CN102361979A - 具有免疫球蛋白结合能力的肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有免疫球蛋白结合能力的肽、以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、制备方法、用于与免疫球蛋白结合的组合物以及手段、以及由于C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物等,该药物组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或与所述肽的融合蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及具有免疫球蛋白结合能力的肽、以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、制备方法、用于与免疫球蛋白结合的组合物以及手段。本发明还涉及由于C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物等,该药物组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或与所述肽的融合蛋白。
背景技术
已知C1q是补体蛋白的一种,在补体活化途径中发挥作用。例如,经典途径的活化是通过C1q与免疫球蛋白分子的Fc部分结合而引起的。
有报道称,C1q在血液中较多存在的类风湿性关节炎(RA)患者将来会出现关节破坏(非专利文献1)。可以认为这与上述的C1q的活化有关,人们希望开发C1q与免疫球蛋白分子结合的抑制剂。
有报道称,C1q与免疫球蛋白分子的结合中,C1qB亚基(B链)的精氨酸残基可能参与(非专利文献2)。但是,该报告是通过计算机模拟来预测的,实际的免疫球蛋白结合部位尚未明确。所述结合部位的详细的氨基酸序列也并未了解。
免疫球蛋白的纯化中使用Protein A或Protein G等的与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质。但是,这些蛋白质与免疫球蛋白的结合力强,因此,一旦结合后若要分离,则必须是使用强酸性缓冲液等的严苛条件。因此,免疫球蛋白的立体结构容易破坏,无法纯化亲和性高的抗体。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Ochi T等人.,Arthritis Rheum.1988Jan;31(1):37~43
非专利文献2:Gaboriaud C等人.,J Biol Chem.2003Nov 21;278(47):46974~82.Epub 2003Sep 5
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的解决课题在于提供:具有免疫球蛋白结合能力的肽以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、含有所述核酸的载体等。还在于提供:不破坏抗体的立体结构、与抗原的亲和性高的抗体也可纯化的新型抗体纯化方法、以及为此的组合物和手段。
解决课题的手段
本发明人等针对上述情况进行了深入的研究,结果,成功地鉴定了参与C1q与免疫球蛋白结合的氨基酸序列,完成了本发明。还令人惊讶地发现,所述氨基酸序列并不含有被报道参与了结合的精氨酸残基。并且,含有该氨基酸序列的肽比Protein A或Protein G弱地与免疫球蛋白结合,因此消除了抗体立体结构的破坏或对纯化对象抗体的限制(无法纯化与抗原的亲和性高的抗体等)等的以往的抗体纯化时的问题,可以在温和的条件下进行抗体纯化。
即,本发明涉及以下内容:
(1)肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换。
(2)(1)所述的肽,其中,肽中的半胱氨酸被丝氨酸置换。
(3)(2)所述的肽,该肽具有SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列。
(4)肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
(5)(4)所述的肽,其中,所有的氨基酸均可被对应的D-氨基酸置换。
(6)(5)所述的肽,该肽具有dPro Gly dLeu dTyr dTyr dPhe所示的氨基酸序列。
(7)肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换,且肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
(8)(7)所述的肽,其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换,且所有的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
(9)核酸,该核酸是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸,选自
(a)编码(1)所述的肽的核酸;
(b)具有SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列的核酸;
(c)具有下述核苷酸序列的核酸,其是在SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个核苷酸得到的核苷酸序列;
(d)可与上述(b)或(c)的核酸或其互补链在严谨的条件下杂交形成的核酸;
(e)具有下述核苷酸序列的核酸,其是与SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列具有50%以上同源性的核苷酸序列。
(10)(9)所述的核酸,该核酸具有SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列。
(11)载体,该载体含有(9)或(10)所述的核酸。
(12)融合蛋白,其是(1)~(3)中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。
(13)融合蛋白,其是(4)~(8)中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。
(14)核酸,该核酸编码(12)所述的融合蛋白。
(15)载体,该载体含有(14)所述的核酸。
(16)细胞,该细胞含有(9)或(10)所述的核酸或(14)所述的核酸、或者(11)或(15)所述的载体。
(17)具有免疫球蛋白结合能力的肽的制备方法,该方法包含以下步骤:
(a)使用(11)所述的载体来转化细胞;
(b)培养该细胞以生产肽。
(18)具有免疫球蛋白结合能力的肽,该肽可通过(17)所述的方法得到。
(19)融合蛋白的制备方法,该融合蛋白是具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的,所述方法包含:
(a)使用(15)所述的载体来转化细胞;
(b)培养该细胞以生产融合蛋白。
(20)(19)所述的方法,该方法进一步包含由融合蛋白获取目标蛋白质的步骤。
(21)融合蛋白,该融合蛋白可通过(19)或(20)所述的方法得到。
(22)用于使免疫球蛋白结合的组合物,该组合物包含(1)~(8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白。
(23)(22)所述的组合物,该组合物用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。
(24)用于使免疫球蛋白结合的手段,该手段是将(1)~(8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白固定。
