JP4313433B2 - イミュノグロブリン結合能を有するペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸、製造方法、イミュノグロブリンを結合させるための組成物および手段に関するものである。本発明はまた、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などに関するものである。
Ｃ１ｑは補体タンパク質の１つであり、補体活性化経路において作用することが知られている。例えば、古典経路の活性化は、Ｃ１ｑがイミュノグロブリン分子のＦｃ部分に結合することにより引き起こされるとされている。
Ｃ１ｑが血中に多く存在する関節リウマチ（ＲＡ）患者は、将来関節破壊に陥ることが報告されている（非特許文献１）。上述のＣ１ｑによる活性化が関与していると考えられており、Ｃ１ｑとイミュノグロブリン分子との結合の阻害剤の開発が望まれている。
Ｃ１ｑとイミュノグロブリン分子との結合に、Ｃ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）のアルギニン残基が関与する可能性があると報告されている（非特許文献２）。しかしながら、この報告は、コンピューターによるシュミレーションにより予測されたものであり、実際のイミュノグロブリン結合部位は明確にされていなかった。また、かかる結合部位の詳細なアミノ酸配列も分かっていなかった。
イミュノグロブリンの精製において、Protein AまたはProtein Gのようなイミュノグロブリンに特異的に結合するタンパク質が用いられている。しかしながら、これらのタンパク質は、イミュノグロブリンとの結合力が強いため、一旦結合させた後、分離させるのに、強い酸性バッファーを用いるなどの厳しい条件を必要とする。そのため、イミュノグロブリンの立体構造が崩れやすく、親和性の高い抗体を精製することができなかった。
Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-73 Gaboriaud C et al., J Biol Chem. 2003 Nov 21; 278(47): 46974-82. Epub 2003 Sep 5
Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-73 Gaboriaud C et al., J Biol Chem. 2003 Nov 21; 278(47): 46974-82. Epub 2003 Sep 5
本発明の解決課題は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸、かかる核酸を含むベクターなどを提供することである。また、抗体の立体構造を破壊せず、抗原との親和性の高い抗体も精製することができる、新規抗体精製方法、およびそのための組成物および手段を提供することにある。
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合に関与するアミノ酸配列の同定に成功し、本発明を完成するに至った。また、驚くべきことに、かかるアミノ酸配列は、結合に関与すると報告されているアルギニン残基を含まないものであった。さらに、このアミノ酸配列を含むペプチドは、Protein AやProtein Gより弱くイミュノグロブリンと結合するので、抗体の立体構造の破壊や精製の対象となる抗体の制限（抗原との親和性が高い抗体を精製することができないなど）などの従来の抗体精製の際の問題を解消し、マイルドな条件下での抗体精製を可能にした。
すなわち、本発明は、
（１）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、
からなる群より選択される、ペプチド、
（２）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するものである、（１）記載のペプチド、
（３）配列番号１のアミノ酸配列を有するものである、（１）または（２）記載のペプチド、
（４）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）（１）記載のペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｄ）前記（ｂ）または（ｃ）の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、
（ｅ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸、
（５）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有するものである、（４）記載の核酸、
（６）配列番号８または９のヌクレオチド配列を有するものである、（４）または（５）記載の核酸、
（７）（４）〜（６）のいずれか記載の核酸を含むベクター、
（８）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質、
（９）（８）記載の融合タンパク質をコードする核酸、
（１０）（９）記載の核酸を含むベクター、
（１１）（４）〜（６）のいずれか若しくは（９）記載の核酸、または（７）若しくは（１０）記載のベクターを含む、細胞、
（１２）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）（７）記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む、方法、
（１３）（１２）記載の方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、
（１４）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）（１０）記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
を含む、方法、
（１５）融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含む、（１４）記載の方法、
（１６）（１４）または（１５）記載の方法により得ることのできる、融合タンパク質、
（１７）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物、
（１８）イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（１７）記載の組成物、
（１９）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段、
（２０）イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（１９）記載の手段、
（２１）イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む、方法、
（２２）（２１）記載の方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキット、
（２３）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物、
（２４）疾患が関節リウマチである、（２３）記載の医薬組成物、
（２５）疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、（２３）記載の医薬組成物、
（２６）標識されている（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質、
（２７）（２６）記載の標識されているペプチドまたは融合タンパク質を試料中の抗体と反応させ、次いで抗体と結合した該ペプチドまたは融合タンパク質を検出することを特徴とする、試料中の抗体の検出方法、に関するものである。
（１）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、
からなる群より選択される、ペプチド、
（２）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するものである、（１）記載のペプチド、
（３）配列番号１のアミノ酸配列を有するものである、（１）または（２）記載のペプチド、
（４）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）（１）記載のペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｄ）前記（ｂ）または（ｃ）の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、
（ｅ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸、
（５）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有するものである、（４）記載の核酸、
（６）配列番号８または９のヌクレオチド配列を有するものである、（４）または（５）記載の核酸、
（７）（４）〜（６）のいずれか記載の核酸を含むベクター、
（８）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質、
（９）（８）記載の融合タンパク質をコードする核酸、
（１０）（９）記載の核酸を含むベクター、
（１１）（４）〜（６）のいずれか若しくは（９）記載の核酸、または（７）若しくは（１０）記載のベクターを含む、細胞、
（１２）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）（７）記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む、方法、
（１３）（１２）記載の方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、
（１４）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）（１０）記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
を含む、方法、
（１５）融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含む、（１４）記載の方法、
（１６）（１４）または（１５）記載の方法により得ることのできる、融合タンパク質、
（１７）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物、
（１８）イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（１７）記載の組成物、
（１９）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段、
（２０）イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（１９）記載の手段、
（２１）イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む、方法、
（２２）（２１）記載の方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキット、
（２３）（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物、
（２４）疾患が関節リウマチである、（２３）記載の医薬組成物、
