JP4705694B2 - イミュノグロブリン結合能を有するペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸、製造方法、イミュノグロブリンを結合させるための組成物および手段に関するものである。本発明はまた、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などに関するものである。
Ｃ１ｑは補体タンパク質の１つであり、補体活性化経路において作用することが知られている。例えば、古典経路の活性化は、Ｃ１ｑがイミュノグロブリン分子のＦｃ部分に結合することにより引き起こされるとされている。
Ｃ１ｑが血中に多く存在する関節リウマチ（ＲＡ）患者は、将来関節破壊に陥ることが報告されている（非特許文献１）。上述のＣ１ｑによる活性化が関与していると考えられており、Ｃ１ｑとイミュノグロブリン分子との結合の阻害剤の開発が望まれている。
Ｃ１ｑとイミュノグロブリン分子との結合に、Ｃ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）のアルギニン残基が関与する可能性があると報告されている（非特許文献２）。しかしながら、この報告は、コンピューターによるシミュレーションにより予測されたものであり、実際のイミュノグロブリン結合部位は明確にされていなかった。また、かかる結合部位の詳細なアミノ酸配列も分かっていなかった。
イミュノグロブリンの精製において、Protein AまたはProtein Gのようなイミュノグロブリンに特異的に結合するタンパク質が用いられている。しかしながら、これらのタンパク質は、イミュノグロブリンとの結合力が強いため、一旦結合させた後、分離させるのに、強い酸性バッファーを用いるなどの厳しい条件を必要とする。そのため、イミュノグロブリンの立体構造が崩れやすく、親和性の高い抗体を精製することができなかった。
Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-43 Gaboriaud C et al., J Biol Chem. 2003 Nov 21; 278(47): 46974-82. Epub 2003 Sep 5
本発明の解決課題は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸、かかる核酸を含むベクターなどを提供することである。また、抗体の立体構造を破壊せず、抗原との親和性の高い抗体も精製することができる、新規抗体精製方法、およびそのための組成物および手段を提供することにある。
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合に関与するアミノ酸配列の同定に成功し、本発明を完成するに至った。また、驚くべきことに、かかるアミノ酸配列は、結合に関与すると報告されているアルギニン残基を含まないものであった。さらに、このアミノ酸配列を含むペプチドは、Protein AやProtein Gより弱くイミュノグロブリンと結合するので、抗体の立体構造の破壊や精製の対象となる抗体の制限（抗原との親和性が高い抗体を精製することができないなど）などの従来の抗体精製の際の問題を解消し、マイルドな条件下での抗体精製を可能にした。
すなわち、本発明は、
（１）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、
からなる群より選択され、ここで、ペプチド中のシステインは異なる種類のアミノ酸で置換されてもよい、ペプチド；
（２）ペプチド中のシステインがセリンで置換されている、（１）記載のペプチド；
（３）配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列を有するものである、（２）記載のペプチド；
（４）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、
からなる群より選択され、ここで、ペプチド中のアミノ酸は対応するＤ−アミノ酸で置換されてもよい、ペプチド；
（５）全てのアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、（４）記載のペプチド；
（６）ｄＰｒｏ Ｇｌｙ ｄＬｅｕ ｄＴｙｒ ｄＴｙｒ ｄＰｈｅで表されるアミノ酸配列を有するものである、（５）記載のペプチド；
（７）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、
からなる群より選択され、ここで、ペプチド中のシステインは異なる種類のアミノ酸で置換されてもよく、かつペプチド中のアミノ酸は対応するＤ−アミノ酸で置換されてもよい、ペプチド；
（８）ペプチド中のシステインが異なる種類のアミノ酸で置換され、かつ全てのアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、（７）記載のペプチド；
（９）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）（１）記載のペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｄ）前記（ｂ）または（ｃ）の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し得る核酸、
（ｅ）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸；
（１０）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列を有するものである、（９）記載の核酸；
（１１）（９）または（１０）記載の核酸を含むベクター；
（１２）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質；
（１３）（４）〜（８）のいずれか記載のペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質；
（１４）（１２）記載の融合タンパク質をコードする核酸；
（１５）（１４）記載の核酸を含むベクター；
（１６）（９）若しくは（１０）記載の核酸または（１４）記載の核酸、あるいは（１１）または（１５）記載のベクターを含む、細胞；
（１７）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）（１１）記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む、方法；
（１８）（１７）記載の方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド；
（１９）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）（１５）記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
を含む、方法；
（２０）融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含む、（１９）記載の方法；
（２１）（１９）または（２０）記載の方法により得ることのできる、融合タンパク質；
（２２）（１）〜（８）のいずれか記載のペプチド、または（１２）若しくは（１３）記載の融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物；
（２３）イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（２２）記載の組成物；
（２４）（１）〜（８）のいずれか記載のペプチド、または（１２）若しくは（１３）記載の融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段；
（２５）イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するためであるか、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（２４）記載の手段；
（２６）イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）（１）〜（８）のいずれか記載のペプチド、または（１２）若しくは（１３）記載の融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む、方法；
（２７）（２６）記載の方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキット；
（２８）（１）〜（８）のいずれか記載のペプチド、または（１２）若しくは（１３）記載の融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物；
（２９）疾患が関節リウマチである、（２８）記載の医薬組成物；
（３０）疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、（２８）記載の医薬組成物；
（３１）標識されている（１）〜（８）のいずれか記載のペプチド、または（１２）若しくは（１３）記載の融合タンパク質；
（３２）（３１）記載の標識されているペプチドまたは融合タンパク質を試料中の抗体と反応させ、次いで抗体と結合した該ペプチドまたは融合タンパク質を検出することを特徴とする、試料中の抗体の検出方法
に関するものである。
本発明により、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸、製造方法、イミュノグロブリンを結合させるための組成物および手段、およびイミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などが提供される。
図１は、６アミノ酸を有するペプチドＲ１、９アミノ酸を有するペプチドＲ２、１５アミノ酸を有するペプチドＲ３〜Ｒ６がＣ１ｑとイミュノグロブリンの結合を阻害することを示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。 図２は、６アミノ酸を有する変異ペプチドＲ７〜Ｒ９、９アミノ酸を有する変異ペプチド１０、１５アミノ酸を有する変異ペプチドＲ１１がＣ１ｑとイミュノグロブリンの結合を阻害することを示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。 図３は、変異ペプチドＲ１２〜１８がＣ１ｑとイミュノグロブリンの結合を阻害することを示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。 図４は、変異ペプチドＲ１９〜２２がＣ１ｑとイミュノグロブリンの結合を阻害することを示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。 図５は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ５の腹腔内投与（１回／１日投与または２回／１日投与）により、関節炎誘発マウスにおいて関節炎が抑制されたことを示す。対照として、ペプチドを含まない０．５％ メチルセルロース溶液を１回／１日投与したマウスの結果、および０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサート溶液を１回／１日投与したマウスの結果を示す。 図６は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ１の腹腔内投与により、関節炎誘発マウスにおいて関節炎が抑制されたことを示す。対照として、ペプチドを含まない０．５％ メチルセルロース溶液を同様に投与したマウスの結果を示す。 図７は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ２の腹腔内投与により、関節炎誘発マウスにおいて関節炎が抑制されたことを示す。対照として、ペプチドを含まない０．５％ メチルセルロース溶液を同様に投与したマウスの結果を示す。 図８は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ５の腹腔内投与により、関節炎誘発マウスにおいて関節炎が抑制されたことを示す。対照として、ペプチドを含まない０．５％ メチルセルロース溶液を同様に投与したマウスの結果を示す。 