(25)(24)所述的手段,该手段用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。
(26)使免疫球蛋白结合的方法,该方法包含:
(a)将(1)~(8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白添加到试样中,
(b)检测肽或融合蛋白与免疫球蛋白的结合体。
(27)试剂盒,该试剂盒用于在(26)所述的方法中使用,包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含有所述肽的融合蛋白。
(28)由C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物,该药物组合物包含(1)~(8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白。
(29)(28)所述的药物组合物,其中,疾病是类风湿性关节炎。
(30)(28)所述的药物组合物,其中,疾病是系统性红斑狼疮简写为SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病。
(31)标记的(1)~(8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白。
(32)试样中抗体的检测方法,其特征在于:使(31)所述的标记肽或融合蛋白与试样中的抗体反应,接着检测与抗体结合的该肽或融合蛋白。
发明效果
本发明提供:具有免疫球蛋白结合能力的肽以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、制备方法、用于使免疫球蛋白结合的组合物和手段、以及由于C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物等,该药物组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或与所述肽的融合蛋白。
附图说明
图1表示具有6个氨基酸的肽R1、具有9个氨基酸的肽R2、具有15个氨基酸的肽R3~R6抑制C1q与免疫球蛋白的结合。图中、NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果,PC是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果。
图2表示具有6个氨基酸的变异肽R7~R9、具有9个氨基酸的变异肽10、具有15个氨基酸的变异肽R11抑制C1q与免疫球蛋白的结合。图中,NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果,PC是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果。
图3表示变异肽R12~18抑制C1q与免疫球蛋白的结合。图中,NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果,PC是将不含有肽DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果。
图4表示变异肽R19~22抑制C1q与免疫球蛋白的结合。图中,NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果,PC是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果。
图5表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R5(1次/1天给予或2次/1天给予),在诱发关节炎的小鼠中,关节炎得到抑制。作为对照,给出1次/1天给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果、以及1次/1天给予0.1mg/kg甲氨蝶呤溶液的小鼠的结果。
图6表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R1,在诱发关节炎的小鼠中,关节炎得到抑制。作为对照,给出同样地给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。
图7表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R2,在诱发关节炎的小鼠中,关节炎得到抑制。作为对照,给出同样地给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。
图8表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R5,在诱发关节炎的小鼠,关节炎得到抑制。作为对照,给出同样地给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。
图9表示腹腔内给予10mg/kg的肽R2或R13、或者静脉内给予1mg/kg的R1或10mg/kg的R17的、诱发关节炎的小鼠中临床评分的变化。作为对照,给出同样地给予不含有肽的生理盐水的小鼠的结果。
图10表示腹腔内给予10mg/kg的肽R2或R13、或者静脉内给予1mg/kg的R1或10mg/kg的R17的、诱发关节炎的小鼠中后肢容积的变化。作为对照,给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0.1mg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。
图11表示腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R13的、诱发关节炎的小鼠中临床评分变化。作为对照,给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0.1mg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。
图12表示腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R19的、诱发关节炎的小鼠中临床评分的变化。作为对照,给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0.1mg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。
图13表示腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R21的、诱发关节炎的小鼠中临床评分的变化。作为对照,给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0.1mg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。
图14表示通过腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R1、R2或R5,诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中,SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。作为对照,给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果。
