KR101499302B1

KR101499302B1 - 회충을 검출하기 위한 방법, 장치, 키트 및 조성물

Info

Publication number: KR101499302B1
Application number: KR1020127015549A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 앨런 엘스모어; 로리 에이. 플린; 마이클 크로포드; 진밍 겡
Original assignee: 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드; 다이버젼스 인코포레이티드
Priority date: 2009-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2015-03-09
Also published as: US20110086340A1; KR20120099724A; BR112012011696A2; CA2780807C; BR112012011696B1; US8268574B2; WO2011063009A1; US20130224759A1; CA2780807A1; US9212220B2

Abstract

본원에서는 포유동물 샘플 내에서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법, 장치, 키트 및 조성물을 개시한다. 본 발명의 방법, 장치, 키트 및 조성물은 구충, 편충 및 사상충 중 하나 이상에 감염될 수도 있는 포유동물로부터의 분변 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 포유동물에서 회충의 존재 또는 부재를 확인하는 것은, 예를 들면 포유동물을 치료하는 최적의 경로를 선택하고/거나 치료가 개시된 후 포유동물이 감염으로부터 해소되었는지 여부를 결정하기 위한 목적으로 수행될 수 있다.

Description

회충을 검출하기 위한 방법, 장치, 키트 및 조성물 {METHODS, DEVICES, KITS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING ROUNDWORM}

본 발명은 포유동물에서 회충의 검출을 위한 조성물, 장치, 키트 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 구충, 편충 및 사상충 항원 중 하나 이상을 포함할 수도 있는 포유동물로부터의 샘플 내에서 회충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한, 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물, 항체 및 항체 조성물, 장치, 키트 및 방법에 관한 것이다.

성체 회충은 소장에 서식하고, 산란하며, 충란은 분변에 배출된다. 이러한 환경에서, 감염성 유충은 충란 내에 잔류하고, 최적의 온도에서 대략 3주 후에 감염 단계로 발전한다. 감염성 충란은 섭취에 의해 숙주에 진입하여, 소장에서 부화한다. 생후 5주 미만의 개에서, 유충은 조직을 통해 혈류로 이동하여, 결국 나중에 폐 및 기관에 도달하고, 여기서 추가적인 발달이 일어난다. 숙주는 유충을 기침으로 배출하고 삼키고, 이는 탈피하여 성충이 되어, 소장에서 서식한다. 생후 5주가 넘은 개 또는 인간을 비롯한 다른 동물 내에서 부화한 유충은 간, 폐, 심장, 뇌 및 골격근을 비롯하여 매우 다양한 조직으로 이동할 수 있다. 이들 유충은 그 후에 발달을 멈추고, 숙주의 조직에서 포낭에 싸인다. 수태 및 수유 중인 개에서, 포낭에 싸인 유충은 다시 활동을 시작하게 되어 모체에서 장 감염을 일으키고, 자궁으로 이동하여 태반을 통해 태아를 직접 감염시키거나, 또는 유방 조직으로 이동하여 포유 중인 동물을 감염시킬 수 있다. 기생 회충은 이들의 동물 숙주에서 질환을 일으키며, 인간의 중증의 장염 및 알레르기 반응 뿐만 아니라 유충 이행 증후군의 병인성 물질로, 이는 이러한 환경으로부터의 감염성 충란의 섭취 또는 연장 숙주의 간, 근육 또는 다른 조직 내에서 발견되는 유충의 섭취 후에 발생한다.

장 회충 감염은 동물에서 흔하게 발견되고, 처치하지 않고 방치할 경우, 심각한 질환 및 심지어는 사망을 일으킬 수 있다. 회충-감염된 동물을 일부 유형의 기생충 (연충)에 감염된 것으로 진단하기는 비교적 쉽지만, 회충을 식별하는 것, 특히 원인이 되는 벌레에 따라 식별하는 것은 상당히 더 어렵다. 이는 감염된 동물을 돌보는 사람이 회충이 감염의 구체적인 원인이라는 것을 알고 있을 때 회충 감염이 가장 잘 처치되기 때문에 문제가 된다. 또한, 감염된 동물 또는 그의 배설물과 접촉하게 될 수 있는 인간은 기생충 감염에 대해 미리 주의를 받을 수 있다. 이러한 측면에서, 일부 연충, 예를 들면 회충 및 구충은 인간에서 심각한 질환 (예를 들면, 유충 이행증)을 유발하지만, 일반적으로 편충은 인간에서 중요한 인수 감염 역할을 하지 않는 것으로 인정되므로, 높은 특이성을 갖는 충 종을 결정하는 것이 중요하다.

회충 감염의 진단을 위한 현재의 방법은 주로, 분변 도말표본에서 직접적으로 또는 밀도 매질 내에서 부상분리(flotation)에 의한 충란(ova)의 농축 후에 분변 샘플의 현미경 검사를 포함한다. 상기 절차가 많이 채택되기는 하지만, 방법은 심각한 단점이 있다. 이들 현미경 방법은 시간 소모적이고, 불쾌하고, 전문화된 장비를 필요로 하며, 낮은 특이성 및 민감도를 나타낼 수 있다 [Dryden et al., 2005, Vet Therap. 6(1), 15-28]. 또한, 이들 방법의 결과의 정확도는 작업자의 기술과 전문지식에 따라 많이 좌우된다.

대변 취급은 유쾌하지 않고 위험하다. 대변을 처리하기 위한 위생적이고 무해한 절차는 불편하고 종종 복잡하다. 그러한 절차는 칭량하고, 원심분리하고, 저장하는 것을 포함할 수 있고, 적합한 기기, 보호 장비 및 숙련된 기술자가 갖추어진 임상 실험실을 제외하고는 어렵다. 따라서, 분변 시험을 수행하도록 요구되는 단계의 수의 임의의 감소 및 시험 작업자와 시험 물질 사이의 접촉의 임의의 감소가 바람직하다. 임상 실험실에서는 분변 내에서 다양한 바이러스, 세균 및 비-연충 기생충 및 유기체의 검출을 위한 면역분석 방법을 이용하였다. 그러나, 분변, 전혈 또는 혈청 내에서 기생충 감염, 특히 회충 감염의 검출을 위한 간단한 면역분석 방법이 여전히 필요하다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 나열된 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 또는 Copro6716에 대응하는 아미노산 서열의 전부 또는 항원 부분을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 서열 중 하나의 보존적 변이체인 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 추가의 측면에서, 상기 항체는 회충 감염된 포유동물로부터의 항원에 특이적으로 결합하나, 구충, 사상충 및/또는 편충에 감염된 포유동물로부터의 항원에는 특이적으로 결합하지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7, 또는 Copro6716에 대응하는 아미노산 서열의 전부 또는 항원 부분을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 서열 중 하나의 보존적 변이체인 서열을 포함하는 폴리펩티드로 면역화시켜 수득한 항체를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플로부터 회충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 장치를 제공하고, 상기 장치는 고체 지지체를 포함하고, 상기 고체 지지체는 그 위에 고정되어 있는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 또는 Copro6716에 대응하는 아미노산 서열 또는 그의 항원 부분을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 갖는다. 장치는 예를 들면 ELISA 장치, 예를 들면 측방 유동 면역분석 장치 또는 미세적정 플레이트 장치일 수 있고 이로 제한되지 않는다. 장치에 의해 회충에 대해 시험될 수 있는 포유동물 샘플은 예를 들면 분변, 전혈, 혈청, 모유 및 전체 조직, 예를 들면 유선, 장, 간, 심장, 폐, 식도, 뇌, 근육 및 눈으로부터의 조직을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 장치는 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충(worm) 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 및 하나 이상의 세균으로 이루어지는 군 중 하나 이상의 검출을 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함할 수 있지만, 포함할 필요는 없다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면 샘플 내의 회충, 예를 들면 톡소카라 카니스(Toxocara canis; T. canis), 톡소카라 카티(Toxocara cati; T. cati), 톡소카라 비툴로룸(Toxocara vitulorum; T. vitulorum), 톡사스카리스 레오니나(Toxascaris leonina; T. leonina), 바일리사스카리스 프로시오니스(Baylisascaris procyonis; B. procyonis), 아스카리디아 갈리(Ascaridia galli; A. galli), 파라스카리스 에쿠오룸(Parascaris equorum; P. equorum), 아스카리스 수움(Ascaris suum; A. suum), 또는 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides; A. lumbricoides), 아니사키스 심플렉스(Anisakis simplex; A. simplex), 또는 슈도테라노바 데시피엔스(Pseudoterranova decipiens; P. decipiens)의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 샘플은 포유동물, 예를 들면 개과동물, 고양이과동물, 돼지과동물, 소과동물, 고래목동물, 기각류 또는 인간로부터 얻을 수 있다. 한 측면에서, 방법은 회충 분변항원에 대해 분변 샘플을 시험하기 위해 수행된다. 그러나, 방법은 분변 샘플을 시험하기 위해 수행되는 것으로 제한되지는 않는다. 따라서, 샘플은 분변 이외에, 예를 들면 전혈, 혈청, 모유 및 전체 조직, 예를 들면 유선, 장, 간, 심장, 폐, 식도, 뇌, 근육 및 눈으로부터의 조직일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 방법의 단계는 본 발명의 항체 중 하나 이상과 샘플을 접촉시키는 단계; 샘플에서 존재하는 경우에 폴리펩티드의 존재 하에 항체 폴리펩티드 복합체를 형성시키는 단계; 및 존재하는 경우에 항체-폴리펩티드 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 포유동물이 회충에 감염되었는지 또는 회충에 감염되지 않았는지 진단하는 단계 및 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 목적을 위해 항체와 접촉시킨 동일한 샘플 또는 포유동물로부터의 일부 다른 샘플에 회충으로부터의 핵산이 존재하는지 여부를 결정하는 단계인 임의의 단계들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 방법은 또한 회충이 존재하는 환경 오염에 대해 시험하기 위해 사용될 수 있다. 장치에 의해 회충에 대해 시험될 수 있는 환경 샘플은 마당, 정원, 모래 상자 및 운동장을 비롯한 주거 환경으로부터의 토양, 분해 물질, 또는 분변 물질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 시험 위치는 공원, 해변, 숲, 농장, 또는 개, 고양이, 또는 회충의 다른 포유동물 숙주로부터의 분변 물질에 노출되는 다른 위치를 포함할 수 있다. 실내 및 실외 배설물 상자로부터의 분변도 시험될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 임의로 예를 들면 본 발명의 장치 및 본 발명의 하나 이상의 조성물 및 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 키트는 임의로, 예를 들면 장치의 일부로서 사용되고/되거나 방법의 수행시에 사용되는 하나 이상의 지시약, 하나 이상의 항체 표지 화합물, 하나 이상의 항체, 하나 이상의 항원 포획 시약, 하나 이상의 억제제,및 하나 이상의 세척 시약을 추가로 포함할 수 있다.

도 1은 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 865-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 보여준다.
도 2는 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 632-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 2)을 보여준다.
도 3은 서열 1의 큰 오픈 리딩 프레임(open reading frame) (ORF)의 아미노산 서열 (서열 3)을 보여준다. 정지 코돈은 *로 표시한다.
도 4는 서열 2의 큰 ORF의 아미노산 서열 (서열 4)을 보여준다. 정지 코돈은 *로 표시한다.
도 5는 서열 4 및 서열 5의 비교 정렬을 보여준다. 서열 4 및 서열 5의 컨센서스 서열은 서열 7에 나타낸 바와 같다.
도 6a는 본 발명의 다중-웰 플레이트 장치를 보여준다.
도 6b는 본 발명의 특이적 항체가 그에 고정되어 있는 도 6a의 플레이트의 단일 웰의 확대도를 보여준다.
도 7은 실시예 1의 본 발명의 방법에 따라 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 샘플로부터 수득한 광학 밀도 (OD) 값의 그래프를 보여준다.
도 8은 실시예 2의 본 발명의 방법에 따라 회충, 구충 또는 편충에 감염된 개과동물로부터의 분변 샘플로부터 수득한 OD 값의 그래프를 보여준다.
도 9는 실시예 2의 본 발명의 방법에 따라 사상충에 감염된 개과동물로부터의 분변 샘플로부터 수득한 OD 값의 그래프를 보여준다.
도 10은 ELISA 분석을 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 회충, 구충, 편충 또는 사상충에 감염된 개과동물로부터의 분변 샘플을 사용하여 수행한 미세적정 플레이트를 보여준다.
도 11은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라, 개과동물이 회충에 감염되었을 때의 상기 개과동물 세트로부터의 분변 샘플, 및 회충이 없어진 후의 상기 개과동물로부터의 분변 샘플로부터 수득한 OD 값의 그래프를 보여준다.
도 12는 실시예 5의 본 발명의 방법에 따라 회충-감염된 고양이과동물로부터의 분변 샘플로부터 수득한 OD 값의 그래프를 보여준다.
도 13은 실시예 6의 본 발명의 방법에 따라, 고양이과동물이 회충에 감염되었을 때의 상기 고양이과동물 세트로부터의 분변 샘플, 및 회충이 없어진 후의 상기 고양이과동물로부터의 분변 샘플로부터 수득한 OD 값의 첫번째 그래프를 보여준다.
도 14는 실시예 6의 본 발명의 방법에 따라 회충에 감염되지 않은 대조 고양이과동물 세트로부터의 분변 샘플로부터 수득한 OD 값의 두번째 그래프를 보여준다.
도 15는 샘플로서 술포프로필 (SP) 컬럼으로부터의 용출 분획을 사용하는 ELISA를 보여주고, Copro6716이 실시예 7의 본 발명의 방법에 따라 SP 컬럼을 용출시킴으로써 부분적으로 정제되고 농축될 수 있음을 보여준다.
도 16은 실시예 7의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-전장 DIV6716 IgG-HRP로 프로빙한 웨스턴 블롯(western blot)을 사용하여 Copro6716의 분자량이 약 10 KD임을 보여준다.
도 17은 실시예 7의 본 발명의 방법에 따라 음영진 상자로 강조함으로써 식별되는 질량분광 분석에 의해 확인된 4개의 펩티드 (서열 8, 9, 10 및 11)가 존재하는 전장 DIV6716의 아미노산 서열 (서열 5)을 보여준다.

