制备的人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒进行临床研究，在比较了143例患有各种肿瘤的患者之血浆标本(其中包括38例肺癌，44例胃癌，45例肾癌)，和110例非肿瘤患者的血浆标本(包括各种炎症性疾病患者和健康人的血浆标本)的检测结果发现，Tu M2-PK检测肿瘤特异性为90％，对不同部位的肿瘤检测灵敏度为82-65％不等。说明Tu M2-PK在各类肿瘤患者的血浆中均有明显升高，虽然灵敏度有一定差别，但相较目前发现的所有肿瘤标志物临床统计数据来看，Tu M2-PK的特异性是最高的。

具体实施方式

实施例一：两种M2-PK抗原决定簇多肽片段的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇多肽。多肽的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原多肽的浓度。

该两种多肽片段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。下图表示了这个合成过程。

本发明的两种M2-PK抗原决定簇多肽片段的制备如下：

1.所用原料：

HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)

NMP(氮甲基吡咯烷酮)

DCM(二氯甲烷)

MeoH(甲醇)

Piperidine(哌啶)

DMAP(二甲基氨基吡啶)

HOBT(羟基苯并三唑)

DCC(二环己基碳二亚胺)

TFA(三氟乙酸)

EDT(1，2-乙二硫醇)

硫代苯甲醚

结晶苯酚

乙腈

2.使用仪器：

多肽自动合成仪

旋转蒸发仪

高效液相色谱仪

冷冻干燥机

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即0.1mmol于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的AA按不同的顺序联接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(2)联接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

(6)重复3-5直至合成结束，得到M2-PK多肽的肽树脂258mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT，硫代苯甲醚，H₂O作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到M2-PK多肽的粗品。

多肽的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱 C₈10×100mm

色谱仪 Waters600美国Waters公司

流动相 A-0.1％TFA(三氟乙酸)H₂O

B-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长 214nm

流速 4ml/分钟

洗脱梯度 20-60％B于30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱： C₁₈4.6×150mm

流动相： A-0.1％TFA(三氟乙酸)H₂O

B-0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长： 214nm

流速： 1ML/min

洗脱梯度： 0-60％B于30分钟

两种多肽片段分析结果显示纯度95％以上。

实施例二：将实施例一所得的M2-PK抗原决定簇多肽片段与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物制备特异性的多克隆抗体。

(-)M2-PK抗原决定簇多肽片段1多克隆抗体制备：

1.抗原的制备：用碳二亚胺法将M2-PK多肽与载体蛋白KLH(血蓝蛋白)联接制备成抗原。

2.动物制备抗血清：取抗原与1ml弗氏完全佐剂(基础免疫)或弗氏不完全佐剂(加强免疫)充分乳化后免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，每次剂量为50-200μg/ml，分20点皮内注射，共免疫7-8次，末次免疫后的第十天取耳血测定抗体效价。

3.测定抗体效价：用ELISA法测定抗体效价，结果显示抗体效价达到1：32000以上。

4.接种H22肝癌细胞于腹腔内。

5.取腹水及分离上清。

6.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化。

7.抗体分装后冻干，低温保存。

(二)M2-PK抗原决定簇多肽片段2多克隆抗体制备：

2.免疫动物制备抗血清：取抗原与1ml弗氏完全佐剂(基础免疫)或弗氏完不全佐剂(加强免疫)充分乳化后免疫新西兰大白兔背部，每次剂量为50-200g/ml，分20点皮内注射，共免疫7-8次，末次免疫后的第十天取耳血测定抗体效价。

4.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

5.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化。

6.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例三：M2-PK ELISA试剂盒的制备。

制备试剂盒的第一、二步是制备M2-PK抗原决定簇多肽片段及多抗，第三步是将上述制备的M2-PK多抗用于诊断试剂盒的制备，本实施例中把两种M2-PK多抗中的片段1多克隆抗体作为制剂盒中的包被抗体，片段2多克隆抗体则作为结合抗体。

M2-PK ELISA试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M，pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃(MW 105.99) 16.0克

NaHCO₃(MW 84.01) 29.0克

蒸馏水溶至1000ml。

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的PBS-Tween 20

Na2HPO4.12H2O 58克

KH2PO4 4克

NaCl 100克

KCl 4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20 20ml。

C、酶标记物稀释液：

10×PBS 10ml

FCS(小牛血清) 20ml

蒸馏水溶至1000ml

稳定剂 1克

防腐剂 1ml。

D、显色剂A：

柠檬酸 35.5克

过氧化脲 10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20 10ml。

E、显色剂B：

柠檬酸 120克

EDTA-Na2 1克

TMB.2HCl 2克

蒸馏水溶至1000ml。

F、终止液：2M H2SO4

浓硫酸(95-98％) 22.2ml

蒸馏水 177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将M2-PK抗原决定簇多肽片段1多克隆抗体溶于PH＝9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液中，多抗浓度为10μg/ml，制成预包被液，在酶标板上每孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，洗涤，经封闭、干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(即M2-PK抗原决定簇多肽片段2多克隆抗体)和酶标二抗浓度确定：

结合抗体和酶标二抗浓度用方阵滴定实验确定。

4.试剂盒的组成：

1.预包被板 48/96孔

2.肿瘤M2-PK标准品1→6个 6×50μl

3.结合抗体 1×10ml

4.酶标二抗(HRP-IgG) 1×10ml

5.浓缩洗涤液(25×) 1×20ml

6.样品稀释液 1×20ml

7.显色剂A 1×6.0ml

8.显色剂B 1×6.0ml

9.终止液 1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中加入按1∶100稀释好的待检的EDTA血浆标本以及标准品100μl/孔，均为双孔，同时设空白孔，37℃孵育60分钟，洗涤5次，拍干。在各孔内加入结合抗体(即M2-PK抗原决定簇多肽片段2多克隆抗体)100μ1/孔，37℃孵育30分钟，洗涤5次，拍干。再在各孔内加入标记有辣根过氧化酶的抗人IgG抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪测定各孔的450nm处的吸光度。

6.结果判定：

OD比值计算：待测标本孔的OD值-空白孔的OD值

通过标准曲线计算结果。

在EDTA血浆中，M2-PK的浓度≤15U M2-PK/ml的为可能由于其它原因导致M2-PK升高，不是因肿瘤引起，也就是说对肿瘤检测而言，是阴性。

M2-PK的浓度＞15U M2-PK/ml，为阳性。

序列表

<110>深圳市安群生物工程有限公司

<120>人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Glu Ala Thr Glu Ser

1 5 10 15

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Tyr Asp Arg Val Phe Ala Ser Phe Ile Arg Ala Ala Asp

1 5 10

Claims

1.一种人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽，为如下两种多肽片段之一：

(1)Tyr-His-Ala-Glu-Thr-Ile-Lys-Asn-Val-Arg-Glu-Ala-Thr-Glu-Ser；

(2)Tyr-Asp-Arg-Val-Phe-Ala-Ser-Phe-Ile-Arg-Ala-Ala-Asp。

2.一种人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体，由权利要求1所述的人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽制备而成。

3.如权利要求2所述的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体在制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒上的应用。

4.如权利要求3所述的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体在制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒上的应用，其特征在于：所述试剂盒采用权利要求2所述的一种人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体作为包被抗体。

5.如权利要求4所述的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体在制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒上的应用，其特征在于：所述制剂盒还包括权利要求2所述的另一种人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体，该抗体与包被抗体的多肽来源不同。

6.根据权利要求5所述的人肿瘤M2型丙酮酸激酶多克隆抗体在制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶体外诊断试剂盒上的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标记的二抗。