図９は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ２若しくはＲ１３を腹腔内投与したか、または１ｍｇ／ｋｇのＲ１若しくは１０ｍｇ／ｋｇのＲ１７を静脈内投与した関節炎誘発マウスにおける臨床スコアの変化を示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水を同様に投与したマウスの結果を示す。 図１０は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ２若しくはＲ１３を腹腔内投与したか、または１ｍｇ／ｋｇのＲ１若しくは１０ｍｇ／ｋｇのＲ１７を静脈内投与した関節炎誘発マウスにおける後肢容積の変化を示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水または０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを腹腔内投与したマウスの結果を示す。 図１１は、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ１３を腹腔内投与した関節炎誘発マウスにおける臨床スコアの変化を示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水または０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを腹腔内投与したマウスの結果を示す。 図１２は、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ１９を腹腔内投与した関節炎誘発マウスにおける臨床スコアの変化を示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水または０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを腹腔内投与したマウスの結果を示す。 図１３は、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ２１を腹腔内投与した関節炎誘発マウスにおける臨床スコアの変化を示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水または０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを腹腔内投与したマウスの結果を示す。 図１４は、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ１、Ｒ２またはＲ５の腹腔内投与により、ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットにおいてＳＬＥ、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病が抑制されたことを示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水を同様に投与したラットの結果を示す。 図１５は、１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ１またはＲ２の尾静脈内投与により、ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットにおいてＳＬＥ、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病が抑制されたことを示す。対照として、ペプチドを含まない生理食塩水を同様に投与したラットの結果を示す。 図１６は、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのペプチドＲ１３またはＲ１９の腹腔内投与により、ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットにおいてＳＬＥ、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病が抑制されたことを示す。陰性対照としてペプチドを含まない生理食塩水、および陽性対照としてヒドロコルチゾン５０ｍｇ／ｋｇを同様に投与したラットの結果を示す。 図１７は、１０ｍｇ／ｋｇでのペプチドＲ１３またはＲ１９の尾静脈内投与により、ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットにおいてＳＬＥ、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病が抑制されたことを示す。陰性対照としてペプチドを含まない生理食塩水を同様に投与したラットの結果を示す。 図１８は、Ｒ１３ペプチドを１００ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで投与することにより、関節炎抑制効果が確認されたことを示す。陰性対照として、生理食塩水またはスクランブルペプチドを同様に投与した群（グラフ中、ＣＩＡまたはスクランブルとして示す）、陽性対照として、メトトレキサートを同様に投与した群（グラフ中、ＭＴＸ（０．１５ｍｇ／ｋｇ）として示す）の結果を示す。 図１９は、本発明のペプチドにより、抗体が検出できたことを示す図である。各レーンに用いたＢＳＡの量を以下に示す：レーン１ ＢＳＡ ０．１μｇ、レーン２ ＢＳＡ ０．５μｇ、レーン３ ＢＳＡ １．０μｇ、レーン４ ＢＳＡ ２．０μｇ 図２０は、本発明のペプチドを用いたアフィニティー精製用カラムによってウサギ抗体が精製できたことを示す図である。対照として、Protein Aを用いて精製した結果を示す。値は、それぞれのフラクションに含まれるＩｇＧタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）を示す。図中、ＰＴは未吸着フラクション、Ｗ１〜５は洗浄フラクション、Ｅ１〜５は溶出フラクションを示す。 図２１は、本発明のペプチドを用いたアフィニティー精製用カラムによってヒト抗体が精製できたことを示す図である。値は、それぞれのフラクションに含まれるＩｇＧタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）を示す。図中、ＰＴは未吸着フラクション、Ｗ１〜５は洗浄フラクション、Ｅ１〜５は溶出フラクションを示す。
本発明は、１の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、
からなる群より選択され、ここで、ペプチド中のシステインは異なる種類のアミノ酸で置換されてもよく、かつ／またはペプチド中のアミノ酸は対応するＤ−アミノ酸で置換されてもよい、ペプチドに関するものである。本発明のペプチドは、Protein AおよびProtein Gと比較して、イミュノグロブリンとの結合能が弱く、そのため、例えば、本発明のペプチドと結合したイミュノグロブリンをマイルドな条件下で解離することなどが可能となる。また、本発明のペプチドと結合したイミュノグロブリン自体の変性も低減される。結合能は、当該技術分野において既知の方法により調べることができる。例えば、ペプチドをイミュノグロブリン存在下でインキュベートし、結合するかどうかを直接調べてもよい。
本発明のペプチドは、ペプチド中のシステインが異なる種類のアミノ酸で置換されていてもよい。上記異なる種類のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよびプロリンなどのアミノ酸のＬ体およびＤ体に加えて、β−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−アミノレブリン酸、５−アミノ吉草酸、ホモシステイン、オルニチン、５−ヒドロキシトリプトファン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）、トリヨードチロニン、チロキシン、ホモリジン、ノルロイシン、クレアチン、デスモシン、ノルバリンおよびヨードチロシンなどの非天然アミノ酸のＬ体およびＤ体が挙げられる。好ましくは、本願発明のペプチドは、ペプチド中のシステインがセリンに置換されているものである。また、本発明のペプチドは、ペプチド中のアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸で置換されてもよい。詳細には、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個または１５個のアミノ酸を対応するＤ−アミノ酸で置換してもよい。対応するＤ−アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよびプロリンなどのアミノ酸のＤ体に加えて、上記非天然アミノ酸のＤ体であってもよい。好ましくは、本願発明のペプチドは、全てのアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸で置換されているものである。あるいは、本願発明のペプチドは、ペプチド中のシステインが上記の異なる種類のアミノ酸で置換され、かつペプチド中のアミノ酸が上記の対応するＤ−アミノ酸で置換されていてもよい。好ましくは、本願発明のペプチドは、ペプチド中のシステインがセリンに置換され、かつ全てのアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸で置換されているものである。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のペプチドはイミュノグロブリン結合能を有するものである。さらに、本発明のペプチドは、天然のタンパク質由来のアミノ酸配列を改変することによってタンパク質分解を受けにくく、投与した対象の体内において高い安定性および長い半減期を有する。
本発明のペプチドは、イミュノグロブリン結合能を有するものである。かかるペプチドは、配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列またはｄＰｒｏ Ｇｌｙ ｄＬｅｕ ｄＴｙｒ ｄＴｙｒ ｄＰｈｅで表されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよく、上記アミノ酸配列の内部、Ｎ末端および／またはＣ末端において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド（変異ペプチド）、および上記アミノ酸配列と例えば、２６．６％以上または４４．４％以上、好ましくは、少なくとも５０％以上、より好ましくは、例えば、６０、６６．７、７０、７５、８０、８３．３、８５、９０、９３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。なお、本明細書において、「ｄＬ（ｄＬｅｕ）」、「ｄＰ（ｄＰｒｏ）」、「ｄＡ（ｄＡｌａ）」、「ｄＹ（ｄＴｙｒ）」および「ｄＦ（ｄＰｈｅ）」、「ｄＳ（ｄＳｅｒ）」、「ｄＫ(ｄＬｙｓ)」、「ｄＶ（ｄＶａｌ）」、「ｄＴ（ｄＴｈｒ）」、「ｄＨ（ｄＨｉｓ）」は、それぞれロイシン、プロリン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、リシン、バリン、トレオニン、ヒスチジンのＤ体を表す。さらに、アミノ酸配列の相同性は、短鎖ペプチドの場合、単純に配列を比較し計算することもできる。あるいは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。さらに、これらのアミノ酸のいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のペプチドはイミュノグロブリン結合能を有するものである。