（２５）疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、（２３）記載の医薬組成物、
（２６）標識されている（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド、または（８）記載の融合タンパク質、
（２７）（２６）記載の標識されているペプチドまたは融合タンパク質を試料中の抗体と反応させ、次いで抗体と結合した該ペプチドまたは融合タンパク質を検出することを特徴とする、試料中の抗体の検出方法、に関するものである。
本発明により、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸、製造方法、イミュノグロブリンを結合させるための組成物および手段、およびイミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などが提供される。
本発明は、１の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、からなる群より選択されるペプチドに関するものである。本発明のペプチドは、Protein AおよびProtein Gと比較して、イミュノグロブリンとの結合能が弱く、そのため、例えば、本発明のペプチドと結合したイミュノグロブリンをマイルドな条件下で解離することなどが可能となる。また、本発明のペプチドと結合したイミュノグロブリン自体の変性も低減される。結合能は、当該技術分野において既知の方法により調べることができる。例えば、ペプチドをイミュノグロブリン存在下でインキュベートし、結合するかどうかを直接調べてもよい。
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と６６．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチド、からなる群より選択されるペプチドに関するものである。本発明のペプチドは、Protein AおよびProtein Gと比較して、イミュノグロブリンとの結合能が弱く、そのため、例えば、本発明のペプチドと結合したイミュノグロブリンをマイルドな条件下で解離することなどが可能となる。また、本発明のペプチドと結合したイミュノグロブリン自体の変性も低減される。結合能は、当該技術分野において既知の方法により調べることができる。例えば、ペプチドをイミュノグロブリン存在下でインキュベートし、結合するかどうかを直接調べてもよい。
本発明のペプチドは、イミュノグロブリン結合能を有するものである。かかるペプチドは、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド（変異ペプチド）、および配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と例えば、２６．６％以上または４４．４％以上、好ましくは、少なくとも５０％以上、より好ましくは、例えば、６０、６６．７、７０、７５、８０、８３．３、８５、９０、９３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。あるいは、短鎖ペプチドの場合は単純に配列を比較し、計算することもできる。さらに、これらのアミノ酸のいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のペプチドはイミュノグロブリン結合能を有するものである。
本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、本発明のペプチドは、配列番号１〜７のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよく、上記アミノ酸配列またはその相同配列をコア配列として含み、かつかかるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、ペプチドまたはアミノ酸、それらのアナログ、ポリエチレングリコール、糖、多糖、ヌクレオチドなどの種々の物質の結合したものであってもよい。Ｎ／Ｃ末端にアミノ酸またはペプチドを介して、蛍光標識、ビオチン、ストレプトアビジン、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、金コロイドなどの物質が結合していてもよい。例えば、ペプチドが結合する場合、かかるペプチドは、１個〜５０個、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜９個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、かかるペプチドが、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＥタグとしての機能などの機能を有するものであってもよい。
本発明のペプチドは、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づき、遺伝子工学的に製造してもよい。本発明のペプチドは、上述の通りイミュノグロブリン結合能を有するので、かかるペプチドを用いてイミュノグロブリンを結合させ、イミュノグロブリンの存在または量を決定すること、イミュノグロブリンを単離することなどが可能である。
本発明は、もう１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）上記本発明のペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｄ）前記（ｂ）または（ｃ）の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、
（ｅ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸に関するものである。本明細書において核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明の核酸は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得され得る。本発明において、配列番号８、１０、１２および１３のヌクレオチド配列は、Ｃ１ｑＢサブユニットに由来し、かつ配列番号１、２、３および４のアミノ酸配列をそれぞれコードするものである。同様に、配列番号９、１１、１４〜１６のヌクレオチド配列は、Ｃ１ｑＣサブユニットに由来し、かつ配列番号１、２、５〜６のアミノ酸配列をそれぞれコードするものである。
（ａ）上記本発明のペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｄ）前記（ｂ）または（ｃ）の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、
（ｅ）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸に関するものである。本明細書において核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明の核酸は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得され得る。本発明において、配列番号８、１０、１２および１３のヌクレオチド配列は、Ｃ１ｑＢサブユニットに由来し、かつ配列番号１、２、３および４のアミノ酸配列をそれぞれコードするものである。同様に、配列番号９、１１、１４〜１６のヌクレオチド配列は、Ｃ１ｑＣサブユニットに由来し、かつ配列番号１、２、５〜６のアミノ酸配列をそれぞれコードするものである。
本発明の核酸は、具体的には、（１）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸、（２）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸、（３）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と例えば、２６．６％以上または４４．４％以上、好ましくは、少なくとも５０％以上、より好ましくは、例えば、６０、６６．７、７０、７５、８０、８３．３、８５、９０、または９３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸、（４）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、（５）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、（６）前記（３）または（４）のいずれかの核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、および（７）配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも５０％以上、好ましくは、例えば、６０、７０、７５、８０、９０、９３、９５、または９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸などである。さらに、これらのヌクレオチドのいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのヌクレオチド配列を有する場合であっても、本発明の核酸は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードし得るものである。
上記ストリンジェントな条件としては、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリダイズさせた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回の条件、または６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回の条件などである。
上記ヌクレオチド配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。
本発明の核酸は、上記ヌクレオチド配列を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸そのものであってもよく、上記ヌクレオチド配列をコア配列として含み、かつかかる配列の５’末端および／または３’末端に、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのアナログなどの種々の物質の結合したものであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドが結合する場合、かかるポリヌクレオチドは、１〜１５０個、例えば、１〜６０個、１〜４５個、１〜１８個のヌクレオチドからなるものであってもよい。
本発明は、さらなる態様において、上記核酸を含むベクターに関するものである。本発明のベクターは、上記核酸を含んでいればいずれのものであってもよい。ベクターの種類、上記核酸のヌクレオチド配列以外の配列などは、ベクターを導入する宿主の種類、目的などの種々の条件に応じて適宜選択され得る。本発明のベクターは、例えば、配列番号８または９のヌクレオチド配列の５’末端または３’末端にインフレームで目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した融合タンパク質の発現用ベクターとして用いることもできる。融合タンパク質からの目的のタンパク質の単離を容易にするために、本発明のベクターは、上記ヌクレオチド配列と目的のタンパク質のヌクレオチド配列挿入部の間に例えば、ＨＲＶ ３Ｃ、トロンビン、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、エンテロキナーゼなどのプロテーゼにより認識される配列を含んでいてもよい。本発明のベクターを細胞に導入し、タンパク質を産生させることにより、上記本発明のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを得てもよい。