图15表示通过尾静脉内给予10mg/kg的肽R1或R2,在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中,SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。作为对照,给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果。
图16表示通过腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R13或R19,在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中,SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。作为阴性对照,给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果,以及作为阳性对照,给出同样地给予50mg/kg氢化可的松的大鼠的结果。
图17表示通过尾静脉内给予10mg/kg的肽R13或R19,在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中,SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。作为阴性对照,给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果。
图18表示通过以100mg/kg或10mg/kg给予R13肽,可见关节炎抑制效果。作为阴性对照,给出同样地给予生理盐水或错义肽(scramble peptide)的组(图表中,以CIA或错义表示)的结果,作为阳性对照,给出同样地给予甲氨蝶呤的组(图表中,以MTX(0.15mg/kg)表示)的结果。
图19是表示通过本发明的肽来检测抗体的图。各泳道中使用的BSA的量如下所示:泳道1BSA 0.1μg,泳道2BSA 0.5μg,泳道3BSA1.0μg,泳道4BSA 2.0μg
图20是表示通过使用本发明的肽的亲和纯化用柱来纯化兔抗体的图。作为对照,给出使用Protein A进行纯化的结果。值表示各组分中所含的IgG蛋白质量(mg/ml)。图中,PT表示未吸附组分,W1~5表示洗涤组分、E1~5表示洗脱组分。
图21是表示通过使用本发明的肽的亲和纯化用柱来纯化人抗体的图。值表示各组分中所含的IgG蛋白质量(mg/ml)。图中,PT表示未吸附组分,W1~5表示洗涤组分,E1~5表示洗脱组分。
具体实施方式
在一个方案1中,本发明涉及一种肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换,且/或肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。本发明的肽与Protein A和Protein G比较,与免疫球蛋白的结合能力弱,因此,例如,可以温和的条件下将与本发明的肽结合的免疫球蛋白解离等。另外,与本发明的肽结合的免疫球蛋白自身的变性也降低。结合能力可通过该技术领域中已知的方法检测。例如,可以在免疫球蛋白存在下将肽进行培育,直接检测有否结合。
本发明的肽中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换。上述不同种类的氨基酸除了甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和脯氨酸等的氨基酸的L构型和D构型之外,还可举出:β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基乙酰丙酸、5-氨基戊酸、高半胱氨酸、鸟氨酸、5-羟基色氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸(多巴)、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、高赖氨酸(homolysine)、正亮氨酸、肌酸、锁链赖氨素、正缬氨酸和碘酪氨酸等的非天然氨基酸的L构型和D构型。优选本申请发明的肽中,肽中的半胱氨酸被置换为丝氨酸。本发明的肽中,肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。具体来说,在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,可将1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或15个氨基酸用对应的D-氨基酸置换。对应的D-氨基酸除了丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和脯氨酸等氨基酸的D构型之外,也可以是上述非天然氨基酸的D构型。优选本申请发明的肽中,所有的氨基酸被对应的D-氨基酸置换。或者,本申请发明的肽中,肽中的半胱氨酸可被上述不同种类的氨基酸置换,且肽中的氨基酸被上述的对应的D-氨基酸置换。优选本申请发明的肽中,肽中的半胱氨酸被置换为丝氨酸,且所有的氨基酸被对应的D-氨基酸置换。即使是具有任意一种氨基酸序列的情形,本发明的肽也都是具有免疫球蛋白结合能力的肽。并且,本发明的肽是将来自天然蛋白质的氨基酸序列进行修饰,因此难以进行蛋白质分解,在所给予的对象体内具有高稳定性和长的半衰期。
本发明的肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽。所述肽可以是具有SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列或dPro Gly dLeu dTyr dTyrdPhe所示的氨基酸序列的肽;还可以是具有下述氨基酸序列的肽(变异肽):其是在上述氨基酸序列的内部、N末端和/或C末端,缺失、置换或附加1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸得到的氨基酸序列;以及具有下述氨基酸序列的肽:其是与上述氨基酸序列具有例如26.6%以上或44.4%以上、优选至少为50%以上、更优选例如60、66.7、70、75、80、83.3、85、90、93%以上同源性的氨基酸序列。在本说明书中,“dL(dLeu)”、“dP(dPro)”、“dA(dAla)”、“dY(dTyr)”和“dF(dPhe)”、“dS(dSer)”、“dK(dLys)”、“dV(dVal)”、“dT(dThr)”、“dH(dHis)”分别表示亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸的D构型。并且,关于氨基酸序列的同源性,为短链肽时,可以单纯地对序列进行比较来计算。或者,可使用FASTA、BLAST、DNASIS(Hitachi Software Engineering(株)制造)、GENETYX((株)Genetyx制造)进行测定。并且,这些氨基酸的任意一种均可以进行适当修饰。即使是具有任意一种氨基酸序列的情形,本发明的肽也都是具有免疫球蛋白结合能力的肽。
本发明的肽只要具有上述氨基酸序列即可,可以是任意的肽。例如,本发明的肽可以是由SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列或dPro Gly dLeu dTyr dTyr dPhe所示的氨基酸序列组成的肽本身。或者,还可以是含有上述氨基酸序列或其同源序列作为核心序列,且在所述氨基酸序列的N末端和/或C末端结合有肽或氨基酸、它们的类似物、聚乙二醇、糖、多糖、核苷酸等各种物质的肽。还可以在N/C末端经由氨基酸或肽、或者使用可利用的官能基团在氨基酸序列的内部结合荧光标记、生物素、链霉抗生物素蛋白、地高辛(DIG)、磁珠、胶乳珠、胶体金等的物质。例如,肽结合时,所述肽可以是由1个~50个、例如1~20个、1~15个、1~9个氨基酸组成的肽。所述肽可以是发挥组氨酸标记物、GST标记物、S标记物、Myc标记物、HA标记物、或E标记物功能等的、具有功能的肽。
