BR112012011696B1 - Dispositivos, métodos e kits para detectar antígeno de lombriga - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO E ANTICORPOS ISOLADOS, BEM COMO DISPOSITIVOS, MÉTODOS E KITS PARA DETECTAR ANTÍGENO DE LOMBRIGA. A presente invenção refere-se a métodos, dispositivos, kits e composições para detectar a presença ou a ausência de lombriga em uma amostra de mamífero. Métodos, dispositivos, kits e composições da presente invenção podem ser usados para confirmar a presença ou a ausência de lombriga em uma amostra fecal de um mamífero que pode também ser infectado com um ou mais dentre acilóstomo, tricurídeo e dirofilariose. Confirmação da presença ou da ausência de lombriga no mamífero pode ser feita, por exemplo, para o propósito de selecionar um curso ideal de tratar o mamífero e/ou para o propósito de determinar se o mamífero foi liberado da infecção depois do tratamento ter sido iniciado.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se às composições, dispositivos, kits e métodos para a detecção de lombriga em mamíferos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos e composições de polipeptídeo, composições de anticorpos e anticorpo, dispositivos, kits, e métodos para detectar a presença ou a ausência de antígeno de lombriga em uma amostra de um mamífero, que pode também incluir um ou mais antígenos de ancilóstomo, tricurídeo e dirofilariose.

2. Descrição da Técnica Anterior

[0002] Lombrigas adultas vivem no intestino delgado e põem ovos que distribuem nas fezes. No ambiente, larvas infecciosas permanecem dentro dos ovos e desenvolvem em um estágio infeccioso depois de aproximadamente três semanas em temperaturas ideais. Os ovos infecciosos entram em um hospedeiro através da ingestão e chocam no intestino delgado. Em cães com menos de cinco semanas de idade, as larvas migram através do tecido e para dentro da corrente sanguínea antes eventualmente atingindo o pulmão e a traqueia onde desenvolvimento adicional ocorre. O hospedeiro escarra e engole as larvas, que se transformam em adultos que residem no intestino delgado. Larvas que chocam dentro de cães maiores do que cinco semanas de idade ou dentro de outros animais, incluindo seres humanos, são capazes de viajar para uma ampla gama de tecidos incluindo o fígado, pulmões, coração, cérebro, e músculo esquelético. As larvas subsequentemente atrasam o desenvolvimento deles e enquistam o tecido do hospedeiro. Em cadelas prenhas ou amamentando, larvas enquistadas podem se tornar reativadas e causar infecção intestinal na mãe, migrar para o útero e diretamente infectar o feto através da placenta, ou migrar para o tecido mamário e infectar animais que estão se amamentando. Lombrigas parasíticas causam doença não só em seus hospedeiros animais, mas são também os agentes etiológicos de síndrome de emigração larval como também enterite grave e reações alérgicas em seres humanos, que ocorrem depois da ingestão de ovos infectados do ambiente ou ingestão de larvas encontradas dentro do fígado, carne ou outros tecidos de hospedeiros intermediários.

[0003] Infecção intestinal por lombriga é comum em animais e, se deixada não tratada, pode causar sérias doenças e até morte. Embora seu diagnóstico seja relativamente fácil para diagnosticar um animal infectado com lombriga como tendo uma infecção por verme parasítico (helminto) de algum tipo, é significativamente mais difícil identificar lombriga, especificamente, como o verme causador. Este é um problema porque as infecções por lombriga são melhor tratadas quando o cuidador do animal infectado tem conhecimento de que a lombriga é a fonte específica da infecção. Além disso, seres humanos que podem entrar em contato com o animal infestado ou seus excrementos, pode ser avisado para tomar precauções contra aquisição do parasita. Nesse contexto, é importante determinar a espécie de verme com alta especificidade, pois alguns helmintos, como as lombrigas e os ancilóstomos, podem causar doença significativa (por exemplo, larva migrans) em seres humanos, enquanto é geralmente aceito que tricurídeos não desempenham um papel zoonótico de importância em seres humanos.

[0004] Métodos atuais para diagnóstico de infecções por lombriga principalmente envolvem exame de microscópio de amostras fecais, quer diretamente em esfregaços fecais ou acompanhando a concentração da ova por flutuação em meio de densidade. A despeito da alta adoção deste procedimento, o método tem deficiências significativas. Esses métodos microscópicos consomem tempo, são desagradáveis, exigem equipamento especializado e podem ter baixa especificidade e sensibilidade [Dryden et al., 2005, Vet Therap. 6(1), 1528]. Além disso, a exatidão dos resultados desses métodos é altamente dependente da habilidade e perícia do operador.

[0005] Manuseio de fezes é desagradável e perigoso. Procedimentos sanitários e inofensivos para processar fezes são incômodos e muitas vezes complexos. Tais procedimentos podem incluir pesar, centrifugar e armazenar, e são difíceis exceto em laboratório clínico equipado com um aparelho apropriado, equipamento protetor, e técnico habilidoso. Desta maneira, qualquer redução no número de etapas requeridas para realizar um teste fecal e qualquer redução no contato entre o operador de teste e o material de teste é desejável. Laboratórios clínicos têm usado métodos de imunoensaio para a detecção de vários vírus, bactérias e parasitas não helmintos e organismos em fezes. Entretanto, permanece uma necessidade de um método simples de imunoensaio para a detecção de uma infecção por verme parasítico, e infecção por lombriga em particular nas fezes, no sangue todo e no soro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Em um aspecto, a invenção inclui anticorpos que especificamente se ligam para um polipeptídeo incluindo toda ou uma porção antigênica da sequência de aminoácido que corresponde a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou copro6716, como relacionado aqui no presente, ou para um polipeptídeo incluindo uma sequência que é uma variante conservativa de um dessas sequências. Em um aspecto adicional, os anticorpos especificamente se ligam para antígeno a partir de mamíferos infestados por lombriga, mas não especificamente se ligam à antígeno a partir de mamíferos infectados com ancilóstomo, dirofilariose e/ou tricurídeo.

[0007] Em outro aspecto, a invenção inclui anticorpos que são obtidos pela imunização com o polipeptídeo incluindo toda ou uma porção antigênica da sequência de aminoácidos que corresponde à SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7, ou copro6716, ou com um polipeptídeo incluindo uma sequência que é uma variante conservativa de uma daquelas sequências.

[0008] Em ainda outro aspecto, a invenção provê um dispositivo para detector a presença ou ausência de antígenos de lombriga na amostra; o dispositivo compreendendo um suporte sólido, em que o suporte sólido tem imobilizados no mesmo um ou mais anticorpos que são capazes de especificamente se ligar a um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou copro6716, ou uma porção antigênica do mesmo. O dispositivo, pode ser, mas não é limitado a ser, por exemplo, um dispositivo de ELISA, como um dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral ou dispositivo de placa de microtitulação. Amostras de mamíferos que podem ser testadas para lombriga pelo dispositivo incluem, mas não são limitadas a ser, fezes, sangue todo, soro, leite mamário e tecido integral, como o tecido da glândula mamária, intestino, fígado, coração, pulmão, esôfago, cérebro, músculo, e olho, por exemplo. O dispositivo ainda pode incluir, mas não necessita incluir, um ou mais reagentes para a detecção de um ou mais do grupo consistindo em: um ou mais parasitas de vermes não lombriga, um ou mais parasitas não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, e uma ou mais bactérias.

[0009] Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método de detectar a presença ou ausência de lombriga, como Toxocara canis (T. canis), Toxocara cati (T. cati), Toxocara vitulorum (T. vitulorum), Toxascaris leonina (T. leonina), Baylisascaris procyonis (B. procyonis), Ascaridia galli (A. galli), Parascaris equorum (P. equorum), Ascaris suum (A. suum), or Ascaris lumbricoides (A. lumbricoides), Anisakis simplex (A. simplex), or Pseudoterranova decipiens (P. decipiens), por exemplo, em uma amostra. A amostra pode ser obtida de um mamífero, como um canino, felino, suíno, bovino, cetáceo, pinipede ou ser humano. Em um aspecto, o método é realizado para testar uma amostra fecal para coproantigênico de lombriga. O método, entretanto, não é limitado para ser realizado para testar uma amostra fecal. Em adição à fezes, a amostra desta maneira pode ser, mas não está limitada a ser sangue todo, soro, leite mamário e tecido integral, como tecido de glândula mamária, intestino, fígado, coração, pulmão, esôfago, cérebro, músculo, e olho, por exemplo. Etapas do método incluem contatar a amostra com um ou mais dos anticorpos da invenção; formando polipeptídeos de anticorpos complexos na presença dos polipeptídeos se houver algum, na amostra; e detectar a presença ou ausência dos complexos de anticorpo-polipeptídeo, se houver algum. O método ainda pode incluir uma ou mais das etapas opcionais de diagnosticar o mamífero como tendo ou não tendo uma infecção por lombriga e determinar se um ácido nucleico da lombriga está presente na mesma amostra que foi contatada com os anticorpos para o propósito de detectar a presença ou ausência de lombriga ou em alguma outra amostra do mamífero. O método pode também ser usado para testar contaminação ambiental com lombriga. Amostras ambientais que podem ser testadas para lombriga pelo dispositivo incluem, mas não são limitadas a solo, material em decomposição, ou matéria fecal de composições residenciais incluindo quintais, jardins, caixas de areia, e playgrounds (pátios de recreio). Locais de teste podem também incluir parques, praias, florestas, fazendas, ou outros locais expostos ao material fecal de cães, gatos, ou outros hospedeiros mamíferos de lombrigas. Fezes de caixas de palha de dentro ou de for a de casa podem também ser testadas.

[00010] Em ainda outro aspecto, a presente invenção inclui um kit para realizar uma ou mais etapas do método da invenção. O kit pode opcionalmente incluir, por exemplo, o dispositivo e uma ou mais das composições da presente invenção e instruções para realizar o método da presente invenção. O kit pode ainda opcionalmente incluir, por exemplo, um ou mais reagentes indicadores, um ou mais compostos marcando anticorpos, um ou mais anticorpos, um ou mais reagentes de captura de antígeno, um ou mais inibidores, e um ou mais reagentes laváveis para serem usados como parte do dispositivo e/ou para serem usados na realização do método.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00011] Figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos de uma sequência de cDNA de 865 nucleotídeo de Toxocara canis adulta completa. (SEQ ID NO:1).

[00012] Figura 2 mostra a sequência de nucleotídeos de uma sequência de 632 nucleotídeos de Toxocara cati adulta toda. (SEQ ID NO:2).

[00013] Figura 3 mostra uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) de uma estrutura de leitura aberta grande (ORF) de SEQ ID NO:1. O códon de interrupção é indicado por *.

[00014] Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) de uma ORF grande de SEQ ID NO:2. O codon de interrupção é indicado por *.

[00015] Figura 5 mostra um alinhamento de comparação de SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5. A sequência de consenso de SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 é mostrada como SEQ ID NO:7.

[00016] Figura 6A mostra um dispositivo de placa de cavidades múltiplas da presente invenção.

[00017] Figura 6B mostra um exame minucioso de uma única cavidade da placa da Figura 6A com um anticorpo específico da presente invenção imobilizado para esse fim.

[00018] Figura 7 mostra um gráfico de valores de densidade óptica (OD) obtidos de amostras fecais de caninos infectados por lombriga seguindo o método da presente invenção em um primeiro Exemplo.

[00019] Figura 8 mostra um gráfico de valores de OD obtidos de amostras fecais de caninos infectados com lombriga, ancilóstomo ou tricurídeo seguindo o método da presente invenção em um segundo Exemplo.

[00020] Figura 9 mostra um gráfico de valores de OD obtidos de amostras fecais de caninos infectados com dirofilariose seguindo o método da presente invenção no segundo Exemplo.

[00021] Figura 10 mostra uma placa de microtitulação em que um ensaio ELISA foi realizado usando amostras fecais de caninos infectados com lombriga, ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilariose seguindo o método da presente invenção em um terceiro Exemplo.

[00022] Figura 11 mostra um gráfico de valores de OD obtidos das amostras fecais de um conjunto de caninos quando esses caninos tiveram uma infecção por lombriga, e de amostras fecais daqueles caninos depois deles terem sido libertados da lombriga, seguindo o método da presente invenção em um quarto Exemplo.

[00023] Figura 12 mostra um gráfico de valores de OD obtido de amostras fecais de felinos infectados por lombriga seguindo o método da presente invenção em um quinto Exemplo.

[00024] Figura 13 mostra um primeiro gráfico de valores de OD obtidos de amostras fecais de um conjunto de felinos quando esses felinos tiveram uma infecção por lombriga, e de amostras fecais daqueles felinos depois de terem se libertado da lombriga, seguindo o método da presente invenção em um sexto Exemplo.

[00025] Figura 14 mostra um segundo gráfico de valores de OD obtido de amostras fecais de um conjunto de controle de felinos que não foram infectados com lombriga seguindo o método da presente invenção no sexto Exemplo.

[00026] Figura 15 mostra um ELISA com frações de eluição de uma coluna de sulfopropila (SP) como amostras, demonstrando que Copro6716 pode ser parcialmente purificada e enriquecida eluindo a coluna de SP seguindo o método da presente invenção no sétimo Exemplo.

[00027] Figura 16 mostra que o peso molecular de Copro6716 era cerca de 10KD usando o western blotting marcado com anti-DIV6716 IgG-HRP de coelho de comprimento total seguindo o método da presente invenção no sétimo Exemplo.

[00028] Figura 17 mostra a sequência de aminoácidos de DIV6716 de comprimento total (SEQ ID NO: 5) com os quatro peptídeos (SEQ ID NOs: 8, 9, 10 e 11) identificados por análise de Espectrometria de Massa identificada realçando-os nas caixas matizadas seguindo o método da presente invenção no sétimo Exemplo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS DA INVENÇÃO I. Introdução

[00029] A presente invenção é em geral dirigida para métodos, dispositivos, kits e composições para detectar lombriga em uma amostra obtida de um mamífero. A presente invenção refere-se a antígenos de lombriga de Toxocara, como Toxocara canis ou Toxocara cati, por exemplo. Em particular, a presente invenção refere-se a peptídeos de Toxocara e variantes conservativas dos mesmos, polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos e oligonucleotídeos que especificamente se ligam àqueles polinucleotídeos, anticorpos que são criados contra e que especificamente se ligam a esses polipeptídeos, e métodos, dispositivos e kits para detectar lombriga, como Toxocara, Toxascaris, Baylisascaris, Ascaridia, Parascaris, e Ascaris, Anisakis, ou Pseudoterranova, incluindo T. canis, T. cati, T. vitulorum, T. leonina,, B. procyonis, A. galli, P. equorum, A. lumbricoides, A. suum, A. simplex, ou P. decipiens, por exemplo.