本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、本発明のペプチドは、配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列またはｄＰｒｏ Ｇｌｙ ｄＬｅｕ ｄＴｙｒ ｄＴｙｒ ｄＰｈｅで表されるアミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列またはその相同配列をコア配列として含み、かつかかるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、ペプチドまたはアミノ酸、それらのアナログ、ポリエチレングリコール、糖、多糖、ヌクレオチドなどの種々の物質の結合したものであってもよい。Ｎ／Ｃ末端にアミノ酸またはペプチドを介して、あるいは利用可能な官能基を用いてアミノ酸配列の内部に、蛍光標識、ビオチン、ストレプトアビジン、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、金コロイドなどの物質が結合していてもよい。例えば、ペプチドが結合する場合、かかるペプチドは、１個〜５０個、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜９個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、かかるペプチドが、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＥタグとしての機能などの機能を有するものであってもよい。
本発明のペプチドは、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づき遺伝子工学的に製造するか、またはペプチド固相合成法などに従って化学的に合成してもよく、あるいはそれらを組み合わせて製造および取得してもよい。本発明のペプチドは、上述の通りイミュノグロブリン結合能を有するので、かかるペプチドを用いてイミュノグロブリンを結合させ、イミュノグロブリンの存在または量を決定すること、イミュノグロブリンを単離することなどが可能である。
本発明は、もう１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列またはその相同配列を有するペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｄ）前記（ｂ）または（ｃ）の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し得る核酸、
（ｅ）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸に関するものである。本明細書において核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明の核酸は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得され得る。本発明において、配列番号３３〜３７のヌクレオチド配列は、配列番号２８〜３２のアミノ酸配列をそれぞれコードするものである。
本発明の核酸は、具体的には、（１）配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸、（２）配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸、（３）配列番号２８〜３２のいずれかのアミノ酸配列と例えば、２６．６％以上または４４．４％以上、好ましくは、少なくとも５０％以上、より好ましくは、例えば、６０、６６．７、７０、７５、８０、８３．３、８５、９０、または９３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸、（４）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、（５）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、（６）前記（３）または（４）のいずれかの核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し得る核酸、および（７）配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも５０％以上、好ましくは、例えば、６０、７０、７５、８０、９０、９３、９５、または９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸などである。さらに、これらのヌクレオチドのいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのヌクレオチド配列を有する場合であっても、本発明の核酸は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードし得るものである。
上記ストリンジェントな条件としては、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリッド形成させた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回の条件、または６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回の条件などである。
上記ヌクレオチド配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。
本発明の核酸は、上記ヌクレオチド配列を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、配列番号３３〜３７のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸そのものであってもよく、上記ヌクレオチド配列をコア配列として含み、かつかかる配列の５’末端および／または３’末端に、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのアナログなどの種々の物質が結合したものであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドが結合する場合、かかるポリヌクレオチドは、１〜１５０個、例えば、１〜６０個、１〜４５個、１〜１８個のヌクレオチドからなるものであってもよい。
本発明は、さらなる態様において、上記核酸を含むベクターに関するものである。本発明のベクターは、上記核酸を含んでいればいずれのものであってもよい。ベクターの種類、上記核酸のヌクレオチド配列以外の配列などは、ベクターを導入する宿主の種類、目的などの種々の条件に応じて適宜選択され得る。本発明のベクターは、例えば、配列番号３３〜３７のいずれかで示すヌクレオチド配列の５’末端または３’末端にインフレームで目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した融合タンパク質の発現用ベクターとして用いることもできる。融合タンパク質からの目的のタンパク質の単離を容易にするために、本発明のベクターは、上記ヌクレオチド配列と目的のタンパク質のヌクレオチド配列挿入部の間に例えば、ＨＲＶ ３Ｃ、トロンビン、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、エンテロキナーゼなどのプロテーゼにより認識される配列を含んでいてもよい。本発明のベクターを細胞に導入し、タンパク質を産生させることにより、上記本発明のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを得てもよい。
本発明は、別の態様において、本発明のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質に関するものである。本発明の融合タンパク質は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。本発明の融合タンパク質はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含むものであるので、かかるペプチドをタグ配列として用い、目的のタンパク質を単離および／または精製することなどが可能になる。また、上述の通り、本発明のペプチドはイミュノグロブリンとの結合能が低いので、本発明の融合タンパク質は、例えば、精製用カラムに固定された場合、Protein AまたはProtein Gと比較して、マイルドな条件下でのイミュノグロブリンの精製およびかかるカラムの繰り返し使用（劣化が抑えられる）を可能にし、例えば、イミュノグロブリンの検出用プローブとして用いた場合、リプローブが容易であるなどの利点を有する。
本発明の融合タンパク質に含まれる目的のタンパク質は、いずれのタンパク質であってもよい。本発明の融合タンパク質が、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシデース（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼおよびグリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などの酵素を目的のタンパク質として含む場合、本発明の融合タンパク質に含まれるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドとイミュノグロブリンとの結合を検出することなどが容易になる。本発明の融合タンパク質はまた、例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＥタグなどのタグ配列、核移行シグナル、シリカ結合タンパク質、またはProtein Aなどを含んでいてもよい。
本発明の融合タンパク質は、本発明のペプチドと目的のタンパク質との間にプロテアーゼにより認識されるペプチドを含んでいてもよい。かかるペプチドを含むことにより、融合タンパク質から目的のタンパク質を容易に単離することができる。
従って、本発明は、さらなる態様において、上記融合タンパク質をコードする核酸に関するものである。
さらに、本発明は、上記融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに関するものである。かかるベクターを細胞に導入し、タンパク質を産生させることにより、本発明の融合タンパク質を得てもよい。
本発明は、１つの態様において、上記イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸、上記融合タンパク質をコードする核酸、またはそれらの核酸を含むベクターを含む細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記核酸またはベクターを用いて形質転換することにより製造することができる。本発明の細胞を培養し、産生されたイミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含む融合タンパク質を回収することにより、本発明のペプチドまたは融合タンパク質を製造することもできる。
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む方法に関するものである。細胞の形質転換は、当業者に既知の手段および／または方法により行われ得る。
従って、本発明は、上記ペプチドの製造方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドに関するものである。
本発明は、別の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
工程を含む方法に関するものである。本発明の融合タンパク質の製造方法は、融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含んでいてもよい。
従って、本発明は、上記融合タンパク質の製造方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質に関するものである。
本発明は、１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物に関するものである。上記ペプチドまたは融合タンパク質以外の成分は、本発明の組成物が用いられる目的など種々の条件に応じて適宜選択され得る。上述の通り、本発明の組成物はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含むものであるので、本発明の組成物は、例えば、イミュノグロブリンの存在または量を決定するための組成物であってもよく、イミュノグロブリンを単離するための組成物であってもよい。本発明の組成物により、試料中のイミュノグロブリンの量を決定すること、試料からイミュノグロブリンを単離することなどが可能になる。