本发明的肽可通过本领域技术人员已知的各种方法制备和取得。例如,可根据编码本发明的肽的核苷酸序列通过基因工程来制备,或者可根据肽固相合成法等进行化学合成,或者还可以将它们组合来制备和取得。如上所述,本发明的肽具有免疫球蛋白结合能力,因此,使用所述肽,使其与免疫球蛋白结合,可以确定免疫球蛋白的存在或量,可以分离免疫球蛋白等。
在另一个方案中,本发明涉及一种核酸,该核酸是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸,选自
(a)编码具有SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列或其同源序列的肽的核酸;
(b)具有SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列的核酸;
(c)具有下述核苷酸序列的核酸,其是在SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个核苷酸得到的核苷酸序列;
(d)可在严谨的条件下与上述(b)或(c)的核酸或其互补链杂交形成的核酸;
(e)具有下述核苷酸序列的核酸,其是与SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列具有50%以上同源性的核苷酸序列。
在本说明书中,核酸是指单链或双链的DNA或RNA。本发明的核酸可通过本领域技术人员已知的各种方法来制备和取得。本发明中,SEQID NO:33~37的核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:28~32的氨基酸序列。
具体来说,本发明的核酸为以下(1)~(7)所述的核酸等:(1)编码具有SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列的肽的核酸;(2)编码具有下述氨基酸序列的肽的核酸,其是在SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个左右的氨基酸得到的氨基酸序列;(3)编码具有下述氨基酸序列的肽的核酸,其是与SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列具有例如26.6%以上或44.4%以上、优选至少50%以上、更优选例如60、66.7、70、75、80、83.3、85、90或93%以上同源性的氨基酸序列;(4)具有SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列的核酸;(5)具有下述核苷酸序列的核酸,其是在SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列中,缺失、置换或附加1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8或9个左右的核苷酸得到的核苷酸序列;(6)可在严谨的条件下与上述(3)或(4)的任意的核酸或其互补链杂交形成的核酸;以及(7)具有下述核苷酸序列的核酸,其是与SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列至少具有50%以上、优选例如60、70、75、80、90、93、95、或97%以上同源性的核苷酸序列。并且,这些核苷酸的任意一种均可以进行适当修饰。即使是具有任意一种氨基酸序列的情形,本发明的核酸也都是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸。
作为上述严谨的条件,例如可举出:J.Sambrook等人.,“MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition”,1989,Cold SpringHarbor Laboratory Press中记载的条件。例如在含有6×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.5%SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中,在68℃下与探针杂交形成后,洗涤条件有下述条件等:自2×SSC、0.1%SDS中、室温下变化为在0.1×SSC、0.5%SDS中、68℃的条件;在65℃下、在含有2×SSPE(Frederick M.Ausubel等人.,“CurrentProtocols in Molecular Biology”,1987,John Wiley & Sons,Hoboken NJ.中记载)和0.1%SDS的溶液中洗涤15分钟、2次,在含有0.5×SSPE和0.1%SDS的溶液中进一步洗涤15分钟、2次,接着在含有0.1×SSPE和0.1%SDS的溶液中洗涤15分钟、2次的条件;或者在65℃下、在含有2×SSPE、0.1%SDS和甲酰胺(5~50%)的溶液中洗涤15分钟、2次,在含有0.5×SSPE、0.1%SDS和甲酰胺(5~50%)的溶液中进一步洗涤15分钟、2次,接着在含有0.1×SSPE、0.1%SDS和甲酰胺(5~50%)的溶液中洗涤15分钟、2次的条件。
上述核苷酸序列的同源性例如可使用FASTA、BLAST、DNASIS(Hitachi Software Engineering(株)制造)、GENETYX((株)Genetyx制造)来测定。
本发明的核酸只要是具有上述核苷酸序列的核酸即可,可以是任意的核酸。例如,可以是由SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列组成的核酸本身,还可以是含有上述核苷酸序列作为核心序列,且所述序列的5’末端和/或3’末端结合有核苷酸、多核苷酸、或它们的类似物等各种物质的核酸。例如多核苷酸结合时,所述多核苷酸可以是由1~150个、例如1~60个、1~45个、1~18个核苷酸组成的多核苷酸。
在又一方案中,本发明涉及含有上述核酸的载体。本发明的载体只要含有上述核酸即可,可以使任意的载体。载体的种类、上述核酸的核苷酸序列以外的序列等可根据导入载体的宿主的种类、目的等各种条件适当选择。本发明的载体例如可通过在SEQ ID NO:33~37的任一个所示的核苷酸序列的5’末端或3’末端读框内插入编码目标蛋白质的核苷酸序列,可作为具有免疫球蛋白结合能力的肽附加在目标蛋白质的N末端或C末端得到的融合蛋白的表达用载体使用。为了容易地从融合蛋白上分离目标蛋白质,本发明的载体可以在上述核苷酸序列和目标蛋白质的核苷酸序列插入部之间含有例如通过HRV 3C、凝血酶、因子Xa、肠激酶等的蛋白酶识别的序列。也可以将本发明的载体导入细胞,以生产蛋白质,由此得到上述本发明的具有免疫球蛋白结合能力的肽。
在另一方案中,本发明涉及本发明的具有免疫球蛋白结合能力的肽附加在目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。本发明的融合蛋白可通过本领域技术人员已知的各种方法来制备和取得。本发明的融合蛋白含有具有免疫球蛋白结合能力的肽,因此,可以使用所述肽作为标记物序列,进行目标蛋白质的分离和/或纯化等。另外,如上所述,本发明的肽与免疫球蛋白的结合能力低,因此,本发明的融合蛋白例如固定于纯化用柱中时,与Protein A或Protein G比较,可在温和的条件下进行免疫球蛋白的纯化以及将所述柱反复使用(可抑制劣化),例如,作为免疫球蛋白的检测用探针时,具有再探测容易等的优点。