[00030] A presente invenção provê uma alternativa superior para essas técnicas de inspeção microscópica existentes. Isto é verdadeiro porque a presente invenção provê composições, dispositivos, kits e métodos para detectar a presença ou ausência de lombriga em uma amostra de um mamífero que: (1) são fáceis de usar e rendem resultados coerentemente confiáveis; (2) permitem que a ausência ou presença de lombriga em um mamífero seja confirmada independente de o mamífero estar infectado com ancilóstomo, tricurídeo, e/ou dirofilária; e (3) pode detectar lombriga antes do tempo em que a ova da lombriga aparece primeiro nas fezes do hospedeiro infectado.

[00031] A presente invenção é baseada em parte na descoberta de propriedades inesperadas de composições da presente invenção. Especificamente, foi determinado que um anticorpo da presente invenção criado contra um polipeptídeo da presente invenção pode ser usado para capturar e detectar antígenos de lombriga em um mamífero, mesmo quando o mamífero está também infestado por um ou mais de ancilóstomo, tricurídeo e dirofilária. Esta especificidade para lombriga é surpreendente por que lombrigas, tricurídeos, ancilóstomos e vermes do coração são todos nematoides relacionados, e um anticorpo criado contra uma proteína isolada de qualquer um desses vermes seria esperado ter uma reação cruzada com um ou mais dos outros vermes, antígenos hospedeiros, ou outros componentes de hospedeiro.

[00032] Foi ainda determinado que esse anticorpo pode ser usado para capturar e detectar antígenos de lombriga em um mamífero tão cedo como 17 dias depois do mamífero ser primeiro infectado com lombriga. Essa capacidade para detectar lombriga tão cedo depois da infecção, e antes do aparecimento de qualquer ova de lombriga nas fezes do mamífero infectado, é surpreendente porque a ova da lombriga, em geral, não aparece nas fezes de um hospedeiro contagioso até cerca de cinco a oito semanas depois do hospedeiro se tornar infectado.

[00033] A presente invenção, desta maneira, inclui métodos, dispositivos, composições e kits que usam anticorpos e/ou fragmentos dos mesmos para especificamente capturar e detectar antígenos de lombriga em um mamífero que pode também ser infestado por um ou mais tricurídeo, ancilóstomo e dirofilária. A capacidade da presente invenção para detectar e diagnosticar lombriga, mesmo quando um ou mais outros tipos de vermes estão também presentes, permite ao cuidador do mamífero a oportunidade de idealmente selecionar um tratamento para liberar a lombriga do mamífero. Adicionalmente, a capacidade da presente invenção para, em alguns casos, detectar lombriga logo em 17 dias depois do mamífero ser primeiro infectado, provê a possibilidade que o cuidador pode começar tal tratamento antes do mamífero ficar gravemente doente pela lombriga. Uma intervenção antes do aparecimento de ova nas fezes também reduzirá grandemente ou eliminará a possibilidade da infestação ser espalhada para outros animais ou seres humanos.

II. II. Definições e Usos de Termos

[00034] O termo "composições da invenção" refere-se a todos os ácidos nucleicos, polipeptídeos, anticorpos, e misturas que incluem um ou mais desses ácidos nucleicos, polipeptídeos, e anticorpos e um ou mais outros compostos, que podem ser usados para detectar a presença ou ausência de lombriga em uma amostra obtida de um mamífero realizando o método da presente invenção que são explicitamente descritos, implicitamente abrangidos ou de outra maneira descritos aqui no presente.

[00035] "Uma amostra de um mamífero" em que lombriga pode ser detectada pela presente invenção inclui todos os componentes corporalmente e extratos dos mesmos, como qualquer fluido, sólido, célula ou tecido, que são capazes de conter antígeno de lombriga. Amostras exemplares desta maneira incluem, mas não são limitadas a ser, fezes, leite, sangue todo e porções do mesmo, incluindo soro, e ainda inclui extratos de tecidos, incluindo tecidos de glândula mamária, intestino, fígado, coração, pulmão, esôfago, cérebro, músculo, e olho, por exemplo. A amostra pode ser tirada diretamente do mamífero ou a amostra pode ser tirada de qualquer coisa que tenha contatado o mamífero. Por exemplo, a amostra pode ser excrementos fecais frescos ou deteriorados do mamífero. Como outro exemplo, a amostra pode incluir solo, sujeira, areia, material de planta, ou qualquer outro material que pode ser misturado com componentes corporais que podem ser deixados para trás por um mamífero, como fezes, por exemplo. Não importa a origem ou o conteúdo da amostra, essa amostra às vezes é referida aqui no presente como a "amostra do mamífero", a "amostra de teste" ou a "amostra sob teste".

[00036] Como usado aqui no presente, "ácido nucleico" é sinônimo de, e desta maneira é usado intercambiavelmente com "gene", "DNA", "cDNA", "EST", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", "poliácido nucleico", "RNA" e "mRNA". Um ácido nucleico pode ser na forma de filamento duplo ou ele pode ser na forma de filamento único. Adicionalmente, um ácido nucleico é naturalmente isolado, como de uma lombriga toda ou uma porção do mesmo, por exemplo, ou ele é artificialmente sintetizado, em um organismo hospedeiro recombinante ou por qualquer outro meio artificial conhecido da pessoa versada, como empregando uma técnica baseada em PCR-, criando um organismo transgênico que sintetiza o ácido nucleico, usando uma máquina sintetizando o DNA, ou por qualquer outra técnica com base em molecular, por exemplo.

[00037] "Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são termos sinônimos que são usados intercambiavelmente aqui no presente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Um polipeptídeo, peptídeo e proteína da presente invenção podem ser naturalmente isolados, como de uma lombriga toda ou de uma porção de lombriga, por exemplo, ou artificialmente sintetizados, em um organismo hospedeiro recombinante ou por quaisquer outros meios artificiais conhecidos do técnico versado.

[00038] O termo "anticorpo" ou "anticorpo da presente invenção" refere-se a qualquer anticorpo que é capaz de especificamente se ligar a um ou mais antígenos de lombriga, mas não para qualquer antígeno de ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilária. Os anticorpos da presente invenção podem ser criados contra um ou mais polipeptídeos imunogênicos da presente invenção. A menos que estabelecido de outra maneira, deve ser compreendido que o anticorpo da presente invenção pode incluir uma mistura de dois ou mais tipos anticorpo diferentes. Por exemplo, o anticorpo pode ser uma mistura de dois tipos de anticorpos, em que um dos dois tipos especificamente se liga a um antígeno particular e o outro dos dois tipos especificamente se liga a algum outro antígeno.

[00039] O "polipeptídeo imunogênico da presente invenção" e, mais simplesmente, "o polipeptídeo da presente invenção", é um imunógeno contra o qual os anticorpos da presente invenção podem ser criados. Todos os "polipeptídeos da presente invenção" são imunogênicos e desta maneira podem ser usados para extrair uma resposta imune em um animal hospedeiro para produzir os anticorpos da presente invenção. A menos que estabelecido de outra maneira, deve ser entendido que o polipeptídeo da presente invenção pode ser um componente de uma composição misturada de uma pluralidade de componentes.

[00040] Um "imunógeno" é qualquer agente, como o polipeptídeo imunogênico da presente invenção, por exemplo, que é capaz de extrair uma resposta imune em um animal que está exposto àquele agente.

[00041] O termo "lombriga", como usado aqui no presente, refere-se à helmintos como lombrigas intestinais da ordem Ascaridida, que inclui os gêneros Toxocara, Toxascaris, Baylisascaris, Ascaridia, Parascaris, Ascaris, Anisakis, e Pseudoterranova. Desse modo, o termo "lombriga", como usado aqui no presente, não se refere à totalidade do Filo Nematoda. Desta maneira, "lombriga" não inclui qualquer membro dos gêneros Ancylostoma, Uncinaria, Necator, Trichuris ou Dirofilaria.

[00042] Uma "lombriga de coproantígeno" ou um "coproantígeno de lombriga" é qualquer produto de lombriga que está presente nas fezes de um mamífero tendo uma infecção por lombriga, e que pode ser especificamente ligado por um ou mais dos anticorpos da invenção. Por exemplo, um coproantígeno de lombriga pode ser, mas não está limitado a ser, um ou mais dos polipeptídeos da invenção.

[00043] Os presentes inventores determinaram que uma nova isoforma 10 kD de DIV6716, que é uma proteína excretora/secretora de T. canis, está presente nas fezes de caninos infectados por T. canis logo em 17 dias depois dos caninos se tornarem inicialmente infectados com o T. canis. Deta maneira, um "coproantígeno de lombriga" pode ser esta nova isoforma 10 kD de DIV6716 (que é referida aqui no presente como "Copro6716") que foi observada em fezes de caninos pelos presentes inventores.

[00044] "Específico para", "especificamente se liga", e "estavelmente liga" significa que uma composição particular da invenção, como um anticorpo, polipeptídeo, ou oligonucleotídeo da presente invenção, por exemplo, reconhece e se liga a um ou mais outros agentes com maior afinidade do que para pelo menos um outro agente. Como um exemplo, um anticorpo da presente invenção é dito ser "específico para", "especificamente se ligar", e para "estavelmente se ligar" a antígenos de lombriga sem que aquele anticorpo é capaz de reconhecer e ligar àqueles antígenos de lombriga com maior afinidade do que para quaisquer outros antígenos de um verme parasítico não lombriga. Tal especificidade de ligação pode ser testada usando metodologia bem conhecida na técnica, por exemplo, ELISA, ou um radioimunoensaio (RIA). Com base nas informações observadas a respeito da especificidade de ligação de uma composição particular da invenção, o método da presente invenção pode ser realizado sob condições que permitem que a composição se ligue a (e desta maneira permite a detecção de tal ligação para) um agente ou agentes particulares, mas não para significativamente ligar outros agentes, enquanto essas condições são mantidas. Como um exemplo, o método da presente invenção pode ser realizado sob condições que permitem um anticorpo da presente invenção se ligar para (e desta maneira permitir a detecção de tal ligação para) um ou mais antígenos de lombriga presentes em uma amostra particular, mas não significativamente a qualquer antígeno de ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilária que pode estar presente naquela amostra.

[00045] "Detectar lombriga" significa detectar um ou mais produtos específicos de lombriga, incluindo um ou mais dos polipeptídeos, anticorpos e ácidos nucleicos da presente invenção, ou um ou mais antígenos de lombriga, ou Copro6716, por exemplo. A presença de um ou mais tais produtos de lombriga em uma amostra de um mamífero é indicativa de que o mamífero tem uma infecção por lombriga, independente se qualquer organismo de lombriga todo ou ova do mesmo está também presente naquela amostra. Ao contrário, a ausência de um ou mais tais produtos de lombriga em uma amostra de um mamífero é indicativa de que o mamífero não tem uma infecção por lombriga.

[00046] "Aminoácido" refere-se aos aminoácidos sintéticos ou de ocorrência natural. Resíduos de aminoácido são abreviados como a seguir: Alanina é A ou Ala; Arginina é R ou Arg; Asparagina é N ou Asn; Ácido Aspártico é D ou Asp; Cisteína é C ou Cys; Ácido Glutâmico é E ou Glu; Glutamina é Q ou Gln; Glicina é G ou Gly; Histidina é H ou His; Isoleucina é I ou Ile; Leucina é L ou Leu; Lisina é K ou Lys; Metionina é M ou Met; Fenilalanina é F ou Phe; Prolina é P ou Pro; Serina é S ou Ser; Treonina é T ou Thr; Triptofano é W ou Trp; Tirosina é Y ou Tyr; e Valina é V ou Val. Exceto quando definido de outra maneira aqui no presente, X ou Xaa representa qualquer aminoácido. Outros aminoácidos relevantes incluem, mas não são limitados a ser, 4- hidroxiprolina e 5-hidroxilisina. Em todos os casos, a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo descrito ou de outra maneira referido aqui no presente é apresentada em forma convencional em que o mais a esquerda, ou primeiro, resíduo de aminoácido da sequência é o resíduo do N-terminal e o mais à direita, ou último, resíduo de aminoácido da sequência é o resíduo do C-terminal.

[00047] Uma "variante conservativa" de qualquer sequência de ácido nucleico particular inclui qualquer sequência tendo uma ou mais substituições de códon degenerado para aquela sequência particular de ácido nucleico, qualquer sequência tendo uma ou mais substituições de nucleotídeos para, inserções para, e deleções daquela sequência de ácidos nucleicos particular, e a sequência complementar daquele particular ácido nucleico e as variantes conservativas daquela sequência complementar. Variantes conservativas de uma sequência particular de ácido nucleico preferivelmente têm pelo menos cerca de 85% de identidade, mais preferivelmente têm pelo menos cerca de 90% de identidade, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95- 99% de identidade, para aquela sequência de ácido nucleico particular. Variantes conservativas de uma sequência de ácido nucleico particular podem ser artificialmente sintetizadas ou elas podem ser isoladas em sua forma natural de um organismo, incluindo de um organismo de lombriga, como Toxocara canis e Toxocara cati, por exemplo.

[00048] Uma "variante conservativa" de qualquer sequência de polipeptídeo particular é qualquer polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que varia da sequência de aminoácidos daquele particular polipeptídeo, mas ainda retém as propriedades de ligação específicas daquele particular polipeptídeo, de tal maneira que um anticorpo da presente invenção, que é criado contra o particular polipeptídeo é capaz de especificamente ligar o polipeptídeo variante. Desta maneira, por exemplo, uma variante conservativa de um particular polipeptídeo pode ter uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções, adições, e inserções para aquele particular polipeptídeo. Por exemplo, uma variante conservada de um particular polipeptídeo pode ter 30 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, ou 5 ou menos, substituições de aminoácidos conservados para aquele particular polipeptídeo. Variantes conservativas de um particular polipeptídeo preferencialmente, mas não essencialmente, têm pelo menos cerca de 80% de identidade, mais preferencialmente têm pelo menos cerca de 90% de identidade, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 91-99% de identidade, para aquele particular polipeptídeo. Uma identidade percentual de qualquer ácido nucleico sujeito ou sequência de aminoácidos (por exemplo, qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui no presente) relativos a outro ácido nucleico "alvo" ou sequência de aminoácidos, pode ser determinada como a seguir. Primeiro, um ácido nucleico alvo ou sequência de aminoácidos da invenção pode ser comparado e alinhado a um ácido nucleico sujeito ou sequência de aminoácidos, usando o programa de sequências BLAST 2 (Bl2seq) da versão única de BLASTZ contendo BLASTN e BLASTP (por exemplo, versão 2.0.14). A versão única de BLASTZ pode ser obtida em www.ncbi.nlm.nih.gov. Instruções explicando como usar BLASTZ, e especificamente o programa Bl2seq, podem ser encontradas no arquivo 'readme' que acompanha BLASTZ. Os programas também são descritos em detalhes por Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264; Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873; e Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389.

[00049] "Copro6716" refere-se a uma porção de 10kD de DIV6716 encontrada em fezes de mamíferos.