I. 도입

본 발명은 일반적으로 포유동물로부터 얻은 샘플에서 회충을 검출하는 방법, 장치, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들면 톡소카라, 예를 들면 톡소카라 카니스 또는 톡소카라 카티로부터의 회충 항원에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 톡소카라 폴리펩티드 및 그의 보존적 변이체, 이들 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 이들 폴리펩티드에 대해 발생하고 이들 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및 예를 들면 회충, 예를 들면 톡소카라, 톡사스카리스, 바일리사스카리스, 아스카리디아, 파라스카리스 및 아스카리스, 아니사키스, 또는 슈도테라노바, 예를 들면 티. 카니스, 티. 카티, 티. 비툴로룸, 티. 레오니나, 비. 프로시오니스, 에이. 갈리, 피. 에쿠오룸, 에이. 룸브리코이데스, 에이. 수움, 에이. 심플렉스, 또는 피. 데시피엔스를 검출하는 방법, 장치 및 키트에 관한 것이다.

본 발명은 상기 기존의 현미경 검사 기술보다 우수한 대안을 제공한다. 이것은 본 발명이 (1) 일관적으로 신뢰할 수 있는 결과의 제시와 사용 둘 다가 쉽고; (2) 포유동물이 구충, 편충 및/또는 사상충에 감염되었는지 여부와 상관없이 포유동물 내의 회충의 부재 또는 존재를 확인할 수 있고; (3) 감염된 숙주의 분변에서 회충란이 처음으로 보이는 시점 이전에 회충을 검출할 수 있는, 포유동물로부터의 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 조성물, 장치, 키트 및 방법을 제공한다는 점에서 사실이다.

본 발명은 부분적으로는 본 발명의 조성물의 예기치 않은 특성의 발견을 기초로 한다. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성된 본 발명의 항체가 심지어는 포유동물에 구충, 편충 및 사상충 중 하나 이상이 다수 존재하는 경우에도, 포유동물에서 회충 항원을 포획 및 검출하는데 사용될 수 있는 것으로 결정되었다. 회충에 대한 이러한 특이성은 놀라운 사실로서, 이것은 회충, 구충, 편충 및 사상충 모두가 관련되는 선충이고, 이들 충 중의 임의의 하나로부터 단리된 단백질에 대해 생성된 항체는 하나 이상의 다른 충, 숙주 항원, 또는 다른 숙주 성분과 교차반응할 것으로 예상되기 때문이다.

또한, 포유동물이 회충에 처음 감염되고 17일 경과시까지의 조기에 상기 항체가 포유동물에서 회충 항원을 포획 및 검출하는데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 감염 직후 및 감염된 포유동물의 분변에서 임의의 회충란이 나타나기 전에 회충을 검출할 수 있는 능력은 놀라운 사실로서, 이것은 숙주가 감염된 후 약 5 내지 8주까지는 감염 숙주의 분변에서 회충란이 일반적으로 나타나지 않기 때문이다.

따라서, 본 발명은 구충, 편충 및 사상충 중 하나 이상이 다수 존재할 수도 있는 포유동물에서 회충 항원을 특이적으로 포획 및 검출하기 위한 항체 및/또는 그의 단편을 사용하는 방법, 장치, 조성물 및 키트를 포함한다. 심지어 하나 이상의 다른 충 유형이 또한 존재하는 경우에도 회충을 검출 및 진단하는 본 발명의 능력 때문에, 포유동물을 돌보는 사람은 포유동물로부터 회충을 없애기 위한 치료법을 최적으로 선택할 수 있는 기회를 가질 수 있다. 또한, 일부의 경우에는, 포유동물이 처음 감염되고 17일 경과시까지의 조기에 회충을 검출하는 본 발명의 능력때문에, 포유동물을 돌보는 사람은 포유류가 회충에 의해 심각하게 아프기 전에 그러한 치료법을 시작할 수 있는 가능성을 제공받는다. 또한, 분변에서 충란이 나타나기 이전의 개입은, 기생충 감염이 다른 동물 또는 인간으로 확산되는 가능성을 크게 감소시키거나 제거할 수 있다.

II. 용어의 정의 및 사용

용어 "본 발명의 조성물"은 본원에서 명시적으로 설명되거나 함축적으로 포함되거나 또는 다른 방식으로 개시된, 본 발명의 방법을 수행함으로써 포유동물로부터 얻은 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 모든 핵산, 폴리펩티드, 항체, 및 이러한 핵산, 폴리펩티드, 및 항체 중 하나 이상과 하나 이상의 다른 화합물을 포함하는 혼합물을 의미한다.

그 내부에서 회충이 본 발명에 의해 검출될 수 있는 "포유동물로부터의 샘플"은 모든 신체 성분 및 그의 추출물, 예를 들면 회충 항원을 함유할 수 있는 임의의 유체, 고체, 세포 또는 조직을 포함한다. 따라서, 예시적인 샘플은 예를 들면 분변, 모유, 전혈 및 그의 일부, 예를 들면 혈청을 포함하고, 이로 제한되지 않고, 조직 추출물, 예를 들면 유선, 장, 간, 심장, 폐, 식도, 뇌, 근육 및 눈으로부터의 조직을 추가로 포함한다. 샘플은 포유동물로부터 직접 채취할 수 있거나 샘플은 포유동물과 접촉한 모든 것으로부터 채취할 수 있다. 예를 들면, 샘플은 포유동물의 갓 배설한 또는 부패한 분변일 수 있다. 또다른 예로서, 샘플은 예를 들면 포유동물에 의해 배출될 수 있는 신체 성분, 예를 들면 분변과 혼합될 수 있는 토양, 진흙, 모래, 식물 물질, 또는 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다. 샘플의 기원 또는 함량과 상관없이, 상기 샘플은 때때로 본원에서 "포유동물 샘플", "시험 샘플" 또는 "시험 중의 샘플"로 지칭된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 "유전자", "DNA", "cDNA", "EST", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "다중핵산", "RNA" 및 "mRNA"와 동의어이고, 따라서 상호 교환가능하게 사용된다. 핵산은 이중가닥 형태일 수 있거나, 단일가닥 형태일 수 있다. 또한, 핵산은 예를 들면 전체 회충 또는 그의 일부로부터 천연에서 단리되거나, 또는 예를 들면 재조합 숙주 유기체에서 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 인공적인 수단에 의해, 예를 들면 PCR-기반 기술을 사용하거나, 핵산을 합성하는 트랜스제닉 유기체를 생성하거나, DNA 합성 기기를 사용하거나, 또는 임의의 다른 분자 기반 기술에 의해 인공적으로 합성된다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되는 동의어로서, 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본 발명의 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질은 예를 들면 회충 전체 또는 회충의 일부로부터 천연에서 단리되거나, 또는 재조합 숙주 유기체에서 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 인공적인 수단에 의해 인공적으로 합성될 수 있다.

용어 "항체" 또는 "본 발명의 항체"는 구충, 편충 또는 사상충으로부터의 임의의 항원에 결합하지 않으면서 하나 이상의 회충 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 본 발명의 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드에 대해 생성시킬 수 있다. 달리 언급되지 않으면, 본 발명의 항체는 2 가지 이상의 상이한 유형의 항체의 혼합물을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 항체는 2가지 유형의 항체의 혼합물일 수 있고, 여기서 두 유형 중의 하나는 하나의 특정 항원에 특이적으로 결합하고, 두 유형 중의 다른 하나는 몇몇의 다른 항원에 특이적으로 결합한다.

"본 발명의 면역원성 폴리펩티드" 및 보다 간단히 "본 발명의 폴리펩티드"는 본 발명의 항체가 그에 대해 생성될 수 있는 면역원이다. 모든 "본 발명의 폴리펩티드"는 면역원성이고, 따라서 본 발명의 항체를 생산하기 위해 숙주 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 달리 언급되지 않으면, 본 발명의 폴리펩티드는 다수의 성분의 혼합된 조성물의 한 성분일 수 있음을 이해하여야 한다.

"면역원"은 예를 들면 그 물질에 노출된 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 물질, 예를 들면 본 발명의 면역원성 폴리펩티드이다.

용어 "회충"은 본원에서 사용될 때, 톡소카라, 톡사스카리스, 바일리사스카리스, 아스카리디아, 파라스카리스, 아스카리스, 아니사키스, 및 슈도테라노바 속을 포함하는 아스카리디다 목의 장내 회충과 같은 연충을 나타낸다. 따라서, 용어 "회충"은 본원에서 사용될 때, 선형동물 문의 전체를 의미하지는 않는다. 따라서, "회충"은 안실로스토마, 운시나리아, 네카토르, 트리쿠리스, 또는 디로필라리아 속의 임의의 구성원을 포함하지 않는다.

"회충 분변항원" 또는 "회충의 분변항원"은 회충에 감염된 포유동물의 분변에 존재하고 하나 이상의 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 회충 생성물이다. 예를 들면, 회충 분변항원은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드일 수 있고, 이로 제한되지 않는다.

본 발명자들은 티. 카니스의 배설/분비 단백질인 DIV6716의 신규한 10 kD 이소형이, 개과동물이 티. 카니스로 처음 감염되고 17일 경과시까지의 조기에 티. 카니스-감염된 개과동물의 분변에 존재하는 것으로 결정하였다. 따라서, "회충 분변항원"은 본 발명자들에 의해 개과동물 분변에서 관찰된 DIV6716의 상기 신규한 10 kD 이소형 (본원에서 "Copro6716"으로 지칭됨)일 수 있다.

"에 특이적인", "에 특이적으로 결합하다" 및 "에 안정적으로 결합하다"는 본 발명의 특정 조성물, 예를 들면 본 발명의 항체, 폴리펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드가 예를 들면 하나 이상의 다른 물질보다 더 큰 친화도로 하나 이상의 다른 물질을 인식하고 이에 결합함을 의미한다. 한 예로서, 본 발명의 항체는 항체가 비-회충 기생충으로부터의 임의의 다른 항원보다 더 큰 친화도로 회충 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있을 때 회충 항원"에 특이적인", "에 특이적으로 결합한다" 및 "안정적으로 결합한다"고 언급된다. 상기 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, ELISA 또는 방사성 면역분석 (RIA)을 사용하여 시험될 수 있다. 본 발명의 특정 조성물의 결합 특이성에 대해 관찰된 정보를 기초로 하여, 본 발명의 방법은 조성물의 특정 물질(들)에 대한 결합을 허용하지만 (따라서, 상기 결합의 검출을 허용하지만), 다른 물질에는 유의하게 결합하도록 허용하지 않는 조건을 유지하면서 상기 조건 하에서 수행할 수 있다. 한 예로서, 본 발명의 방법은 본 발명의 항체가 특정 샘플에 존재하는 하나 이상의 회충 항원에 결합하는 것을 허용하지만 (따라서, 상기 결합의 검출을 허용하지만), 샘플에 존재할 수 있는 임의의 구충, 편충 또는 사상충 항원에는 유의하게 결합하도록 허용하지 않는 조건 하에서 수행할 수 있다.

"회충의 검출"은 예를 들면 하나 이상의 회충-특이적 생성물, 예를 들면 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 항체 및 핵산, 또는 하나 이상의 회충 항원 또는 Copro6716의 검출을 의미한다. 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 회충 생성물의 존재는 임의의 전체 회충 유기체 또는 그의 충란이 또한 그 샘플에 존재하는지의 여부와 상관없이 포유동물이 회충에 감염되었음을 나타낸다. 반대로, 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 회충 생성물의 부재는 포유동물이 회충에 감염되지 않았음을 나타낸다.

"아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산을 나타낸다. 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 알라닌은 A 또는 Ala이고; 아르기닌은 R 또는 Arg이고; 아스파라긴은 N 또는 Asn이고; 아스파르트산은 D 또는 Asp이고; 시스테인은 C 또는 Cys이고; 글루탐산은 E 또는 Glu이고; 글루타민은 Q 또는 Gln이고; 글라이신은 G 또는 Gly이고; 히스티딘은 H 또는 His이고; 이소류신은 I 또는 Ile이고; 류신은 L 또는 Leu이고; 라이신은 K 또는 Lys이고; 메티오닌은 M 또는 Met이고; 페닐알라닌은 F 또는 Phe이고; 프롤린은 P 또는 Pro이고; 세린은 S 또는 Ser이고; 트레오닌은 T 또는 Thr이고; 트립토판은 W 또는 Trp이고; 타이로신은 Y 또는 Tyr이고; 발린은 V 또는 Val이다. 본원에서 달리 규정되는 경우를 제외하고, X 또는 Xaa는 임의의 아미노산을 나타낸다. 다른 관련 아미노산은 4-히드록시프롤린 및 5-히드록시라이신을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 모든 경우에, 본원에서 설명되거나 달리 언급되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열의 맨 왼쪽 또는 제1 아미노산 잔기가 N-말단 잔기이고 서열의 맨 오른쪽 또는 마지막 아미노산 잔기가 C-말단 잔기인 통상적인 형태로 제시된다.

임의의 특정 핵산 서열의 "보존적 변이체"는 특정 핵산 서열에 대한 하나 이상의 다의성(degenerate) 코돈 치환이 존재하는 임의의 서열, 특정 핵산 서열에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입 및 결실이 존재하는 임의의 서열 및 특정 핵산의 상보성 서열 및 상기 상보성 서열의 보존적 변이체를 포함한다. 특정 핵산 서열의 보존적 변이체는 특정 핵산 서열에 대해 바람직하게는 약 85％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 동일성, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 95-99％ 이상의 동일성을 갖는다. 특정 핵산 서열의 보존적 변이체는 인공적으로 합성될 수 있거나, 예를 들면 회충 유기체, 예를 들면 톡소카라 카니스 및 톡소카라 카티를 비롯한 유기체로부터 그의 천연 형태로 단리될 수 있다.

임의의 특정 폴리펩티드 서열의 "보존적 변이체"는 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이하지만, 특정 폴리펩티드에 대해 생성시킨 본 발명의 항체가 변이체 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있도록 특정 폴리펩티드의 특이적인 결합 특성을 계속 보유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 폴리펩티드이다. 따라서, 예를 들면, 특정 폴리펩티드의 보존적 변이체는 특정 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가 및 삽입을 가질 수 있다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드의 보존된 변이체는 특정 폴리펩티드에 대한 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하의 보존된 아미노산 치환을 가질 수 있다. 특정 폴리펩티드의 보존적 변이체는 필수적이지는 않지만, 바람직하게는 특정 폴리펩티드에 대한 약 80％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 동일성, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 91-99％ 이상의 동일성을 갖는다. 다른 "표적" 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 임의의 대상 핵산 또는 아미노산 서열 (예를 들면, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드)의 동일성 ％는 다음과 같이 결정될 수 있다. 먼저, 본 발명의 표적 핵산 또는 아미노산 서열은 BLASTN 및 BLASTP를 함유하는 BLASTZ의 단독형(stand-alone) 버전 (예를 들면, 버전 2.0.14)로부터의 BLAST 2 시퀀시즈(Sequences) (Bl2seq) 프로그램을 사용하여 대상 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 비교 및 정렬될 수 있다. BLASTZ의 단독형 버전은 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 얻을 수 있다. BLASTZ, 구체적으로 Bl2seq 프로그램을 사용하는 방법을 설명하는 내용은 BLASTZ에 부수되는 "readme" 파일에서 볼 수 있다. 프로그램은 또한 문헌 [Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264]; [Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873]; 및 [Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389]에 상세하게 기재되어 있다.