本发明的融合蛋白中所含的目标蛋白质可以使任意的蛋白质。本发明的融合蛋白含有例如碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(HRP)、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)等的荧光蛋白质、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽S转移酶、麦芽糖结合蛋白质等的酶作为目标蛋白质时,可以容易地检测本发明的融合蛋白中所含的具有免疫球蛋白结合能力的肽与免疫球蛋白的结合等。本发明的融合蛋白还可以含有例如组氨酸标记物、GST标记物、S标记物、Myc标记物、HA标记物或E标记物等的标记物序列,核定位信号、硅结合蛋白质或Protein A等。
本发明的融合蛋白可以在本发明的肽与目标蛋白质之间含有蛋白酶识别肽。通过含有所述肽,可以容易地从融合蛋白中分离目标蛋白质。
因此,在又一方案中,本发明涉及编码上述融合蛋白的核酸。
本发明进一步涉及含有编码上述融合蛋白的核酸的载体。可通过将所述载体导入细胞,生产蛋白质,来得到本发明的融合蛋白。
在一个方案中,本发明涉及编码上述具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸、编码上述融合蛋白的核酸、或含有载体的细胞,该载体含有上述这些核酸。本发明的细胞例如可通过使用上述核酸或载体来转化大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等宿主细胞来制备。培养本发明的细胞,回收所生产的具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含有具有免疫球蛋白结合能力的肽的融合蛋白,由此可以制备本发明的肽或融合蛋白。
在又一方案中,本发明涉及具有免疫球蛋白结合能力的肽的制备方法,该方法包含以下步骤:
(a)使用含有核酸的载体来转化细胞,其中,该核酸编码具有免疫球蛋白结合能力的肽;
(b)培养该细胞以生产肽。
细胞的转化可通过本领域技术人员已知的手段和/或方法进行。
因此,本发明涉及可通过上述肽的制备方法得到的、具有免疫球蛋白结合能力的肽。
在另一方案中,本发明涉及具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白的制备方法,该方法包含以下步骤:
(a)使用含有核酸的载体来转化细胞,其中,所述核酸编码具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端或C末端得到的融合蛋白;
(b)培养该细胞以生产融合蛋白。
本发明的融合蛋白的制备方法可以进一步包含从融合蛋白中获取目的蛋白质的步骤。
因此,本发明涉及可通过上述融合蛋白的制备方法得到的、具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。
在一个方案中,本发明涉及用于使免疫球蛋白结合的组合物,该组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。上述肽或融合蛋白以外的成分可根据使用本发明的组合物的目的等各种条件适当选择。如上所述,本发明的组合物含有具有免疫球蛋白结合能力的肽,因此,本发明的组合物例如可以是用于确定免疫球蛋白的存在或量的组合物,也可以是用于分离免疫球蛋白的组合物。通过本发明的组合物,可以确定试样中免疫球蛋白的量,也可以从试样中分离免疫球蛋白。
在又一方案中,本发明涉及用于使免疫球蛋白结合的手段,该手段是将具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含有所述肽的融合蛋白固定。本发明的手段例如是在板、树脂、柱、珠、琼脂糖或Sepharose等的含有糖的树脂、硅基板、玻璃(玻片等)、金属(金等)、磷灰石等的担体上固定上述肽或融合蛋白。固定可通过以下方法进行:经由肽、或蛋白质的氨基或羧基的方法,经由氨基酸支链的SH基的方法,通过离子性结合的方法,通过疏水性结合的方法等本领域技术人员已知的手段、方法。
如上所述,本发明的手段是将具有免疫球蛋白结合能力的肽固定,因此,本发明的手段包含用于确定免疫球蛋白的存在或量的手段、以及用于分离免疫球蛋白的手段。例如也可以以ELISA用板、免疫球蛋白纯化用柱、检测用玻璃阵列(glass array)、微流体系统、SPR用传感芯片、检测用硅基板、抗体药物纯化系统等的形式使用本发明的手段。
在又一方案中,本发明涉及使免疫球蛋白结合的方法,该方法包含:
(a)将具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含有所述肽的融合蛋白添加到试样中;
(b)检测肽或融合蛋白与免疫球蛋白的结合体。
试样只要具有含免疫球蛋白的可能性即可,可以是任意的试样。通过检测与免疫球蛋白的结合体的存在和/或量,可以确定试样中是否存在免疫球蛋白,并可进一步确定存在于试样中的免疫球蛋白的量等。本发明的方法中使用的肽或融合蛋白可以进行标记。标记可举出:生物素化、荧光标记、RI标记、酶标等本领域技术人员已知的各种标记。通过附加所述标记,使得对与肽或融合蛋白的结合体的检测变得容易。本发明的方法可进一步包含从结合体上分离免疫球蛋白的步骤。
因此,本发明涉及试剂盒,该试剂盒是用于在使免疫球蛋白结合的方法中使用,包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。本发明的试剂盒中,除了上述肽或融合蛋白之外,例如还可含有标记、检测结合体的手段等。
在另一方案中,本发明涉及由C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物,该药物组合物含有具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含所述肽的融合蛋白。由C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病是指由于所述结合而直接或间接地发生的疾病,例如可举出:类风湿性关节炎、关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎综合征、肾炎等的免疫复合物病,其它的炎症性疾病、感染症、和恶性肿瘤等。本发明的药物组合物是通过所含的具有免疫球蛋白结合能力的肽抑制C1q与免疫球蛋白的结合,可以治疗和预防上述疾病。本发明的肽来自原本存在于人体内的C1q,且为6~15个残基,较短,因此,将本发明的肽给予人时发生的副作用少。并且,本发明的肽是将来自天然蛋白质的氨基酸序列进行修饰,因此难以进行蛋白质分解,在所给予的对象体内具有高稳定性和长的半衰期。
本发明的药物组合物的给予方法可根据疾病的种类、对象的状态、和/或靶部位等的条件适当选择。该方法可举出:皮内给予、皮下给予、肌肉内给予、静脉内给予、透鼻给予、口服给予等,但并不限于此。本发明的药物组合物中所含的肽的量、药物组合物的剂型、给予频率等可根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等的条件适当选择,例如1次的肽给予量可以是0.01~100mg/kg、优选0.1~10mg/kg,但本发明的肽的给予量并不限于这些。
在又一方案中,本发明涉及由C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防方法,该方法包含将有效量的具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白给予对象。
以下给出实施例,具体且详细地说明本发明,但不能理解为实施例限定本发明。
实施例1
免疫球蛋白所识别的C1q中的氨基酸序列的鉴定
材料和方法