[00050] Bl2seq faz uma comparação entre a sequência de sujeito e uma sequência alvo, usando o algoritmo BLASTN (usado para comparar sequências de ácido nucleico) ou BLASTP (usado para comparar sequências de aminoácidoss). Tipicamente, os parêmetros padrão da matriz de escore BLOSUM62, custom de existência de intervalo de 11 e custo de prolongamento de 1, um tamanho de palavra de 3, um valor esperado de 10, um custo por resíduo de 1 e uma proporção de lambda de 0,85 são usados quando realizando os alinhamentos da sequência de aminoácidos. O arquivo de saída contém regiões alinhadas, de homologia entre a sequência alvo e a sequência sujeito. Uma vez alinhadas, o comprimento é determinado contando o número de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos consecutivos (isto é, excluindo intervalos) da sequência alvo que se alinha com a sequência da sequência de sujeitos com qualquer posição combinada e termina com qualquer outra posição combinada. Uma posição combinada é qualquer posição em que um resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idêntico está presente em ambas as sequência, alvo e de sujeito. Intervalos de um ou mais resíduos podem ser inseridos em uma sequência de sujeito ou alvo para maximizar os alinhamentos das sequências entre domínios estruturalmente conservados (por exemplo, a-hélices, β-folhas, e loops). A identidade de percentual sobre um comprimento particular é determinada contando o número de posições combinadas sobre aquele comprimento particular, dividindo aquele número pelo comprimento e multiplicando o valor resultante por 100. Por exemplo, se (i) uma sequência alvo de aminoácidos 500 é comparada a uma sequência de aminoácidos sujeitos, (ii) o programa Bl2seq apresenta 200 aminoácidos da sequência alvo alinhada com uma região da sequência sujeito em que o primeiro e o último aminoácido daquela região de aminoácidos 200 são combinados, e (iii) o número de combinações sobre aqueles aminoácidos alinhados 200 é 180, depois a sequência alvo de aminoácidos 500 contém um comprimento de 200 e uma sequência identidade sobre aquele comprimento de 90% (isto é, 180/200x100=90). Será percebido que uma sequência alvo de ácido nucleico ou aminoácido que alinha uma sequência sujeito pode resultar em muitos comprimentos diferentes com cada comprimento tendo sua própria identidade percentual. É observado que o valor da identidade percentual pode ser arredondado para o mais perto de dez. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 é arredondado para menos 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e 78,19 é arredondado para mais até 78,2. É também notado que o valor do comprimento será sempre um número inteiro.

[00051] Variantes conservativas de uma sequência de polipeptídeo particular podem ser artificialmente sintetizadas ou elas podem ser isoladas em suas formas naturais de um organismo, incluindo de um organismo de lombriga, como Toxocara canis e Toxocara cati, por exemplo. Em um exemplo específico, o polipeptídeo da invenção tendo uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO:4 mostrada abaixo é uma variante conservativa do polipeptídeo da presente invenção tendo uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO:3 em que SEQ ID NO:4 é mais de 92% idêntica à SEQ ID NO:3 sobre um alinhamento de 131 aminoácidos. Mais em geral, cada uma das SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 são variantes conservadas uma da outra. Deve também ficar compreendido que outras variantes conservadas das SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 são consideradas pela presente invenção como descrito aqui no presente, mas o técnico versado deverá reconhecer que todas essas variantes consideradas são também muito numerosas para listar. O técnico versado irá também reconhecer que essas variantes incluem, mas não são limitadas àquelas tendo uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido básico, uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido acídico, uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido polar, uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido hidrofóbico, uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido aromático, e uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido pequeno. (resíduos de aminoácido "básico" são K, R e H. Resíduos de aminoácido "acídico" são D e E. Resíduos de aminoácido "polar" são N e Q. Aminoácidos "hidrofóbicos" são I, L, e V. Resíduos de aminoácido "aromático" são F, Y, e W. Aminoácidos "pequenos" são G, S, A, T e M.)

III. Ácidos nucleicos e Polipeptídeos da Invenção

[00052] Os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção são descritos em detalhes no Pedido Provisório: "Métodos, Dispositivos, Kits e Composições Para Detectar Lombriga," Pedido Série No. 61/128.079, depositado no dia 19 de maio de 2008, e está incorporado por referência em sua inteireza.

[00053] Em uma tentativa para identificar composições que podem ser usadas para confirmar a presença ou ausência de lombriga em uma amostra fecal, uma pluralidade de iniciadores de oligonucleotídeos correspondentes às porções de dois clones de marcador de sequência expressa (EST) (ko15fo7 e ko34f08; que estão disponíveis do Centro de Sequência de Genoma da Universidade de Washington (Washington University Genome Sequencing Center, St. Louis, MO) foram designados, sintetizados e usados em reações de 5’ RACE, 3’RACE e RT-PCR que incluíram RNA total isolado de Toxocara canis ou Toxocara cati. Como resultado desses esforços, uma sequência de DNA de nucleotídeos 865- cDNA foi deduzida de Toxocara canis (essa sequência é mostrada na Figura 1 e é identificada aqui no presente como SEQ ID NO:1), e uma sequência de cDNA de nucleotídeos 632- foi deduzida de Toxocara cati (essa sequência é mostrada na Figura 2 e é identificada aqui no presente como SEQ ID NO:2). (pesquisas de BLAST que foram realizadas usando SEQ ID NO:1 indicaram que uma porção daquela sequência é similar a, mas não é idêntica a ou substancialmente idêntica à, sequência de ácido nucleico que é prevista para codificar uma porção da proteína TBA-1 de Toxocara canis e para sequência de ácido nucleico que é prevista para codificar a proteína ABA-1 de Ascaris lumbricoides (ver S. Yahiro et al., Parasite Immunology 20:351-7 (1998); M. W. Kennedy, Parasitology Todia 16:373-80 (2000); e Y. Xia et al., Parasitology 120:211-24 (2000).)

[00054] A análise das sequências correspondentes à SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 indicou que cada uma dessas sequências contém uma ORF grande. Especificamente, como mostrado na Figura 3, o ORF grande da SEQ ID NO:1 corresponde aos nucleotídeos 2 até 616 da SEQ ID NO:1 e é previsto para codificar um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos a seguir: KKIYGVAASRRRRHHFTLENSLDTHLKWLSHEQKEELLQMKKDGKSK KELQDKIMHYYEHLEGDAKHEATEQLKGGCREILKHVVGEEKAAEIK ALKDSGASKDELKAKVEEALHAVTDEEKKQHIAEFGPACKKIYGVAAS RRRRHHFTLENSLDTHLKWLSHEQKEELLQMKKDGKSKKELQDKIM HYYEHLEGMLLALCILY (SEQ ID NO:3).

[00055] Além disso, como mostrado na Figura 4, o ORF grande da SEQ ID NO:2 corresponde aos nucleotídeos 1 até 486 da SEQ ID NO:2 e é previsto para codificar um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos a seguir: IYGVAASRRRRHHFTLEKSLDTHLKWLSHEQKEELLKMKKDGKSKKELQDK VMHFYEHLEGDAKHEATEQLKGGCREILKHVVGEEKAAEIKALKDSGASKD ELKAKVEDALHAVTDEEKKQHIAEFGPACKEIFGVPIDVRHKRDPYTNMTP DEVAEGLRS (SEQ ID NO:4).

[00056] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser codificados por ácidos nucleicos que têm uma sequência de nucleotídeos que corresponda a todas ou porções de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 ou a todas ou porções de quaisquer variantes conservativas dessas sequências. Deve ficar entendido, desta maneira, que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo da presente invenção é variável.

[00057] Por exemplo, o polipeptídeo da presente invenção pode ter uma sequência de aminoácidos que corresponde a todas ou a uma porção de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 ou todas ou uma porção de quaisquer variantes conservativas de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[00058] Em um exemplo específico, o polipeptídeo da presente invenção tem a sequência de aminoácidos a seguir: MHHFTLENSLDTHLKWLSHEQKEELLQMKKDGKSKKELQDKIMHYY EHLEGDAKHEATEQLKGGCREILKHVVGEEKAAEIKALKDSGASKDE LKAKVEEALHAVTDEEKKQHIAEFGPACKKIYGVAAS (SEQ ID NO:5).

[00059] Com 130 aminoácidos, proteína DIV6716 (SEQ ID NO:5) é cerca de 14 kD em tamanho. Os presentes inventores determinaram que uma porção truncada (cerca de 10 kDa) da proteína do comprimento todo (14 kDa), e desta maneira não a versão 14 kDa, está presente nas fezes de caninos que estão infectados por T. canis. (Essa porção 10 kDa truncada de DIV6716 é referida aqui no presente como "Copro6716"; a detecção de Copro6716 em fezes de caninos infectados por T. canis- é descrita na seção de Exemplos incluída aqui no presente.) Em um aspecto, desta maneira, a presente invenção provê polipeptídeos que podem ser usados para gerar anticorpos que podem ser usados para especificamente capturar e detectar Copro6716.

[00060] Os resíduos de aminoácido 129 que seguem o resíduo de metionina do N-terminal do polipeptídeo correspondente à SEQ ID NO:5 (DIV 6716) especificamente representa os resíduos de aminoácido 14 até 142 da SEQ ID NO:3. Como descrito na seção de Exemplos incluída aqui no presente, a metionina do N-terminal foi artificialmente adicionada ao N-terminal deste polipeptídeo realizando uma técnica de clonagem padrão. Além disso, como descrito ao longo de toda a seção de Exemplos, anticorpo criado contra o polipeptídeo correspondente à SEQ ID NO:5 foi útil para detectar antígeno de lombriga. Por causa da metionina do N-terminal ter sido artificialmente adicionada, e não se acha que naturalmente exista em Toxocara (o resíduo que é imediatamente anterior ao resíduo de histidina na posição 14 em cada uma das SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 é arginina, e não metionina), é desta maneira considerado que o polipeptídeo da presente invenção pode ter uma sequência de aminoácidos que corresponde aos resíduos de aminoácidos 14 até 142 da SEQ ID NO:3, ou, mais especificamente: HHFTLENSLDTHLKWLSHEQKEELLQMKKDGKSKKELQDKIMHYYEH LEGDAKHEATEQLKGGCREILKHVVGEEKAAEIKALKDSGASKDELK AKVEEALHAVTDEEKKQHIAEFGPACKKIYGVAAS (SEQ ID NO:6).

[00061] Adicionalmente, um alinhamento de SEQ ID NO:5 (principalmente sequência derivada de Toxocara canis; com a única exceção sendo o resíduo de metionina do N-terminal) para SEQ ID NO:4 (sequência derivada de Toxocara cati) é mostrado na Figura 5. Por causa do anticorpo criado contra um polipeptídeo tendo sequência correspondente a SEQ ID NO:5 foi útil para detectar Toxocara cati (ver a seção de Exemplos incluída aqui no presente), é adicionalmente considerado que o polipeptídeo da presente invenção pode ter a sequência de aminoácidos correspondente a SEQ ID NO:7 (que também é mostrada na Figura 5), em que o X na posição 1 é I ou ausente, o X na posição 2 é Y ou ausente, o X na posição 3 é G ou ausente, o X na posição 4 é V ou ausente, o X na posição 5 é A ou ausente, o X na posição 6 é A ou ausente, o X na posição 7 é S ou ausente, o X na posição 8 é R ou ausente, o X na posição 9 é R ou ausente, o X na posição 10 é R ou ausente, o X na posição 11 é R ou M, o X na posição 18 é N ou K, o X na posição 37 é Q ou K, o X na posição 52 é I ou V, X na posição 55 é Y ou F, o X na posição 110 é E ou D, o X na posição 133 é K ou E, o X na posição 135 é Y ou F, o X na posição 138 é A ou P, o X na posição 139 é A ou I, o X na posição 140 é S ou D, o X na posição 141 é V ou ausente, o X na posição 142 é R ou ausente, o X na posição 143 é H ou ausente, o X na posição 144 é K ou ausente, o X na posição 145 é R ou ausente, o X na posição 146 é D ou ausente, o X na posição 147 é P ou ausente, o X na posição 148 é Y ou ausente, o X na posição 149 é T ou ausente, o X na posição 150 é N ou ausente, o X na posição 151 é M ou ausente, o X na posição 152 é T ou ausente, o X na posição 153 é P ou ausente, o X na posição 154 é D ou ausente, o X na posição 155 é E ou ausente, o X na posição 156 é V ou ausente, o X na posição 157 é A ou ausente, o X na posição 158 é E ou ausente, o X na posição 159 é G ou ausente, o X na posição 160 é L ou ausente, o X na posição 161 é R ou ausente, e o X na posição 162 é S ou ausente.

[00062] É também considerado que qualquer uma ou mais das SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 pode ser somente uma porção de uma sequência maior de polipeptídeos, e desta maneira pode representar sequência parcial de uma ou mais proteínas que normalmente são expressas em lombriga, por exemplo, ou uma ou mais sequências de polipeptídeos que são artificialmente fundidas à SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou Copro6716. O técnico versado reconhecerá que existe uma variedade de técnicas para artificialmente fundir dói sou mais fragmentos de polipeptídeo juntos.

[00063] É ainda adicionalmente considerado que o polipeptídeo da presente invenção pode incluir mais de uma das SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e Copro6716. Por exemplo, o polipeptídeo da presente invenção pode incluir a SEQ ID NO:5 fundida a SEQ ID NO:7. Além disso, é considerado que o polipeptídeo da presente invenção pode incluir uma pluralidade de fragmentos de polipeptídeo correspondentes a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e Copro6716. Por exemplo, o polipeptídeo da presente invenção pode ser formado por uma pluralidade de fragmentos de polipeptídeo correspondendo a SEQ ID NO:5 que são fundidos juntos. Em outro exemplo, o polipeptídeo da presente invenção pode ser formado por uma pluralidade de fragmentos de polipeptídeo correspondentes a SEQ ID NO:5 e uma pluralidade de fragmentos de polipeptídeo correspondentes a SEQ ID NO:7 que são fundidos juntos em qualquer combinação.

[00064] Visto que um particular polipeptídeo da presente invenção foi expresso e isolado por uma técnica específica (em que é descrito na seção de Exemplos incluída aqui no presente), o técnico versado reconhecerá que qualquer um dos polipeptídeos da presente invenção pode ser isolado empregando qualquer uma ou mais de uma variedade de técnicas. (Ver, por exemplo, Sewald e Jakubke, Peptídeos: Chemistry and Biology, Wiley Publishing (2002); Peptídeo Synthesis and Applications (Métodos in Molecular Biology) Howl, ed., Humana Press (2005); Jones, Aminoácido and Peptídeo Synthesis, Oxford University Press (2002), cada um dos quais é incorporado aqui no presente por referência em sua inteireza). Essas técnicas incluem aquelas que podem ser realizadas para isolar polipeptídeos naturalmente existentes como Copro6716 ou polipeptídeos tendo sequência de aminoácidos correspondentes a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 e qualquer variante de ocorrência natural desses polipeptídeos. Essas técnicas ainda incluem aqueles que podem ser realizados para artificialmente gerar os polipeptídeos tendo sequência de aminoácidos correspondentes a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 e qualquer variante conservada desses polipeptídeos como Copro6716 ou polipeptídeos. Tais variantes podem ser geradas, por exemplo, empregando qualquer uma ou mais técnicas de mutagênese ou por síntese direta.