本発明は、もう１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段に関するものである。本発明の手段は、例えば、プレート、樹脂、カラム、ビーズ、アガロースまたはセファロースなどの糖を含むレジン、シリカ基板、ガラス（スライドガラスなど）、金属（金など）、アパタイトなどの担体に上記ペプチドまたは融合タンパク質が固定されたものである。固定化は、ペプチド、またはタンパク質のアミノ基若しくはカルボキシル基を介した方法、アミノ酸側鎖のＳＨ基を介した方法、イオン的な結合による方法、疎水的な結合による方法などの当業者に既知の手段・方法により行われ得る。
上述の通り、本発明の手段はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドが固定化されたものであるので、本発明の手段は、イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するための手段、およびイミュノグロブリンを単離するための手段を含むものである。本発明の手段を、例えば、ＥＬＩＳＡ用プレート、イミュノグロブリン精製用カラム、検出用ガラスアレイ、マイクロ流路系、ＳＰＲ用センサーチップ、検出用シリカ基板、抗体医薬品精製システムなどとして用いることもできる。
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む方法に関するものである。試料は、イミュノグロブリンが含まれている可能性があればいずれのものであってもよい。イミュノグロブリンとの結合体の存在および／または量を調べることにより、試料中にイミュノグロブリンが存在するかどうか、さらには、試料中に存在するイミュノグロブリンの量を決定することなどが可能になる。本発明の方法に用いるペプチドまたは融合タンパク質は標識されたものであってもよい。標識としては、ビオチン化、蛍光標識、ＲＩ標識、酵素標識など当業者に既知の種々のものが挙げられる。かかる標識を付すことにより、ペプチドまたは融合タンパク質との結合体を調べることが容易になる。さらに、本発明の方法は、結合体からイミュノグロブリンを単離する工程を含んでいてもよい。
従って、本発明は、イミュノグロブリンを結合させる方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキットに関するものである。本発明のキットには、上記ペプチドまたは融合タンパク質の他、例えば、標識、結合体を調べる手段などが含まれ得る。
本発明は、別の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物に関するものである。Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患とは、かかる結合により直接的または間接的に生じる疾患をいい、例えば、関節リウマチ、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎症群、腎炎などの免疫複合体病、その他の炎症性疾患、感染症、および悪性腫瘍などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、含まれるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドがＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、上記疾患を治療および予防することができる。なお、本発明のペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するものであって、かつ６〜１５残基と短いので、本発明のペプチドをヒトに投与することで生じる副作用は少ない。さらに、本発明のペプチドは、天然のタンパク質由来のアミノ酸配列を改変することによってタンパク質分解を受けにくく、投与した対象の体内において高い安定性および長い半減期を有する。
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、および／または標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与頻度などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択でき、例えば、１回あたりのペプチド投与量を０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇとしてもよいが、本発明のペプチドの投与量はこれらに限定されるものではない。
本発明は、さらなる態様において、有効量のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を対象に投与することを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防方法に関するものである。
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
イミュノグロブリンが認識するＣ１ｑ中のアミノ酸配列の同定
材料および方法
ヒトＣ１ｑのサブユニットＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に、ヌクレオチド配列を配列番号２０〜２２に示す。それぞれのアミノ酸配列をもとにして、各サブユニットのアミノ酸配列を１５アミノ酸（残基）ずつ３アミノ酸の間隔でずらした配列を合成ペプチド（順に、ペプチド番号１〜７８、９７〜１１７、１９３〜２７０番）としてガラスアレイ上に合成した。それぞれのペプチドの合成はアレイ上の特定の位置で行い、Ｃ１ｑのサブユニットの全アミノ酸配列を網羅する合成ペプチドを含むペプチドアレイを作製した。尚、アレイの作製はＪＰＴ社に委託して行った。
ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１，０００倍希釈したＣｙ３標識ヤギ抗マウスイミュノグロブリン（ＩｇＧ）（１ｍｇ／ｍｌ；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３３０μｌをペプチドアレイ上に塗布し、シールをした後、４℃で１２時間インキュベートした。その後メタノール１回、Ｍｉｌｉ−Ｑ水で５分間×５回洗浄した。遠心してアレイスライドを乾燥させ、蛍光スキャナー（Agilent DNAマイクロアレイスキャナ；アジレント社製）で、スキャンし、ソフトウェア（Feature Extractionソフトウェア；アジレント社製）を用いてアレイ上のそれぞれのペプチドスポットの蛍光強度を数値化した。強い蛍光強度を示すいくつかのスポットを検出した。このうち、バックグラウンドレベルより６０，０００以上高い蛍光強度を示すペプチドスポットのアミノ酸配列（配列番号３〜７）を表１に示す。なお、本明細書において、アミノ酸は当該分野において知られた１文字表記により記載している。
Figure 0004705694
結果
１４９番および１５０番のペプチドはＣ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）由来の配列であり、２４４〜２４６番のペプチドはＣ１ｑＣサブユニット（Ｃ鎖）由来の配列である。これらの配列から、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンの結合に必須な配列はＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基をコアにした配列であると予測した。またこのコア配列を含む配列であればそのＮ末端若しくはＣ末端側に数残基のアミノ酸が結合していてもイミュノグロブリンとの結合が妨げられないことも確認した。１４９番および１５０番、２４４〜２４６番のペプチドのヌクレオチド配列を配列番号１２〜１６に示す。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドによるイミュノグロブリンとＣ１ｑの結合の阻害
阻害活性の検討（１）
材料および方法
Ｃ１ｑとイミュノグロブリン（ＩｇＧ）の結合に必須と考えられるＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基のペプチドが、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｒ２）、かかるペプチドより短いアミノ酸配列ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）を有するペプチド（Ｒ１）、ならびに配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列ＳＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦＴ（配列番号３）を有するペプチド（Ｒ３）、アミノ酸配列ＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦＴＹＨＡ（配列番号４）を有するペプチド（Ｒ４）、アミノ酸配列ＳＴＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号５）を有するペプチド（Ｒ５）、およびアミノ酸配列ＣＫＶＰＧＬＹＹＦＶＹＨＡＳＨ（配列番号７）を有するペプチド（Ｒ６）をＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。これらのペプチドを表２に示す。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようＤＭＳＯに溶解し、保存した。
Figure 0004705694
ヒトＣ１ｑタンパク質（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０％ グリセロール（ｐＨ７．２）に溶解し、２００μｇ／ｍｌ ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を５ｍｍ×１５ｍｍの大きさのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ；アマシャム社製）に２μｌ（４００ｎｇ）ずつスポットし、室温にて約１時間風乾した。ニトロセルロース膜をＴＢＳに浸し、５分間インキュベートし、５％ブロッキング剤（Amersham ECL blocking reagent；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて室温にて１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳにて軽く洗浄した後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）（BECKMAN COULTER社製）をＴＢＳにて１０００倍希釈し、各ペプチドの濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように混合した溶液２０μｌに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＴＢＳ溶液（ＴＢＳに最終濃度０．０５％で Ｔｗｅｅｎ ２０を加えたもの）にて軽く洗浄した後、同液にて１０分間、３回振盪しながら洗浄した。
ＡＬＰ標識イミュノグロブリン（ＩｇＧ）を用いた検出方法
ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて染色像の取り込みを行った。
結果
結果を図１に示す。Ｃ１ｑとイミュノグロブリン（ＩｇＧ）との結合に必須と思われる９アミノ酸を有するペプチドＲ２およびかかるペプチドをコア配列として有するペプチド（ペプチドＲ３〜６）によって結合が阻害されているだけでなく、より短いアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチドＲ１）によっても結合が阻害されたことから、イミュノグロブリンとＣ１ｑの結合にはＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）の６残基のアミノ酸をコアとする配列が重要であることがわかった。また、これらのペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、この結合により引き起こされる疾患を治療または予防できる可能性があることが分かった。