本発明は、別の態様において、本発明のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質に関するものである。本発明の融合タンパク質は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。本発明の融合タンパク質はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含むものであるので、かかるペプチドをタグ配列として用い、目的のタンパク質を単離および／または精製することなどが可能になる。また、上述の通り、本発明のペプチドはイミュノグロブリンとの結合能が低いので、本発明の融合タンパク質は、例えば、精製用カラムに固定された場合、Protein AまたはProtein Gと比較して、マイルドな条件下でのイミュノグロブリンの精製およびかかるカラムの繰り返し使用（劣化が抑えられる）を可能にし、例えば、イミュノグロブリンの検出用プローブとして用いた場合、リプローブが容易であるなどの利点を有する。
本発明の融合タンパク質に含まれる目的のタンパク質は、いずれのタンパク質であってもよい。本発明の融合タンパク質が、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシデース（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼおよびグリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などの酵素を目的のタンパク質として含む場合、本発明の融合タンパク質に含まれるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドとイミュノグロブリンとの結合を検出することなどが容易になる。本発明の融合タンパク質はまた、例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＥタグなどのタグ配列、核移行シグナル、シリカ結合タンパク質、またはProtein Aなどを含んでいてもよい。
本発明の融合タンパク質は、本発明のペプチドと目的のタンパク質との間にプロテアーゼにより認識されるペプチドを含んでいてもよい。かかるペプチドを含むことにより、融合タンパク質から目的のタンパク質を容易に単離することができる。
従って、本発明は、さらなる態様において、上記融合タンパク質をコードする核酸に関するものである。
さらに、本発明は、上記融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに関するものである。かかるベクターを細胞に導入し、タンパク質を産生させることにより、本発明の融合タンパク質を得てもよい。
本発明は、１つの態様において、上記イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸、上記融合タンパク質をコードする核酸、またはそれらの核酸を含むベクターを含む細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記核酸またはベクターを用いて形質転換することにより製造することができる。本発明の細胞を培養し、産生されたイミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含む融合タンパク質を回収することにより、本発明のペプチドまたは融合タンパク質を製造することもできる。
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む方法に関するものである。細胞の形質転換は、当業者に既知の手段および／または方法により行われ得る。
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む方法に関するものである。細胞の形質転換は、当業者に既知の手段および／または方法により行われ得る。
従って、本発明は、上記ペプチドの製造方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドに関するものである。
本発明は、別の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
工程を含む方法に関するものである。本発明の融合タンパク質の製造方法は、融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含んでいてもよい。
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
工程を含む方法に関するものである。本発明の融合タンパク質の製造方法は、融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含んでいてもよい。
従って、本発明は、上記融合タンパク質の製造方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質に関するものである。
本発明は、１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物に関するものである。上記ペプチドまたは融合タンパク質以外の成分は、本発明の組成物が用いられる目的など種々の条件に応じて適宜選択され得る。上述の通り、本発明の組成物はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含むものであるので、本発明の組成物は、例えば、イミュノグロブリンの存在または量を決定するための組成物であってもよく、イミュノグロブリンを単離するための組成物であってもよい。本発明の組成物により、試料中のイミュノグロブリンの量を決定すること、試料からイミュノグロブリンを単離することなどが可能になる。
本発明は、もう１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段に関するものである。本発明の手段は、例えば、プレート、樹脂、カラム、ビーズ、アガロースまたはセファロースなどの糖を含むレジン、シリカ基板、ガラス（スライドガラスなど）、金属（金など）、アパタイトなどの担体に上記ペプチドまたは融合タンパク質が固定されたものである。固定化は、ペプチド、またはタンパク質のアミノ基若しくはカルボキシル基を介した方法、アミノ酸側鎖のＳＨ基を介した方法、イオン的な結合による方法、疎水的な結合による方法などの当業者に既知の手段・方法により行われ得る。
上述の通り、本発明の手段はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドが固定化されたものであるので、本発明の手段は、イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するための手段、およびイミュノグロブリンを単離するための手段を含むものである。本発明の手段を、例えば、ＥＬＩＳＡ用プレート、イミュノグロブリン精製用カラム、検出用ガラスアレイ、マイクロ流路系、ＳＰＲ用センサーチップ、検出用シリカ基板、抗体医薬品精製システムなどとして用いることもできる。
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む方法に関するものである。試料は、イミュノグロブリンが含まれている可能性があればいずれのものであってもよい。イミュノグロブリンとの結合体の存在および／または量を調べることにより、試料中にイミュノグロブリンが存在するかどうか、さらには、試料中に存在するイミュノグロブリンの量を決定することなどが可能になる。本発明の方法に用いるペプチドまたは融合タンパク質は標識されたものであってもよい。標識としては、ビオチン化、蛍光標識、ＲＩ標識、酵素標識など当業者に既知の種々のものが挙げられる。かかる標識を付すことにより、ペプチドまたは融合タンパク質との結合体を調べることが容易になる。さらに、本発明の方法は、結合体からイミュノグロブリンを単離する工程を含んでいてもよい。
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む方法に関するものである。試料は、イミュノグロブリンが含まれている可能性があればいずれのものであってもよい。イミュノグロブリンとの結合体の存在および／または量を調べることにより、試料中にイミュノグロブリンが存在するかどうか、さらには、試料中に存在するイミュノグロブリンの量を決定することなどが可能になる。本発明の方法に用いるペプチドまたは融合タンパク質は標識されたものであってもよい。標識としては、ビオチン化、蛍光標識、ＲＩ標識、酵素標識など当業者に既知の種々のものが挙げられる。かかる標識を付すことにより、ペプチドまたは融合タンパク質との結合体を調べることが容易になる。さらに、本発明の方法は、結合体からイミュノグロブリンを単離する工程を含んでいてもよい。
従って、本発明は、イミュノグロブリンを結合させる方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキットに関するものである。本発明のキットには、上記ペプチドまたは融合タンパク質の他、例えば、標識、結合体を調べる手段などが含まれ得る。
本発明は、別の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物に関するものである。Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患とは、かかる結合により直接的または間接的に生じる疾患をいい、例えば、関節リウマチ、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎症群、腎炎などの免疫複合体病、その他の炎症性疾患、感染症、および悪性腫瘍などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、含まれるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドがＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、上記疾患を治療および予防することができる。なお、本発明のペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するものであって、かつ６〜１５残基と短いので、本発明のペプチドをヒトに投与することで生じる副作用は少ない。
本発明は、さらなる態様において、有効量のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を対象に投与することを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防方法に関するものである。
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
イミュノグロブリンが認識するＣ１ｑ中のアミノ酸配列の同定
材料および方法