[00065] Os polipeptídeos da presente invenção são capazes de induzir uma resposta imune em um animal hospedeiro que é exposto à esses polipeptídeos para produzir um ou mais dos anticorpos da presente invenção. Sem levar em consideração a técnica através da qual eles são derivados, os polipeptídeos da presente invenção são preferencialmente preparados em forma substancialmente pura quando eles são para ser usados para o propósito de criar anticorpo. Preferencialmente, esses polipeptídeos são pelo menos cerca de 80% puros, mais preferencialmente são pelo menos cerca de 90-95% puros, e ainda mais preferencialmente são pelo menos cerca de 99% puros. Técnicas exemplares para induzir uma resposta imune em um organismo hospedeiro e para isolar anticorpos a partir dos mesmos são descritas aqui no presente, mas deve ser compreendido que a presente invenção não está limitada a essas técnicas. O técnico versado reconhecerá que existe uma pluralidade de técnicas paras alcançar o mesmo objetivo sem se desviar do escopo e espírito da invenção.

IV. Anticorpos da Invenção

[00066] A presente invenção ainda inclui anticorpos e fragmentos de ligação de antígenos dos mesmos que são criados contra e que especificamente ligam todos ou parte de um ou mais polipeptídeos da presente invenção, e também inclui composições que incluem os ditos anticorpos e fragmentos de ligação de antígenos dos mesmos. Quando contatados a uma amostra obtida de um mamífero, esses anticorpos e fragmentos de ligação de antígenos são capazes de especificamente ligar antígeno de lombriga presente na amostra, mas não são capazes de especificamente ligar qualquer antígeno de ancilóstomo, tricurídeo, ou dirofilária que pode estar presente na amostra. Os anticorpos da presente invenção são apropriados para ser usados somente para capturar um ou mais antígenos de lombriga, somente para detectar um ou mais antígenos de lombriga, ou mais preferencialmente, para ambos capturar e detectar um ou mais antígenos de lombriga.

[00067] Os anticorpos da presente invenção podem pertencer a qualquer classe de anticorpo, incluindo por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, e podem ser preparados por qualquer de uma variedade de técnicas conhecidas no técnico versado. (Ver, por exemplo, Dean, Métodos Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Métodos Mol. Biol. 32:36179 (1994); Baileg, Métodos Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Métodos Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Métodos Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68(1992); Harlow and Lane, Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); and Making and Usando Anticorpos: A Practical Handbook, Howard and Kaser, eds., CRC Press (2006), cada um dos quais está incorporado aqui no presente por referência em sua inteireza.)

[00068] Em uma técnica, o polipeptídeo da invenção é introduzido em um animal hospedeiro, como coelho, camundongo, rato, porco da Índia, cabra, porco, vaca, carneiro, burro, cão, gato, galinha, ou cavalo, por exemplo. Uma resposta imune intensificada pode ser induzida no animal hospedeiro associando o polipeptídeo com um veículo e/ou expondo o hospedeiro a um adjuvante, mas deve ser entendido que a presente invenção não requer que o polipeptídeo seja associado com um veículo ou que o hospedeiro seja exposto ao adjuvante. Um veículo exemplar que pode ser usado para este propósito é albumina de soro bovino, tiroglobulina bovina, e inibidor de tripsina de soja. Adjuvantes exemplares incluem adjuvante completo ou incompleto de Freund e adjuvante MDL-TDM. Independente de se o polipeptídeo é associado com tal veículo ou se o hospedeiro é exposto a um adjuvante, imunizações de reforço opcionalmente podem ser feitas com o animal hospedeiro sendo sangrado uma ou mais vezes depois disso. Anticorpos policlonais que especificamente ligam o polipeptídeo podem depois ser purificados do antissoro obtido do sangramento ou sangramentos. Tal purificação pode ser alcançada, por exemplo, empregando técnicas de afinidade cromatográfica que envolvem associar o polipeptídeo a um suporte sólido. Tais técnicas de afinidade cromatográfica são bem conhecidas pelo técnico versado.

[00069] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo que é criado em coelho imunizando aquele animal hospedeiro com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos correspondentes a SEQ ID NO:5. (Daqui em diante, esse particular anticorpo é referido como "anti-DIV6716".) Uma técnica específica para produzir e isolar anti-DIV6716 pAB é descrita na seção de Exemplos incluída aqui no presente, mas o técnico versado reconhecerá que a produção e isolamento de anti-DIV6716 pAB, ou qualquer outro anticorpo da presente invenção, não estão limitados a essa técnica específica.

[00070] Em outras modalidades, o anticorpo da presente invenção é criado em um hospedeiro contra um ou mais polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é uma variante conservativa das sequências correspondentes a SEQ ID NO:5. Em algumas outras modalidades, o anticorpo da presente invenção é criado em um hospedeiro contra qualquer um ou mais polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos correspondentes a sequência de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:7, ou um ou mais polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é uma variante conservativa de qualquer uma dessas sequências.

[00071] Em outra modalidade, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo que especificamente liga Copro6176 e/ou um ou mais polipeptídeo tendo a sequências de aminoácidos correspondentes a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:7, ou porções antigênicas do mesmo.

[00072] Em ainda outras modalidades, o anticorpo da presente invenção especificamente liga um ou mais polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é uma variante conservativa de Copro6176 ou das sequências correspondentes a SEQ ID NO:5. Em algumas outras modalidades, o anticorpo da presente invenção especificamente liga um ou mais polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos correspondentes a sequência de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:7, ou um ou mais polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é uma variante conservativa de qualquer uma dessas sequências.

[00073] É também para ser compreendido que os anticorpos da invenção podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais, anticorpos de cadeia única (scFv) anticorpos quiméricos e fragmentos dos mesmos. Anticorpos monoclonais que são específicos para o polipeptídeo de interesse podem ser obtidos e purificados, por exemplo, preparando linhas de células que geram anticorpos tendo a especificidade desejada para o polipeptídeo de interesse. Linhas de células deste tipo podem ser derivadas de células de um tipo particular (por exemplo, células do baço) que são isoladas de um animal hospedeiro que tinha sido anteriormente imunizado com o polipeptídeo como descrito antes. Em tal caso, essas células poderão depois ser imortalizadas, por exemplo, fundindo-as com células de mieloma por realizar qualquer de uma variedade de técnicas de fusão conhecidas pelo técnico versado. Em uma técnica exemplar, as células do animal hospedeiro imunizado são coincubadas com seu parceiro de fusão, por exemplo, as células de mieloma, na presença de um detergente por um curto período de tempo antes de ser laminada em um meio que suporta o crescimento de células híbridas (mas não o parceiro de fusão de mieloma). Tal seleção pode ser alcançada, por exemplo, usando hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). Quando células híbridas emergem durante a seleção, em talvez uma ou duas semanas depois do começar o processo de seleção, colônias híbridas únicas (e suas sobrenadantes) são testadas por sua capacidade para ligar o polipeptídeo ou os polipeptídeos contra os quais o animal hospedeiro foi imunizado. Colônias híbridas tendo a especificidade de ligação mais ideal representarão os melhores candidatos a partir dos quais os anticorpos monoclonais podem ser isolados. Esses anticorpos monoclonais, por exemplo, podem ser isolados diretamente da sobrenadante (isto é, meio) em que essas colônias crescem, empregando qualquer de uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico versado.

[00074] Os anticorpos da invenção também pode ser anticorpos de cadeia única (scFv), ou um antígeno ligando um fragmento de um anticorpo. Fragmentos de ligação de antígenos de anticorpos são uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o sítio de ligação de antígeno ou região da variável de um anticorpo intacto, em que a porção é livre dos domínios de cadeia pesada constantes da região de Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 e Fv. Em adição à produção e purificação de células de animais ou mamíferos, anticorpos, fragmentos de anticorpo, ou estruturas de não-anticorpo podem ser selecionados com base em várias tecnologias in vitro, incluindo exibição de bacteriófago, exibição ribossomal, ou exibição bacteriana.

[00075] Anticorpos, incluindo anticorpos secundários, podem ser marcados com um tipo de rótulo conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, rótulos fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos, enzimas, partículas coloidais, radioisótopos e bioluminescentes. Em várias modalidades da invenção, o um ou mais dos anticorpos da invenção são marcados com uma enzima, uma partícula coloidal, um radionuclídeo ou um fluoróforo. O rótulo particulado pode ser, por exemplo, uma partícula de látex colorido, dispersão coloidal de cor, ou dispersão coloidal ouro conjugada a um anticorpo.

V. Métodos, Dispositivos e Kits da Invenção A. Dispositivos e Kits da Invenção

[00076] A presente invenção, em um aspecto, é um dispositivo para a detecção de infecção por lombriga em um mamífero, como um canino, felino, suíno, bovino, ou ser humano, por exemplo. O dispositivo é arranjado para ajudar na detecção da presença ou ausência de antígeno de lombriga em uma amostra de um mamífero que pode também ser infectado com um ou mais outros parasitas de vermes, incluindo ancilóstomo, tricurídeo e dirofilária.

[00077] Em um aspecto, o dispositivo inclui um suporte sólido, em que um ou mais anticorpos da invenção são imobilizados no suporte sólido. O suporte sólido pode ser, mas não está limitado para ser, o interno, superfície de fundo de um poço ou uma placa de microtítulo ou um substrato que está incluído como parte de um dispositivo de fluxo lateral, por exemplo. Uma placa de microtítulo exemplar é uma placa de 96 cavidades Immulon 1B (que está comercialmente disponível de Thermo Scientific of Milford, MA), mas deve ser também compreendido que o técnico versado reconhecerá que uma grande variedade de outras placas de microtítulo que não são placa de 96 cavidades Immulon 1B 96 permitem a imobilização de anticorpos no mesmo, e dessa maneira serão apropriadas para prover o suporte sólido da presente invenção.

[00078] Um dispositivo de fluxo lateral exemplar é o dispositivo de fluxo lateral que está descrito na Patente US No. 5.726.010, que é incorporada aqui no presente por referência em sua inteireza. O dispositivo para realizar um ensaio de fluxo lateral pode ser um dispositivo de SNAP®, que está comercialmente disponível de IDEXX Laboratories, Inc. of Westbrook, ME. Entretanto, deve ser compreendido que o técnico versado reconhecerá que uma grande variedade de outros dispositivos de fluxo lateral, que não são dispositivos SNAP® ou descritos pela Patente US No. 5.726.010, permitem a imobilização de um anticorpo no mesmo, e desta maneira serão apropriados para ser usados como o dispositivo da presente invenção. Esses dispositivos podem incluir, por exemplo, dispositivos de fluxo lateral que usam tecnologia ouro coloidal.

[00079] Anticorpos usados no dispositivo da invenção podem ser imobilizados no suporte sólido por qualquer metodologia conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, covalentemente ou não covalentemente, diretamente ou indiretamente acoplar os anticorpos ao suporte sólido. Desta maneira, enquanto esses anticorpos podem ser acoplados ao suporte sólido por adsorção física (isto é, sem o uso de ligantes químicos), é também verdadeiro que esses anticorpos podem ser imobilizados para o suporte sólido por qualquer ligação química (isto é, com o uso de ligantes químicos) método prontamente conhecido daquele versado na técnica.

[00080] É também para ser compreendido que o suporte sólido pode ser qualquer material apropriado para a imobilização dos anticorpos da invenção. Por exemplo, o suporte sólido pode ser contas, partículas, tubos, poços, sondas, varetas, pontas de pipetas, válvulas, fibras, membranas, papéis, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses, vidro, polipropileno, polietileno, poliestireno, dextrano, nailon, amilases, plásticos, magnetita ou qualquer outro material apropriado prontamente conhecido daquele versado na técnica.

[00081] O dispositivo opcionalmente pode incluir um ou mais reagentes de captura de antígeno marcado que pode ser misturado com uma amostra de um mamífero antes da aplicação para um dispositivo da invenção. Quando o reagente de antígeno de captura marcado é incluído, o reagente de antígeno de captura marcado pode ou não pode ser depositado ou seco em uma superfície sólida do dispositivo. "Reagente de captura de antígeno" refere-se a qualquer composto que é específico para o antígeno ou antígenos de interesse. O reagente de captura de antígeno marcado, quer adicionado à amostra do mamífero ou pré-depositado no dispositivo, pode ser, por exemplo, um anticorpo marcado específico para um antígeno de lombriga, incluindo, mas não limitado aos anticorpos da presente invenção. Em apenas um exemplo, anti-DIV6716 pAB ou anti-Copro6716 conjugado com peroxidase de rábano pode ser usado como um reagente de captura de antígeno marcado.

[00082] O dispositivo também pode opcionalmente incluir um reagente líquido que transporta (como quando o dispositivo é um dispositivo SNAP®, por exemplo), ou de outra maneira facilita a remoção de (como quando o dispositivo inclui uma placa de microtítulo, por exemplo), material não ligado (por exemplo, porções não reagidas da amostra de mamífero, como, por exemplo, porções não reagidas de extrato fecal, e reagente de captura de antígeno não ligado) para fora da zona de reação (fase sólida). O reagente líquido pode ser um reagente de limpeza e serve somente para remover material não ligado da zona de reação, ou ele pode incluir um reagente detector e servir para remover material não ligado e facilitar detecção de antígeno. Por exemplo, no caso de um reagente de captura de antígeno conjugado a uma enzima, o reagente detector inclui um substrato que produz um sinal detectável mediante reação com o conjugado de anticorpo de enzima na zona de reação (fase sólida). Alternativamente, no caso de um reagente de captura de antígeno marcado conjugada a uma molécula radioativa, fluorescente, ou de absorção de luz, o reagente líquido atua meramente como uma solução de limpeza facilitando a detecção de formação de complexo na zona reativa desaparecendo o reagente marcado não ligado.

[00083] O reagente líquido pode ainda incluir uma quantidade limitada de um "inibidor", isto é, uma substância que bloqueia o desenvolvimento do produto final detectável. Uma quantidade limitada é definida como sendo uma quantidade de inibidor suficiente para bloquear o desenvolvimento do produto final até a maior parte ou todo o excesso, o material não ligado é transportado para fora da segunda região, tempo em que o produto final é produzido.