人C1q的亚基A链、B链、C链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17~19所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:20~22所示。以各氨基酸序列为基础,以3个氨基酸的间隔推移每15个氨基酸(残基),以此序列作为合成肽(肽编号依次为1~78、97~117、193~270号),在玻璃阵列上合成各亚基的氨基酸序列。各肽的合成在阵列上特定的位置进行,制作肽阵列,该肽阵列含有包罗了C1q亚基的全部氨基酸序列的合成肽。阵列的制作委托JPT公司进行。
将330μl用PBS(10mM磷酸缓冲液,pH7.0,0.1M NaCl)稀释1,000倍的Cy3标记山羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)(1mg/ml;ZymedLaboratories公司制造)涂布在肽阵列上,密封,然后在4℃培育12小时。然后用甲醇洗涤1次,用Mili-Q水以5分钟×5次洗涤。离心,将阵列玻片干燥,用荧光扫描仪(Agilent DNA微阵列扫描仪;Agilent公司制造)扫描,使用软件(Feature Extraction软件;Agilent公司制造),将阵列上各肽样点的荧光强度数值化。检测显示强荧光强度的几个样点。其中,显示比背景水平高的、60,000以上高的荧光强度的肽样点的氨基酸序列(SEQ ID NO:3~7)如表1所示。在本说明书中,氨基酸由本领域已知的单字母标记记载。
[表1]
肽编号 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO | 荧光强度* |
149号 | SGKFTCKVPGLYYFT | 3 | 65,300 |
150号 | FTCKVPGLYYFTYHA | 4 | 65,311 |
244号 | STGKFTCKVPGLYYF | 5 | 65,311 |
245号 | KFTCKVPGLYYFVYH | 6 | 65,311 |
246号 | CKVPGLYYFVYHASH | 7 | 65,313 |
*背景的荧光强度为2.6
结果
149号和150号的肽是来自C1qB亚基(B链)的序列,244~246号的肽是来自C1qC亚基(C链)的序列。由这些序列预测,C1q与免疫球蛋白结合所必须的序列是以CKVPGLYYF(SEQ ID NO:2)的9个残基为核心的序列。还确认,如果是含有该核心序列的序列,即使是数个残基的氨基酸与该N末端或C末端一侧结合,也不妨碍与免疫球蛋白的结合。149号和150号、244~246号的肽的核苷酸序列如SEQ IDNO:12~16所示。
实施例2
具有免疫球蛋白结合能力的肽对免疫球蛋白与C1q结合的抑制抑制活性的研究(1)
材料和方法
以下研究C1q与免疫球蛋白(IgG)的结合所必须考虑的CKVPGLYYF(SEQ ID NO:2)的9个残基的肽是否抑制C1q与免疫球蛋白的结合。委托GL Biochem(Shanghai)公司制作具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽(R2)、具有比所述肽短的氨基酸序列PGLYYF(SEQID NO:1)的肽(R1)、以及具有含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的氨基酸序列SGKFTCKVPGLYYFT(SEQ ID NO:3)的肽(R3)、具有氨基酸序列FTCKVPGLYYFTYHA(SEQ ID NO:4)的肽(R4)、具有氨基酸序列STGKFTCKVPGLYYF(SEQ ID NO:5)的肽(R5)、以及具有氨基酸序列CKVPGLYYFVYHASH(SEQ ID NO:7)的肽(R6)。这些肽如表2所示。将各肽溶解于DMSO,使浓度为10mg/ml,保存。
[表2]
合成肽 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO |
R1 | PGLYYF | 1 |
R2 | CKVPGLYYF | 2 |
R3 | SGKFTCKVPGLYYFT | 3 |
R4 | FTCKVPGLYYFTYHA | 4 |
R5 | STGKFTCKVPGLYYF | 5 |
R6 | CKVPGLYYFVYHASH | 7 |
将人C1q蛋白(Carbiochem公司制造)溶解于10mM HEPES、300mM NaCl、40%甘油(pH7.2),制备200μg/ml人C1q蛋白质溶液。以各2μl(400ng)将人C1q蛋白质溶液在5mm×15mm大小的硝基纤维素膜(Hybond C,Amersham公司制造)上点样,在室温下风干约1小时。将硝基纤维素膜浸渍在TBS中,培育5分钟,使用含有5%封闭剂(Amersham ECL blocking reagent,GE Healthcare公司制造)的TBS(20mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl),在室温下封闭1小时。用TBS轻轻洗涤,然后将碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)(BECKMAN COULTER公司制造)用TBS稀释1000倍,浸渍在20μl以各肽的浓度为500μg/ml混合的溶液中,在室温下反应1小时。用TTBS溶液(TBS中加入吐温20,终浓度为0.05%)轻轻洗涤,然后用同溶液振荡10分钟、3次,进行洗涤。
使用ALP标记免疫球蛋白(IgG)的检测方法
将硝基纤维素膜用ALP显色缓冲液(含100mM NaCl,5mMMgCl2的Tris-HCl,pH9.5)轻轻洗涤,然后浸渍在30μl含有BCIP/NBT溶液(Promega公司制造)的ALP显色缓冲液中,在室温下显色10分钟。在得到染色图像时,将硝基纤维素膜浸渍在足够量的蒸馏水中,冲洗显色缓冲液。洗涤后,将硝基纤维素膜风干,使用Multi Gauge(FUJIFILM)获取染色图像。
结果
结果如图1所示。具有C1q与免疫球蛋白(IgG)的结合所必须的9个氨基酸的肽R2以及具有所述肽作为核心序列的肽(肽R3~6)可抑制结合,不仅如此,具有更短的氨基酸序列的肽(肽R1)也抑制结合,因此可知,免疫球蛋白与C1q的结合中,以PGLYYF(SEQ ID NO:1)的6个残基的氨基酸作为核心的序列是很重要的。还可知,这些肽通过抑制C1q与免疫球蛋白的结合,具有治疗或预防由该结合而引起的疾病的可能性。
抑制活性的研究(2)
材料和方法
除了实施例2的抑制活性的研究(1)中给出的肽以外,对于其变异肽是否抑制C1q与免疫球蛋白的结合进行了检测。委托GL Biochem(Shanghai)公司制作表3所示的肽。将各肽溶解于DMSO,使浓度为10mg/ml,保存。实验按照与实施例2的抑制活性的研究(1)同样的方法进行,对照也是对肽R1、R2和R5进行试验。
[表3]
合成肽 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO |
R7 | PGAYYF | 23 |
R8 | PGLAYF | 24 |
R9 | PGLYAF | 25 |
R10 | CKAPGLYYF | 26 |
R11 | STAKFTCKVPGLYYF | 27 |
结果
结果如图2所示。将特定的氨基酸置换为丙氨酸所得的肽充分抑制了C1q与免疫球蛋白的结合。因此可知,对于这些变异肽或者含有它们作为核心的肽,通过抑制C1q与免疫球蛋白的结合,也具有治疗或预防由该结合而引起的疾病的可能性。
抑制活性的研究(3)
材料和方法
接续实施例1(2),对于又一种变异肽检测是否抑制C1q与免疫球蛋白的结合。将表4所示的肽委托GL Biochem(Shanghai)公司制作。这些肽通过将特定的氨基酸残基置换为对应的D-氨基酸,或者将氨基酸序列中的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基,可使肽稳定性提高。即,这些肽设计为具有更长的半衰期,在对象体内的治疗或预防效果可长期持续。将各肽溶解于DMSO,使浓度为10mg/ml,保存。实验按照与实施例2的抑制活性的研究(1)同样的方法进行,对照使用了肽R1、R2和R5。