"Copro6716"은 포유동물 분변에서 발견되는 DIV6716의 10 kD 부분을 의미한다.

Bl2seq는 BLASTN (핵산 서열의 비교를 위해 사용됨) 또는 BLASTP (아미노산 서열의 비교를 위해 사용됨) 알고리즘을 사용하여 대상 서열과 표적 서열 사이의 비교를 수행한다. 일반적으로, BLOSUM62 스코어링 매트릭스, 갭(gap) 존재 코스트 11 및 연장 코스트 1, 단어 크기 3, 기대값 10, 잔기당 코스트 1 및 람다 비율 0.85의 디폴트 파라미터가 아미노산 서열 정렬을 수행할 때 사용된다. 출력 파일은 표적 서열과 대상 서열 사이의 정렬된 상동성 구역을 함유한다. 정렬된 후, 길이는 임의의 매치된 위치로부터 시작하여 임의의 다른 매치된 위치에서 종결되는 대상 서열로부터의 서열과 정렬되는 표적 서열로부터의 연속적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 (즉, 갭 제외)의 수를 계수함으로써 결정된다. 매치된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 표적 및 대상 서열 모두에 존재하는 임의의 위치이다. 구조적으로 보존된 도메인 (예를 들면, α-나선, β-시트, 및 루프) 사이의 서열 정렬을 최대화하기 위해서 하나 이상의 잔기의 갭이 표적 또는 대상 서열 내에 삽입될 수 있다.

특정 길이에 걸친 동일성 ％는 특정 길이에 걸쳐 매치된 위치의 수를 계수하고, 그 수를 길이로 나누고, 생성되는 값에 100을 곱하여 결정된다. 예를 들면, (i) 500개 아미노산의 표적 서열이 대상 아미노산 서열과 비교되고, (ii) Bl2seq 프로그램이, 200개 아미노산 구역의 제1 및 마지막 아미노산이 매치되는, 대상 서열의 구역과 정렬된 표적 서열로부터의 200개의 아미노산을 제시하고, (iii) 이러한 200개의 정렬된 아미노산에 걸친 매치의 수가 180이면, 500개 아미노산의 표적 서열은 200개의 길이 및 길이의 90％에 걸친 서열 동일성 (즉, 180/200x100=90)을 함유한다. 대상 서열과 정렬되는 핵산 또는 아미노산 표적 서열은 많은 상이한 길이를 생성시킬 것이고, 각각의 길이는 그 자신의 동일성 ％를 갖는다는 것이 이해될 것이다. 동일성 ％ 값은 소수점 첫째 자리에서 반올림될 수 있음을 유의한다. 예를 들면, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1로 반올림되고, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 반올림된다. 또한, 길이 값은 항상 정수일 것임을 유의한다.

특정 폴리펩티드 서열의 보존적 변이체는 인공적으로 합성될 수 있거나 또는 유기체, 예를 들면 회충 유기체, 예를 들면 톡소카라 카니스 및 톡소카라 카티로부터 그의 천연 형태로 단리될 수 있다. 하나의 구체적인 예에서, 아래 제시된 서열 4에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드의 보존적 변이체이고, 이것은 서열 4가 131개 아미노산의 정렬에 걸쳐 서열 3에 92％ 초과로 동일하기 때문이다. 보다 일반적으로는, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7 중의 각각의 하나는 서로에 대한 보존된 변이체이다. 또한, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7의 다른 보존된 변이체가 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 의해 고려됨을 이해하여야 하지만, 당업자는 상기 고려되는 모든 변이체가 나열하기에는 너무 많음을 알 것이다. 또한, 당업자는 상기 변이체가 염기성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 산성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 극성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 소수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 방향족 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 및 작은 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함하고 이로 제한되지 않음을 알 것이다 ("염기성" 아미노산 잔기는 K, R 및 H이다. "산성" 아미노산 잔기는 D 및 E이다. "극성" 아미노산 잔기는 N 및 Q이다. "소수성" 아미노산은 I, L 및 V이다. "방향족" 아미노산 잔기는 F, Y 및 W이다. "작은" 아미노산은 G, S, A, T 및 M이다).

III. 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드

본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 2008년 5월 19일 출원된 출원번호 61/128,079, "회충 검출을 위한 방법, 장치, 키트 및 조성물(Methods, Devices, Kits And Compositions For Detecting Roundworm)"의 가출원에 상세하게 기재되어 있고, 이들은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.

분변 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있는 조성물을 확인하기 위한 시도에서, 2개의 발현서열표식 (EST) 클론의 일부에 대응하는 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (ko15fo7 및 ko34f08이고, 미주리주 세인트 루이스의 워싱턴 유니버시티 게놈 시퀀싱 센터(Washington University Genome Sequencing Center)로부터 입수가능함)를 설계하고 합성하여, 톡소카라 카니스 또는 톡소카라 카티로부터 단리된 총 RNA를 포함하는 5' RACE, 3' RACE 및 RT-PCR 반응에 사용하였다. 상기 노력의 결과, 865-뉴클레오티드 cDNA 서열이 톡소카라 카니스로부터 추정되었고 (이 서열은 도 1에 제시되고, 본원에서 서열 1로 확인됨), 632-뉴클레오티드 cDNA 서열이 톡소카라 카티로부터 추정되었다 (이 서열은 도 2에 제시되고, 본원에서 서열 2로 확인됨) (서열 1을 사용하여 수행한 BLAST 탐색은 상기 서열의 일부가 톡소카라 카니스의 TBA-1 단백질의 일부를 코딩할 것으로 예측되는 핵산 서열, 및 아스카리스 룸브리코이데스의 ABA-1 단백질을 코딩할 것으로 예측되는 핵산 서열과 유사하지만 이와 동일하지 않거나 실질적으로 동일한 것임을 나타내었다) (문헌 [S. Yahiro et al., Parasite Immunology 20:351-7 (1998)]; [M. W. Kennedy, Parasitology Today 16:373-80 (2000)]; 및 [Y. Xia et al., Parasitology 120:211-24 (2000)] 참조).

서열 1 및 서열 2에 대응하는 서열의 분석은 이들 서열 중 각각 하나가 큰 ORF를 함유한다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 도 3에 제시한 바와 같이, 서열 1의 큰 ORF는 서열 1의 뉴클레오티드 2 내지 616에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:

또한, 도 4에 제시한 바와 같이, 서열 2의 큰 ORF는 서열 2의 뉴클레오티드 1 내지 486에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:

본 발명의 폴리펩티드는 서열 1 및 서열 2의 전부 또는 일부, 또는 상기 서열의 임의의 보존적 변이체의 전부 또는 일부에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 가변적임을 이해하여야 한다.

예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 4의 전부 또는 일부, 또는 서열 3 또는 서열 4의 임의의 보존적 변이체의 전부 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

하나의 구체적인 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 갖는다:

130개의 아미노산이 존재하는 단백질 DIV6716 (서열 5)은 크기가 약 14 kD이다. 따라서, 본 발명자들은 14 kDa 버전이 아니라, 전장 (14 kDa) 단백질의 말단 절단된 부분 (약 10 kDa)만이 티. 카니스로 감염된 개과동물의 분변에 존재하는 것을 밝혀내었다 (상기 DIV6716의 10 kDa의 말단 절단된 부분은 본원에서 "Copro6716"으로 언급되고; 티. 카니스-감염된 개과동물의 분변에서 Copro6716의 검출은 본원에 포함된 실시예 부분에서 설명된다). 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 Copro6716을 특이적으로 포획 및 검출하기 위해 사용될 수 있는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드를 제공한다.

서열 5에 대응하는 폴리펩티드 (DIV 6716)의 N-말단 메티오닌 잔기 다음의 129개의 아미노산 잔기는 서열 3의 아미노산 잔기 14 내지 142를 구체적으로 나타낸다. 본원에 포함된 실시예 부분에 기재된 바와 같이, N-말단 메티오닌을 표준 클로닝 기술을 수행함으로써 상기 폴리펩티드의 N-말단에 인공적으로 부가하였다. 또한, 실시예 부분 전체에서 설명되는 바와 같이, 서열 5에 대응하는 폴리펩티드에 대해 생성시킨 항체는 회충 항원의 검출에 유용하였다. N-말단 메티오닌을 인공적으로 부가하였고, 이는 천연에서 톡소카라에 존재하는 것으로 생각되지 않기 때문에 (서열 3 및 서열 4 중 각각 하나의 위치 14의 히스티딘 잔기 바로 앞에 존재하는 잔기는 메티오닌이 아니라 아르기닌임), 따라서 본 발명의 폴리펩티드가 서열 3의 아미노산 잔기 14 내지 142에 대응하는 아미노산 서열, 또는 보다 구체적으로 하기 서열을 가질 수 있음이 고려된다:

또한, 서열 4 (톡소카라 카티-유래된 서열)에 대한 서열 5 (대부분 톡소카라 카니스-유래된 서열; 유일한 예외는 N-말단 메티오닌 잔기임)의 정렬을 도 5에 제시한다. 서열 5에 대응하는 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 톡소카라 카티의 검출에 유용하였기 때문에 (본원에 포함된 실시예 부분 참조), 또한 본 발명의 폴리펩티드는 서열 7에 대응하는 아미노산 서열 (도 5에 함께 제시되어 있음)을 가질 수 있을 것으로 고려되고, 여기서 위치 1의 X는 I이거나 존재하지 않고, 위치 2의 X는 Y이거나 존재하지 않고, 위치 3의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 4의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 5의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 6의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 7의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 8의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 9의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 10의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 11의 X는 R 또는 M이고, 위치 18의 X는 N 또는 K이고, 위치 37의 X는 Q 또는 K이고, 위치 52의 X는 I 또는 V이고, 위치 55의 X는 Y 또는 F이고, 위치 110의 X는 E 또는 D이고, 위치 133의 X는 K 또는 E이고, 위치 135의 X는 Y 또는 F이고, 위치 138의 X는 A 또는 P이고, 위치 139의 X는 A 또는 I이고, 위치 140의 X는 S 또는 D이고, 위치 141의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 142의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 143의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 144의 X는 K이거나 존재하지 않고, 위치 145의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 146의 X는 D이거나 존재하지 않고, 위치 147의 X는 P이거나 존재하지 않고, 위치 148의 X는 Y이거나 존재하지 않고, 위치 149의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 150의 X는 N이거나 존재하지 않고, 위치 151의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 152의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 153의 X는 P이거나 존재하지 않고, 위치 154의 X는 D이거나 존재하지 않고, 위치 155의 X는 E이거나 존재하지 않고, 위치 156의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 157의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 158의 X는 E이거나 존재하지 않고, 위치 159의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 160의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 161의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 162의 X는 S이거나 존재하지 않는다.

또한, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7 중의 임의의 하나 이상은 단지 더 큰 폴리펩티드 서열의 일부일 수 있고, 따라서 예를 들면 회충에서 정상적으로 발현되는 하나 이상의 단백질, 또는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 Copro6716에 인공적으로 융합된 하나 이상의 폴리펩티드 서열의 부분 서열을 나타낼 수 있는 것으로 고려된다. 당업자는 2 이상의 폴리펩티드 단편을 함께 인공적으로 융합하기 위한 다양한 기술이 존재함을 알 것이다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 심지어 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 Copro6716 중의 하나를 초과하여 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 7에 융합된 서열 5를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 Copro6716에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 함께 융합되는 서열 5에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편에 의해 형성될 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 조합으로 함께 융합되는, 서열 5에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편 및 서열 7에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 하나의 특정 폴리펩티드가 특정 기술 (본원에 포함되는 실시예 부분에서 설명되는)에 의해 발현되고 단리되었지만, 당업자는 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 임의의 하나 이상의 다양한 기술을 사용하여 단리할 수 있음을 이해할 것이다 (예를 들면, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sewald and Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Wiley Publishing (2002)]; [Peptide Synthesis and Applications (Methods in Molecular Biology) Howl, ed., Humana Press (2005)]; [Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (2002)] 참조). 상기 기술은 기존의 천연 폴리펩티드, 예를 들면 Copro6716 또는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 임의의 천연 발생 변이체를 단리하기 위해 수행될 수 있는 기술을 포함한다. 상기 기술은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 Copro6716과 같은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 임의의 보존된 변이체를 인공적으로 생성하기 위해 수행될 수 있는 기술을 추가로 포함한다. 상기 변이체는, 예를 들면 임의의 하나 이상의 돌연변이 유발 기술을 사용하거나 또는 직접 합성에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 본 발명의 항체를 생산하기 위해 상기 폴리펩티드에 노출된 숙주 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 이들이 유도되는 기술에 상관없이, 본 발명의 폴리펩티드는, 바람직하게는 항체 생성을 위해 사용되어야 할 때 실질적으로 순수한 형태로 제조된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 약 80％ 이상 순수한, 보다 바람직하게는 약 90-95％ 이상 순수한, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 99％ 이상 순수하다. 숙주 유기체에서 면역 반응을 유도하고 그로부터 항체를 단리하기 위한 예시적인 기술이 본원에 기재되지만, 본 발명이 이들 기술로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 당업자는 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 상기 목적을 달성하기 위한 다수의 기술이 존재함을 알 것이다.

IV. 본 발명의 항체

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드의 전부 또는 일부에 대해 생성되고 이에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함하고, 또한 상기 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함한다. 포유동물로부터 얻은 샘플에 접촉될 때, 상기 항체 및 항원-결합 단편은 샘플에 존재하는 회충 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 샘플에 존재할 수 있는 구충, 편충 또는 사상충으로부터의 임의의 항원에는 특이적으로 결합할 수 없다. 본 발명의 항체는 단지 하나 이상의 회충 항원을 포획하기 위해, 단지 하나 이상의 회충 항원을 검출하기 위해, 또는 보다 바람직하게는 하나 이상의 회충 항원을 포획 및 검출하기 위해 사용하기 적절하다.

본 발명의 항체는 예를 들면 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 클래스에 속할 수 있고, 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들면, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998)]; [Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994)]; [Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994)]; [Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994)]; [Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993)]; [Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992)]; [Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)]; [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]; 및 [Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Howard and Kaser, eds., CRC Press (2006)] 참조).