[00084] O dispositivo da presente invenção pode também incluir vários reagentes de ligação imobilizados em locais distintos do reagente, ou reagentes, de captura de antígeno. Por exemplo, um imunoreagente (um anticorpo, antígeno ou polipeptídeo) que reconhece uma porção de anticorpo de espécie específica (por exemplo, lombriga- específica) de um reagente de captura de antígeno ou anticorpo marcado, ou uma porção de enzima de um reagente de enzima marcado, pode ser incluído como um controle positiva para avaliar a viabilidade dos reagentes dentro do dispositivo. Por exemplo, um controle positivo pode ser um anticorpo de peroxidase antirrábano que foi criado em, por exemplo, cabra ou camundongo. Adicionalmente, um reagente, por exemplo, um anticorpo, isolado de um membro não imune das espécies das quais a porção de anticorpo do complexo antígeno- anticorpo foi derivada, pode ser incluída como um controle negativo para avaliar a especificidade de formação do imunocomplexo (isto é, complexo antígeno-anticorpo).

[00085] Além de ser designado para detectar lombriga em uma amostra de mamífero, o dispositivo da invenção opcionalmente pode ser projetado para permitir que um ou mais outros testes de diagnóstico sejam realizados. Por exemplo, o suporte sólido pode também incluir reagentes para a detecção de um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, ou uma ou mais bactérias. Os reagentes para a detecção de um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, ou uma ou mais bactérias, por exemplo, um ou mais anticorpos ou um ou mais antígenos reconhecidos pelos anticorpos específicos para um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, ou uma ou mais bactérias.

[00086] Em uma modalidade, que é mostrada nas FIGS. 6A e 6B, o dispositivo da presente invenção é uma placa de microtítulo 10 que inclui uma pluralidade de cavidades 12, em que cada cavidade 12 incluir um suporte sólido 14 tendo anti-DIV6716 pAB (representado como elemento 16) imobilizado logo depois.

[00087] A placa 10 pode ser usada em conjunto com um método da presente invenção para detectar lombriga em uma amostra de mamífero. Especificamente, uma infecção por lombriga pode ser diagnosticada em um mamífero detectando um ou mais antígenos de lombriga com o anti-DIV6716 pAB que é imobilizado no suporte sólido 14. Em uma modalidade, os antígenos que são detectados como coproantígenos de lombriga. "Coproantígenos de lombriga" são qualquer produto ou produtos de lombriga que estão presentes em uma amostra fecal e que pode especificamente e firmemente se ligar ao anti DIV6716 pAB ou anti-Copro6716. Coproantígenos de lombriga desta maneira podem ser a lombriga toda, ovos de lombriga, fragmentos de lombriga, ou produtos secretados, excretados ou derramados da lombriga ou uma combinação dos mesmos. Coproantígenos de lombriga ainda incluem os polipeptídeos da presente invenção, como Copro6716 e os polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos correspondentes a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:7, polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que é uma variante conservativa daquelas sequências, e/ou fragmentos antigênicos de qualquer um de tais polipeptídeos e/ou fragmentos antigênicos de quaisquer tais polipeptídeos, por exemplo. Um coproantígeno de lombriga exemplar é Copro6716 que foi detectado pela presente invenção em amostras fecais obtidas de caninos infectados por lombriga como descrito aqui no presente.

[00088] A invenção ainda incluir kits de ensaio (por exemplo, artigos de preparação) para detectar lombriga em uma amostra de mamífero. Um kit desta maneira pode incluir um ou mais dispositivos e/ou composições da presente invenção. Por exemplo, o kit pode incluir anticorpos anti-lombriga e meios para determinar ligação dos anticorpos para antígenos de lombriga na amostra. Em um exemplo particular, tal kit inclui o dispositivo tendo um anticorpo anti-lombriga imobilizado, como anti-DIV6716 pAB ou anti-Copro6716 pAB, por exemplo, um ou mais reagentes de captura de antígeno (por exemplo, um reagente de captura de antígeno marcado não imobilizado e um reagente de captura de antígeno marcado imobilizado) e reagente de limpeza, como também reagente detector e reagentes de controle positivo e negativo, se desejado ou apropriado. Outros componentes como tampões, controles, e similares, conhecidos daqueles de conhecimento comum na técnica, podem ser incluídos nos kits de teste. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas, para prover concentrações em solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser providos como pós secos, normalmente liofilizados, que na dissolução proverão uma solução de reagente tendo as concentrações apropriadas para combinar com uma amostra. O presente kit pode ainda incluir instruções para realizar um ou mais métodos da presente invenção, incluindo instruções para usar qualquer dispositivo e/ou composição da presente invenção que está incluída com o kit.

B. Métodos da Invenção

[00089] A presente invenção ainda inclui métodos para usar um ou mais dos dispositivos, kits e/ou composições da presente invenção para detectar a presença ou ausência de lombriga em uma amostra. Os métodos, desta maneira, podem ser realizados para detectar a presença ou ausência de lombriga em uma amostra, como, por exemplo, uma amostra fecal, que é obtida de um mamífero, incluindo, mas não limitado a um canino, felino, suíno, bovino ou ser humano. Adicionalmente, os métodos podem ser realizados para detectar Toxocara, como T. canis ou T. cati, ou T. vitulorum, por exemplo. Deve ser compreendido, entretanto, que estes métodos não estão limitados para ser usados para detectar Toxocara, e desta maneira esses métodos podem ser realizados para o propósito de detectar outras espécies de lombriga, como Toxascaris, incluindo T. leonina, Baylisascaris, incluindo B. procyonis, Ascaridia, incluindo A. galli, Parascaris, incluindo P. equorum, Ascaris, incluindo A. lumbricoides and A. suum, Anisakis, incluindo Anisakis simplex, ou Pseudoterranova, incluindo P. decipiens, por exemplo. Esses métodos ainda são úteis para confirmar tal presença ou ausência de lombriga em uma amostra mesmo quando essa amostra incluir um ou mais produtos derivados de outras espécies de vermes, incluindo um ou mais produtos de ancilóstomo, tricurídeo e/ou dirofilária.

[00090] Nos métodos da presente invenção, detecção de lombriga pode ser realizada detectando a presença ou ausência de um ou mais antígenos de lombriga, como Copro6716 ou os polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos correspondente a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:7, como também fragmentos de antigênicos e/ou variante conservativas daquelas sequências, por exemplo. Quando a amostra sob teste para lombriga é fezes, a porção solúvel das fezes pode ser coletada por qualquer protocolo conhecido na técnica. Por exemplo, em adição ao protocolo específico descrito na seção de Exemplos aqui no presente, as porções solúveis da amostra em geral podem ser coletadas usando filtragem, extração, centrifugação, ou simples mixagem seguida por assentamento gravimétrico. O técnico versado reconhecerá que existe uma variedade de maneiras de extrair e preparar amostras não fecais de um mamífero também. Por exemplo, a amostra pode ser um fluido corporal que é naturalmente excretada ou de outra maneira liberada pelo mamífero ou que é artificialmente obtida do mamífero. Tal extração artificial pode ser realizada mungindo o mamífero ou injetando uma seringa no mamífero e passando o fluido para dentro da seringa. Uma vez obtido, o fluido opcionalmente pode ser fracionado (por exemplo, o soro pode ser fracionado do sangue todo como depois usado como a amostra). Como outro exemplo, a amostra pode ser obtida esfregando o mamífero, como a cavidade oral do mamífero, por exemplo. Como ainda outro exemplo, seções de tecido podem ser obtidas por biópsia.

[00091] Os métodos incluem contatar a amostra do mamífero com um ou mais anticorpos específicos para um ou mais antígenos de lombriga sob condições que permitam um complexo de antígeno/anticorpo, isto é, um imunocomplexo, para formar. Isto é, um anticorpo especificamente se liga a um antígeno de lombriga presente na amostra. O técnico versado é familiarizado com ensaios de condições que podem ser usadas para detectar tal ligação de complexo de antígeno/anticorpo. Por exemplo, o complexo de antígeno/anticorpo pode ser detectado usando um anticorpo secundário que se liga ao complexo de antígeno/anticorpo. A formação de um complexo entre antígeno de lombriga e anticorpos antilombriga na amostra pode ser detectada usando qualquer método apropriado conhecido na técnica.

[00092] Ainda, a quantidade relativa de complexos de anticorpo- antígeno que são formados em uma reação particular pode ser medida com respeito àqueles formados em qualquer outra reação por qualquer metodologia conhecida na técnica para alcançar esse objetivo. Quando é determinado que uma amostra sob teste tem mais complexos anticorpo-antígeno do que uma amostra de controle, pode ser concluído que lombriga está presente na amostra de teste. Quando isto é real, pode ser concluído que o mamífero do qual a amostra de teste foi obtida abriga uma infecção intestinal por lombriga. Uma ou ambas as conclusões que lombriga está presente na amostra de teste e que o mamífero sendo testado abriga uma infecção intestinal por lombriga podem ser feitas por um clínico em um provedor de serviço de diagnóstico ou por um cuidador do mamífero, como o veterinário do mamífero, por exemplo. Quando um cuidador de um mamífero determina (ou é ao contrário informado que) um mamífero abriga uma infecção por lombriga, o cuidador pode depois submeter o mamífero a um curso de tratamento que é idealmente projetado para libertar o mamífero da lombriga especificamente, mais que de uma infecção de nematoide parasítica em geral. Em adição, seres humanos que podem entrar em contato com o animal infestado ou seus excrementos, podem ser avisados a tomar precauções contra aquisição do parasita. Neste contexto, é importante determinar a espécie de verme com alta especificidade, como alguns helmintos, como lombrigas e ancilóstomos, podem causar significativa doença (por exemplo, larval migrans) em seres humanos, enquanto é em geral aceito que tricurídeo não desempenha um papel zoonótico de importância em seres humanos. Ainda, a presente invenção pode ser usada para confirmar que qualquer animal que recebeu tratamento para uma infecção por lombriga foi libertado daquela infecção.

[00093] As etapas do método da presente invenção podem incluir aplicar uma amostra de mamífero a um dispositivo da invenção, que inclui um anticorpo específico imobilizado para um ou mais antígenos de lombriga, e detectar a presença ou ausência do antígeno de lombriga na amostra. Anticorpos específicos para antígenos de lombrigas podem ser direta ou indiretamente acoplados a um suporte sólido ou um substrato como uma cavidade de microtítulo, porção de imobilizar anticorpo de um dispositivo SNAP®, esfera magnética, esfera não magnética, coluna, matriz, membrana, esteira fibrosa composta de fibras naturais ou sintéticas (por exemplo, vidro ou materiais baseados em celulose ou polímeros termoplásticos, como, polietileno, polipropileno, ou poliester), estrutura sinterizada composta de materiais particulados (por exemplo, vidro ou vários polímeros termoplásticos), ou moldar película de membrana composta de nitrocelulose, nailon, polissulfona ou similares (em geral sintéticos por natureza). Todos esses materiais de substrato podem ser usados em formas apropriadas, como películas, folhas, ou placas, ou podem ser revestidos em ou ligados ou laminados para veículos inertes apropriados, como papel, vidro, películas de plástico, ou tecidos. Métodos apropriados para imobilizar peptídeos nas fases sólidas incluem interações iônicas, hidrofóbicas, covalentes e similares.

[00094] Os métodos da presente invenção não requerem o uso de fases sólidas ou substratos, entretanto. O técnico versado reconhecerá que existe um número de maneiras em que o presente método pode ser realizado para detectar a presença ou ausência de lombriga sem envolver o uso de fases sólidas ou substratos. Em apenas um exemplo, métodos de imunoprecipitação que não requerem o uso de fases sólidas ou substratos podem ser realizados.

[00095] Em algumas modalidades da invenção, o complexo antígeno/anticorpo é detectado quando um reagente indicador, como um conjugado de enzima, que é ligado ao anticorpo, cataliza uma reação detectável. Opcionalmente, um reagente indicador incluindo um sinal gerando composto pode ser aplicado para o complexo antígeno/anticorpo sob condições que permitem a formação de um complexo antígeno/anticorpo/indicador detectável. Opcionalmente, o anticorpo pode ser marcado com um reagente indicador antes para a formação de um complexo antígeno/anticorpo.

[00096] A formação de um complexo antígeno/anticorpo ou um complexo antígeno/anticorpo/indicador em alguns dos métodos da presente invenção, especificamente, pode ser detectada por métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, fotométricos, separação de tamanho ou precipitação. Detecção de um complexo antígeno/anticorpo também pode ser realizada pela adição de um anticorpo secundário que é acoplado a um reagente indicador incluindo um sinal gerando composto. Reagentes indicadores incluindo sinal gerando compostos (rótulos) associados com um complexo polipeptídeo/anticorpo podem ser detectados usando os métodos descritos acima e podem incluir agentes cromogênicos, catalisadores como conjugados de enzima, compostos fluorescentes como fluoresceína e rodamina, compostos quimioluminescente como dioxetanos, acridiniumos, fenantridiniumos, rutênio, e luminol, elementos radioativos, rótulos visuais diretos, como também cofatores, inibidores, partículas magnéticas, e similares. Exemplos de conjugados de enzimas incluem fosfatase alcalina, peroxidase de rábano, betagalactosidase e similares. A seleção de um marcador particular não é crítica, mas será capaz de produzir um sinal por si mesmo ou em conjunto com uma ou mais substâncias adicionais.

[00097] Métodos da invenção incluem, mas não são limitadas àqueles baseados em competição, reação direta ou ensaios tipo intercalado, incluindo, mas não limitado a ensaios ELISA, RIA, imunofluorescente (IFA), hemaglutinação (HA), imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA), e ensaios de placa de microtítulo (isto é, qualquer ensaio feito em um ou mais cavidades de uma placa de microtítulos). Um ensaio da invenção inclui um ensaio de ligação cromatográfica de fluxo reversível, que pode ser realizado, por exemplo, usando um dispositivo SNAP®. Ver Patente U.S. No. 5.726.010.

[00098] Em algumas modalidades, o método da invenção facilita ensaios de ligação específica do tipo competição ou intercalado. Em um ensaio intercalado, reagentes de captura de antígeno são imobilizados em uma zona reativa. Esses reagentes de captura de antígeno podem especificamente se ligar para antígenos na amostra sendo testada para lombriga. Em seguida à ligação do antígeno da amostra, o complexo de reagente de captura de antígeno/antígeno é detectado por qualquer método apropriado. Por exemplo, o complexo pode ser reagido com reagentes de ligação específicos marcados (por exemplo, um conjugado enzima-anticorpo) e antígeno detectado (por exemplo, mediante reação com substrato).

[00099] Em outras modalidades do método da presente invenção, um ensaio de competição é realizado. Em um ensaio de competição, reagentes de captura de antígeno são imobilizados na zona reativa e são contatados simultaneamente com antígeno de uma amostra e antígeno rotulado (por exemplo, um conjugado antígeno-enzima). A quantidade de rótulos detectados na zona reativa é inversamente proporcional à quantidade de antígeno na amostra.