[表4]
合成肽 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO |
R12 | PGdLYYF | 与1对应 |
R13 | dPGdLdYdYdF | 与1对应 |
R14 | SGKFTSKVPGLYYFT | 28 |
R15 | STGKFTSKVPGLYYF | 29 |
R16 | SKVPGLYYFVYHASH | 30 |
R17 | KFTSKVPGLYYFVYH | 31 |
R18 | FTSKVPGLYYFTYHA | 32 |
结果
结果如图3所示。表中,NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液中所得的样品的结果,PC是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液中所得的样品的结果。将特定的氨基酸置换为对应的D-氨基酸(R12和R13)、以及将丝氨酸残基置换为半胱氨酸残基的肽(R14~18)分别抑制C1q与免疫球蛋白的结合。
抑制活性的研究(4)
材料和方法
对又一种变异肽是否抑制C1q与免疫球蛋白的结合进行了检测。将表5所示的肽委托GL Biochem(Shanghai)公司制作。这些肽通过将氨基酸残基置换为对应的D-氨基酸,且将氨基酸序列中的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基,可以使肽稳定性提高。即,这些肽设计为具有更长的半衰期,在对象体内的治疗或预防效果可长期持续。将各肽溶解于DMSO,使浓度为10mg/ml,保存。实验按照与实施例2的抑制活性的研究(1)同样的方法进行,对照使用了肽R1、R5和R13。
[表5]
合成肽 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO |
R19 | dSdKdVdPGdLdYdYdF | 与2对应 |
R20 | dSGdKdFdTdSdKdVdPGdLdYdYdFdT | 与3对应 |
R21 | dSdTGdKdFdTdSdKdVdPGdLdYdYdF | 与5对应 |
R22 | dFdTdSdKdVdPGdLdYdYdFdTdYdHdA | 与4对应 |
结果
结果如图4所示。表中,NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液中所得的样品的结果,PC是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液中所得的样品的结果。将氨基酸残基置换为对应的D-氨基酸、且将氨基酸序列中的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基的肽(R19~22)分别抑制C1q与免疫球蛋白的结合。
实施例3
具有免疫球蛋白结合能力的肽的关节炎抑制作用的验证
(1)具有免疫球蛋白结合能力的肽对诱发关节炎的小鼠的关节炎抑制作用-1
材料和方法
使用单克隆抗体鸡尾酒诱发的关节炎小鼠(BALB/c Cr Slc(SPF)),研究实施例2中的以R5表示的肽的关节炎抑制作用。以2mg/个体静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,3天后,以50μg/个体腹腔内给予脂多糖(LPS),诱发关节炎。自LPS给予翌日(第4天)至第14天,以1天1次或1天2次、10mg/kg腹腔内给予肽R5。自第4天起,以1天1次、0.1mg/kg口服给予阳性对照试剂甲氨蝶呤。自第0天至第14天的偶数日,测定四肢的临床评分。麻醉下,用含有肝素的生理盐水进行放血,持续注入冰冷却4%仲甲醛液,进行全身灌流固定。灌流固定后,摘取两后肢的膝关节(将大腿骨中心部和胫骨中心部切断,除去皮肤和肌肉)以及踝关节(由胫骨中心部至趾尖),进一步用4%仲甲醛液浸泡过夜,固定(4℃)。然后,将两膝和两踝关节移入50mM PBS(4℃),然后由两个方向(内侧面方向和上面方向)进行踝关节的软X射线照片拍摄。
肽溶液的制备
关于肽,根据动物的体重计算必需量。将肽用0.5%甲基纤维素溶液制备成1mg/ml,将制备的肽溶液冷藏保存。
甲氨蝶呤溶液的制备
称量1mg甲氨蝶呤,加入到玛瑙乳钵中,用研磨棒粉碎,然后缓慢加入0.5%甲基纤维素溶液,使其悬浮,制备成0.01mg/ml。然后将制备物冷藏保存。
体重测定、一般症状观察和分组
动物的体重测定是在试验期间中,以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日为第0天,在第0、3、6、9、12和14天测定。每天实施一般状态观察。
关节炎模型的制作
第0天,以2mg/个体对20只7周龄的小鼠静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,第3天,以50μg/个体腹腔内给予LPS。
肽溶液的给予
肽溶液是自第4天起,1天1次(上午)或1天2次(上午和下午)腹腔内给予10mg/kg。作为对照,自第4天起,1天1次(上午)腹腔内给予0.5%甲基纤维素溶液。给予时使用注射针(26G,Terumo)和注射器(1.0ml容量,Terumo)。给予量是10ml/kg。甲氨蝶呤是自第4天起,1天1次(上午)口服给予0.1mg/kg。给予时使用经口探棒(peroralprobe)(小鼠用peroral probe,Fuchigami器械店)和注射器(1.0ml容量,Terumo)。给予量为10ml/kg。
临床评分观察
临床评分的观察是在自第0天至第14天的偶数日,按照以下标准进行观察。四肢的合计最高为12分。
<临床评分>
0:正常的关节
1:稍有炎症和红肿
2:前后足全体形成妨碍了前后足使用的严重的红斑和肿胀
3:伴随强直、关节僵硬、功能丧失的前后足或关节的变形统计学的分析处理方法
试验成绩以平均值±标准误差表示,使用EXSAS(Version7.1.6,株式会社Arm Systex)进行分析。临床评分是进行Wilcoxon检验。用肉眼观察足的肿胀。
结果
结果如图5所示。未观察到1天1次给予和1天2次给予之间肽R5的有效性存在显著差异,可见对关节炎抑制的效果。关节炎抑制的强度比甲氨蝶呤强。由该结果可已明确,本发明的肽在临床中,具有比现已使用的药物优异的关节炎抑制作用,对于关节炎和相关疾病的处置和预防有用。
已知甲氨蝶呤即使微量使用也会带来严重的副作用。而本发明的肽来自天然,未见任何副作用。因此,本发明的使用比以往使用的药物有利。
(2)具有免疫球蛋白结合能力的肽对于诱发关节炎的小鼠的关节炎抑制作用-2
材料和方法
使用单克隆抗体鸡尾酒诱发的关节炎小鼠,研究实施例2中以R1、R2和R5给出的肽的关节炎抑制作用。以2mg/个体静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,3天后,以50μg/个体腹腔内给予LPS,诱发关节炎。各肽是自诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日(第0天)起,分别以10mg/kg按照1天2次、连续给予14天,通过临床评分来研究关节炎抑制作用。实验按照与实施例3(1)同样的方法进行。
肽溶液的制备
各肽是根据动物的体重计算必需量。用0.5%甲基纤维素溶液制备成1mg/ml,冷藏保存。
体重测定和一般状态观察
动物的体重测定是在试验期间,以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日为第0天,在第0、3、6、9、12和14天测定。每天实施一般状态观察。
关节炎模型的制作和分组
给予开始前一天测定体重,通过分组软件随机分组,使各组的平均体重值大致相等。第0天,以2mg/个体对20只7周龄的小鼠静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,第3天,以50μg/个体腹腔内给予LPS。