하나의 기술에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면 숙주 동물, 예를 들면 토끼, 마우스, 래트, 기니 피그, 염소, 돼지, 소, 양, 당나귀, 개, 고양이, 닭 또는 말 내로 도입된다. 증강된 면역 반응은 폴리펩티드를 담체와 회합시키고/시키거나 숙주를 어쥬번트(adjuvant)에 노출시킴으로써 숙주 동물에서 유도될 수 있지만, 본 발명이 폴리펩티드를 담체와 회합시키거나 숙주를 어쥬번트에 노출시킬 것을 필요로 하지 않음을 이해하여야 한다. 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 예시적인 담체에는 소 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제이다. 예시적인 어쥬번트는 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 어쥬번트 및 MDL-TDM 어쥬번트를 포함한다. 폴리펩티드를 상기 담체와 회합시키거나 숙주를 어쥬번트에 노출시키는지의 여부와 무관하게, 부스터(booster) 면역화를 임의로 수행할 수 있고, 숙주 동물은 이후에 1회 이상 방혈된다. 이어서, 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는 혈액 또는 혈액들로부터 얻은 항혈청으로부터 정제될 수 있다. 이러한 정제는, 예를 들면 폴리펩티드를 고체 지지체에 회합시키는 것을 수반하는 친화도 크로마토그래피 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다. 상기 친화도 크로마토그래피 기술은 당업자에게 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 5에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다 (이하에서, 상기 특정 항체는 "항-DIV6716"으로 지칭됨). 항-DIV6716 pAB를 생성 및 단리하는 특정 기술은 본원에 포함된 실시예 부분에 기재되어 있으나, 당업자는 항-DIV6716 pAB, 또는 본 발명의 임의의 다른 항체의 생산 및 단리가 그러한 특정 기술로 제한되지 않음을 알 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 5에 대응하는 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 대해 숙주에서 생성된다. 일부의 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 3, 서열 4, 서열 6 또는 서열 7의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 임의의 상기 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 대해 숙주에서 생성된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Copro6176 및/또는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 대응하는 아미노산 서열 또는 그의 항원 부분을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Copro6176의 보존적 변이체 또는 서열 5에 대응하는 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 다른 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 3, 서열 4, 서열 6 또는 서열 7의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 임의의 상기 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

또한, 본 발명의 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 단일쇄 항체 (scFv), 키메라(chimeric) 항체, 및 그의 단편일 수 있음을 이해하여야 한다. 관심있는 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들면 관심있는 폴리펩티드에 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 세포주를 생성시킴으로써 얻고 정제될 수 있다. 상기 종류의 세포주는 상기 설명한 바와 같이 폴리펩티드로 사전에 면역화된 숙주 동물로부터 단리된 특정 종류의 세포 (예를 들면, 비장 세포)로부터 유도될 수 있다. 이어서, 상기 경우에, 상기 세포는, 예를 들면 당업자에게 공지된 임의의 하나의 다양한 융합 기술을 수행하여 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 불멸화될 수 있다. 하나의 예시적인 기술에서, 면역화된 숙주 동물로부터의 세포는 하이브리드(hybrid) 세포 (골수종 융합 파트너가 아니라)의 성장을 지지하는 배지에 도말되기 전에 짧은 시간 동안 세제의 존재 하에 그의 융합 파트너, 예를 들면 골수종 세포와 함께 동시 인큐베이션된다. 상기 선택은, 예를 들면 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT)을 사용하여 달성될 수 있다. 아마도 선택 과정 개시 1주 또는 2주 후에 하이브리드 세포가 선택 동안 출현할 때, 단일 하이브리드 콜로니 (및 이들의 상등액)는 그에 대해 숙주 동물이 면역화되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들에 결합하는 그들의 능력에 대해 시험된다. 가장 최적의 결합 특이성을 갖는 하이브리드 콜로니는 그로부터 모노클로날 항체가 단리될 수 있는 최상의 후보를 제시할 것이다. 상기 모노클로날 항체는, 예를 들면 상기 콜로니가 당업자에게 공지된 임의의 하나의 다양한 기술을 사용하여 성장하는 상등액 (즉, 배지)으로부터 직접 단리될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체 (scFv), 또는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 구역을 포함하는 무손상 항체의 일부이고, 상기 일부에는 무손상 항체의 Fc 구역의 불변 중쇄 도메인이 존재하지 않는다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ 및 F_v 단편을 포함한다. 동물 또는 포유동물 세포로부터의 생산 및 정제 이외에, 항체, 항체 단편, 또는 비-항체 스캐폴드(scaffold)는 다양한 시험관내 기술, 예를 들면 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 또는 세균 디스플레이를 기초로 하여 선택될 수 있다.

2차 항체를 포함하는 항체는 당업계에 공지된 임의의 종류의 표지, 예를 들면, 형광, 화학발광, 방사성, 효소, 콜로이드성 입자, 방사성 동위원소 및 생체발광 표지로 표지될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 항체는 효소, 콜로이드성 입자, 방사성 핵종 또는 형광단으로 표지된다. 입자형 표지는 예를 들면 항체에 접합된 착색 라텍스 입자, 염료 졸(sol), 또는 금 졸일 수 있다.

V. 본 발명의 방법, 장치 및 키트

A. 본 발명의 장치 및 키트

한 측면에서, 본 발명은, 예를 들면 포유동물, 예를 들면 개과동물, 고양이과동물, 돼지과동물, 소과동물, 또는 인간에서 회충 감염을 검출하기 위한 장치이다. 상기 장치는 구충, 편충 및 사상충을 비롯한 하나 이상의 다른 기생충으로 감염될 수도 있는 포유동물로부터의 샘플에서 회충 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 돕도록 배열된다.

한 측면에서, 장치는 고체 지지체를 포함하고, 하나 이상의 본 발명의 항체가 고체 지지체 상에 고정된다. 고체 지지체는, 예를 들면 미세적정 플레이트의 웰의 내부, 저변 표면 또는 측방 유동 장치의 일부로서 포함되는 기판일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 미세적정 플레이트는 이뮬론(Immulon) 1B 96-웰 플레이트 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 밀포드)로부터 시판됨)이지만, 당업자는 이뮬론 1B 96-웰 플레이트가 아닌 매우 다양한 다른 미세적정 플레이트가 그에 대한 항체의 고정을 허용하고, 따라서 본 발명의 고체 지지체의 제공에 적절함을 알 것으로 이해된다.

예시적인 측방 유동 장치는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,726,010호에 기재된 측방 유동 장치이다. 측방 유동 분석을 수행하기 위한 장치는 SNAP® 장치 (이덱스 래보래토리즈, 인크. (IDEXX Laboratories, Inc., 미국 메인주 웨스트브룩)로부터 시판됨)일 수 있다. 그러나, 당업자는 SNAP® 장치가 아니거나, 미국 특허 제5,726,010호에 설명되지 않은 매우 다양한 다른 측방 유동 장치가 그에 대한 항체의 고정을 위해 이용가능하고, 따라서 본 발명의 장치로서 사용하기 적절함을 알 것임을 이해하여야 한다. 상기 장치는, 예를 들면 콜로이드성 금 기술을 이용하는 측방 유동 장치를 포함할 수 있다.

본 발명의 장치에 사용되는 항체는, 예를 들면 공유 또는 비-공유 방식으로, 직접 또는 간접적으로 항체를 고체 지지체에 부착시키는 것을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 따라서, 상기 항체는 물리적 흡착 (즉, 화학적 링커를 사용하지 않음)에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있지만, 이들 항체는 당업자에게 익히 공지된 임의의 화학적 결합 (즉, 화학적 링커의 사용을 통함) 방법에 의해 고체 지지체에 고정될 수도 있다.

또한, 고체 지지체는 본 발명의 항체의 고정을 위한 임의의 적절한 물질일 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들면, 고체 지지체는 비드, 입자, 튜브, 웰, 프로브, 딥스틱(dipstick), 피펫 팁, 슬라이드, 섬유, 멤브레인, 종이, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 유리, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 플라스틱, 자철석 또는 당업자에게 익히 공지된 임의의 다른 적절한 물질일 수 있다.

상기 장치는, 임의로 본 발명의 장치에 적용하기 전에 포유동물로부터의 샘플과 혼합될 수 있는 하나 이상의 표지된 항원 포획 시약을 포함할 수 있다. 표지된 항원 포획 시약이 포함될 때, 표지된 항원 포획 시약은 장치의 고체 표면 상에 퇴적되거나 건조될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. "항원 포획 시약"은 관심있는 항원 또는 항원들에 특이적인 임의의 화합물을 나타낸다. 포유동물 샘플에 첨가되거나 또는 장치 상에 예비-퇴적되었는지와 상관없이, 표지된 항원 포획 시약은, 예를 들면 본 발명의 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는, 회충 항원에 특이적인 표지된 항체일 수 있다. 단지 한 실시예에서, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-DIV6716 pAB 또는 항-Copro6716이 표지된 항원 포획 시약으로서 사용될 수 있다.

또한, 장치는 반응 구역 (고체상)으로부터 결합되지 않은 물질 (예를 들면, 포유동물 샘플의 반응하지 않은 부분, 예를 들면 분변 추출물의 반응하지 않은 부분, 및 결합되지 않은 항원 포획 시약)을 수송하거나 (예를 들면, 장치가 SNAP® 장치일 때), 또는 그 제거를 용이하게 하는 (예를 들면, 장치가 미세적정 플레이트를 포함할 때) 액체 시약을 임의로 포함할 수 있다. 액체 시약은 세척 시약일 수 있고, 반응 구역으로부터 단지 결합되지 않은 물질을 제거하는 작용을 할 수 있거나, 또는 검출기 시약을 포함하고, 결합되지 않은 물질을 제거하고 항원 검출을 용이하게 하는 둘 다의 작용을 할 수 있다. 예를 들면, 효소에 접합된 항원 포획 시약의 경우에, 검출기 시약은 반응 구역 (고체상)에서 효소-항체 접합체와의 반응시에 검출가능한 신호를 생성시키는 기질을 포함한다. 별법으로, 방사성, 형광, 또는 흡광 분자에 접합된 표지된 항원 포획 시약의 경우에, 액체 시약은 단지 비결합된 표지된 시약을 세척 제거함으로써 반응 구역에서 복합체 형성의 검출을 용이하게 하는 세척 용액으로 작용할 뿐이다.

액체 시약은 제한된 양의 "억제제", 즉, 검출가능한 최종 생성물의 발생을 차단하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 제한된 양은 검출가능한 최종 생성물이 생산되는 시점에 대부분 또는 모든 과량의 결합되지 않은 물질이 제2 구역으로부터 수송될 때까지 최종 생성물 발생을 차단하기에 충분한 억제제의 양으로서 규정된다.

또한, 본 발명의 장치는 항원 포획 시약 또는 시약들과 상이한 위치에 고정된 다양한 결합 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, 표지된 항체의 종-특이적 (예를 들면, 회충-특이적) 항체 부분 또는 항원 포획 시약, 또는 효소-표지된 시약의 효소 부분을 인식하는 면역시약 (항체, 항원 또는 폴리펩티드)이 장치 내의 시약의 생존력을 평가하기 위한 양성 대조군으로서 포함될 수 있다. 예를 들면, 양성 대조군은, 예를 들면 염소 또는 마우스에서 생성된 항-양고추냉이 퍼옥시다제 항체일 수 있다. 추가로, 시약, 예를 들면 항원-항체 복합체의 항체 부분이 유도된 종의 비-면역 구성원으로부터 단리된 항체가 면역복합체 (즉, 항원-항체 복합체) 형성의 특이성을 평가하기 위한 음성 대조군으로서 포함될 수 있다.

포유동물 샘플에서 회충을 검출하도록 설계되는 것 이외에, 본 발명의 장치는, 임의로 수행될 하나 이상의 다른 진단 시험이 가능하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 또한 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 또는 하나 이상의 세균의 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균의 검출을 위한 시약은, 예를 들면 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 또는 하나 이상의 세균에 특이적인 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 항체 또는 하나 이상의 항원일 수 있다.

한 실시양태에서, 도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이, 본 발명의 장치는 다수의 웰 12를 포함하는 미세적정 플레이트 10이고, 각각의 웰 12는 그 위에 고정된 항-DIV6716 pAB (요소 16으로 나타냄)를 갖는 고체 지지체 14를 포함한다.

플레이트 10은 포유동물 샘플에서 회충을 검출하기 위해 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 특히, 회충 감염은 하나 이상의 회충 항원을 고체 지지체 14 상에 고정된 항-DIV6716 pAB로 검출함으로써 포유동물에서 진단될 수 있다. 한 실시양태에서, 검출되는 항원은 회충 분변항원이다. "회충 분변항원"은 분변 샘플에 존재하고 항-DIV6716 pAB 또는 항-Copro6716에 특이적이고 안정적으로 결합할 수 있는 회충의 임의의 생성물 또는 생성물들이다. 따라서, 회충 분변항원은 전체 회충, 회충란, 회충 단편, 또는 회충으로부터 분비, 배설 또는 탈락된 생성물 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 회충 분변항원은, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면 Copro6716, 및 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 상기 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및/또는 임의의 상기 폴리펩티드의 항원 단편을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이 회충-감염된 개과동물로부터 수득된 분변 샘플에서 본 발명에 의해 검출된 예시적 회충 분변항원은 Copro6716이다.

본 발명은 포유동물 샘플에서 회충을 검출하기 위한 분석 키트 (예를 들면, 제품)를 추가로 포함한다. 따라서, 키트는 본 발명의 하나 이상의 장치 및/또는 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 항-회충 항체 및 샘플에서 회충 항원에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 하나의 특정 예에서, 상기 키트는 고정된 항-회충 항체, 예를 들면 항-DIV6716 pAB 또는 항-Copro6716 pAB, 예를 들면 하나 이상의 항원 포획 시약 (예를 들면, 비-고정된 표지된 항원 포획 시약 및 고정된 항원 포획 시약) 및 세척 시약 및 검출기 시약 및 원하거나 적절한 경우 양성 및 음성 대조군 시약을 갖는 장치를 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 성분, 예를 들면 버퍼, 대조군 등이 상기 시험 키트에 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하도록 상이할 수 있다. 특히, 시약은 대체로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있고, 용해 시에 샘플과 조합하기 위한 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다. 본 발명의 키트는 본 발명의 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 지시서, 예를 들면 키트와 함께 포함되는 본 발명의 임의의 장치 및/또는 조성물을 사용하기 위한 지시서를 추가로 포함할 수 있다.