[000100] Em algumas modalidades do método, anticorpos específicos para um antígeno de lombriga ou antígenos são acoplados a uma fase sólida ou substrato. Uma amostra potencialmente incluindo um antígeno de lombriga é adicionado ao substrato. Anticorpos que especificamente se ligam a lombriga são adicionados. Os anticorpos podem ser os mesmos anticorpos usados na fase sólida ou eles podem ser de uma fonte ou espécie diferente. Ainda, esses anticorpos podem ser ligados a um reagente indicador, como um conjugado de enzima. Etapas de limpeza podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato de enzima pode ser adicionado e a cor pode ser permitida se desenvolver. A reação de cor pode ser interrompida e a cor pode ser quantificada usando, por exemplo, um espectrofotômetro, e/ou a cor pode ser subjetivamente avaliada pelo olho humano.

[000101] Em outras modalidades do método, anticorpos específicos para um antígeno de lombriga ou antígenos são acoplados a uma fase sólida ou substrato. Uma amostra potencialmente incluindo um antígeno de lombriga é adicionada ao substrato. Segundo anticorpos de antiespécies que especificamente ligam antígenos de lombrigas são adicionados. Esses segundos anticorpos são de espécies diferentes do que são os anticorpos de fase sólida. Terceiros anticorpos de antiespécies que especificamente se ligam a segundos anticorpos e que não se ligam especificamente a anticorpos da fase sólida são adicionados. Os terceiros anticorpos podem incluir um reagente indicador, como um conjugado de enzima. Etapas de limpeza podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato de enzima pode ser adicionado e a cor pode ser permita se desenvolver. A reação de cor pode ser interrompida e a cor pode ser quantificada usando, por exemplo, um espectrofotômetro, e/ou a cor pode ser subjetivamente avaliada pelo olho humano.

[000102] Em um exemplo específico, o método da presente invenção é realizado em conjunto com um dispositivo que é um ensaio de dispositivo de fluxo lateral adicionando uma amostra de mamífero preparada para uma matriz de fluxo do dispositivo em uma primeira região (uma zona de aplicação de amostra). A amostra preparada é carregada em uma etapa de fluxo de fluido por ação capilar para uma segunda região da matriz de fluxo, em que existe um rótulo particulado capaz de ligar e formar um primeiro complexo com um antígeno na amostra. O rótulo particulado pode ser, por exemplo, uma partícula de látex colorida, sol corante, ou de sol ouro conjugados para um anticorpo específico para um antígeno de lombriga. O primeiro complexo é realizado para uma terceira região da matriz de fluxo em que um anticorpo que especificamente liga para um antígeno de lombriga é imobilizado em uma locação distinta. Um segundo complexo é formado entre o anticorpo imobilizado e o primeiro complexo. O rótulo particulado que faz parte do segundo complexo pode ser diretamente visualizado pelo olho humano.

[000103] Anticorpo de lombriga pode ser um reagente de captura de antígeno imobilizado em uma zona de reação (fase sólida). Um segundo reagente de captura de antígeno, isto é, um segundo anticorpo de lombriga que foi conjugado para um rótulo, pode ser adicionado para a amostra, antes da amostra ser adicionada ao dispositivo, ou o segundo reagente de captura do antígeno pode ser incorporado ao dispositivo. Por exemplo, o reagente de captura do antígeno pode ser depositado e seco em uma etapa de fluxo de fluido que provê comunicação de fluido entre uma zona de aplicação de amostra e a fase sólida. O contato do reagente de captura de antígeno rotulado com a amostra de teste pode resultar em dissolução do reagente de captura de antígeno rotulado.

[000104] Em uma modalidade do método da presente invenção, antígeno de lombriga é detectado por ELISA. Exemplos específicos do método de ELISA da presente invenção são descritos na seção de Exemplos incluída aqui no presente. Embora a presente invenção seja descrita com respeito àqueles métodos ELISA específicos, entretanto, deve ser compreendido que aqueles de conhecimento comum na técnica reconhecerão que etapas de ELISA alternativas, adicionais ou substitutas podem ser usadas sem se desviar do objetivo básico realizado através deste método da invenção.

[000105] Em outra modalidade da presente invenção, antígeno de lombriga é detectado usando um dispositivo de fluxo lateral, como um dispositivo SNAP®, por exemplo.

[000106] Ainda, os métodos da invenção para detecção da infecção por lombriga podem ser combinados com outros ensaios de diagnóstico para detectar a presença de outros organismos ou condições. Por exemplo, ensaios da invenção podem ser combinados com reagentes que detectam um ou mais parasitas fecais de verme não lombriga, um ou mais parasitas fecais de não verme, um ou mais vírus, um ou mais fungos, uma ou mais bactérias, um ou mais parasitas suportados pelo sangue ou sangue oculto ou uma combinação dos mesmos. Provendo dois ou mais sítios de ligação únicos em um dispositivo de ensaio único (como, por exemplo, dois pontos únicos de um dispositivo de ensaio SNAP®), a presente invenção permite a detecção de dois ou mais organismos de uma única amostra. Em uma modalidade, há três pontos únicos para detecção de infecção ou infestação passada ou presente de três organismos (os pontos sendo reagentes de ligação de antígeno ou anticorpo) de uma única amostra (isto é, a mesma amostra individual é exposta para os três reagentes de captura em um dispositivo único). Em ainda outra modalidade, há quatro pontos únicos para detecção de infecção ou infestação passada ou presente de quatro organismos (os pontos sendo regentes de antígeno ou anticorpo) de uma amostra única (isto é, a mesma amostra individual é exposta para os quatro reagentes de captura em um único dispositivo. Deve ser entendido, entretanto, que o mesmo dispositivo pode incluir mais do que quatro pontos únicos e/ou permitir a detecção de mais de quatro organismos.

[000107] Os reagentes para a detecção de um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas de não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, ou uma ou mais bactérias podem ser, por exemplo, um ou mais anticorpos ou um ou mais antígenos reconhecidos pelos anticorpos específicos para um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas de não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, ou uma ou mais bactérias.

[000108] Quando um dispositivo da presente invenção inclui reagentes para a detecção específica de ancilóstomos e reagentes para a detecção específica de tricurídeos, por exemplo, em adição aos reagentes para detectar lombriga, o método da presente invenção pode envolver usando aquele dispositivo para o propósito adicional ou propósitos para determinar se a amostra que está sendo testada para lombriga também inclui ancilóstomo e/ou tricurídeo. Neste arranjo, desta maneira, o método/dispositivo da presente invenção não será somente capaz de especificamente confirmar que a lombriga está presente em ou ausente de qualquer amostra de teste particular, mas também será útil para especificamente confirmar que a amostra inclui ou não inclui qualquer antígeno de ancilóstomo e/ou qualquer antígeno de tricurídeo. A capacidade para especificamente detectar lombriga e um ou mais outros organismos aplicando uma única amostra para o dispositivo da invenção será útil para o cuidador do animal a partir do qual a amostra sob teste foi obtida. Um cuidador que aprende que uma amostra inclui ambos lombriga e tricurídeo, mas não ancilóstomo, por exemplo, poderá usar esse conhecimento para tratar o mamífero do qual a amostra foi tirada especificamente para lombriga administrando para aquele mamífero um fármaco otimamente eficaz contra lombriga e um segundo fármaco otimamente eficaz contra tricurídeo. Estando ausente tal conhecimento, o cuidador pode, por exemplo, de outra maneira tratar o mamífero com um fármaco que é otimamente eficaz contra somente lombriga, somente tricurídeo, ou nem lombriga nem tricurídeo (em tais casos, o mamífero estaria em risco de receber tratamento abaixo do ótimo). Em adição, seres humanos que podem entrar em contato com o animal infestado ou seus excrementos pode ser avisado para tomar precauções contra adquirir o parasita ou parasitas. Neste contexto, é importante determinar a espécie de verme com alta especificidade, em alguns helmintos, como lombrigas e ancilóstomos, pode causar doença significativa (por exemplo, larval migrans, graves enterites ou reações alérgicas) em seres humanos, enquanto é em geral aceito que o tricurídeo não desempenha um papel zoonótico de importância em seres humanos.

[000109] O método ainda pode opcionalmente incluir usar um ou mais ácidos nucleicos de lombriga, incluindo, mas não limitado a ácidos nucleicos da presente invenção, para determinar a presença ou ausência de lombriga em uma amostra de mamífero. Tal uso desses ácidos nucleicos para determinar a presença de lombriga pode ser realizado antes, depois ou concomitantemente com a realização de quaisquer outros aspectos do método, incluindo a detecção de lombriga pelo anticorpo. Desta maneira, em um aspecto, depois da lombriga ser detectada ou não detectada, em uma amostra particular e o mamífero do qual a amostra foi obtida, é diagnosticado como tendo ou não tendo a infecção por lombriga, a amostra (ou uma obtida mais tarde do mamífero diagnosticado) pode ser testado para a presença ou ausência de qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos, incluindo qualquer um ou mais ácidos nucleicos da invenção. Qualquer um que não conseguir detectar lombriga em um mamífero particular usando um ou mais ácidos nucleicos (depois da lombriga ter sido detectada usando um ou mais anticorpos) não necessita levar em consideração a possibilidade de que os anticorpos tenham detectado antígeno de lombriga antes do aparecimento de lombriga ácido nucleico detectável na amostra. Em tal caso, o cuidador do mamífero pode escolher ignorar a observação de que o ácido nucleico tenha falhado para detectar a lombriga e prosseguir com tratamento do mamífero especificamente para infecção por lombriga baseado na observação que os anticorpos tinham de fato detectado lombriga. Em outro aspecto, os ácidos nucleicos são usados para determinar a presença ou ausência de lombriga em um particular mamífero, e depois a presença ou ausência de lombriga é adicionalmente avaliada usando os anticorpos da presente invenção. Detecção de uma ou mais ácidos nucleicos de lombriga pode ser realizada usando quaisquer técnicas de detecção de ácido nucleico conhecidas do técnico versado. Por exemplo, tal detecção pode ser realizada realizando uma técnica baseada em PCR-, como, mas limitada a, por exemplo, uma técnica baseada em PCR em tempo real. Técnicas baseadas em PCR exemplares são descritas em, por exemplo, PCR Protocols (Métodos in Molecular Biology), 2nd ed., Bartlett e Stirling, eds., Humana Press (2003); e Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); cada uma das quais é incorporada aqui no presente por referência em sua inteireza.

[000110] A presente invenção é especificamente descrita com referência a seis Exemplos; entretanto, não deve ser interpretado como sendo limitada a isso.

EXEMPLOS

[000111] A menos que de outra maneira indicado, os materiais e técnicas a seguir foram usados para gerar dados descritos em um ou mais dos Exemplos 1-7 como descrito abaixo.

[000112] Preparação de anticorpo policlonal. O anticorpo policlonal "anti-DIV6716 pAB" (IgG) foi criado em coelho contra um polipeptídeo tendo sequência de aminoácidos correspondentes a SEQ ID NO:5, e purificado de soro usando métodos padrão. Resumidamente, nucleotídeos 50 até 427 de SEQ ID NO:1 foram clonados em estrutura dentro de um vector (D8223, que é um derivado de pUC19) para criar o plasmídeo D8339. Especificamente, os 129 aminoácidos de SEQ ID NO:5 que seguem o resíduo de metionina no N-terminal de que aquela sequência corresponde a uma porção de SEQ ID NO:3 e são codificados pela porção clonada de SEQ ID NO:1. No plasmídeo D8339, o resíduo de metionina do N-terminal foi codificado pela sequência de vectores na junção daquele plasmídeo em que o vector foi ligado à sequência clonada de SEQ ID NO:1.

[000113] A sequência de DNA codificando SEQ ID NO:5 foi depois clivada do plasmídeo D8339 através de restrição de digestão de exonuclease (NdeI e BamHI) e purificada. Essa sequência purificada foi depois ligada ao vetor de expressão linearizado, pET28a, e o construto circular resultante (pTDX204::DIV6716) foi transformado em células BL21 (DE3) de E. coli. (A sequência completa da inserção foi confirmada por análise de sequência de DNA.) Expression da proteína de fusão marcada de His- foi induzida pela adição de 1 mM IPTG para culturas da E. coli transformada. A proteína recombinante foi solubilizada em 6 M de ureia de purificada pela afinidade de níquel e cromatografia de troca de íon. (A proteína recombinante é aqui no presente referida como "rDIV6716".)

[000114] Depois rDIV6716 ter sido introduzida em coelhos, anti- DIV6716 pAB foi purificada do plasma dos coelhos imunizados, isolando o anticorpo IfG por cromatografia de afinidade de proteína G. O anticorpo policlonal anti-DIV6716 pAB foi usado em todos os seis Exemplos descritos aqui no presente.

[000115] Tratamento de infecção e anti-helmíntico de animais canino e felino. Infecção de nematoide parasítico foi efetuada administrando oralmente cerca de 150-300 de ovos com larva de lombriga (Toxocara), ancilóstomo (Ancylostoma canium), ou tricurídeo (Trichuris vulpis) para um canino ou felino saudável. (Especificamente, T. canis foi a lombriga que foi administrada para o canino e T. cati foi a lombriga administrada para o felino.) Por exemplo 2, amostras fecais foram coletadas de caninos conhecidos como sendo naturalmente infectados com dirofilariose (verme do coração) (Dirofilaria immitis). Além disso, por exemplos 4 e 6 somente, caninos foram tratados no dia 91 depois da infecção com Interceptor® (milbemicina oxima), que é um agente antielmíntico comercialmente disponível de Novartis Animal Health Inc. de Basel, Switzerland, ou felinos foram tratados no dia 56 depois da infecção com Drontal® (praziquantel/pirantel pamoato), que é um agente antielmíntico comercialmente disponível de Bayer HealthCare, LLC of Shawnee Mission, KS, de acordo com o protocolo do fabricante. É bem sabido por aqueles de conhecimento comum na técnica que Interceptor® e Drontal® são eficazes para a remoção de lombrigas (e outros vermes parasíticos) de caninos e felinos, respectivamente, dentro de 72 horas depois do tratamento. A infecção foi confirmada por observação microscópica de ova de verme em amostras fecais obtidas desses animais hospedeiros.

[000116] Preparação de amostra fecal de canino e felino. Animais caninos e felinos conhecidos como sendo livres de infecção de verme parasítico, ou de ser infectados com uma lombriga, ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilariose proveu a fonte de amostras fecais. Amostras (aproximadamente 1 grama) de amostras fecais de canino ou felino congeladas, não preservadas foram suspensas em 4 ml de solução diluente ("solução diluente" é 0,05 M Tris base; 1 mM EDTA; 0,45% de Kathon; 16 mg/ml de sulfato de gentamicina; 0,05% de Tween-20; 40% de soro bovino fetal; 10% de soro de coelho; e 5% de soro de camundongo). A suspensão foi centrifugada a 4000 rpm por 20 minutos para produzir uma primeira sobrenadante. A primeira sobrenadante foi centrifugada a 12000 rpm por 5 minutos para produzir um segundo sobrenadante, que é referida aqui no presente como "extrato fecal".