阻害活性の検討（２）
材料および方法
実施例２の阻害活性の検討（１）にて示すペプチド以外にも、その変異ペプチドについて、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。表３に示すペプチドをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようＤＭＳＯに溶解し、保存した。なお、実験は実施例２の阻害活性の検討（１）と同様の方法で行い、対照としてペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５についても試験を行った。
Figure 0004705694
結果
結果を図２に示す。特定のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を十分に阻害した。従って、これらの変異ペプチドあるいはそれらをコアとして含むペプチドも、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、この結合により引き起こされる疾患を治療または予防できる可能性があることが分かった。
阻害活性の検討（３）
材料および方法
実施例１（２）に続き、さらなる変異ペプチドについて、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。表４に示すペプチドをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。これらのペプチドは、特定のアミノ酸残基を対応するＤ−アミノ酸に置換するか、またはアミノ酸配列中のシステイン残基をセリン残基に置換することによってペプチド安定性を向上させている。すなわち、これらのペプチドはより長い半減期を有しており、対象体内での治療または予防効果が長期にわたって持続するように設計されている。各ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようＤＭＳＯに溶解し、保存した。なお、実験は実施例２の阻害活性の検討（１）と同様の方法で行い、対照としてペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５を用いた。
Figure 0004705694
結果
結果を図３に示す。表中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。特定のアミノ酸を対応するＤ−アミノ酸（Ｒ１２およびＲ１３）、およびセリン残基をシステイン残基に置換したペプチド（Ｒ１４〜１８）はそれぞれ、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害した。
阻害活性の検討（４）
材料および方法
さらなる変異ペプチドについて、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。表５に示すペプチドをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。これらのペプチドは、アミノ酸残基を対応するＤ−アミノ酸に置換し、かつアミノ酸配列中のシステイン残基をセリン残基に置換することによってペプチド安定性を向上させている。すなわち、これらのペプチドはより長い半減期を有しており、対象体内での治療または予防効果が長期にわたって持続するように設計されている。各ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようＤＭＳＯに溶解し、保存した。なお、実験は実施例２の阻害活性の検討（１）と同様の方法で行い、対照としてペプチドＲ１、Ｒ５およびＲ１３を用いた。
Figure 0004705694
結果
結果を図４に示す。表中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。アミノ酸残基を対応するＤ−アミノ酸に置換し、かつアミノ酸配列中のシステイン残基をセリン残基に置換したペプチド（Ｒ１９〜２２）は、それぞれＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害した。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用の検証
（１）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−１
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウス（ＢＡＬＢ／ｃ Ｃｒ Ｓｌｃ （ＳＰＦ））を用い、実施例２にてＲ５として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、その３日後にＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）を５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。ペプチドＲ５を、ＬＰＳ投与翌日（４日目）より１４日目まで、１日１回あるいは１日２回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。陽性対照薬のメトトレキサートを、４日目より１日１回、０．１ｍｇ／ｋｇで経口投与した。０日目より１４日目までの偶数日に四肢の臨床スコアを測定した。麻酔下にてヘパリン含有生理食塩液で脱血を行い、氷冷４％パラホルムアルデヒド液を持続注入して全身灌流固定した。灌流固定後、両後肢の膝関節（大腿骨中心部および脛骨中心部を切断し、皮膚および筋肉を除去）および踵関節（脛骨中心部から指先まで）を摘出し、さらに４％パラホルムアルデヒド液で一晩浸漬固定（４℃）した。その後、両膝および両踵関節を５０ｍＭ ＰＢＳ（４℃）に移した後、踵関節の軟Ｘ線写真撮影を２方向（内側面方向および上面方向）から行った。
ペプチド溶液の調製
ペプチドについて、動物の体重を基に必要量を算出した。ペプチドを０．５％メチルセルロース溶液で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、調製したペプチド溶液を冷蔵保存した。
メトトレキサート溶液の調製
メトトレキサートを、１ｍｇ秤量してメノウ乳鉢に入れ、乳棒で粉砕した後に０．５％メチルセルロース溶液を徐々に加えて懸濁し、０．０１ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。その後、調製物を冷蔵保存した。
体重測定、一般症状観察および群分け
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は、毎日実施した。
関節炎モデルの作製
０日目に７週齢のマウス２０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
ペプチド溶液の投与
ペプチド溶液は、４日目より１日１回（午前）あるいは１日２回（午前および午後）１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。対照として、４日目より０．５％メチルセルロース溶液を１日１回（午前）腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ；テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量；テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。メトトレキサートは、４日目より１日１回（午前）０．１ｍｇ／ｋｇ経口投与した。投与には経口ゾンデ（マウス用経口ゾンデ；フチガミ器械店）および注射筒（１．０ｍｌ容量；テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
臨床スコア観察
臨床スコアの観察は、０日目より１４日目までの偶数日に以下に従って観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し、ＥＸＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１．６；株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。
結果
結果を図５に示す。１日１回投与と１日２回投与の間でペプチドＲ５の有効性に有意な差異は観察されなかったが、関節炎抑制に対する効果は認められた。また、関節炎抑制の強度は、メトトレキサートよりも強いものであった。この結果から、本発明のペプチドは、臨床において既に用いられている医薬品より優れた関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。
なお、メトトレキサートは微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、副作用は一切認められなかった。従って、本発明の使用は、従来用いられている医薬品と比べて有利である。
（２）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−２
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用い、実施例２にてＲ１、Ｒ２およびＲ５として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、その３日後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。各ペプチドは、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日（０日目）より、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇを１日２回、１４日間連続投与を行い、関節炎抑制作用を臨床スコアにより検討した。なお、実験は、実施例３（１）と同様の方法で行った。
ペプチド溶液の調製
各ペプチドは、動物の体重を基に必要量を算出した。０．５％メチルセルロース溶液で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、冷蔵保存した。
体重測定および一般状態観察
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は毎日実施した。
関節炎モデルの作製および群分け
投与開始前日に体重を測定し、群分けソフトにより各群の平均体重値がほぼ等しくなるように無作為に割り付けた。０日目に、７週齢のマウス２０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
ペプチド溶液の投与
各ペプチド溶液を、０日目より、午前および午後の１日２回、腹腔内投与した。対照として、０日目より、０．５％メチルセルロース溶液を１日２回、腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ；テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量；テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
臨床スコア観察
関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、１４日目までの偶数日に、全例の四肢の臨床スコアを以下に従い観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し、ＥＸＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１．６；株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。
結果