B. 본 발명의 방법

본 발명은 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 하나 이상의 장치, 키트 및/또는 조성물을 사용하기 위한 방법을 추가로 포함한다. 따라서, 방법은 개과동물, 고양이과동물, 돼지과동물, 소과동물 또는 인간을 포함하고 이로 제한되지 않는 포유동물로부터 얻은 샘플, 예를 들면 분변 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 또한, 방법은, 예를 들면 톡소카라, 예를 들면 티. 카니스 또는 티. 카티 또는 티. 비툴로룸을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 그러나, 이들 방법은 톡소카라 검출에 사용되는 것으로 제한되지는 않으며, 따라서 이들 방법이, 예를 들면 다른 종류의 회충, 예를 들면 톡사스카리스, 예를 들면 티. 레오니나, 바일리사스카리스, 예를 들면 비. 프로시오니스, 아스카리디아, 예를 들면 에이. 갈리, 파라스카리스, 예를 들면 피. 에쿠오룸, 아스카리스, 예를 들면 에이. 룸브리코이데스 및 에이. 수움, 아니사키스, 예를 들면 아니사키스 심플렉스, 또는 슈도테라노바, 예를 들면 피. 데시피엔스를 검출하기 위한 목적으로 수행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이들 방법은 심지어는 샘플이 구충, 편충 및/또는 사상충으로부터의 하나 이상의 생성물을 비롯한 다른 충 종류로부터 유래된 하나 이상의 생성물을 포함하는 경우에도, 샘플에서 회충의 상기 존재 또는 부재를 확인하는데 유용하다.

본 발명의 방법에서, 회충의 검출은, 예를 들면 하나 이상의 회충 항원, 예를 들면 Copro6716, 또는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 또는 서열 7에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 서열의 항원 단편 및/또는 보존적 변이체의 존재 또는 부재를 검출함으로써 수행할 수 있다. 회충에 대한 시험 중의 샘플이 분변일 경우, 분변의 가용성 부분은 당업계에 공지된 임의의 프로토콜에 의해 수집될 수 있다. 예를 들면, 본원의 실시예 부분에서 설명되는 특정 프로토콜 이외에, 샘플의 가용성 부분은, 일반적으로 여과, 추출, 원심분리, 또는 단순한 혼합, 이어서 중력 침강을 이용하여 수집할 수 있다. 당업자는, 또한 포유동물로부터의 비-분변 샘플을 추출하고 제조하는 다양한 방식이 존재함을 알 것이다. 예를 들면, 샘플은 포유동물에서 천연적으로 배설 또는 방출되거나, 또는 포유동물로부터 인공적으로 얻은 체액일 수 있다. 상기 인공적인 추출은 포유동물의 젖을 짜내거나, 또는 주사기로 포유동물을 찔러 유체를 주사기 내로 빨아들임으로써 수행될 수 있다. 일단 수득하면, 유체를 임의로 분획화할 수 있다 (예를 들면, 혈청은 전혈로부터 분획화된 후, 샘플로서 사용될 수 있다). 다른 예로서, 샘플은, 예를 들어 포유동물, 예를 들면 포유동물의 구강에 대한 면봉 채취에 의해 얻을 수 있다. 또 다른 예로서, 조직 절편은 생검에 의해 얻을 수 있다.

본 방법은 포유동물 샘플을, 항원/항체 복합체, 즉 면역복합체가 형성하도록 하는 조건 하에 하나 이상의 회충 항원에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 즉, 항체는 샘플에 존재하는 회충 항원에 특이적으로 결합한다. 당업자는 상기 항원/항체 복합체 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있는 분석 및 조건을 잘 알고 있다. 예를 들면, 항원/항체 복합체는 항원/항체 복합체에 결합하는 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 샘플 내의 회충 항원과 항-회충 항체 사이의 복합체의 형성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출될 수 있다.

또한, 하나의 특정 반응에서 형성되는 항체-항원 복합체의 상대적인 양은 상기 목적을 달성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 임의의 다른 반응에서 형성되는 것에 대해 측정할 수 있다. 시험 중의 샘플에 대조군 샘플보다 많은 항체-항원 복합체가 존재하는 것으로 결정될 때, 시험 샘플 내에 회충이 존재한다고 결론을 내릴 수 있다. 이것이 사실일 때, 시험 샘플을 얻은 포유동물은 장내 회충에 감염되었다고 결론을 내릴 수 있다. 시험 샘플에 회충이 존재하고, 시험되는 포유동물이 장내 회충에 감염되었다는 결론 중 하나 또는 둘 모두는, 예를 들면 진단 서비스 제공처의 의사 또는 포유동물을 돌보는 사람, 예를 들면 포유동물의 수의사에 의해 내려질 수 있다. 포유동물이 회충에 감염되었다고 포유동물을 돌보는 사람이 결정한 경우 (또는, 정보를 전달받은 경우), 돌보는 사람은 일반적으로 기생 선충 감염보다는 포유동물에서 회충을 특이적으로 제거하도록 최적으로 설계된 치료 과정에 포유동물을 적용할 수 있다. 또한, 감염된 동물 또는 그의 배설물과 접촉하게 될 수 있는 인간은 기생충 감염에 대해 미리 주의를 받을 수 있다. 이러한 측면에서, 일부 연충, 예를 들면 회충 및 구충은 인간에서 심각한 질병 (예를 들면, 유충 이행증)을 유발하지만, 일반적으로 편충은 인간에서 중요한 인수 감염 역할을 하지 않는 것으로 인정되므로, 높은 특이성을 갖는 충 종을 결정하는 것이 중요하다. 또한, 본 발명은 회충 감염에 대한 처치를 받은 임의의 동물에서 그 감염이 없어졌는지 확인하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계는 하나 이상의 회충 항원에 대해 특이적인 고정된 항체를 포함하는 본 발명의 장치에 포유동물 샘플을 적용하는 단계, 및 샘플에서 회충 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 회충의 항원에 특이적인 항체는 고체 지지체 또는 기질, 예를 들면 미세적정 웰, SNAP® 장치의 항체-고정 부분, 자성 비드, 비-자성 비드, 컬럼, 매트릭스, 멤브레인, 합성 또는 천연 섬유로 이루어진 섬유상 매트 (예를 들면, 유리 또는 셀룰로스-기반 물질 또는 열가소성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에스테르), 입자형 물질 (예를 들면, 유리 또는 다양한 열가소성 중합체)로 이루어진 소결 구조체, 또는 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리술폰 등 (일반적으로 자연에서 합성임)으로 이루어진 주조 멤브레인 필름에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 이들 기질 물질은 모두 적합한 형상, 예를 들면 필름, 시트 또는 플레이트로 사용될 수 있거나, 적절한 불활성 담체, 예를 들면 종이, 유리, 플라스틱 필름 또는 직물 상에 코팅되거나 결합되거나 라미네이팅될 수 있다. 펩티드를 고체상 상에 고정하기 위한 적합한 방법은 이온성, 소수성, 공유 상호작용 등을 포함한다.

그러나, 본 발명의 방법은 고체상 또는 기질의 사용을 요구하지 않는다. 당업자는 고체상 또는 기질의 사용을 포함하지 않으면서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 방법이 수행될 수 있는 많은 방식이 존재함을 알 것이다. 단지 하나의 예에서, 고체상 또는 기질의 사용을 필요로 하지 않는 면역침전 방법을 수행할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 항원/항체 복합체는 항체에 결합되는 지시약, 예를 들면 효소 접합체가 검출가능한 반응을 촉매할 때 검출된다. 임의로, 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약은 검출가능한 항원/항체/지시 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 항원/항체 복합체에 적용될 수 있다. 임의로, 항체는 항원/항체 복합체의 형성 전에 지시약으로 표지될 수 있다.

본 발명의 방법의 일부에서 항원/항체 복합체 또는 항원/항체/지시 복합체의 형성은 방사성 측정, 색도 측정, 형광 측정, 광도 측정, 크기-분리, 또는 침전 방법에 의해 특이적으로 검출될 수 있다. 또한, 항원/항체 복합체의 검출은 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약에 결합되는 2차 항체의 첨가에 의해 달성할 수 있다. 폴리펩티드/항체 복합체와 회합된 신호 발생 화합물 (표지)을 포함하는 지시약은 상기 기재된 방법을 이용하여 검출될 수 있고, 발색제, 촉매, 예를 들면 효소 접합체, 형광 화합물, 예를 들면 플루오레세인 및 로다민, 화학발광 화합물, 예를 들면 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄 및 루미놀, 방사성 원소, 직접적 시각 표지 및 보조인자, 억제제, 자성 입자 등을 포함할 수 있다. 효소 접합체의 예는 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 등을 포함한다. 특정 표지의 선택는 중요하지 않지만, 이는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 물질과 함께 신호를 발생할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법은 ELISA, RIA, 면역-형광 분석 (IFA), 적혈구응집반응 (HA), 형광 편광 면역분석 (FPIA) 및 미세적정 플레이트 분석 (즉, 미세적정 플레이트의 하나 이상의 웰에서 이루어진 임의의 분석)을 포함하고 이로 제한되지 않는, 경쟁, 직접 반응 또는 샌드위치(sandwich)형 분석에 기초한 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 하나의 분석은 가역적 유동 크로마토그래피 결합 분석을 포함하고, 이는, 예를 들면 SNAP® 장치를 이용함으로써 수행될 수 있다 (미국 특허 제5,726,010호 참조).

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샌드위치 또는 경쟁형 특이적 결합 분석을 용이하게 한다. 샌드위치 분석에서, 항원 포획 시약은 반응 구역 내에 고정된다. 이들 항원 포획 시약은 회충에 대해 시험되는 샘플 내의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 샘플로부터의 항원의 결합 후에, 항원 포획 시약/항원 복합체가 임의의 적절한 방법에 의해 검출된다. 예를 들면, 복합체는 표지된 특이적 결합 시약 (예를 들면, 효소-항체 접합체) 및 검출된 항원 (예를 들면, 기질과의 반응 시에)과 반응될 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 경쟁 분석을 수행한다. 경쟁 분석에서, 항원 포획 시약이 반응 구역 내에 고정되고, 샘플로부터의 항원 및 표지된 항원 (예를 들면, 항원-효소 접합체)와 동시에 접촉된다. 반응 구역에서 검출된 표지의 양은 샘플 내의 항원의 양에 역비례한다.

본 방법의 일부 실시양태에서, 회충 항원(들)에 특이적인 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 잠재적으로 회충으로부터의 항원을 포함하는 샘플을 기질에 첨가한다. 회충에 특이적으로 결합하는 항체가 첨가된다. 항체는 고체상에서 사용된 것과 동일한 항체일 수 있거나, 상이한 공급원 또는 종으로부터의 것일 수 있다. 또한, 이들 항체는 지시약, 예를 들면 효소 접합체에 연결될 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단(chromophore) 또는 효소 기질을 첨가할 수 있고, 색상을 발색시킬 수 있다. 색상 반응을 중단시킬 수 있고, 색상을, 예를 들면 분광광도계를 사용하여 정량할 수 있고/있거나, 색상을 인간 눈에 의해 주관적으로 평가할 수 있다.

본 방법의 다른 실시양태에서, 회충 항원(들)에 특이적인 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 잠재적으로 회충 항원을 포함하는 샘플이 기질에 첨가된다. 회충 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항-종 항체가 첨가된다. 이들 제2 항체는 고체상 항체와는 상이한 종으로부터의 것이다. 제2 항체에 특이적으로 결합하고 고체상 항체에 특이적으로 결합하지 않는 제3 항-종 항체가 첨가된다. 제3 항체는 지시약, 예를 들면 효소 접합체를 포함할 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단 또는 효소 기질을 첨가할 수 있고, 색상을 발색시킬 수 있다. 색상 반응을 중단시킬 수 있고, 색상을, 예를 들면 분광광도계를 사용하여 정량할 수 있고/있거나, 색상을 인간 눈에 의해 주관적으로 평가할 수 있다.

특정한 예에서, 본 발명의 방법은 제조된 포유동물 샘플을 장치의 유동 매트릭스에 제1 구역 (샘플 적용 구역)에서 첨가함으로써, 측방 유동 분석 장치인 장치와 함께 수행된다. 제조된 샘플은 유체 유동 경로 내에서 모세관 작용에 의해, 샘플 내의 항원에 결합하여 제1 복합체를 형성할 수 있는 입자형 표지가 존재하는 유동 매트릭스의 제2 구역으로 운반된다. 입자형 표지는, 예를 들면 회충 항원에 특이적인 항체에 접합된 착색 라텍스 입자, 염료 졸, 또는 금 졸일 수 있다. 제1 복합체는 회충 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 구별되는 위치에서 고정되어 있는 유동 매트릭스의 제3 구역으로 운반된다. 고정된 항체와 제1 복합체 사이에서 제2 복합체가 형성된다. 제2 복합체의 일부인 입자형 표지는 인간 눈에 의해 직접 가시화될 수 있다.

회충 항체는 반응 구역 (고체상) 내의 고정된 항원 포획 시약일 수 있다. 제2 항원 포획 시약, 즉 표지에 접합된 제2 회충 항체가 샘플이 장치에 첨가되기 전에 샘플에 첨가될 수 있거나, 제2 항원 포획 시약이 장치 내로 포함될 수 있다. 예를 들면, 표지된 항원 포획 시약은 샘플 적용 구역과 고체상 사이에 유체 소통을 제공하는 유체 유동 경로 상에 퇴적되고 건조될 수 있다. 표지된 항원 포획 시약을 시험 샘플과 접촉시키면 표지된 항원 포획 시약의 용해를 일으킬 수 있다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 회충 항원은 ELISA에 의해 검출된다. 본 발명의 ELISA 방법의 구체적인 예는 본원에 포함되는 실시예 부분에 설명되어 있다. 본 발명은 이들 구체적인 ELISA 방법에 관하여 설명되지만, 당업자는 별도의, 추가의 또는 대체 ELISA 단계가 본 발명의 상기 방법을 통해 달성되는 기본 목표로부터 벗어나지 않으면서 이용될 수 있음을 알 것을 이해해야 한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 회충 항원은, 예를 들면 SNAP® 장치와 같은 측방 유동 장치를 이용함으로써 검출된다.