[000117] Ensaios de ELISA. Anti-DIV6716 pAB purificado (100 μl/cavidade para todos os Exemplos; 10 μg/ml para cada Exemplo menos Exemplo 3, e 3 μg/ml para o exemplo 3) foi imobilizado por adsorção física em placas de 96 cavidades de Immulon 1B 96- durante a noite a 4°C. As placas foram depois bloqueadas com 1% de BSA em 0,1M Tris pH 7,0 a 4°C durante a noite, seguido pela secagem a temperatura ambiente. Aproximadamente 100 μl de extrato fecal foram adicionados para cada cavidade e deixado para incubar a temperatura ambiente por uma hora. As cavidades foram depois lavadas cinco vezes com solução de PBS-Tween-20 de acordo com métodos padrão conhecidos daqueles de conhecimento comum na técnica. Em um frasco de reação separado, anti-DIV6716 pAB livre foi rotulado com peroxidase de rábano (HRP) usando o agente de reticulação succinimidil 4-[N-maleimidometil]cicloexano-1-carboxilato (SMCC) para criar um conjugado, e 10 μg/ml desse conjugado foi adicionado a cada cavidade tendo imobilizado anti-DIV6716 pAB. Em seguida a um período de incubação de 30-minutos a temperatura ambiente, conjugado não ligado foi lavado a partir das cavidades usando solução de PBS-Tween-20 de acordo com os métodos padrão conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica. 50 μl de substrato de peroxidase TMBLUE® (SeraCare Life Sciences, West Bridgewater, MA) foram depois adicionados para cada cavidade e as placas foram incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente. Depois de interromper cada reação enzimática com 0,1% de sulfato de dodecil de sódio (SDS) em seguida ao período de incubação de 10- minutos, o valor da densidade óptica (OD) de cada cavidade da placa de 96- cavidades foi medido em A650 por técnicas espectrofotométricas padrão, usando uma leitora de placa ELISA para gerar um "valor de OD650" (ou, mais simplesmente, um "valor de OD") para cada cavidade. Nesse arranjo, o valor de OD obtido para qualquer cavidade particular da placa de 96- cavidades foi diretamente proporcional para a quantidade de antígeno presente especificamente ligado na cavidade. EXEMPLO 1

[000118] Anti-DIV6716 pAB especificamente liga a lombriga em amostras fecais obtidas de caninos infectados por lombriga.

[000119] Foi um objetivo do Exemplo 1 para determinar se anti- DIV6716 pAB especificamente liga coproantígeno de lombriga em caninos. Valores de OD medidos para amostras fecais obtidas de caninos individuais que foram conhecidos como tendo uma infecção por lombriga são medidos na Figura 7. Especificamente, essas amostras correspondem a caninos infectados por lombriga que são identificadas como "round+SPY", "round+QKZ", "round+KWZ", "round+WHY" e "round+RYZ" na Figura 7. Neste Exemplo, um valor de OD também foi medido para extrato de Toxocara canis toda ("Toxocara Toda"; adicionado para a placa em 1 μg/ml) e para rDIV6716 (adicionado para a placa a 1 μg/ml), que serviu como controles positivos. (Especificamente, o extrato de Toxocara todo foi preparado como descrito no Pedido de Patente US No. 11/763.592, designado pelo concessionário da presente invenção, que é incorporado aqui no presente por referência em sua inteireza.) Ainda, um valor de OD foi medido para cada um dos dois extratos fecais obtidos de dois caninos que não tinham uma infecção por verme parasítico ("negTIY" e "negSVY") e para uma amostra que não continha qualquer extrato fecal ("Somente Diluente"). (Esses três últimos serviram como controles negativos.)

[000120] O valor de OD medido do extrato fecal obtido de caninos negTIY e negSVY foi 0,10 e 0,13, respectivamente, e o valor de OD medido da amostra de diluente somente foi 0,05. (O valor médio de OD para essas amostras de controle negativo desta maneira foi 0,09.) O anti-DIV6716 pAB desta maneira foi considerado não ter antígeno especificamente ligado em nenhuma dessas amostras de controle negativo.

[000121] De modo inverso, a média de valores de OD medidos das amostras obtidas de caninos "round+SPY", "round+QKZ", "round+KWZ", "round+WHY" e "round+RYZ" foi 1,97, que foi mais do que 21 vezes mais elevado que o valor médio de OD medido para as três amostras de controle negativo. Esses dados indicam que anti- DIV6716 pAB especificamente liga um ou mais coproantígenos de lombriga.

EXEMPLO 2

[000122] Anti-DIV6716 pAB especificamente liga coproantígeno de lombriga, mas não especificamente liga coproantígeno de ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilária.

[000123] Foi um objetivo do Exemplo 2 determinar se anti-DIV6716 pAB especificamente liga coproantígeno de ancilóstomo e/ou tricurídeo em caninos. Valores de OD medidos para extratos fecais de canino coagulados são mostrados na Figura 8. Especificamente, esses extratos fecais foram derivados de amostras fecais obtidas de cinco animais caninos reconhecidos como sendo infectados com lombriga ("infectado com Lombriga"), dois animais caninos reconhecidos como sendo infectados com ancilóstomo ("infectado com Ancilóstomo"), e cinco animais caninos conhecidos como sendo infectados com tricurídeo ("infectado com Tricurídeo"). Adicionalmente, valores de OD foram também medidos para extrato de Toxocara canis toda ("Toxocara" toda;1 μg/mL) e rDIV6716 (1 μg/mL), que serviram como controles positivos, e para um amostra congelada de extratos fecais obtida de cinco caninos reconhecidos como livres de infecção com verme parasítico ("Não infectados") e para uma amostra que não continha qualquer extrato fecal ("Diluente Somente"). (Essas duas últimas amostras serviram como controles negativos.)

[000124] Com referência à Figura 8, o valor de OD medido para cada uma das amostras infectadas com ancilóstomo e infectadas com tricurídeo foi 0,09, que aproximada ou igualada aos valores medidos de OD da amostra de controle negativo de diluente somente (0,05) e a amostra de controle negativo não infectada (0,09). Esses dados indicam que anti-DIV6716 pAB não liga especificamente coproantígeno nas amostras obtidas de caninos infectados com ancilóstomo e infectados com tricurídeo.

[000125] De modo inverso, o valor de OD medido do extrato fecal congelado de caninos infectados com lombriga foi 0,44, que foi cerca de cinco vezes maior do que o obtido para as amostras de controle negativo e amostras infectadas com ancilóstomo e infectadas com tricurídeo. Esses dados indicam que anti-DIV6716 pAB especificamente liga um ou mais antígenos de lombriga, mas não especificamente liga qualquer coproantígeno de ancilóstomo ou tricurídeo.

[000126] Foi outro objetivo do Exemplo 2 determinar se anti-DIV6716 pAB especificamente liga coproantígeno dedirofilariose em caninos, pois a dirofilariose tem um relacionamento filogênico próximo com lombrigas, criando a possibilidade de reatividade cruzada. Valores de OD medidos para extratos fecais de canino individual são mostrados na Figura 9. Especificamente, essas amostras foram obtidas de caninos infectados com dirofilariose que são identificadas como "TRS 405", "TRS 583", e "TRS 868" na Figura 9. Neste Exemplo, um valor de OD também foi medido para cada um dos extratos fecais obtidos de dois caninos que não tinham uma infecção por verme parasítico ("negTIY" e "negSVY"). (Esses dois últimos extratos serviram como controles negativos).

[000127] Com referência à Figura 9, a média dos valores de OD medidos para as amostras infectadas com dirofilariose foi 0,21 (com o maior desses valores de OD sendo 0,27), que aproximou (e foi realmente menos do que) a média dos dois valores de OD medidos para as amostras de controle negativo (0,33). Esses dados indicam que anti- DIV6716 pAB não ligam especificamente qualquer coproantígeno nas amostras obtidas de caninos infectados com dirofilariose.

EXEMPLO 3

[000128] Anti-DIV6716 pAB especificamente liga coproantígeno de lombriga, mas não liga especificamente coproantígeno de ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilariose, e a ligação específica de coproantígeno de lombriga por anti-DIV6716 pAB produz uma mudança colorimétrica que é prontamente observável para o olho humano.

[000129] Foi um objetivo do Exemplo 3 determinar se a ligação específica entre anti-DIV6716 pAB e coproantígeno de lombriga, enquanto o anti-DIV6716 pAB é imobilizado em um suporte sólido, pode produzir uma mudança colorimétrica que é observável para o olho humano.

[000130] Com referência à Figura 10, anti-DIV6716 pAB (3 μg/mL) foi imobilizado sobre as superfícies do fundo das cavidades A1-A12 e B1- B12 de uma placa de microtítulo como descrito antes. Seguindo tal imobilização, as cavidades A3 e B3 foram expostas ao extrato fecal de um canino infectado com dirofilariose (indicado por "HW" na Figura 10). As cavidades A4 e B4 foram expostas ao extrato fecal de um primeiro canino infectado com ancilóstomo, as cavidades A5 e B5 foram expostas ao extrato fecal de um segundo canino infectado com ancilóstomo, e as cavidades A6 e B6 foram expostas ao extrato fecal de um terceiro canino infectado com ancilóstomo. As cavidades A7 e B7 foram expostas ao extrato fecal de um primeiro canino infectado com lombriga, as cavidades A8 e B8 foram expostas ao extrato fecal de um segundo canino infectado com lombriga, e as cavidades A9 e B9 foram expostas ao extrato fecal de um terceiro canino infectado com lombriga. As cavidades A10 e B10 foram expostas ao extrato fecal de um primeiro canino infectado com tricurídeo, as cavidades A11 e B11 foram expostas ao extrato fecal de um segundo canino infectado com tricurídeo, e as cavidades A12 e B12 foram expostas ao extrato fecal de um terceiro canino infectado com tricurídeo. As cavidades A1 e B1 foram expostas ao rDIV6716 (1 μg/ml), e desta maneira aquelas cavidades serviram como controles positivos. As cavidades A2 e B2 não foram expostas a qualquer extrato fecal ou a rDIV6716, e desta maneira aquelas cavidades serviram como controles negativos.

[000131] Em seguida à incubação de todas essas cavidades com substrato de peroxidase de TMBLUE® e a subsequente adição da SDS, mudança colorimétrica foi visualmente observada em cada uma das cavidades que foi exposta ao extrato fecal de caninos infectados com lombriga (A7-A9 e B7-B9), mas nenhuma mudança colorimétrica foi observada em qualquer uma das cavidades que tinha sido exposta ao extrato fecal de caninos infectados com ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilariose.

[000132] Esses dados indicam que anti-DIV6716 pAB detecta lombriga suficientemente para produzir uma mudança colorimétrica que é forte e prontamente visível ao olho humano. Adicionalmente, esses dados indicam que tal mudança colorimétrica permite o olho humano prontamente distinguir amostras fecais positivas de lombriga daquelas que não contêm lombriga, incluindo aquelas que incluem um ou mais de ancilóstomo, tricurídeo ou dirofilarioses.

EXEMPLO 4

[000133] Anti-DIV6716 pAB detecta coproantígeno de lombriga em alguns caninos logo 17 dias depois de serem infectados com lombriga, e anti-DIV6716 pAB não detecta lombriga em fezes de animais caninos que tiveram uma infecção por lombriga, mas que ficaram livre dessa infecção na hora em que as fezes foram excretadas pelos caninos.

[000134] Foi um objetivo do Exemplo 4 determinar se anti-DIV6716 pAB pode detectar coproantígenos de lombriga em pelo menos alguns caninos infectados com lombriga antes da ova da lombriga aparecer primeiro nas fezes daqueles caninos. Foi outro objetivo do Exemplo 4 determinar se anti-DIV6716 pAB detecta lombriga nas fezes de animais caninos que tiveram se libertado de uma infecção anterior por lombriga.

[000135] Em direção a estes objetivos, valores de OD foram medidos para amostras fecais obtidas de cinco caninos e são mostradas na Figura 11. Esses caninos, que são identificados como "QKZ", "RYZ", KWZ", "SPY" e "WHY", foram infectados com lombriga no dia 0 e foram tratados com o agente antielmíntico Interceptor® no 91 depois da administração da infecção como descrito antes. Amostras fecais foram tiradas de todos ou de alguns desses caninos no dia 0, no dia 2 e dia 111 em seguida à administração das infecções por lombriga para esses animais, e nos dias selecionados entre dia 2 e dia 111. Observações de microscópio das amostras fecais do primeiro conjunto de caninos confirmaram que cada uma das amostras tiradas no dia 0 até o dia 31 e do dia 100 até o dia 111 estava substancialmente livre de ova de lombriga, e que, com uma exceção, tais ovas estavam presentes somente nas amostras em cada um dos dias 38 até 97. (A única exceção sendo que as ovas não foram observadas no dia 38 da amostra fecal do canino KWZ.)

[000136] Com referência à Figura 11, a média de valor OD medido para esses cinco caninos no dia 17 foi 0,35, que foi cinco vezes mais alta do que foi a medis dos valores de OD (0,07) que foram medidos para aqueles caninos no dia 0. Ainda, o valor específico de OD que foi medido para o canino WHY no dia 17 (que foi 0,78) foi mais do que 11 vezes mais alto do que foi a média dos valores de OD que foram medidos para todos os cinco caninos no dia 0, e os valores específicos de OD que foi medido para o canino WHY nos dias 23 e 31 (0,18 e 0,29, respectivamente) foram mais do que duas ou mais do que quatro vezes mais altos, respectivamente, do que foi a média dos valores de OD que foram medidos para todos os cindo caninos no dia 0. Esses dados indicam que, em alguns casos, anti-DIV6716 pAB pode detectar lombriga em fezes de um canino infectado com lombriga logo 17 dias depois do canino primeiro ficar infectado com lombriga.

[000137] Com contínua referência à Figura 11, os valores de OD medidos para as amostras fecais tiradas de cinco caninos nos dias 38 até 93 foram muitas vezes mais altos do que foram os valores de OD medidos para amostras fecais daqueles mesmos caninos em seguida ao tratamento deles com o agente anti-helmintico. Esses dados indicam que anti-DIV6716 pAB não detecta lombriga nas fezes de um canino que foi libertado de uma infecção anterior por lombriga.

EXEMPLO 5

[000138] Anti-DIV6716 pAB especificamente liga antígeno de lombriga em amostras fecais obtidas de animais felinos infectados com lombriga.

[000139] Foi um objetivo do Exemplo 5 para determinar se anti- DIV6716 pAB especificamente liga coproantígeno de lombriga em felinos.