結果を図６、図７および図８に示す。Ｒ１、Ｒ２またはＲ５を１０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与した全ての群において関節炎抑制作用が認められた。従って、本発明のペプチドは、関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。また、一般症状の異常および体重に対する作用は、用いたペプチドのいずれにおいても認められなかった。
また、マウスを用いた試験において、本発明のペプチドは毒性影響を示さなかった。さらに、本発明のペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するものであって、かつ６〜１５残基と短いので、本発明のペプチドを用いることで治療または予防に伴う副作用を低減させることが期待できる。
（３）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−３
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用い、実施例２（３）にてＲ１３およびＲ１７として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、その３日後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。各ペプチドは、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与から４日後より、それぞれを１日１回、１０日間連続で腹腔内または静脈内投与を行い、関節炎抑制作用を臨床スコアおよび後肢容積測定により検討した。
ペプチド溶液の調製
各ペプチドは、動物の体重を基に必要量を算出した。生理食塩水を用いて調製し（Ｒ１ ０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２ １ｍｇ／ｍｌ、ならびにＲ１３およびＲ１７ １ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌ）、冷蔵保存した。
体重測定および一般状態観察
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は毎日実施した。
関節炎モデルの作製および群分け
投与開始前日に体重を測定し、群分けソフトにより各群の平均体重値がほぼ等しくなるように無作為に割り付けた。０日目に、７週齢のマウス５５匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、３日目後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
ペプチド溶液の投与
各ペプチド溶液を、４日目より、１日１回腹腔内または静脈内投与した。同様に、陰性対照として生理食塩水、および陽性対照としてメトトレキサート（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を、４日目より、１日１回腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ；テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量；テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
臨床スコア観察
関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、１４日目までの偶数日に、全例の四肢の臨床スコアを以下に従い観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し、ＥＸＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１．６；株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。体重および足容積などの定量的データは、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検定を行い、分散が均一であればＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行い、分散が不均一であればＳｔｅｅｌの多重比較検定を行った。
結果
結果を図９および図１０に示す。図９の臨床スコアでは、Ｒ１３またはＲ１７を１日１回投与（Ｒ１３について腹腔内、Ｒ１７について静脈内）した全ての群において、Ｒ１およびＲ２を投与した場合（Ｒ１について静脈内、Ｒ２について腹腔内）と同程度の関節炎抑制作用が示されており、メトトレキサートを投与した場合と比較しても、同程度またはそれ以上の作用であった。また、図１０の後肢容積測定の結果から、本願発明のペプチドは、Ｒ１およびＲ２、さらにメトトレキサートと同程度またはそれ以上に関節炎による患部の腫れを抑制していることが理解される。従って、本発明のペプチドは、関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。
なお、メトトレキサートは微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、副作用は一切認められなかった。従って、本発明の使用は、従来用いられている医薬品と比べて有利である。
（４）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−４
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用い、実施例２（３）にてＲ１３として、実施例２（４）にてＲ１９およびＲ２１としてそれぞれ示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、その３日後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。各ペプチドは、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与から４日後より、それぞれを１日１回、１０日間連続で腹腔内投与を行い、関節炎抑制作用を臨床スコアおよび後肢容積測定により検討した。
ペプチド溶液の調製
各ペプチドは、動物の体重を基に必要量を算出した。生理食塩水を用いて調製し（１０ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌ）、冷蔵保存した。
体重測定および一般状態観察
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は毎日実施した。
関節炎モデルの作製および群分け
投与開始前日に体重を測定し、群分けソフトにより各群の平均体重値がほぼ等しくなるように無作為に割り付けた。０日目に、７週齢のマウス４０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、３日目後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
ペプチド溶液の投与
各ペプチド溶液を、４日目より、１日１回腹腔内投与した。同様に、陰性対照として生理食塩水、および陽性対照としてメトトレキサート（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、４日目より、１日１回腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ；テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量；テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇとした。
臨床スコア観察
関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、１４日目までの偶数日に、全例の四肢の臨床スコアを以下に従い観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し、ＥＸＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１．６；株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。体重および足容積などの定量的データは、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検定を行い、分散が均一であればＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行い、分散が不均一であればＳｔｅｅｌの多重比較検定を行った。
結果
結果を図１１、１２および１３に示す。ペプチドＲ１３を１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した場合、メトトレキサートと同程度のまたはそれ以上の関節炎抑制作用が確認された。また、ペプチドＲ１９および２１を１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した場合についても、メトトレキサートと同程度のまたはそれ以上の関節炎抑制作用が確認された。従って、本発明のペプチドは、関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。
なお、メトトレキサートは微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、副作用は一切認められなかった。従って、本発明の使用は、従来用いられている医薬品と比べて有利である。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの免疫複合体病抑制作用の検証
（１）ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットにおけるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの免疫複合体病抑制作用−１
材料および方法
７週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系ラットの雄６４匹を用いて、ペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５について、投与方法（腹腔内投与と尾静脈内投与）ごとに２回に分けて試験を行った。馴化は、固形通常飼料ＣＲＦ−１を与えて９日以上行った。投与前日に動物の背部を剪毛し、投与当日、ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を尾静脈内投与した。腹腔内投与する際はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する際は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与する際は被験物質投与３０分後に、静脈内投与する際は１０分後に、動物の背部に０．１ｍｌ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。惹起４時間後、動物を安楽死させ十分に脱血した後に、背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位を打ち抜き、その皮膚よりエバンスブルー色素を一晩かけて抽出した。漏出色素量は、分光光度計でエバンスブルー色素に関する吸光度を測定し、検量線を用いて定量化した（なお、実施例４にて用いた実験方法については、H. Okamoto, Y. Iwahisa and M. Terasawa : Suppression of the Arthus reaction by Y-24180, a potent and specific antagonist of platelet-activating factor. Agents Actions, 35 : 149-158 (1992)を参照のこと）。
この実験において用いた各ペプチド溶液を以下に示す：
＜陰性対照物質＞
生理食塩液
＜ペプチド溶液＞