ヒトＣ１ｑのサブユニットＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に、ヌクレオチド配列を配列番号２０〜２２に示す。それぞれのアミノ酸配列をもとにして、各サブユニットのアミノ酸配列を１５アミノ酸（残基）ずつ３アミノ酸の間隔でずらした配列を合成ペプチド（順に、ペプチド番号１〜７８、９７〜１１７、１９３〜２７０番）としてガラスアレイ上に合成した。それぞれのペプチドの合成はアレイ上の特定の位置で行い、Ｃ１ｑのサブユニットの全アミノ酸配列を網羅する合成ペプチド含むペプチドアレイを作製した。尚、アレイの作製はＪＰＴ社に委託して行った。
材料および方法
ヒトＣ１ｑのサブユニットＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に、ヌクレオチド配列を配列番号２０〜２２に示す。それぞれのアミノ酸配列をもとにして、各サブユニットのアミノ酸配列を１５アミノ酸（残基）ずつ３アミノ酸の間隔でずらした配列を合成ペプチド（順に、ペプチド番号１〜７８、９７〜１１７、１９３〜２７０番）としてガラスアレイ上に合成した。それぞれのペプチドの合成はアレイ上の特定の位置で行い、Ｃ１ｑのサブユニットの全アミノ酸配列を網羅する合成ペプチド含むペプチドアレイを作製した。尚、アレイの作製はＪＰＴ社に委託して行った。
ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１，０００倍希釈したＣｙ３標識ヤギ抗マウスイミュノグロブリン（ＩｇＧ）（１ｍｇ／ｍｌ；Zymed Laboratories社製）３３０μｌをペプチドアレイ上に塗布し、シールをした後、４℃で１２時間インキュベートした。その後メタノール１回、Ｍｉｌｉ−Ｑ水で５分間×５回洗浄した。遠心してアレイスライドを乾燥させ、蛍光スキャナー（Agilent DNAマイクロアレイスキャナ；アジレント社製）で、スキャンし、ソフトウェア（Feature Extractionソフトウェア；アジレント社製）を用いてアレイ上のそれぞれのペプチドスポットの蛍光強度を数値化した。強い蛍光強度を示すいくつかのスポットを検出した。このうち、バックグラウンドレベルより６０，０００以上高い蛍光強度を示すペプチドスポットのアミノ酸配列（配列番号３〜７）を表１に示す。なお、本明細書において、アミノ酸は当該分野において知られた１文字表記により記載している。
結果
１４９番および１５０番のペプチドはＣ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）由来の配列であり、２４４番〜２４６番のペプチドはＣ１ｑＣサブユニット（Ｃ鎖）由来の配列である。これらの配列から、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンの結合に必須な配列はＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基をコアにした配列であると予測した。またこのコア配列を含む配列であればそのＮ末端もしくはＣ末端側に数残基のアミノ酸が結合していてもイミュノグロブリンとの結合が妨げられないことも確認した。１４９および１５０番、２４４番〜２４６番のペプチドのヌクレオチド配列を配列番号１２〜１６に示す。
１４９番および１５０番のペプチドはＣ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）由来の配列であり、２４４番〜２４６番のペプチドはＣ１ｑＣサブユニット（Ｃ鎖）由来の配列である。これらの配列から、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンの結合に必須な配列はＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基をコアにした配列であると予測した。またこのコア配列を含む配列であればそのＮ末端もしくはＣ末端側に数残基のアミノ酸が結合していてもイミュノグロブリンとの結合が妨げられないことも確認した。１４９および１５０番、２４４番〜２４６番のペプチドのヌクレオチド配列を配列番号１２〜１６に示す。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドによるイミュノグロブリンとＣ１ｑの結合の阻害
阻害活性の検討（１）
材料および方法
Ｃ１ｑとイミュノグロブリン（ＩｇＧ）の結合に必須と考えられるＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基のペプチドが、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｒ２）、かかるペプチドより短いアミノ酸配列ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）を有するペプチド（Ｒ１）、ならびに配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列ＳＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦＴ（配列番号３）を有するペプチド（Ｒ３）、アミノ酸配列ＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦＴＹＨＡ（配列番号４）を有するペプチド（Ｒ４）、アミノ酸配列ＳＴＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号５）を有するペプチド（Ｒ５）、およびアミノ酸配列ＣＫＶＰＧＬＹＹＦＶＹＨＡＳＨ（配列番号７）を有するペプチド（Ｒ６）をGL Biochem（Shanghai）社に委託して作製した。これらのペプチドを表２に示す。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。
阻害活性の検討（１）
材料および方法
Ｃ１ｑとイミュノグロブリン（ＩｇＧ）の結合に必須と考えられるＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基のペプチドが、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｒ２）、かかるペプチドより短いアミノ酸配列ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）を有するペプチド（Ｒ１）、ならびに配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列ＳＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦＴ（配列番号３）を有するペプチド（Ｒ３）、アミノ酸配列ＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦＴＹＨＡ（配列番号４）を有するペプチド（Ｒ４）、アミノ酸配列ＳＴＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号５）を有するペプチド（Ｒ５）、およびアミノ酸配列ＣＫＶＰＧＬＹＹＦＶＹＨＡＳＨ（配列番号７）を有するペプチド（Ｒ６）をGL Biochem（Shanghai）社に委託して作製した。これらのペプチドを表２に示す。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。
ヒトＣ１ｑタンパク質（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０％ グリセロール（ｐＨ７．２）に溶解し、２００μｇ／ｍｌ ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を５ｍｍ×１５ｍｍの大きさのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ；アマシャム社製）に２μｌ（４００ｎｇ）ずつスポットし、室温にて約１時間風乾した。ニトロセルロース膜をＴＢＳに浸し、５分間インキュベートし、５％ブロッキング剤（Amersham ECL blocking reagent；GE Healthcare社製）を含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて室温にて１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳにて軽く洗浄した後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）（BECKMAN COULTER社製）をＴＢＳにて１０００倍希釈し、各ペプチドの濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように混合した溶液２０μｌに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＴＢＳ溶液（ＴＢＳに最終濃度０．０５％で Ｔｗｅｅｎ ２０を加えたもの）にて軽く洗浄した後、同液にて１０分間、３回振盪しながら洗浄した。
ＡＬＰ標識イミュノグロブリン（ＩｇＧ）を用いた検出方法
ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて染色像の取り込みを行った。
ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて染色像の取り込みを行った。
結果
結果を図１に示す。Ｃ１ｑとイミュノグロブリン（ＩｇＧ）との結合に必須と思われる９アミノ酸を有するペプチドＲ２およびかかるペプチドをコア配列として有するペプチド（ペプチドＲ３〜６）によって結合が阻害されているだけでなく、より短いアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチドＲ１）によっても結合が阻害されたことから、イミュノグロブリンとＣ１ｑの結合にはＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）の６残基のアミノ酸をコアとする配列が重要であることがわかった。また、これらのペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、この結合により引き起こされる疾患を治療または予防できる可能性があることが分かった。
結果を図１に示す。Ｃ１ｑとイミュノグロブリン（ＩｇＧ）との結合に必須と思われる９アミノ酸を有するペプチドＲ２およびかかるペプチドをコア配列として有するペプチド（ペプチドＲ３〜６）によって結合が阻害されているだけでなく、より短いアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチドＲ１）によっても結合が阻害されたことから、イミュノグロブリンとＣ１ｑの結合にはＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）の６残基のアミノ酸をコアとする配列が重要であることがわかった。また、これらのペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、この結合により引き起こされる疾患を治療または予防できる可能性があることが分かった。
阻害活性の検討（２）
材料および方法