또한, 회충 감염의 검출을 위한 본 발명의 방법은 다른 유기체 또는 조건의 존재를 검출하기 위해 다른 진단 분석과 조합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 분석은 하나 이상의 비-회충 분변 기생충, 하나 이상의 비-충 분변 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 하나 이상의 세균, 하나 이상의 혈액-매개 기생충 또는 잠혈 또는 그의 조합을 검출하는 시약과 조합될 수 있다. 단일 분석 장치 내에 2개 이상의 특유한 결합 부위 (예를 들면, SNAP® 분석 장치 상의 2개의 특유한 점(spot))를 제공함으로써, 본 발명은 단일 샘플로부터 2개 이상의 유기체의 검출을 허용한다. 한 실시양태에서, 단일 샘플로부터 3개의 유기체로부터의 과거의 또는 존재하는, 감염 또는 기생충 감염의 검출을 위한 3개의 특유한 점 (점은 항원 또는 항체 결합 시약이다)이 존재한다 (즉, 동일한 개별 샘플이 단일 장치 상의 3개의 포획 시약에 노출된다). 또다른 실시양태에서, 단일 샘플로부터 4개의 유기체로부터의 과거의 또는 존재하는 감염 또는 기생충 감염의 검출을 위한 4개의 특유한 점 (점은 항원 또는 항체 결합 시약이다)이 존재한다 (즉, 동일한 개별 샘플이 단일 장치 상의 4개의 포획 시약에 노출된다). 그러나, 동일한 장치가 4개 초과의 특유한 점을 포함하고/하거나, 4개 초과의 유기체의 검출을 허용할 수 있음을 이해해야 한다.

하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균의 검출을 위한 시약은, 예를 들면 하나 이상의 항체, 또는 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균에 특이적인 항체에 의해 인지되는 하나 이상의 항원일 수 있다.

본 발명의 장치가 회충을 검출하기 위한 시약 이외에, 예를 들면 구충의 특이적 검출을 위한 시약 및 편충의 특이적 검출을 위한 시약을 포함하는 경우, 본 발명의 방법은 추가의 목적, 또는 회충에 대해 시험되는 샘플이 또한 구충 및/또는 편충을 포함하는지 여부를 결정하기 위한 목적으로 상기 장치를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 정렬에서, 본 발명의 방법/장치는 회충이 임의의 특정 시험 샘플에 존재하는지 또는 부재하는지를 구체적으로 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 샘플이 임의의 구충 항원 및/또는 임의의 편충 항원을 포함하는지 또는 포함하지 않는지를 구체적으로 확인하는데 유용하다. 단일 샘플을 본 발명의 장치에 적용하여 회충 및 하나 이상의 다른 유기체를 구체적으로 검출하는 능력은 시험 중인 샘플이 수득되는 동물을 돌보는 사람에게 유용할 것이다. 예를 들면, 샘플이 회충 및 편충 둘 다를 포함하지만 구충을 포함하지 않는다는 것을 학습한 돌보는 사람은 포유동물에게 회충에 대해 가장 효과적인 약물 및 편충에 대해 가장 효과적인 제2 약물을 투여함으로써, 구체적으로 회충에 대한 샘플이 채취되는 포유동물을 처치하는 지식을 이용할 수 있다. 이러한 지식이 없다면, 예를 들면 돌보는 사람은 회충에만 가장 효과적이거나, 편충에만 가장 효과적이거나, 또는 회충 또는 편충 어느 것에도 가장 효과적이지 않은 약물로 포유동물을 달리 처치할 수 있다 (이러한 경우, 포유동물은 최적 수준 아래의 처치를 받을 위험이 있을 것이다). 또한, 감염된 동물 또는 그의 배설물과 접촉하게 될 수 있는 인간은 기생충(들) 감염에 대해 미리 주의를 받을 수 있다. 이러한 측면에서, 일부 연충, 예를 들면 회충 및 구충은 인간에게서 심각한 질병 (예를 들면, 유충 이행증, 중증의 장염 또는 알레르기 반응)을 유발할 수 있지만, 일반적으로 편충은 인간에게서 중요한 인수 감염 역할을 하지 않는 것으로 인정되므로, 높은 특이성을 갖는 충 종을 결정하는 것이 중요하다.

또한, 본 방법은 임의로 본 발명의 핵산을 포함하고 이로 제한되지 않는, 회충으로부터의 하나 이상의 핵산을 사용하여 포유동물 샘플 내에 회충의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 회충의 존재를 결정하기 위한 이들 핵산의 상기 용도는 항체에 의한 회충의 검출을 포함한 방법의 임의의 다른 측면을 수행하기 전에, 수행한 후 또는 동시에 수행될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 특정 샘플에서 회충이 검출되거나 검출되지 않거나, 또는 회충 감염이 있거나 있지 않은 것으로 진단된 후에, 샘플 (또는, 진단된 포유동물로부터의 나중에 얻어진 샘플)을 본 발명의 임의의 하나 이상의 핵산을 포함한 임의의 하나 이상의 핵산의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 하나 이상의 핵산을 사용하여 특정 포유동물에서 회충을 검출하지 못하면 (하나 이상의 항체를 사용함으로써 회충이 검출된 후), 샘플 내에서 검출가능한 회충 핵산의 출현에 앞서 항체가 회충 항원을 검출한 가능성을 고려할 필요가 있을 것이다. 그러한 경우에, 포유동물을 돌보는 사람은 핵산이 회충을 검출하지 못한다는 관찰을 무시하고, 항체가 실제로 회충을 검출했다는 관찰에 기초하여 회충 감염에 대해 특이적으로 포유동물을 치료하는 것을 진행하도록 선택할 수 있다. 다른 측면에서, 핵산은 특정 포유동물 내에서 회충의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용되고, 이어서 회충의 존재 또는 부재는 본 발명의 항체를 사용함으로써 추가로 평가된다. 하나 이상의 회충 핵산의 검출은 당업자에게 공지된 임의의 핵산 검출 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 그러한 검출은 PCR-기반 기술, 예를 들면 비제한적으로 실시간 PCR-기반 기술을 수행함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 PCR-기반 기술은, 예를 들면 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [PCR Protocols (Methods in Molecular Biology), 2^nd ed., Bartlett and Stirling, eds., Humana Press (2003)]; 및 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]에 기재되어 있다.

본 발명은 6개의 실시예를 참조하여 구체적으로 설명되지만, 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

달리 지시하지 않으면, 아래 설명된 바와 같은 실시예 1 내지 7 중 하나 이상에 기재된 데이타를 생성하기 위해 다음의 물질 및 기술을 사용하였다.

폴리클로날 항체 제조. 폴리클로날 항체 "항-DIV6716 pAB" (IgG)를 서열 5에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 토끼에서 생성시키고, 표준 방법을 이용함으로써 혈청으로부터 정제하였다. 간단히 설명하면, 서열 1의 뉴클레오티드 50 내지 427을 벡터 (D8223 (pUC19의 유도체)) 내로 인-프레임(in-frame)으로 클로닝하여 플라스미드 D8339를 생성하였다. 구체적으로, 이 서열의 N-말단에서 메티오닌 잔기 다음의 서열 5의 129개 아미노산은 서열 3의 일부에 대응하고, 서열 1의 클로닝된 부분에 의해 코딩된다. D8339 플라스미드에서, N-말단 메티오닌 잔기는 벡터가 서열 1로부터의 클로닝된 서열에 라이게이션되는 그 플라스미드의 연결부에서 벡터 서열에 의해 코딩되었다.

이어서, 서열 5를 코딩하는 DNA 서열을 D8339 플라스미드로부터 제한 엑소뉴클레아제 분해 (NdeI 및 BamHI)에 의해 절단하고 정제하였다. 이어서, 상기 정제된 서열을 선형화된 발현 벡터, pET28a에 라이게이션하고, 생성되는 원형 구성체 (pTDX204::DIV6716)를 BL21 (DE3) 이. 콜라이(E. coli) 세포 내로 형질전환시켰다 (삽입체의 완전한 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다). His-태그가 부착된 융합 단백질의 발현은 1 mM의 IPTG를 형질전환된 이. 콜라이의 배양액에 첨가하여 유도하였다. 재조합 단백질을 6 M의 우레아 내에 가용화시키고, 니켈 친화도 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (상기 재조합 단백질은 이하 "rDIV6716"으로 지칭함).

rDIV6716을 토끼에 도입시킨 후, 항-DIV6716 pAB를 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 IgG 항체를 단리시킴으로써 면역화시킨 토끼의 혈장으로부터 정제하였다. 폴리클로날 항체 항-DIV6716 pAB를 본원에 기재된 모든 6개의 실시예에서 사용하였다.

개과동물 및 고양이과동물의 감염 및 항-연충 처치. 건강한 개과동물 또는 고양이과동물에게 회충 (톡소카라), 구충 (안실로스토마 카니움) 또는 편충 (트리쿠리스 불피스)의 약 150 내지 300개의 유생 충란을 경구 투여하여 기생 선충 감염을 수행하였다 (특히, 티. 카니스는 개과동물에게 투여한 회충이고, 티. 카티는 고양이과동물에게 투여한 회충임). 실시예 2의 경우, 분변 샘플을 사상충 (디로필라리아 이미티스)으로 자연 감염된 것으로 알려진 개과동물로부터 수집하였다. 또한, 실시예 4 및 6에서만, 제조업자의 프로토콜에 따라 개과동물을 감염후 제91일에 구충제인 인터셉터(Interceptor)® (밀베마이신 옥심; 노바티스 애니멀 헬쓰 인크. (Novartis Animal Health Inc., 스위스 바젤)에서 시판됨)로 처치하거나, 또는 고양이과동물을 감염후 제56일에 구충제인 드론탈(Drontal)® (프라지쿠안텔/피란텔 파모에이트; 바이엘 헬쓰케어, 엘엘씨 (Bayer HealthCare, LLC, 미국 캔사스주 쇼니 미션)에서 시판됨)로 처치하였다. 인터셉터® 및 드론탈®이 처치후 72시간 이내에 각각 개과동물 및 고양이과동물로부터 회충 (및 다른 기생충)을 제거하는데 효과적이라는 것은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 상기 숙주 동물로부터 수득한 분변 샘플에서 충란을 현미경으로 관찰함으로써 감염을 확인하였다.

개과동물 및 고양이과동물 분변 샘플 제조. 기생충 감염이 없는 것으로, 또는 회충, 구충, 편충 또는 사상충 중 하나에 감염된 것으로 알려진 개과동물 및 고양이과동물이 분변 샘플의 공급원으로 제공되었다. 동결되고 무보존된 개과동물 또는 고양이과동물 분변 샘플로부터의 샘플 (대략 1 g)을 4 ml의 희석 용액 ("희석 용액"은 트리스(Tris) 염기 0.05 M; EDTA 1 mM; 카톤(Kathon) 0.45％; 겐타마이신 술페이트 16 mg/ml; 트윈(Tween)-20 0.05％; 태아 소 혈청 40％; 토끼 혈청 10％; 및 마우스 혈청 5％임) 내에 현탁시켰다. 현탁액을 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 제1 상등액을 생성하였다. 제1 상등액을 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 본원에서 "분변 추출물"로서 지칭되는 제2 상등액을 생성하였다.

ELISA 분석. 정제된 항-DIV6716 pAB (모든 실시예에 대해 100 ㎕/웰; 실시예 3을 제외한 각각의 실시예에 대해 10 ㎍/ml, 및 실시예 3에 대해 3 ㎍/ml)를 4℃에서 밤새 이뮬론 1B 96-웰 플레이트 상에 물리적 흡착에 의해 고정시켰다. 이어서, 플레이트를 0.1 M의 트리스 (pH 7.0) 중의 1％의 BSA로 4℃에서 밤새 블로킹한 후에 실온에서 건조시켰다. 대략 100 ㎕의 분변 추출물을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 PBS-트윈-20 용액으로 5회 세척하였다. 별개의 반응 용기에서, 유리 항-DIV6716 pAB를 가교결합제 숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)를 사용하여 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)로 표지함으로써 접합체를 생성하고, 상기 10 ㎍/ml의 접합체를 항-DIV6716 pAB가 고정되어 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 기간 후에, 결합되지 않은 접합체를 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 PBS-트윈-20 용액을 사용하여 웰로부터 세척하였다. 이어서, 50 ㎕의 TMBLUE® 퍼옥시다제 기질 (세라케어 라이프 사이언시즈 (SeraCare Life Sciences, 미국 매사추세츠주 웨스트 브리지워터))을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 10분 인큐베이션 기간에 이어 0.1％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 사용하여 각각의 효소 반응을 중단시킨 후에, 96-웰 플레이트의 각각의 웰의 광학 밀도 (OD) 값을 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 표준 분광광도 기술에 의해 A650에서 측정함으로써 각각의 웰에 대한 "OD650 값" (또는, 보다 간단히 "OD 값")을 생성하였다. 상기 배열에서, 96-웰 플레이트의 임의의 특정 웰에 대해 수득한 OD 값은 웰 내에 존재하는 특이적으로 결합된 항원의 양에 정비례하였다.

실시예 1

항-DIV6716 pAB는 회충-감염된 개과동물로부터 수득된 분변 샘플에서 회충에 특이적으로 결합한다.

실시예 1의 목적은 항-DIV6716 pAB가 개과동물에서 회충 분변항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 것이었다. 회충-감염을 가진 것으로 알려진 개별의 개과동물로부터 수득된 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값을 도 7에 제시하였다. 특히, 이들 샘플은 도 7에서 "회(round)+SPY", "회+QKZ", "회+KWZ", "회+WHY" 및 "회+RYZ"로 식별된 회충-감염된 개과동물에 대응한다. 또한, 이 실시예에서, 전체 톡소카라 카니스 추출물 ("톡소카라 전체"; 1 ㎍/ml로 플레이트에 첨가됨) 및 rDIV6716 (1 ㎍/ml로 플레이트에 첨가됨)에 대해 OD 값을 측정하였고, 양성 대조군으로서 사용되었다 (특히, 전체 톡소카라 추출물을 본 발명의 출원인에게 양도된 미국 특허 출원 제11/763,592호에 기재된 바와 같이 제조하였고, 그 전부가 본원에 참고로 포함됨). 또한, 기생충에 감염되지 않은 2 마리의 개과동물로부터 수득한 2개의 분변 추출물 ("negTIY" 및 "negSVY") 중 각각 하나, 및 임의의 분변 추출물을 함유하지 않은 샘플 ("희석액 단독")에 대한 OD 값도 측정하였다 (상기 마지막 3개의 샘플은 음성 대조군으로서 사용됨).

negTIY 및 negSVY 개과동물로부터 수득한 분변 추출물의 측정된 OD 값은 각각 0.10 및 0.13이었고, 희석액 단독 샘플의 측정된 OD 값은 0.05였다 (따라서, 이들 음성 대조군 샘플에 대한 평균 OD 값은 0.09였음). 따라서, 항-DIV6716 pAB는 이들 음성 대조군 샘플 중 임의의 어느 하나에서도 항원에 특이적으로 결합하지 않는 것으로 간주되었다.