所定量秤量した各ペプチド（ペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５）を生理食塩液にて溶解し、２０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。２ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、２０ｍｇ／ｍＬ溶液を生理食塩液で１０倍希釈して調製した。５ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、所定量秤量した各ペプチドを生理食塩液に溶解して調製液とした。
アルサス反応
ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を２ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。腹腔内投与する場合はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する場合は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与の場合は被験物質投与３０分後に、静脈内投与の場合は１０分後に、動物の背部に０．１ｍＬ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。皮内投与は動物１匹に対して、ＰＢＳ２ヵ所、抗ＯＶＡ溶液２ヵ所とした。惹起４時間後に、動物をエーテル麻酔下の断頭により安楽死させ、十分に脱血させた後に背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位をポンチで打ち抜き、色素抽出に使用した。
色素抽出および測定
ポンチで打ち抜いた皮膚片短冊上に数ヶ所の切れ込みをいれ、２ｍｌの色素抽出液中に浸漬して１０分間振とう攪拌した。その後、室温で一晩静置した。一晩静置した後、再度１０分間振とう攪拌し、遠心分離（１５００ｒｐｍ，１５分）を行い、その上清を色素測定用試料とした。測定にはＵＶ−１６００（株式会社島津製作所）を使用し、ＯＤ６２０ｎｍの波長で測定した。漏出色素量は、色素量標準曲線から算出した。
データの処理および統計処理
体重測定値および漏出色素量について、群平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を算出した。漏出色素量については、抗ＯＶＡ溶液投与２ヵ所の平均値からＰＢＳ投与２ヵ所の平均値を差し引いたものを各動物の値とした。漏出色素量について以下の統計解析を行った。１回目の試験（各ペプチド溶液の腹腔内投与）では、第１群対第２、３群、第１群対第４、５群、第１群対第６、７群のそれぞれについてＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第１群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。２回目の試験（各ペプチド溶液の尾静脈内投与）では、第９群対第１０、１１、１２群の間でＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第９群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。有意水準はＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定では５％、その他の検定では両側５％とした。
結果
各ペプチド溶液の腹腔内投与の結果を図１４、尾静脈内投与の結果を図１５にてそれぞれ示す。この実施例において用いたＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応モデル系において、対照と比較して３０％程度のエバンスブルー漏出量の減少が認められており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の抑制に有効であると考えられる。ペプチド溶液の腹腔内投与において、ペプチドＲ１、Ｒ２、Ｒ５の全てにおいて明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用が認められた。また、尾静脈投与において、ペプチドＲ１、Ｒ２で明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用が認められた。従って、本発明のペプチドは、明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用を有しており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の処置および予防に有用であることが明らかになった。
（２）ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットにおけるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの免疫複合体病抑制作用−２
材料および方法
７週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系ラットの雄４５匹を用いて、ペプチドＲ１３およびＲ１９について、投与方法（腹腔内投与と尾静脈内投与）ごとに２回に分けて試験を行った。馴化は、固形通常飼料ＣＲＦ−１を与えて６日または８日行った。投与前日に動物の背部を剪毛し、投与当日、ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を尾静脈内投与した。腹腔内投与する際はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する際は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与する際は被験物質投与３０分後に、静脈内投与する際は１０分後に、動物の背部に０．１ｍｌ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。惹起４時間後、動物を安楽死させ十分に脱血した後に、背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位を打ち抜き、その皮膚よりエバンスブルー色素を一晩かけて抽出した。漏出色素量は、分光光度計でエバンスブルー色素に関する吸光度を測定し、検量線を用いて定量化した。
この実験において用いた各ペプチド溶液を以下に示す：
＜陰性対照物質＞
生理食塩液
＜陽性対照物質投与液＞
所定量秤量したヒドロコルチゾンを乳鉢に入れて乳棒で破砕した後、最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩液を加えて懸濁液を調製する。
＜ペプチド溶液＞
所定量秤量した各ペプチド（ペプチドＲ１３およびＲ１９）を生理食塩液にて溶解し、２０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。２ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、２０ｍｇ／ｍＬ溶液を生理食塩液で１０倍希釈して調製した。５ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、所定量秤量した各ペプチドを生理食塩液に溶解して調製液とした。
アルサス反応
ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を２ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。腹腔内投与する場合はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する場合は５０分後に、各ペプチド溶液を投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与の場合は被験物質投与３０分後に、静脈内投与の場合は１０分後に、動物の背部に０．１ｍＬ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。皮内投与は動物１匹に対して、ＰＢＳ２ヵ所、抗ＯＶＡ溶液２ヵ所とした。惹起４時間後に、動物をエーテル麻酔下の断頭により安楽死させ、十分に脱血させた後に背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位をポンチで打ち抜き、色素抽出に使用した。
色素抽出および測定
ポンチで打ち抜いた皮膚片短冊上に数ヶ所の切れ込みをいれ、２ｍｌの色素抽出液中に浸漬して１０分間振とう攪拌した。その後、室温で一晩静置した。一晩静置した後、再度１０分間振とう攪拌し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１５分）を行い、その上清を色素測定用試料とした。測定にはＵＶ−１６００（株式会社島津製作所）を使用し、ＯＤ６２０ｎｍの波長で測定した。漏出色素量は、色素量標準曲線から算出した。
データの処理および統計処理
体重測定値および漏出色素量について、群平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を算出した。漏出色素量については、抗ＯＶＡ溶液投与２ヵ所の平均値からＰＢＳ投与２ヵ所の平均値を差し引いたものを各動物の値とした。漏出色素量について以下の統計解析を行った。１回目（被験物質の腹腔内投与）試験では、第１、２、３群、第１、４、５群のそれぞれについてＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第１群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。第1群と第６群の間ではF検定を行い、分散に違いがなければＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で、分散に違いがあればＡｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定で２群間の平均値の差を検定した。２回目（被験物質の尾静脈内投与）試験では、第７、８、９群の間でＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第７群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。有意水準はＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定では５％、その他の検定では両側５％とした。
結果
各ペプチド溶液の腹腔内投与の結果を図１６、尾静脈内投与の結果を図１７にてそれぞれ示す。腹腔内投与試験ではペプチドＲ１３、１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ投与両群において、陰性対照物質投与群と比較して有意な抑制効果が認められた。特に１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、非常に有意な抑制効果（約６０％の抑制）を認め、これは陽性対象物質ヒドロコルチゾン５０ｍｇ／ｋｇを投与した場合よりも強い抑制効果であった。ペプチドＲ１９投与群は、１０ｍｇ／ｋｇ投与群にて、陰性対照物質投与群と比較して２５〜３０％の低値を示し、抑制効果を認めた。また、１００ｍｇ／ｋｇ投与群では約５０％の抑制効果を認め、陽性対照物質と同様の抑制効果を認めた。２回目の尾静脈投与試験では、ペプチドＲ１３投与群では、約７０％の抑制効果を認め、陰性対照物質投与群と比較して非常に有意な抑制効果であった。またペプチドＲ１９投与群でも、陰性対照物質投与群と比較して約５０％の抑制効果を認めた。この結果は、同配列、Ｌ体で合成したペプチドと比較して、非常に有意な抑制効果であった。Ｄ体ペプチドにすることにより、より強い効果で、明確且つ十分なＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応の抑制効果を示すことが実証され、またこの結果より本ペプチドは糸球体腎炎、ＳＬＥ、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の処置および予防に有用であることが明らかになった。なお、ヒドロコルチゾンはステロイド医薬に分類され、微量の微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、副作用は一切認められなかった。従って、本発明の使用は、従来用いられている医薬品と比べて非常に有利である。