実施例２の阻害活性の検討（１）にて示すペプチド以外にも、その変異ペプチドについて、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。表３に示すペプチドをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。なお、実験は実施例２の阻害活性の検討（１）と同様の方法で行い、対照としてペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５についても試験を行った。
材料および方法
実施例２の阻害活性の検討（１）にて示すペプチド以外にも、その変異ペプチドについて、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害するかどうかを調べた。表３に示すペプチドをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。なお、実験は実施例２の阻害活性の検討（１）と同様の方法で行い、対照としてペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５についても試験を行った。
結果
結果を図２に示す。特定のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を十分に阻害した。従って、これらの変異ペプチドあるいはそれらをコアとして含むペプチドも、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、この結合により引き起こされる疾患を治療または予防できる可能性があることが分かった。
結果を図２に示す。特定のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を十分に阻害した。従って、これらの変異ペプチドあるいはそれらをコアとして含むペプチドも、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、この結合により引き起こされる疾患を治療または予防できる可能性があることが分かった。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用の検証
（１）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−１
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウス（ＢＡＬＢ／ｃ Ｃｒ Ｓｌｃ （ＳＰＦ））を用い、実施例２にてＲ５として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、その３日後にＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）を５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。ペプチドＲ５を、ＬＰＳ投与翌日（４日目）より１４日目まで、１日１回あるいは１日２回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。陽性対照薬のメトトレキサートを、４日目より１日１回、０．１ｍｇ／ｋｇで経口投与した。０日目より１４日目までの偶数日に四肢の臨床スコアを測定した。麻酔下にてヘパリン含有生理食塩液で脱血を行い、氷冷４％パラホルムアルデヒド液を持続注入して全身灌流固定した。灌流固定後、両後肢の膝関節（大腿骨中心部および脛骨中心部を切断し、皮膚および筋肉を除去）および踵関節（脛骨中心部から指先まで）を摘出し、さらに４％パラホルムアルデヒド液で一晩浸漬固定（４℃）した。その後、両膝および両踵関節を５０ｍＭ ＰＢＳ（４℃）に移した後、踵関節の軟Ｘ線写真撮影を２方向（内側面方向および上面方向）から行った。
（１）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−１
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウス（ＢＡＬＢ／ｃ Ｃｒ Ｓｌｃ （ＳＰＦ））を用い、実施例２にてＲ５として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、その３日後にＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）を５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。ペプチドＲ５を、ＬＰＳ投与翌日（４日目）より１４日目まで、１日１回あるいは１日２回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。陽性対照薬のメトトレキサートを、４日目より１日１回、０．１ｍｇ／ｋｇで経口投与した。０日目より１４日目までの偶数日に四肢の臨床スコアを測定した。麻酔下にてヘパリン含有生理食塩液で脱血を行い、氷冷４％パラホルムアルデヒド液を持続注入して全身灌流固定した。灌流固定後、両後肢の膝関節（大腿骨中心部および脛骨中心部を切断し、皮膚および筋肉を除去）および踵関節（脛骨中心部から指先まで）を摘出し、さらに４％パラホルムアルデヒド液で一晩浸漬固定（４℃）した。その後、両膝および両踵関節を５０ｍＭ ＰＢＳ（４℃）に移した後、踵関節の軟Ｘ線写真撮影を２方向（内側面方向および上面方向）から行った。
ペプチド溶液の調製
ペプチドについて、動物の体重を基に必要量を算出した。ペプチドを０．５％メチルセルロース溶液で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、調製したペプチド溶液を冷蔵保存した。
ペプチドについて、動物の体重を基に必要量を算出した。ペプチドを０．５％メチルセルロース溶液で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、調製したペプチド溶液を冷蔵保存した。
メトトレキサート溶液の調製
メトトレキサートを、１ｍｇ秤量してメノウ乳鉢に入れ、乳棒で粉砕した後に０．５％メチルセルロース溶液を徐々に加えて懸濁し、０．０１ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。その後、調製物を冷蔵保存した。
メトトレキサートを、１ｍｇ秤量してメノウ乳鉢に入れ、乳棒で粉砕した後に０．５％メチルセルロース溶液を徐々に加えて懸濁し、０．０１ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。その後、調製物を冷蔵保存した。
体重測定，一般症状観察および群分け
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は、毎日実施した。
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は、毎日実施した。
関節炎モデルの作製
０日目に７週齢のマウス２０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
０日目に７週齢のマウス２０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
ペプチド溶液の投与
ペプチド溶液は、４日目より１日１回（午前）あるいは１日２回（午前および午後）１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。対照として、４日目より０．５％メチルセルロース溶液を１日１回（午前）腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ，テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量，テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。メトトレキサートは、４日目より１日１回（午前）０．１ｍｇ／ｋｇ経口投与した。投与には経口ゾンデ（マウス用経口ゾンデ，フチガミ器械店）および注射筒（１．０ｍｌ容量，テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
ペプチド溶液は、４日目より１日１回（午前）あるいは１日２回（午前および午後）１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。対照として、４日目より０．５％メチルセルロース溶液を１日１回（午前）腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ，テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量，テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。メトトレキサートは、４日目より１日１回（午前）０．１ｍｇ／ｋｇ経口投与した。投与には経口ゾンデ（マウス用経口ゾンデ，フチガミ器械店）および注射筒（１．０ｍｌ容量，テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
臨床スコア観察
臨床スコアの観察は、０日目より１４日目までの偶数日に以下に従って観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
臨床スコアの観察は、０日目より１４日目までの偶数日に以下に従って観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し，ＥＸＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１．６，株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。
試験成績は平均値±標準誤差で表示し，ＥＸＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１．６，株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。
結果
結果を図３に示す。１日１回投与と１日２回投与の間でペプチドＲ５の有効性に有意な差異は観察されなかったが、関節炎抑制に対する効果は認められた。また、関節炎抑制の強度は，メトトレキサートよりも強いものであった。この結果から、本発明のペプチドは、臨床において既に用いられている医薬品より優れた関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。
結果を図３に示す。１日１回投与と１日２回投与の間でペプチドＲ５の有効性に有意な差異は観察されなかったが、関節炎抑制に対する効果は認められた。また、関節炎抑制の強度は，メトトレキサートよりも強いものであった。この結果から、本発明のペプチドは、臨床において既に用いられている医薬品より優れた関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。
（２）関節炎誘発マウスに対するイミュノグロブリン結合能を有するペプチドの関節炎抑制作用−２
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用い、実施例２にてＲ１、Ｒ２およびＲ５として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、その３日後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。各ペプチドは，関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日（０日目）より、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇを１日２回、１４日間連続投与を行い、関節炎抑制作用を臨床スコアにより検討した。なお、実験は、実施例３（１）と同様の方法で行った。