[000140] Valores de OD medidos para amostras fecais obtidas de felinos não infectados e felinos infectados com lombriga são mostradas na Figura 12. Especificamente, esses valores de OD foram medidos de amostras fecais tiradas de cinco felinos diferentes infectados com lombriga (representados pelos identificadores "C085", "CO87", "CO96", "CO100" e "CO104") 40 dias em seguida à administração de uma infecção por lombriga para aqueles felinos. Como um controle negativo, valores de OD também foram medidos de uma amostra fecal obtida do felino CO85 um dia antes da administração da infecção por lombriga para aquele felino ("dia -1").

[000141] Com referência à Figura 12, o valor de OD medido para o felino não infectado (CO85 no dia -1) foi 0,06, enquanto que a média de valor de OD dos cinco felinos no dia 40 foi 1,76. O valor de OD médio medido das amostras fecais obtida dos cinco felinos no dia 40, desta maneira, foi quase 30 vezes maior do que foi o valor de OD medido para o felino não infectado. Esses dados indicam que anti-DIV6716 pAB especificamente liga um ou mais coproantígenos de lombriga em felino. EXEMPLO 6

[000142] Anti-DIV6716 pAB não detecta lombriga em fezes de animais felinos que tiveram uma infecção por lombriga, mas que foram libertados daquela infecção na ocasião em que as fezes foram excretadas pelos felinos.

[000143] Foi um objetivo do Exemplo 6 determinar se anti-DIV6716 pAB detecta lombriga em fezes de animais felinos que foram libertados de uma infecção anterior por lombriga.

[000144] Valores de OD medidos para amostras fecais obtidas de um primeiro conjunto de seis felinos e um segundo conjunto de seis felinos são mostrados nas Figuras 13 e 14, respectivamente. O primeiro conjunto de felinos, que são identificados como "C96", "C100", C107", "C85", "C87" e "C104", foi infectado com lombriga no dia 0 e foram trtados com o agente anti-helmíntico Drontal® anthelmintic no 56° dia depois da administração da infecção como descrito antes. Amostras fecais foram tiradas de todos ou alguns do primeiro conjunto de felinos no dia 0, dia 1 e dia 77 seguindo a administração da infecções por lombriga para esses animais, e nos dias selecionados entre dia 1 e dia 77. Observação de microscópio das amostras fecais do primeiro conjunto de felinos confirmou que cada uma das amostras tiradas do dia 0 até o dia 26 e do dia 60 até o dia 77 foi substancialmente livre de ovas de lombriga, e que tais ovas estavam presentes em cada um do dia 34 até dia 54 amostras.

[000145] O segundo conjunto de felinos, que são identificados como "C91", "C97", C106", "C81", "C98" e "C118", nunca foi infectado com lombriga (e desta maneira serviram como controles negativos). Amostras fecais foram tiradas de cada um desses felinos no dia em que o primeiro conjunto de felinos foi infectado com lombriga (dia 0). Ainda, a amostra fecal foi tirada desse segundo conjunto de felinos no dia 1 e dia 74 em seguida à administração das infecções por lombriga para o primeiro conjunto de felinos, e nos dias selecionados entre o dia 1 e o dia 74. Observação de microscópico das amostras fecais do segundo conjunto de felinos confirmou que cada uma das amostras tiradas do dia 0 até o dia 74 era livre de ovas de lombriga.

[000146] Com referência à Figura 13, os valores de OD medidos para as amostras fecais tiradas do primeiro conjunto de felinos (isto é, os felinos que foram infectados com lombriga) dos dias 34 até 54 foram muitas vezes mais altos do que foram os valores de OD medidos para amostras fecais daqueles mesmos felinos seguindo seu tratamento com o agente anti-helmíntico. Além disso, os valores de OD medidos para as amostras fecais tiradas do primeiro conjunto de felinos nos dias 34 até 54 foram muitas vezes maiores do que para cada uma das amostras de controle negativo da Figura 14. Esses dados ainda indicam que anti- DIV6716 pAB não detecta lombriga em fezes de um felino que foi libertado de uma infecção anterior por lombriga.

EXEMPLO 7

[000147] Uma versão truncada de DIV6716, Copro6716, está presente nas fezes de canino infectado por T. canis. A. Preparação da Amostra Fecal de Canino

[000148] Animais caninos conhecidos por abrigar uma infecção por lombriga (T. canis) ou por não ter uma infecção por verme parasítico forneceu a fonte de amostras fecais. A amostra de fezes de canino congeladas, não preservadas de caninos infectados ou não infectados por lombriga foi suspensa em 4 ml de tampão de extração ("tampão de extração" é fosfato tamponado salino 1X (PBS), pH 7,0-7,5 com 0,05% Tween-20). Essa suspensão foi vortexada por 2 minutos e depois foi centrifugada a 13,000 rpm por 25 minutos para produzir uma primeira sobrenadante. Essa primeira sobrenadante foi depois centrifugada a 10,000 rpm por 5 minutos para produzir uma segunda sobrenadante. Essa segunda sobrenadante daqui em diante é referida como "extrato fecal". B. Troca de íon

[000149] Cromatografia de troca de íon pode enriquecer Copro6716 de uma amostra fecal. Amostras fecais de animais de controle experimentalmente infectadas e não infectadas por lombriga foram usadas para esse estudo. A amostra fecal foi extraída primeiro com PBST (0,05% de Tween 20), pH 7,3. A amostra foi diluída com tampão de acetato de sódio, pH 4,5 e depois o pH foi ajustado para 4,5 com HCl. Finalmente, a amostra foi centrifugada e o sobrenadante foi carregado em uma coluna de sulfopropil (SP) (HiTrap SP Sepharose column, GE Healthcare). A coluna de SP foi depurada com 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,5 com 1 M NaCl, e as frações de depuração foram avaliadas por ELISA. A placa de ELISA foi revestida com coelho anti-DIV6716 IgG a 3 μg/ml. Baseado nos resultados mostrados na Figura 15, é claro que Copro6716 pode ser parcialmente purificado e enriquecido depurando a coluna de SP com tampão de acetato de sódio com 1 M NaCl. Frações contendo Copro6716 depurado em um pico amplo. O fim do pico de depuração não foi encontrado. (Figura 15). C. Western blotting e SDS-PAGE

[000150] Western blotting e gel SDS-PAGE mostraram que o peso molecular de Copro6716 é cerca de 10 kD. Frações de eluição da coluna de SP foram misturadas e o tampão pH foi ajustado para 7,2 com NaOH antes de carregar na coluna de afinidade, que foi preparada pela ligação da proteína G purificada de coelho anti-DIV6716 IgG com resina AminoLink (Pierce, Thermo Scientific). A coluna foi lavada com tampão PBS, pH 7,2, e eluída com tampão de glicina-HCl, pH 2,5, de acordo com as instruções do fabricante. As frações de eluição foram carregadas para um gel de gradiente Bis-Tris de 4-12% de cavidade 10 e transferidas para membrana de nitrocelulose para western blotting. Sondada com anti-DIV6716 IgG-HRP de coelho, a western blotting mostrou que Copro6716 é cerca de 10 kD (figura 16), que é cerca de cerca de 2/3 do tamanho de DIV6716 de comprimento total (o ME aparente da DIV6716 recombinante de comprimento total em SDS- PAGE é cerca de 16 kD; dados não mostrados). Depois de concentração adicional, as mesmas amostras foram visualizadas em um gel SDS-PAGE com Imperial Protein Stain (Pierce, Thermo Scientific). Uma faixa de 10 kD correspondente ao tamanho indicado por anti-6728IgG-HRP foi visível (dados não mostrados). D. Análise de espectrometria de massa

[000151] Análise de espectrometria de massa na faixa cortada de gel SDS-PAGE indicou que essa faixa contém Copro6716, e que a porção de C-terminal- de DIV6716 contém Copro6716.

[000152] A faixa 10 kD que corresponde à faixa 10 kD no western blotting foi cortado do gel SDS-PAGE e enviada para o Keck Center na Universidade de Yale para análise de espectrometria de massa. A amostra no gel foi primeiro tripsina digerida e depois analisada por LC- MS/MS usando o Q-T do espectrômetro de Ultima Mass (Waters). Quatro peptídeos específicos foram encontrados na amostra por análise de Espectrometria de Massa: Peptídeo 1: IMHYYEHLEGDAK (SEQ IS NO:8), Peptídeo 2: HEATEQLK (SEQ ID NO:9), Peptídeo 3: DSGASKDELK (SEQ ID NO:10), e Peptídeo 4: VEEALHAVTDEEK (SEQ ID NO:11).

[000153] A análise de alinhamento nas sequências de DIV6716 (SEQ ID NO:5) e os quatro peptídeos identificados pela análise de MS indicaram que dois peptídeos originais de uma porção central do DIV6716, e os outros dois peptídeos originados do C-terminal metade do comprimento todo de DIV6716, confirmando que a faixa 10 kb identificada por western blotting é derivada de DIV6716. Desta maneira, os dados de espectroscopia de massa são consistentes com o peso molecular aparente de Copro6716 como medido por eletroforese de gel. A Figura 17 mostra a sequência de comprimento total de DIV6716 (SEQ ID NO:5) com os quatro peptídeos identificados pela análise de MS realçadas nas caixas sombreadas.

[000154] A invenção ilustrativamente descrita aqui no presente apropriadamente pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são especificamente descritas aqui no presente. Desta maneira, por exemplo, em cada caso aqui no presente qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente de", e "consistindo em" podem ser substituídos com qualquer um dos outros dois termos, enquanto retendo seus significados comuns. Os termos e expressões que foram empregadas são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de exclusão quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções dos mesmos, mas é sabido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Desta maneira, deverá ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita pelas modalidades preferidas, características opcionais, modificação e variação dos conceitos aqui no presente descritos podem ser recorridos por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção como definido pela descrição e reivindicações anexadas.

[000155] Um número de exemplos para ajudar a ilustrar a invenção foi descrito. No entanto, deverá ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Por isso, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações anexadas até aqui.

Claims (24)

1. Dispositivo para detectar a presença ou a ausência de antígenos de lombriga de uma amostra de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte sólido, em que o suporte sólido tem imobilizado no mesmo um ou mais anticorpos que especificamente se ligam a um polipeptídeo Copro6716 que é uma isoforma de 10 kD de uma proteína excretora/secretora de T. canis, em que o referido polipeptídeo é isolado de matéria fecal; em que o referido polipeptídeo corresponde a uma porção de DIV6716 (SEQ ID NO: 5); e em que o referido polipeptídeo produz quatro fragmentos polipeptídicos IMHYYEHLEGDAK (SEQ ID NO: 8), HEATEQLK (SEQ ID NO: 9), DSGASKDELK (SEQ ID NO: 10) e VEEALHAVTDEEK (SEQ ID NO: 11) em análise de espectroscopia de massa.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos são obtidos pela imunização com o polipeptídeo Copro6716.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra de mamífero é uma amostra fecal.

4. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos não se ligam especificamente a qualquer coproantígeno derivado do grupo consistindo em ancilóstomo, tricurídeo e dirofilariose.

5. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos um ou mais anticorpos são rotulados.

6. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um dispositivo de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima.

7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima é um dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral.

8. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra é de um canino ou um felino.

9. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dispositivo inclui ainda um ou mais reagentes para a detecção de um ou mais do grupo consistindo em: um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas de não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos, e uma ou mais bactérias.

10. Método de detectar a presença ou a ausência de um ou mais antígenos de lombriga em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma amostra de um mamífero com um ou mais anticorpos que podem se ligar especificamente a um polipeptídeo Copro6716 que é uma isoforma de 10 kD de uma proteína excretora/secretora de T. canis, em que o referido polipeptídeo é isolado de matéria fecal; em que o referido polipeptídeo corresponde a uma porção de DIV6716 (SEQ ID NO: 5); e em que o referido polipeptídeo produz quatro fragmentos polipeptídicos IMHYYEHLEGDAK (SEQ ID NO: 8), HEATEQLK (SEQ ID NO: 9), DSGASKDELK (SEQ ID NO: 10) e VEEALHAVTDEEK (SEQ ID NO: 11) em análise de espectroscopia de massa; (b) formar complexos anticorpo-polipeptídeo na presença dos polipeptídeos, se algum, na amostra; e (c) detectar a presença ou a ausência dos complexos de anticorpo-polipeptídeo, se algum.

11. Método de diagnosticar se um mamífero está infectado por lombrigas intestinais, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) contatar uma amostra de um mamífero com um ou mais anticorpos que podem se ligar especificamente ao polipeptídeo Copro6716 que é uma isoforma de 10 kD de uma proteína excretora/secretora de T. canis, em que o referido polipeptídeo é isolado de matéria fecal; em que o referido polipeptídeo corresponde a uma porção de DIV6716 (SEQ ID NO: 5); e em que o referido polipeptídeo produz quatro fragmentos polipeptídicos IMHYYEHLEGDAK (SEQ ID NO: 8), HEATEQLK (SEQ ID NO: 9), DSGASKDELK (SEQ ID NO: 10) e VEEALHAVTDEEK (SEQ ID NO: 11) em análise de espectroscopia de massa; (b) formar complexos anticorpo-polipeptídeo na presença dos polipeptídeo, se algum, na amostra; (c) detectar a presença ou a ausência dos complexos de anticorpo-polipeptídeo, se algum; e (d) diagnosticar o mamífero como apresentando uma infecção por lombrigas se um complexo anticorpo-polipeptídeo estiver presente.

12. Método de acordo a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a amostra é obtida de um mamífero que é um canino ou um felino.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a lombriga é Toxocara canis ou Toxocara cati.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra fecal.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos não se ligam especificamente a qualquer derivado de coproantígeno do grupo consistindo em ancilóstomo, tricurídeo e dirofilariose.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a etapa de detectar a presença ou a ausência dos complexos inclui ainda a etapa de prover pelo menos um anticorpo secundário que se liga a pelo menos um dos complexos.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo secundário é rotulado.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado pelo fato de que um ou mais do um ou mais anticorpos são rotulados.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos são imobilizados em um suporte sólido que forma parte de um dispositivo de imunoensaio ligado à enzima.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima é um dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de contatar a amostra com um ou mais reagentes para detectar um ou mais do grupo consistindo em: um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas de não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos e uma ou mais bactérias.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os reagentes para a detecção de qualquer um ou todos do um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas de não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos e uma ou mais bactérias são um ou mais anticorpos ou um ou mais antígenos reconhecidos por anticorpos específicos para o um ou mais parasitas de verme não lombriga, um ou mais parasitas de não vermes, um ou mais vírus, um ou mais fungos ou uma ou mais bactérias.

23. Kit para detecção de um ou mais antígenos de lombriga em uma amostra de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende um dispositivo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um ou mais reagentes suficientes para a detecção de um ou mais antígenos.

24. Kit de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que um ou mais reagentes são selecionados do grupo consistindo em um ou mais reagentes indicadores, um ou mais compostos rotulando anticorpos, um ou mais anticorpos, um ou mais reagentes de captura de antígeno, um ou mais inibidores e um ou mais reagentes de lavagem.

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