ラットコラーゲン関節炎モデルに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用
ラットコラーゲン関節炎モデルを用い、ペプチドＲ１３として示すペプチドの関節炎抑制効果を検討した。
ウシ由来タイプＩＩコラーゲン５００μｇをルイス系雌性ラットに免疫し、初回免疫後７日目及び１４日目に同コラーゲン１００μｇを追加免疫することにより、コラーゲン関節炎を誘発した。Ｒ１３ペプチド、スクランブルペプチド（ｄＹｄＰｄＹＧｄＦｄＬ）またはメトトレキサートを、関節炎が完全に発症した１２日後より、２５日間１日１回、連続投与を行い、関節炎抑制効果を臨床スコアにより検討した。対照薬として、メトトレキサート、０．１５ｍｇ／ｋｇを投与した。
ペプチド溶液の調製方法
各ペプチドは、動物の体重を基に必要量を算出した。生理食塩水を徐々に加えて懸濁し、１００ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。
臨床スコア観察
ウシ由来タイプＩＩコラーゲンを初回免疫した日を０日目とし、関節炎を発症させた１２日目より、３６日目までの３の倍数日に、全例の四肢の臨床スコアを以下に従い観察した。四肢の合計で最大１６スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 変化なし
１： 足根関節部あるいは足背足裏の軽度な紅斑および腫脹あるいは2本までの指の紅斑および腫脹
２： 足根関節部あるいは足背足裏の紅斑および腫脹あるいは3本以上の指の紅斑および腫脹
３： 足全体の腫脹・紅斑
４： 最大強度の足全体の腫脹・紅斑
結果
図１８に示すように、Ｒ１３ペプチドを１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇで１日１回投与した群は、関節炎抑制効果が見られた。特に、Ｒ１３ペプチドを１００ｍｇ／ｋｇ投与した群では、メトトレキサートを投与した場合以上の抑制効果が見られた。一方で、スクランブルペプチドでは抑制効果は見られなかった。したがって、本発明のペプチドは関節炎抑制効果を有しており、関節炎および関連する疾患の処置及び予防に有用であることが明らかになった。また、一般症状の異常および体重に対する作用は、用いたペプチドいずれにおいても認められなかった。組織学的所見においても、破壊関節部位でのペプチド投与によるＴＮＦの発現の有意な低下も認め、破骨細胞誘導についても抑制していることが判明した。なお、メトトレキサートは微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、副作用は一切認められなかった。従って、本発明の使用は、従来用いられている医薬品と比べて有利である。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体検出薬の検討
材料および方法
ウェスタンブロット法において、２次抗体の代わりにビオチン化ペプチドを用いて１次抗体を検出できるか検討した。ペプチドＲ５をビオチン化したものをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。
ＢＳＡを１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動し、ＰＶＤＦ膜へ転写した。転写したＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルクにてブロッキングした。Ａｎｔｉ−ＢＳＡ ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ）を２０００倍希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴにて３回洗浄した。ビオチン化ペプチドＲ５をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、その溶液１０ｕｌを１０ｍｌのＴＢＳＴに加え（１０００倍希釈）、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴにて３回洗浄した。ＶＥＣＴＯＲ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＡＢＣ ｋｉｔを用いて、発色を行なった。発色液には硫酸ニッケルとジアミノベンジジンを、基質には過酸化水素水を用いた。
結果
結果を図１９に示す。２次抗体の代わりにビオチン化した本発明のペプチドを用いることで、ＰＶＤＦ膜上の抗体が検出できた。従って、本発明のペプチドをビオチン化したものは、抗体の検出において有用であることが分かった。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体精製カラムの検討
材料および方法
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体精製カラムについて検討を行った。なお、対照として、Protein Aを用いた。
ペプチドカラムの作製
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １ｍｌをＰＤ−１０ Ｅｍｐｔｙ ｃｏｌｕｍｎに充填し、１ｍＭ ＨＣｌ １０ｍｌで洗浄し、ＰＢＳ １０ｍｌにて平衡化した。ペプチドＲ４ ５ｍｇをＰＢＳ １ｍｌに溶解し、カラムに添加し、室温にて４時間ローテートした。カラムをＰＢＳ ５ｍｌにて洗浄した後、１Ｍ グリシン１ｍｌを添加し、室温で２時間ローテートすることで未反応のＮＨＳをブロッキングした。１Ｍ グリシンを除去し、ＰＢＳ １０ｍｌにて洗浄して、平衡化した。
抗体の精製
アフィニティー精製用カラムに１ｍｇのａｎｔｉ−ＢＳＡ ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ）（抗ウシ血清アルブミンＩｇＧ（ウサギ））を加え、室温で２時間ローテートした。ＰＢＳ １５ｍｌにて洗浄した。０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）５ｍｌを加えて溶出し、１００ｕｌの１Ｍ Ｔｒｉｓが入ったマイクロチューブに１ｍｌずつ５回溶出した。溶出画分中のタンパク量をDC Protein Assay Kit（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて定量した。また、ヒトＩｇＧについても同様の吸着−溶出試験を行った。
結果
結果を図２０に示す。本発明のペプチドを用いたカラムにおいて、精製に用いたウサギ抗体のうち７０〜８０％を回収できた。この回収率は、対照のProtein Aよりも優れたものであった。また、本発明のペプチドを用いたアフィニティー精製用カラムは、ヒトＩｇＧの精製にも適用できることが分かった（図２１）。従って、本発明のペプチドを固定化した手段は、抗体精製において極めて有用であることが分かった。
本発明により、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸などが得られるので、イミュノグロブリンの検出、単離、精製、関節リウマチ、およびＳＬＥ、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病などのＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物の分野において利用可能である。
SEQ ID NO:1:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:2:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:3:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:4:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:5:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:6:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:7:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:23:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:24:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:25:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:26:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:27:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:28:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:29:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:30:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:31:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:32:Immunoglobulin binding peptide

Claims (13)

  1. イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、ｄＰｒｏ Ｇｌｙ ｄＬｅｕ ｄＴｙｒ ｄＴｙｒ ｄＰｈｅで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
  2. 請求項１記載のペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質。
  3. 請求項１記載のペプチド、または請求項２記載の融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物。
  4. イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、請求項３記載の組成物。
  5. 請求項１記載のペプチド、または請求項２記載の融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段。
  6. イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するためであるか、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、請求項５記載の手段。
  7. イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
    （ａ）請求項１記載のペプチド、または請求項２記載の融合タンパク質を試料に添加し、
    （ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
    を含む、方法。
  8. 請求項７記載の方法に用いるための、請求項１記載のペプチドまたは請求項２記載の融合タンパク質を含むキット。
  9. 請求項１記載のペプチド、または請求項２記載の融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物。
  10. 疾患が関節リウマチである、請求項９記載の医薬組成物。
  11. 疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、請求項９記載の医薬組成物。
  12. 標識されている請求項１記載のペプチド、または請求項２記載の融合タンパク質。
  13. 請求項１２記載の標識されているペプチドまたは融合タンパク質を試料中の抗体と反応させ、次いで抗体と結合した該ペプチドまたは融合タンパク質を検出することを特徴とする、試料中の抗体の検出方法。
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