材料および方法
モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用い、実施例２にてＲ１、Ｒ２およびＲ５として示すペプチドの関節炎抑制作用を検討した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、その３日後にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。各ペプチドは，関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日（０日目）より、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇを１日２回、１４日間連続投与を行い、関節炎抑制作用を臨床スコアにより検討した。なお、実験は、実施例３（１）と同様の方法で行った。
ペプチド溶液の調製
各ペプチドは，動物の体重を基に必要量を算出した。０．５％メチルセルロース溶液で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、冷蔵保存した。
各ペプチドは，動物の体重を基に必要量を算出した。０．５％メチルセルロース溶液で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、冷蔵保存した。
体重測定および一般状態観察
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は毎日実施した。
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は毎日実施した。
関節炎モデルの作製および群分け
投与開始前日に体重を測定し、群分けソフトにより各群の平均体重値がほぼ等しくなるように無作為に割り付けた。０日目に、７週齢のマウス２０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
投与開始前日に体重を測定し、群分けソフトにより各群の平均体重値がほぼ等しくなるように無作為に割り付けた。０日目に、７週齢のマウス２０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを２ｍｇ／個体で静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。
ペプチド溶液の投与
各ペプチド溶液を、０日目より、午前および午後の１日２回、腹腔内投与した。対照として、０日目より、０．５％メチルセルロース溶液を１日２回、腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ、テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量、テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
各ペプチド溶液を、０日目より、午前および午後の１日２回、腹腔内投与した。対照として、０日目より、０．５％メチルセルロース溶液を１日２回、腹腔内投与した。投与には注射針（２６Ｇ、テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量、テルモ）を用いた。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。
臨床スコア観察
関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、１４日目までの偶数日に、全例の四肢の臨床スコアを以下に従い観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、１４日目までの偶数日に、全例の四肢の臨床スコアを以下に従い観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。
＜臨床スコア＞
０： 正常な関節
１： わずかな炎症および赤み
２： 手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３： 強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形
統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し，EXSAS（Version7.1.6、株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはWilcoxon検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。
試験成績は平均値±標準誤差で表示し，EXSAS（Version7.1.6、株式会社アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはWilcoxon検定を行った。足の腫れを肉眼で観察した。
結果
結果を図４、図５および図６に示す。Ｒ１、Ｒ２またはＲ５を１０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与した全ての群において関節炎抑制作用が認められた。従って、本発明のペプチドは、関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。また、一般症状の異常および体重に対する作用は、用いたペプチドのいずれにおいても認められなかった。
また、マウスを用いた試験において、本発明のペプチドは毒性影響を示さなかった。さらに、本発明のペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するものであって、かつ６〜１５残基と短いので、本発明のペプチドを用いることで治療または予防に伴う副作用を低減させることが期待できる。
結果を図４、図５および図６に示す。Ｒ１、Ｒ２またはＲ５を１０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与した全ての群において関節炎抑制作用が認められた。従って、本発明のペプチドは、関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。また、一般症状の異常および体重に対する作用は、用いたペプチドのいずれにおいても認められなかった。
また、マウスを用いた試験において、本発明のペプチドは毒性影響を示さなかった。さらに、本発明のペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するものであって、かつ６〜１５残基と短いので、本発明のペプチドを用いることで治療または予防に伴う副作用を低減させることが期待できる。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの免疫複合体病抑制作用の検証
材料および方法
７週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系ラットの雄６４匹を用いて、ペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５について、投与方法（腹腔内投与と尾静脈内投与）ごとに２回に分けて試験を行った。馴化は、固形通常飼料ＣＲＦ−１を与えて９日以上行った。投与前日に動物の背部を剪毛し、投与当日、ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を尾静脈内投与した。腹腔内投与する際はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する際は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与する際は被験物質投与３０分後に、静脈内投与する際は１０分後に、動物の背部に０．１ｍｌ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。惹起４時間後、動物を安楽死させ十分に脱血した後に、背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位を打ち抜き、その皮膚よりエバンスブルー色素を一晩かけて抽出した。漏出色素量は、分光光度計でエバンスブルー色素に関する吸光度を測定し、検量線を用いて定量化した（なお、実施例４にて用いた実験方法については、H. Okamoto, Y. Iwahisa and M. Terasawa : Suppression of the Arthus reaction by Y-24180, a potent and specific antagonist of platelet-activating factor. Agents Actions, 35 : 149-158 (1992)を参照のこと）。
材料および方法
７週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系ラットの雄６４匹を用いて、ペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５について、投与方法（腹腔内投与と尾静脈内投与）ごとに２回に分けて試験を行った。馴化は、固形通常飼料ＣＲＦ−１を与えて９日以上行った。投与前日に動物の背部を剪毛し、投与当日、ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を尾静脈内投与した。腹腔内投与する際はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する際は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与する際は被験物質投与３０分後に、静脈内投与する際は１０分後に、動物の背部に０．１ｍｌ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。惹起４時間後、動物を安楽死させ十分に脱血した後に、背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位を打ち抜き、その皮膚よりエバンスブルー色素を一晩かけて抽出した。漏出色素量は、分光光度計でエバンスブルー色素に関する吸光度を測定し、検量線を用いて定量化した（なお、実施例４にて用いた実験方法については、H. Okamoto, Y. Iwahisa and M. Terasawa : Suppression of the Arthus reaction by Y-24180, a potent and specific antagonist of platelet-activating factor. Agents Actions, 35 : 149-158 (1992)を参照のこと）。
この実験において用いた各ペプチド溶液を以下に示す：
＜陰性対照物質＞
生理食塩液
＜ペプチド溶液＞
所定量秤量した各ペプチド（ペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５）を生理食塩液にて溶解し、２０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。２ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、２０ｍｇ／ｍＬ溶液を生理食塩液で１０倍希釈して調製した。５ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、所定量秤量した各ペプチドを生理食塩液に溶解して調製液とした。