반대로, "회+SPY", "회+QKZ", "회+KWZ", "회+WHY" 및 "회+RYZ" 개과동물로부터 수득한 샘플의 측정된 OD 값의 평균은 1.97이었고, 3개의 음성 대조군 샘플에 대해 측정한 평균 OD 값보다 21 배 초과하여 더 높았다. 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 하나 이상의 회충 분변항원에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸다.

실시예 2

항-DIV6716 pAB는 회충 분변항원에 특이적으로 결합하지만, 구충, 편충 또는 사상충으로부터의 분변항원에는 특이적으로 결합하지 않는다.

실시예 2의 목적은 항-DIV6716 pAB가 개과동물에서 구충 및/또는 편충의 분변항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 것이었다. 풀링된 개과동물 분변 추출물에 대해 측정된 OD 값을 도 8에 제시하였다. 특히, 이들 분변 추출물은 회충에 감염된 것으로 알려진 5 마리의 개과동물 ("회충-감염됨"), 구충에 감염된 것으로 알려진 2 마리의 개과동물 ("구충-감염됨"), 및 편충에 감염된 것으로 알려진 5 마리의 개과동물 ("편충-감염됨")로부터 수득한 분변 샘플로부터 유래된 것이었다. 또한, 전체 톡소카라 카니스 추출물 ("톡소카라 전체"; 1 ㎍/ml) 및 rDIV6716 (1 ㎍/ml) (양성 대조군으로 사용됨), 및 기생충에 감염되지 않은 것으로 알려진 5 마리의 개과동물 ("감염되지 않음")로부터 수득한 분변 추출물의 풀링된 샘플 및 임의의 분변 추출물을 함유하지 않는 샘플 ("희석액 단독")에 대해 OD 값을 측정하였다 (상기 마지막 2개의 샘플은 음성 대조군으로 사용됨).

도 8을 참조하여, 구충-감염된 및 편충-감염된 샘플 중 각각의 하나에 대해 측정된 OD 값은 0.09이었고, 이는 음성 대조군인 희석액 단독 샘플의 측정된 OD 값 (0.05) 및 음성 대조군인 감염되지 않은 샘플의 측정된 OD 값 (0.09)과 대략 비슷하거나 동일하였다. 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 구충-감염된 및 편충-감염된 개과동물로부터 수득한 샘플 중 하나에서 분변항원에 특이적으로 결합하지 않았다는 것을 나타낸다.

반대로, 회충-감염된 개과동물로부터 풀링된 분변 추출물의 측정된 OD 값은 0.44이었고, 이는 음성 대조군 샘플 및 구충-감염된 샘플 및 편충-감염된 샘플에 대해 수득한 OD 값보다 약 5 배 더 높았다. 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 하나 이상의 회충 항원에 특이적으로 결합하지만, 임의의 구충 또는 편충 분변항원에는 특이적으로 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 2의 또다른 목적은, 사상충이 회충과 밀접한 계통학적 관계를 가지고 교차반응성의 가능성이 있기때문에, 항-DIV6716 pAB가 개과동물에서 사상충의 분변항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 것이었다. 개별 개과동물 분변 추출물에 대해 측정된 OD 값을 도 9에 제시하였다. 특히, 이들 샘플을 도 9에서 "TRS 405", "TRS 583" 및 "TRS 868"로 식별된 사상충-감염된 개과동물로부터 수득하였다. 또한, 이 실시예에서, 기생충에 감염되지 않은 2 마리의 개과동물로부터 수득한 2개의 분변 추출물 ("negTIY" 및 "negSVY") 중 각각 하나에 대한 OD 값도 측정하였다 (상기 마지막 2개의 추출물은 음성 대조군으로 사용됨).

도 9를 참조하여, 사상충-감염된 샘플에 대해 측정된 OD 값의 평균은 0.21이었고 (이들 OD 값 중 가장 큰 값음 0.27임), 음성 대조군 샘플에 대해 측정된 2개의 OD 값의 평균 (0.33)과 대략 비슷하였다 (실제로는 미만임). 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 사상충-감염된 개과동물로부터 수득한 샘플에서 임의의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않았다는 것을 나타낸다.

실시예 3

항-DIV6716 pAB는 회충 분변항원에 특이적으로 결합하지만, 구충, 편충 또는 사상충으로부터의 분변항원에는 특이적으로 결합하지 않고, 항-DIV6716 pAB에 의한 회충 분변항원의 특이적 결합은 인간 눈에 쉽게 관찰가능한 색도 변화를 일으킨다.

실시예 3의 목적은 항-DIV6716 pAB가 고체 지지체 상에 고정되어 있는 동안 항-DIV6716 pAB와 회충 분변항원 사이의 특이적 결합이 인간 눈에 관찰가능한 색도 변화를 일으킬 수 있는지 여부를 결정하는 것이었다.

도 10를 참조하여, 항-DIV6716 pAB (3 ㎍/ml)를 앞서 기재된 바와 같이 미세적정 플레이트의 웰 A1-A12 및 B1-B12의 저변 표면 상에 고정시켰다. 상기 고정 후에, A3 및 B3 웰을 사상충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다 (도 10에서 "HW"로 나타냄). A4 및 B4 웰을 제1 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A5 및 B5 웰을 제2 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A6 및 B6 웰을 제3 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다. A7 및 B7 웰을 제1 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A8 및 B8 웰을 제2 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A9 및 B9 웰을 제3 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다. A10 및 B10 웰을 제1 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A11 및 B11 웰을 제2 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A12 및 B12 웰을 제3 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다. A1 및 B1 웰을 rDIV6716 (1 ㎍/ml)에 노출시키고, 따라서 이들 웰을 양성 대조군으로 이용하였다. A2 및 B2 웰을 임의의 분변 추출물 또는 rDIV6716에 노출시키지 않았고, 따라서 이들 웰을 음성 대조군으로 사용하였다.

이들 모든 웰을 TMBLUE® 퍼옥시다제 기질과 함께 인큐베이션하고 SDS를 후속적으로 첨가한 후, 색도 변화가 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 웰 (A7-A9 및 B7-B9) 중 각각 하나 내에서 육안으로 관찰되었지만, 구충, 편충 또는 사상충에 감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 임의의 웰 내에서 색도 변화가 관찰되지 않았다.

이러한 데이타는 강하고 인간 눈에 쉽게 보이는 색도 변화를 일으키기에 충분하게 항-DIV6716 pAB가 회충을 검출한다는 것을 나타낸다. 추가로, 이들 데이타는 그러한 색도 변화로 인해 인간 눈이 회충을 함유하지 않는 것 (구충, 편충 또는 사상충 중 하나 이상을 포함하는 것을 포함함)으로부터의 회충-양성 분변 샘플을 쉽게 구분함을 나타낸다.

실시예 4

항-DIV6716 pAB는 회충에 감염되고 17일 경과시까지의 조기에 일부 개과동물에서 회충 분변항원을 검출하고, 회충에 감염되었으나 개과동물이 분변을 배설할 때까지 이 감염이 없어진 개과동물의 분변에서는 항-DIV6716 pAB는 회충을 검출하지 않는다.

실시예 4의 목적은 회충란이 상기 개과동물의 분변에서 처음으로 보이기 전에 항-DIV6716 pAB가 적어도 일부의 회충-감염된 개과동물에서 회충 분변항원을 검출할 수 있는지 여부를 결정하는 것이었다. 실시예 4의 또다른 목적은 항-DIV6716 pAB가 이전의 회충 감염이 없어진 개과동물의 분변에서 회충을 검출하는지 여부를 결정하는 것이었다.

이러한 목적을 위해, 5 마리의 개과동물로부터 수득한 분변 샘플에 대해 OD 값을 측정하였고, 도 11에 제시하였다. 이러한 개과동물 ("QKZ", "RYZ", "KWZ", "SPY" 및 "WHY"로 식별됨)을 제0일에 회충에 감염시키고, 앞서 기재된 바와 같이 감염 투여후 제91일에 인터셉터® 구충제로 처치하였다. 이들 동물에게 회충 감염을 투여한 후 제0일, 제2일 및 제111일에, 및 제2일과 제111일 사이에 선택된 날에 이러한 개과동물의 전부 또는 일부로부터 분변 샘플을 채취하였다. 제1 세트의 개과동물로부터의 분변 샘플을 현미경으로 관찰한 결과 제0일 내지 제31일 및 제100일 내지 제111일에 채취한 샘플 중 각각 하나에 회충란이 실질적으로 없음을 확인하였고, 한 가지 예외로, 이러한 충란이 제38일 내지 제97일 중 각각 하나에서의 샘플에만 존재함을 확인하였다 (유일한 예외 사항은, KWZ 개과동물로부터의 제38일 분변 샘플에서 충란이 관찰되지 않았다는 것임).

도 11을 참조하여, 제17일에 상기 5 마리 개과동물에 대해 측정된 평균 OD 값은 0.35이었고, 제0일에 상기 개과동물에 대해 측정된 OD 값의 평균 (0.07) 보다 5 배 더 높았다. 또한, 제17일에 WHY 개과동물에 대해 측정된 특정 OD 값 (0.78이었음)은 제0일에 모든 5 마리 개과동물에 대해 측정된 OD 값의 평균보다 11 배 초과하여 더 높았고, 제23일 및 제31일에 WHY 개과동물에 대해 측정된 특정 OD 값 (각각, 0.18 및 0.29)은 제0일에 모든 5 마리 개과동물에 대해 측정된 OD 값의 평균보다 각각 2 배 초과 및 4 배 초과하여 더 높았다. 이러한 데이타는, 일부 경우에서 항-DIV6716 pAB가, 개과동물이 회충에 처음 감염되고 17일 경과시까지의 조기에 회충-감염된 개과동물로부터의 분변에서 회충을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 11을 계속 참조하여, 제38일 내지 제93일에 5 마리 개과동물로부터 채취한 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값은 이들을 구충제로 처치한 후에 이들 동일한 개과동물로부터의 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값보다 수 배 더 높았다. 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 이전의 회충 감염이 없어진 개과동물로부터의 분변에서 회충을 검출하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5

항-DIV6716 pAB는 회충-감염된 고양이과동물로부터 수득한 분변 샘플에서 회충 황원에 특이적으로 결합한다.

실시예 5의 목적은 항-DIV6716 pAB가 고양이과동물에서 회충 분변항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 것이었다.

감염되지 않은 고양이과동물 및 회충-감염된 고양이과동물로부터 수득한 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값을 도 12에 제시하였다. 구체적으로, 이들 OD 값은 5 마리의 상이한 회충-감염된 고양이과동물 (식별부호 "CO85", "CO87", "CO96", "CO100" 및 "CO104"로 나타냄)로부터 이들 고양이과동물에게 회충 감염을 투여한 후 제40일에 채취한 분변 샘플로부터 측정하였다. 또한, 음성 대조군으로서 OD 값을 고양이과동물에게 회충 감염을 투여하기 하루 전 ("제-1일")에 CO85 고양이과동물로부터 수득한 분변 샘플로부터 측정하였다.

도 12를 참조하여, 감염되지 않은 고양이과동물 (CO85, 제-1일)에 대해 측정된 OD 값은 0.06인 반면, 제40일에 5 마리 고양이과동물의 평균 OD 값은 1.76이었다. 따라서, 제40일에 5 마리 고양이과동물로부터 수득된 분변 샘플로부터 측정된 평균 OD 값은 감염되지 않은 고양이과동물에 대해 측정된 OD 값보다 약 30배를 초과하여 더 높았다. 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 고양이과동물에서 하나 이상의 회충 분변항원에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.

실시예 6

회충에 감염되었으나, 고양이과동물이 분변을 배설할 때까지 이 감염이 없어진 고양이과동물의 분변에서, 항-DIV6716 pAB는 회충을 검출하지 않는다.

실시예 6의 목적은 항-DIV6716 pAB가 이전의 회충 감염이 없어진 고양이과동물의 분변에서 회충을 검출하는지 여부를 결정하는 것이다.

제1 세트의 6 마리 고양이과동물 및 제2 세트의 6 마리 고양이과동물로부터 수득한 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값을 각각 도 13 및 14에 제시하였다. 제1 세트의 고양이과동물 ("C96", "C100", "C107", "C85", "C87" 및 "C104"로 식별됨)을 제0일에 회충에 감염시키고, 앞서 기재된 바와 같이 감염을 투여한 후 제56일에 드론탈® 구충제로 처치하였다. 이들 동물에게 회충 감염을 투여한 후 제0일, 제1일 및 제77일에, 및 제1일과 제77일 사이에 선택된 날에 제1 세트의 고양이과동물의 전부 또는 일부로부터 분변 샘플을 채취하였다. 제1 세트의 고양이과동물로부터의 분변 샘플을 현미경으로 관찰한 결과 제0일 내지 제26일 및 제60일 내지 제77일에 채취한 샘플 중 각각 하나에 회충란이 실질적으로 없음을 확인하였고, 이러한 충란이 제34일 내지 제54일 샘플 중 각각 하나에 존재함을 확인하였다.

제2 세트의 고양이과동물 ("C91", "C97", "C106", "C81", "C98" 및 "C118"로 식별됨)은 전혀 회충에 감염되지 않았다 (따라서, 음성 대조군으로 사용됨). 제1 세트의 고양이과동물을 회충에 감염시킨 날 (제0일)에 제2 세트의 고양이과동물 중 각각 하나로부터 분변 샘플을 채취하였다. 또한, 제1 세트의 고양이과동물에게 회충 감염을 투여한 후 제1일 및 제74일에, 및 제1일과 제74일 사이에 선택된 날에 제2 세트의 고양이과동물로부터 분변 샘플을 채취하였다. 제2 세트의 고양이과동물로부터의 분변 샘플을 현미경으로 관찰한 결과 제0일 내지 제74일에 채취한 샘플 중 각각 하나에 회충란이 없음을 확인하였다.

도 13를 참조하여, 제1 세트의 고양이과동물 (즉, 회충에 감염된 고양이과동물)로부터 제34일 내지 제54일에 채취한 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값은 이들을 구충제로 처치한 후에 이들 동일한 고양이과동물로부터의 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값보다 수 배 더 높았다. 또한, 제1 세트의 고양이과동물로부터 제34일 내지 제54일에 채취한 분변 샘플에 대해 측정된 OD 값은 도 14의 음성 대조군 샘플 중 각각 하나에 대한 것보다 수 배 더 높았다. 또한, 이러한 데이타는 항-DIV6716 pAB가 이전의 회충 감염이 없어진 고양이과동물로부터의 분변에서 회충을 검출하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 7

DIV6716의 말단 절단된 버전인 Copro6716이 티. 카니스 감염된 개과동물 분변 내에 존재한다.