＜陰性対照物質＞
生理食塩液
＜ペプチド溶液＞
所定量秤量した各ペプチド（ペプチドＲ１、Ｒ２およびＲ５）を生理食塩液にて溶解し、２０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。２ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、２０ｍｇ／ｍＬ溶液を生理食塩液で１０倍希釈して調製した。５ｍｇ／ｍｌ溶液の調製は、所定量秤量した各ペプチドを生理食塩液に溶解して調製液とした。
アルサス反応
ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を２ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。腹腔内投与する場合はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する場合は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与の場合は被験物質投与３０分後に、静脈内投与の場合は１０分後に、動物の背部に０．１ｍＬ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。皮内投与は動物１匹に対して、ＰＢＳ２ヵ所、抗ＯＶＡ溶液２ヵ所とした。惹起４時間後に、動物をエーテル麻酔下の断頭により安楽死させ、十分に脱血させた後に背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位をポンチで打ち抜き、色素抽出に使用した。
ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を２ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。腹腔内投与する場合はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する場合は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与の場合は被験物質投与３０分後に、静脈内投与の場合は１０分後に、動物の背部に０．１ｍＬ／部位の用量で各ペプチド溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。皮内投与は動物１匹に対して、ＰＢＳ２ヵ所、抗ＯＶＡ溶液２ヵ所とした。惹起４時間後に、動物をエーテル麻酔下の断頭により安楽死させ、十分に脱血させた後に背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位をポンチで打ち抜き、色素抽出に使用した。
色素抽出および測定
ポンチで打ち抜いた皮膚片短冊上に数ヶ所の切れ込みをいれ、２ｍｌの色素抽出液中に浸漬して１０分間振とう攪拌した。その後、室温で一晩静置した。一晩静置した後、再度１０分間振とう攪拌し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１５分）を行い、その上清を色素測定用試料とした。測定にはＵＶ−１６００（株式会社島津製作所）を使用し、ＯＤ６２０ｎｍの波長で測定した。漏出色素量は、色素量標準曲線から算出した。
ポンチで打ち抜いた皮膚片短冊上に数ヶ所の切れ込みをいれ、２ｍｌの色素抽出液中に浸漬して１０分間振とう攪拌した。その後、室温で一晩静置した。一晩静置した後、再度１０分間振とう攪拌し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１５分）を行い、その上清を色素測定用試料とした。測定にはＵＶ−１６００（株式会社島津製作所）を使用し、ＯＤ６２０ｎｍの波長で測定した。漏出色素量は、色素量標準曲線から算出した。
データの処理および統計処理
体重測定値および漏出色素量について、群平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を算出した。漏出色素量については、抗ＯＶＡ溶液投与２ヵ所の平均値からＰＢＳ投与２ヵ所の平均値を差し引いたものを各動物の値とした。漏出色素量について以下の統計解析を行った。１回目の試験（各ペプチド溶液の腹腔内投与）では、第１群対第２、３群、第１群対第４、５群、第１群対第６、７群のそれぞれについてＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第１群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。２回目の試験（各ペプチド溶液の尾静脈内投与）では、第９群対第１０、１１、１２群の間でＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第９群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。有意水準はＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定では５％、その他の検定では両側５％とした。
体重測定値および漏出色素量について、群平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を算出した。漏出色素量については、抗ＯＶＡ溶液投与２ヵ所の平均値からＰＢＳ投与２ヵ所の平均値を差し引いたものを各動物の値とした。漏出色素量について以下の統計解析を行った。１回目の試験（各ペプチド溶液の腹腔内投与）では、第１群対第２、３群、第１群対第４、５群、第１群対第６、７群のそれぞれについてＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第１群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。２回目の試験（各ペプチド溶液の尾静脈内投与）では、第９群対第１０、１１、１２群の間でＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を行い、分散に違いがなければＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、分散に違いがあればＳｔｅｅｌの多重比較検定で第９群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。有意水準はＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定では５％、その他の検定では両側５％とした。
結果
各ペプチド溶液の腹腔内投与の結果を図７、尾静脈内投与の結果を図８にてそれぞれ示す。この実施例において用いたＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応モデル系において、対照と比較して３０％程度のエバンスブルー漏出量の減少が認められており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の抑制に有効であると考えられる。ペプチド溶液の腹腔内投与において、ペプチドＲ１、Ｒ２、Ｒ５の全てにおいて明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用が認められた。また、尾静脈投与において、ペプチドＲ１、Ｒ２で明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用が認められた。従って、本発明のペプチドは、明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用を有しており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の処置および予防に有用であることが明らかになった。
各ペプチド溶液の腹腔内投与の結果を図７、尾静脈内投与の結果を図８にてそれぞれ示す。この実施例において用いたＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応モデル系において、対照と比較して３０％程度のエバンスブルー漏出量の減少が認められており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の抑制に有効であると考えられる。ペプチド溶液の腹腔内投与において、ペプチドＲ１、Ｒ２、Ｒ５の全てにおいて明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用が認められた。また、尾静脈投与において、ペプチドＲ１、Ｒ２で明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用が認められた。従って、本発明のペプチドは、明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用を有しており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の処置および予防に有用であることが明らかになった。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体検出薬の検討
材料および方法
ウェスタンブロット法において、２次抗体の代わりにビオチン化ペプチドを用いて１次抗体を検出できるか検討した。ペプチドＲ５をビオチン化したものをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。
材料および方法
ウェスタンブロット法において、２次抗体の代わりにビオチン化ペプチドを用いて１次抗体を検出できるか検討した。ペプチドＲ５をビオチン化したものをＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。
ＢＳＡを１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動し、ＰＶＤＦ膜へ転写した。転写したＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルクにてブロッキングした。Ａｎｔｉ−ＢＳＡ ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ）を２０００倍希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴにて３回洗浄した。ビオチン化ペプチドＲ５をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、その溶液１０ｕｌを１０ｍｌのＴＢＳＴに加え（１０００倍希釈）、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴにて３回洗浄した。ＶＥＣＴＯＲ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＡＢＣ ｋｉｔを用いて、発色を行なった。発色液には硫酸ニッケルとジアミノベンジジンを、基質には過酸化水素水を用いた。
結果
結果を図９に示す。２次抗体の代わりにビオチン化した本発明のペプチドを用いることで、ＰＶＤＦ膜上の抗体が検出できた。従って、本発明のペプチドをビオチン化したものは、抗体の検出において有用であることが分かった。