A. 개과동물 분변 샘플 제조

회충 (티. 카니스)에 감염된 것으로 또는 기생충에 감염되지 않은 것으로 알려진 개과동물이 분변 샘플의 공급원으로 제공되었다. 회충-감염된 개과동물 또는 감염되지 않은 개과동물로부터 풀링된 동결되고 무보존된 개과동물 분변의 샘플을 4 ml의 추출 버퍼 ("추출 버퍼"는 0.05％의 트윈-20이 존재하는 1X 포스페이트-완충 염수 (PBS) (pH 7.0-7.5)임) 내에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 2분 동안 볼텍싱한 후, 13,000 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 제1 상등액을 생성하였다. 이어서, 상기 제1 상등액을 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 제2 상등액을 생성하였다. 상기 제2 상등액을 이하 "분변 추출물"로서 지칭한다.

B. 이온 교환

이온 교환 크로마토그래피에 의해 분변 샘플로부터 Copro6716을 농축할 수 있다. 본 연구를 위해 실험적으로 회충 감염된 및 비-감염된 대조군 동물로부터의 분변 샘플을 사용하였다. 분변 샘플을 PBST (0.05％의 트윈 20) (pH 7.3)로 먼저 추출하였다. 샘플을 아세트산나트륨 버퍼 (pH 4.5)로 희석시킨 후, HCl로 pH를 4.5로 조정하였다. 마지막으로, 샘플을 원심분리하고, 상등액을 술포프로필 (SP) 컬럼 (하이트랩(HiTrap) SP 세파로스 컬럼, GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에 로딩하였다. SP 컬럼을 1 M의 NaCl과 함께 50 mM의 아세트산나트륨 버퍼 (pH 4.5)로 용출시키고, 용출 분획을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트를 토끼 항-DIV6716 IgG로 3 ㎍/ml에서 코팅하였다. 도 15에 제시된 결과를 기초로 하여, Copro6716은 SP 컬럼을 1 M의 NaCl과 함께 아세트산나트륨 버퍼로 용출함으로써 부분적으로 정제되고 농축될 수 있음이 명백하다. Copro6716을 함유하는 분획은 넓은 피크로 용출되었다. 용출 피크의 마지막은 발견되지 않았다 (도 15).

C. 웨스턴 블로팅 및 SDS-PAGE

웨스턴 블로팅 및 SDS-PAGE 겔은 Copro6716의 분자량이 약 10 kD임을 보여주었다. SP 컬럼으로부터 용출 분획을 혼합하고, NaOH로 버퍼 pH를 7.2로 조정한 후, 단백질 G 정제된 토끼 항-DIV6716 IgG를 아미노링크(AminoLink) 수지 (피어스(Pierce), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))와 연결함으로써 제조된 친화도 컬럼 상에 로딩하였다. pH 7.2인 PBS 버퍼로 이 컬럼을 세척하고, 제조업자의 지시에 따라 pH 2.5인 글라이신-HCl 버퍼로 용출시켰다. 용출 분획을 10개의 웰 4-12％ 비스(Bis)-트리스 구배 겔에 로딩하고, 웨스턴 블로팅을 위해 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 토끼 항-DIV6716 IgG-HRP로 프로빙할 때, 웨스턴 블로팅은 Copro6716이 약 10 kD임을 보여주었고 (도 16), 이것은 전장 DIV6716의 크기의 약 2/3 크기이다 (SDS-PAGE 상의 전장 재조합 DIV6716의 명백한 분자량은 약 16 kD이고, 데이타를 나타내지는 않았음). 추가로 농축한 후, 동일한 샘플을 임페리얼 프로테인 스테인 (Imperial Protein Stain, 피어스, 써모 사이언티픽)을 사용하여 SDS-PAGE 겔 상에서 가시화하였다. 항-6728IgG-HRP에 의해 지시된 크기에 대응하는 10 kD 밴드가 가시적이었다 (데이타를 나타내지는 않았음).

D. 질량분광법 분석

상기 SDS-PAGE 겔로부터 절개한 밴드에 대한 질량분광법 분석은 상기 밴드가 Copro6716을 함유하고, DIV6716의 C-말단 부분이 Copro6716을 함유함을 나타냈다.

웨스턴 블로팅 상의 10 kD 밴드에 대응하는 10 kD 밴드를 SDS-PAGE 겔로부터 절개하고, 질량분광법 분석을 위해 예일 대학교의 켁 센터(Keck Center at Yale University)로 보냈다. 겔 내의 샘플을 먼저 트립신으로 분해시킨 후, Q-Tof 얼티마(Ultima) 질량 분광기 (워터스(Waters))를 이용하여 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 4개의 특이적인 펩티드가 질량분광법 분석에 의해 샘플 내에서 발견되었다: 펩티드 1: IMHYYEHLEGDAK (서열 8), 펩티드 2: HEATEQLK (서열 9), 펩티드 3: DSGASKDELK (서열 10), 및 펩티드 4: VEEALHAVTDEEK (서열 11).

DIV6716 (서열 5) 및 MS 분석에 의해 확인된 4개의 펩티드의 서열에 대한 정렬 분석은, 2개의 펩티드가 DIV6716의 중앙 부분에서 비롯되고, 다른 2개의 펩티드가 전장 DIV6716의 C 말단의 절반지점에서 비롯된다는 것을 나타냈으며, 이것은 웨스턴 블롯에 의해 확인된 10 kb 밴드가 DIV6716으로부터 유래됨을 확인하는 것이다. 따라서, 질량분석 자료는 겔 전기영동에 의해 측정된 Copro6716의 겉보기 분자량과 일치한다. 도 17은 음영 상자로 강조한, MS 분석에 의해 확인된 4개의 펩티드가 존재하는 DIV6716의 전장 서열 (서열 5)을 보여준다.

적합하게 본원에서 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들) 없이 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면 본원에서 각각의 경우에 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 구성된" 및 "로 구성된"은 그들의 원래 의미를 유지하면서 다른 2개의 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명을 위한 것으로 제한하기 위해 사용되지 않고, 이러한 용어 및 표현의 사용이 제시 및 기재된 특징의 임의의 등가물 또는 이들의 일부를 제외하기 위한 의도는 없으며, 청구된 본 발명의 범위 내에 다양한 변형이 가능함이 인식되어 있다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태로 구체적으로 개시되어 있으나, 본원에 개시된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변화는 당업자에 의해 구현될 수 있고, 이러한 변형 및 변화는 명세서 및 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 여겨진다.

본 발명의 설명을 돕기 위한 다수의 예가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 다양한 변형이 가능한 것으로 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시양태도 본원에 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다.

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Crawford, Michael Geng, Jinming <120> Methods, Devices, Kits and Composition for Detecting Roundworm <130> 09-1191-WO <150> US 61/261,956 <151> 2009-11-17 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 865 <212> DNA <213> Toxocara canis <400> 1 caagaagatt tatggtgtgg cagcttcgag acgaaggagg catcacttca cgctcgaaaa 60 cagtctggac acccacctga aatggcttag ccacgagcaa aaggaggaac tgctgcaaat 120 gaagaaggac ggcaaatcga agaaggagct ccaggataag atcatgcact attacgagca 180 cctcgaaggc gatgcgaaac atgaagcaac agagcaactg aagggcggat gccgcgagat 240 tcttaagcat gttgttggcg aggagaaagc agctgagatc aaagcactga aagattctgg 300 agcaagcaaa gatgagctta aagccaaggt cgaagaggca ctccacgcag tcaccgacga 360 agaaaagaag caacatatcg ccgaattcgg tcccgcatgc aagaagattt atggtgtggc 420 agcttcgaga cgaaggaggc atcacttcac gctcgaaaac agtctggaca cccacctgaa 480 atggcttagc cacgagcaaa aggaggaact gctgcaaatg aagaaggacg gcaaatcgaa 540 gaaggagctc caggataaga tcatgcacta ttacgagcac ctcgaaggga tgctcctcgc 600 gctatgtatc ctgtattgac ggccttccaa cctatcacac 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agttagttcc gaataaagaa 600 ctgtaattat gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 632 <210> 3 <211> 205 <212> PRT <213> Toxocara canis <400> 3 Lys Lys Ile Tyr Gly Val Ala Ala Ser Arg Arg Arg Arg His His Phe 1 5 10 15 Thr Leu Glu Asn Ser Leu Asp Thr His Leu Lys Trp Leu Ser His Glu 20 25 30 Gln Lys Glu Glu Leu Leu Gln Met Lys Lys Asp Gly Lys Ser Lys Lys 35 40 45 Glu Leu Gln Asp Lys Ile Met His Tyr Tyr Glu His Leu Glu Gly Asp 50 55 60 Ala Lys His Glu Ala Thr Glu Gln Leu Lys Gly Gly Cys Arg Glu Ile 65 70 75 80 Leu Lys His Val Val Gly Glu Glu Lys Ala Ala Glu Ile Lys Ala Leu 85 90 95 Lys Asp Ser Gly Ala Ser Lys Asp Glu Leu Lys Ala Lys Val Glu Glu 100 105 110 Ala Leu His Ala Val Thr Asp Glu Glu Lys Lys Gln His Ile Ala Glu 115 120 125 Phe Gly Pro Ala Cys Lys Lys Ile Tyr Gly Val Ala Ala Ser Arg Arg 130 135 140 Arg Arg His His Phe Thr Leu Glu Asn Ser Leu Asp Thr His Leu Lys 145 150 155 160 Trp Leu Ser His Glu Gln Lys Glu Glu Leu Leu Gln Met Lys Lys Asp 165 170 175 Gly Lys Ser Lys Lys Glu Leu Gln Asp Lys Ile Met His 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Claims

서열 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 5의 아미노산 42 내지 110을 포함하고 10 kDa의 분자량을 갖는 정제된 Copro6716 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
제2항에 있어서, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 또는 Copro6716의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 면역화시켜 수득한 단리된 항체이며, 여기서의 서열 7은 위치 52의 Xaa가 Val, Ile, Leu 또는 알라닌이고, 위치 55의 Xaa가 Phe, Tyr 또는 Trp이고, 위치 110의 Xaa가 Asp 또는 Glu인 단리된 항체.
제2항 또는 제3항에 있어서, 검출가능하게 표지된 단리된 항체.
제2항 또는 제3항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 회충-감염된 포유동물로부터 수득한 분변 샘플 중의 회충 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
제5항에 있어서, 포유동물이 구충, 편충 및 사상충 중 하나 이상에 추가로 감염된 것이고, 분변 샘플에 존재할 수 있는 구충, 편충 또는 사상충 중 하나 이상으로부터의 임의의 항원에 특이적으로 결합하지 않는 단리된 항체.
Copro6716 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체가 고정되어 있는 고체 지지체를 포함하고, 여기서 상기 Copro6716 폴리펩티드는 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 5의 아미노산 42 내지 110을 포함하고 10 kDa의 분자량을 갖는 것인, 샘플로부터 회충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 장치.
제7항에 있어서, 하나 이상의 항체가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 또는 Copro6716의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 면역화시켜 수득되는 것이며, 여기서의 서열 7은 위치 52의 Xaa가 Val, Ile, Leu 또는 알라닌이고, 위치 55의 Xaa가 Phe, Tyr 또는 Trp이고, 위치 110의 Xaa가 Asp 또는 Glu인 장치.
제7항 또는 제8항에 있어서, 샘플이 포유동물로부터 수득한 분변 샘플인 장치.
제7항 또는 제8항에 있어서, 하나 이상의 항체가 구충, 편충 및 사상충으로 이루어진 군으로부터 유래된 임의의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않는 것인 장치.
제7항 또는 제8항에 있어서, 하나 이상의 항체 중 하나 이상이 표지된 것인 장치.
제7항 또는 제8항에 있어서, 측방 유동 면역분석 장치와 같은 효소-연결 면역흡착 분석 장치인 장치.
제7항 또는 제8항에 있어서, 샘플이 개과동물 또는 고양이과동물로부터의 것인 장치.
제7항 또는 제8항에 있어서, 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 및 하나 이상의 세균으로 이루어진 군 중 하나 이상을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 더 포함하는 장치.
(a) Copro6716 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 포유동물로부터의 분변 샘플과 접촉시키는 단계;
(b) 샘플에 상기 폴리펩티드가 존재하는 경우, 상기 폴리펩티드의 존재 하에 항체-폴리펩티드 복합체를 형성시키는 단계; 및
(c) 항체-폴리펩티드 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하고, 여기서 상기 Copro6716 폴리펩티드는 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 5의 아미노산 42 내지 110을 포함하고 10 kDa의 분자량을 갖는 것인, 상기 샘플에서 하나 이상의 회충 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
제15항에 있어서,
(d) 회충 항체-폴리펩티드 복합체가 존재하는 경우, 상기 포유동물을 회충에 감염된 것으로 진단하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 샘플이 개과동물 또는 고양이과동물인 포유동물로부터 수득한 것인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 회충이 톡소카라 카니스(Toxocara canis) 또는 톡소카라 카티(Toxocara cati)인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 하나 이상의 항체가 구충, 편충 및 사상충으로 이루어진 군으로부터 유래된 임의의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않는 것인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계가, 상기 복합체 중 하나 이상에 결합하는 하나 이상의 2차 항체를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 하나 이상의 2차 항체가 표지된 것인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 하나 이상의 항체 중 하나 이상이 표지된 것인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 하나 이상의 항체가 측방 유동 면역분석 장치와 같은 효소-연결 면역흡착 분석 장치의 일부를 형성하는 고체 지지체 상에 고정된 것인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 샘플을 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 및 하나 이상의 세균으로 이루어진 군 중 하나 이상을 검출하기 위한 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 하나 이상의 시약이 하나 이상의 비-회충 기생충, 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 또는 하나 이상의 세균에 특이적인 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 항체 또는 하나 이상의 항원인 방법.
제7항 또는 제8항의 장치, 및 하나 이상의 항원을 검출하기에 충분한 하나 이상의 시약을 포함하는, 포유동물 샘플에서 하나 이상의 회충 항원을 검출하기 위한 키트.
제26항에 있어서, 하나 이상의 시약이 하나 이상의 지시약, 하나 이상의 항체 표지 화합물, 하나 이상의 항체, 하나 이상의 항원 포획 시약, 하나 이상의 억제제 및 하나 이상의 세척 시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
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