結果を図９に示す。２次抗体の代わりにビオチン化した本発明のペプチドを用いることで、ＰＶＤＦ膜上の抗体が検出できた。従って、本発明のペプチドをビオチン化したものは、抗体の検出において有用であることが分かった。
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体精製カラムの検討
材料および方法
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体精製カラムについて検討を行った。なお、対照として、Protein Aを用いた。
材料および方法
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを用いた抗体精製カラムについて検討を行った。なお、対照として、Protein Aを用いた。
ペプチドカラムの作製
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １ｍｌをＰＤ−１０ Ｅｍｐｔｙ ｃｏｌｕｍｎに充填し、１ｍＭ ＨＣｌ １０ｍｌで洗浄し、ＰＢＳ １０ｍｌにて平衡化した。ペプチドＲ４ ５ｍｇをＰＢＳ １ｍｌに溶解し、カラムに添加し、室温にて４時間ローテートした。カラムをＰＢＳ ５ｍｌにて洗浄した後、１Ｍ グリシン１ｍｌを添加し、室温で２時間ローテートすることで未反応のＮＨＳをブロッキングした。１Ｍ グリシンを除去し、ＰＢＳ １０ｍｌにて洗浄して、平衡化した。
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １ｍｌをＰＤ−１０ Ｅｍｐｔｙ ｃｏｌｕｍｎに充填し、１ｍＭ ＨＣｌ １０ｍｌで洗浄し、ＰＢＳ １０ｍｌにて平衡化した。ペプチドＲ４ ５ｍｇをＰＢＳ １ｍｌに溶解し、カラムに添加し、室温にて４時間ローテートした。カラムをＰＢＳ ５ｍｌにて洗浄した後、１Ｍ グリシン１ｍｌを添加し、室温で２時間ローテートすることで未反応のＮＨＳをブロッキングした。１Ｍ グリシンを除去し、ＰＢＳ １０ｍｌにて洗浄して、平衡化した。
抗体の精製
アフィニティー精製用カラムに１ｍｇのａｎｔｉ−ＢＳＡ ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ）（抗ウシ血清アルブミンＩｇＧ（ウサギ））を加え、室温で２時間ローテートした。ＰＢＳ １５ｍｌにて洗浄した。０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）５ｍｌを加えて溶出し、１００ｕｌの１Ｍ Ｔｒｉｓが入ったマイクロチ
ューブに１ｍｌずつ５回溶出した。溶出画分中のタンパク量をDC Protein Assay Kit（Bio-Rad）にて定量した。また、ヒトＩｇＧについても同様の吸着−溶出試験を行った。
アフィニティー精製用カラムに１ｍｇのａｎｔｉ−ＢＳＡ ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ）（抗ウシ血清アルブミンＩｇＧ（ウサギ））を加え、室温で２時間ローテートした。ＰＢＳ １５ｍｌにて洗浄した。０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）５ｍｌを加えて溶出し、１００ｕｌの１Ｍ Ｔｒｉｓが入ったマイクロチ
ューブに１ｍｌずつ５回溶出した。溶出画分中のタンパク量をDC Protein Assay Kit（Bio-Rad）にて定量した。また、ヒトＩｇＧについても同様の吸着−溶出試験を行った。
結果
結果を図１０に示す。本発明のペプチドを用いたカラムにおいて、精製に用いたウサギ抗体のうち７０〜８０％を回収できた。この回収率は、対照のProtein Aよりも優れたものであった。また、本発明のペプチドを用いたアフィニティー精製用カラムは、ヒトＩｇＧの精製にも適用できることが分かった（図１１）。従って、本発明のペプチドを固定化した手段は、抗体精製において極めて有用であることが分かった。
結果を図１０に示す。本発明のペプチドを用いたカラムにおいて、精製に用いたウサギ抗体のうち７０〜８０％を回収できた。この回収率は、対照のProtein Aよりも優れたものであった。また、本発明のペプチドを用いたアフィニティー精製用カラムは、ヒトＩｇＧの精製にも適用できることが分かった（図１１）。従って、本発明のペプチドを固定化した手段は、抗体精製において極めて有用であることが分かった。
本発明により、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドとの融合タンパク質、それらをコードする核酸などが得られるので、イミュノグロブリンの検出、単離、精製、関節リウマチ、およびＳＬＥ、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病などのＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物の分野において利用可能である。
SEQ ID NO:1:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:2:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:3:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:4:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:5:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:6:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:7:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:23:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:24:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:25:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:26:Immunoglobulin binding peptide
SEQ ID NO:27:Immunoglobulin binding peptide
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SEQ ID NO:27:Immunoglobulin binding peptide
Claims (27)
- イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、および
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
からなる群より選択される、ペプチド。 - 配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列からなるものである、請求項１記載のペプチド。
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるものである、請求項１または２記載のペプチド。
- イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、請求項１記載のペプチドをコードする核酸。
- 配列番号８〜１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるものである、請求項４記載の核酸。
- 配列番号８または９のヌクレオチド配列からなるものである、請求項４または５記載の核酸。
- 請求項４〜６のいずれか一項記載の核酸を含むベクター。
- 請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質。
- 請求項８記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項９記載の核酸を含むベクター。
- 請求項４〜６のいずれか一項若しくは請求項９記載の核酸、または請求項７若しくは１０記載のベクターを含む、細胞。
- イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）請求項７記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる、
工程を含む、方法。 - 請求項１２記載の方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド。
- イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）請求項１０記載のベクターを用いて細胞を形質転換し、
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる、
を含む、方法。 - 融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
- 請求項１４または１５記載の方法により得ることのできる、融合タンパク質。
- 請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または請求項８記載の融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物。
- イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、請求項１７記載の組成物。
- 請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または請求項８記載の融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段。
- イミュノグロブリンの存在若しくは量を決定するため、またはイミュノグロブリンを単離するためのものである、請求項１９記載の手段。
- イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または請求項８記載の融合タンパク質を試料に添加し、
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる、
を含む、方法。 - 請求項２１記載の方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキット。
- 請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または請求項８記載の融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物。
- 疾患が関節リウマチである、請求項２３記載の医薬組成物。
- 疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、請求項２３記載の医薬組成物。
- 標識されている請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または請求項８記載の融合タンパク質。
- 請求項２６記載の標識されているペプチドまたは融合タンパク質を試料中の抗体と反応させ、次いで抗体と結合した該ペプチドまたは融合タンパク質を検出することを特徴とする、試料中の抗体の検出方法。
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