肽溶液的给予
自第0天起,于上午和下午1天2次腹腔内给予各肽溶液。作为对照,自第0天起,1天2次、腹腔内给予0.5%甲基纤维素溶液。给予时使用注射针(26G,Terumo)和注射器(1.0ml容量,Terumo)。给予量为10ml/kg。
临床评分观察
以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日作为第0天,在至第14天的偶数日,按照如下标准观察全部实验例的四肢的临床评分。四肢的合计最高为12分。
<临床评分>
0:正常的关节
1:稍有炎症和红肿
2:前后足全体形成妨碍了前后足使用的严重的红斑和肿胀
3:伴随强直、关节僵硬、功能丧失的前后足或关节的变形统计学的分析处理方法
试验成绩以平均值±标准误差表示,使用EXSAS(Version7.1.6,株式会社Arm Systex)进行分析。临床评分是进行Wilcoxon检验。肉眼观察足的肿胀。
结果
结果如图6、图7和图8所示。以10mg/kg 1天2次给予R1、R2或R5的所有组中,均可见关节炎抑制作用。由此可以明确,本发明的肽具有关节炎抑制作用,对关节炎和相关疾病的处置和预防有用。另外,在所使用的肽中均未见一般症状的异常和对体重的作用。
在使用小鼠的试验中,本发明的肽未显示毒性影响。并且,本发明的肽来自于原本存在于人体内的C1q,且为6~15个残基,较短,因此,通过使用本发明的肽,有望降低治疗或预防所伴随的副作用。(3)具有免疫球蛋白结合能力的肽对于诱发关节炎的小鼠的关节炎抑制作用-3
材料和方法
使用单克隆抗体鸡尾酒诱发的关节炎小鼠,研究实施例2(3)中以R13和R17给出的肽的关节炎抑制作用。以2mg/个体静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,3天后,以50μg/个体腹腔内给予LPS,诱发关节炎。各肽是自诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予4天后,分别以1天1次连续10天进行腹腔内或静脉内给予,通过临床评分和后肢容积测定来研究关节炎抑制作用。
肽溶液的制备
各肽是根据动物的体重来计算必需量。使用生理盐水进行制备(R1为0.1mg/ml、R2为1mg/ml、以及R13和R17为1mg/ml或10mg/ml),冷藏保存。
体重测定和一般状态观察
动物的体重测定是在试验期间,以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日作为第0天,在第0、3、6、9、12和14天测定。每日实施一般状态观察。
关节炎模型的制作和分组
给予开始的前一天测定体重,通过分组软件随机分组,使各组的平均体重值大致相等。第0天,以2mg/个体对55只7周龄的小鼠静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,第3天后,以50μg/个体腹腔内给予LPS。
肽溶液的给予
自第4天起,1天1次腹腔内或静脉内给予各肽溶液。同样地,自第4天起,1天1次腹腔内给予生理盐水作为阴性对照、以及给予甲氨蝶呤(0.01mg/ml)作为阳性对照。给予时使用注射针(26G,Terumo)和注射器(1.0ml容量,Terumo)。给予量为10ml/kg。
临床评分观察
以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日作为第0天,至第14天的偶数日,按照如下标准观察全部实验例的四肢的临床评分。四肢的合计最高为12分。
<临床评分>
0:正常的关节
1:稍有炎症和红肿
2:前后足全体形成妨碍了前后足使用的严重的红斑和肿胀
3:伴随强直、关节僵硬、功能丧失的前后足或关节的变形
统计学的分析处理方法
试验成绩以平均值±标准误差表示,使用EXSAS(Version7.1.6,株式会社Arm Systex)进行分析。临床评分是进行Wilcoxon检验。肉眼观察足的肿胀。体重和足容积等的定量性数据进行Bartlett检验,如果方差齐同(分散が均一),则进行Dunnett的多重比较检验,如果方差不齐同(分散が不均一),则进行Steel的多重比较检验。
结果
结果如图9和图10所示。图9的临床评分中,在1天1次给予(R13为腹腔内,R17为静脉内)R13或R17的所有的组中,显示了与给予R1和R2时(R1为静脉内,R2为腹腔内)同程度的关节炎抑制作用,与给予甲氨蝶呤时比较,也为同程度或更大的作用。由图10的后肢容积测定的结果可以了解,本发明的肽以与R1和R2、进一步与甲氨蝶呤同程度或更大地抑制关节炎导致的患部的肿胀。由此可知,本发明的肽具有关节炎抑制作用,对于关节炎以及相关疾病的处置和预防有用。
已知甲氨蝶呤即使微量使用也会带来严重的副作用。而本发明的肽来自天然,未见任何副作用。因此,本发明的应用比以往使用的药物有利。
(4)具有免疫球蛋白结合能力的肽对于诱发关节炎的小鼠的关节炎抑制作用-4
材料和方法
使用单克隆抗体鸡尾酒诱发的关节炎小鼠,研究实施例2(3)中作为R13、实施例2(4)中作为R19和R21分别给出的肽的关节炎抑制作用。以2mg/个体静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,3天后以50μg/个体腹腔内给予LPS,诱发关节炎。各肽是自诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予4天后,分别以1天1次连续10天进行腹腔内给予,通过临床评分和后肢容积测定来研究关节炎抑制作用。
肽溶液的制备
各肽是根据动物的体重来计算必需量。使用生理盐水进行制备(10mg/ml和1mg/ml),冷藏保存。
体重测定和一般状态观察
动物的体重测定是在试验期间,以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日作为第0天,在第0、3、6、9、12和14天测定。每日实施一般状态观察。
关节炎模型的制作和分组
给予开始前一天测定体重,通过分组软件随机分组,使各组的平均体重值大致相等。第0天,以2mg/个体对40只7周龄的小鼠静脉内给予诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒,第3天后,以50μg/个体腹腔内给予LPS。
肽溶液的给予
自第4天起,1天1次腹腔内给予各肽溶液。同样,自第4天起,1天1次腹腔内给予生理盐水作为阴性对照、以及给予甲氨蝶呤(0.1mg/ml)作为阳性对照。给予时使用注射针(26G,Terumo)和注射器(1.0ml容量,Terumo)。给予量是10ml/kg或100mg/kg。
临床评分观察
以诱发关节炎用的单克隆抗体鸡尾酒给予日作为第0天,至第14天的偶数日,按照如下标准观察全部实验例的四肢的临床评分。四肢的合计最高为12分。
<临床评分>
0:正常的关节
1:稍有炎症和红肿
2:前后足全体形成妨碍了前后足使用的严重的红斑和肿胀
3:伴随强直、关节僵硬、功能丧失的前后足或关节的变形统计学的分析处理方法
试验成绩以平均值±标准误差表示,使用EXSAS(Version7.1.6,株式会社Arm Systex)进行分析。临床评分是进行Wilcoxon检验。肉眼观察足的肿胀。体重和足容积等的定量性数据是进行Bartlett检验,如果方差齐同,则进行Dunnett的多重比较检验,如果方差不齐同,则进行Steel的多重比较检验。
结果
结果如图11、12和13所示。以10mg/kg或100mg/kg的用量腹腔内给予肽R13时,可见与甲氨蝶呤同程度或更大的关节炎抑制作用。以100mg/kg的用量腹腔内给予肽R19和21时,可见与甲氨蝶呤同程度或更大的关节炎抑制作用。由此可以明确,本发明的肽具有关节炎抑制作用,对于关节炎和相关疾病的处置和预防有用。
已知甲氨蝶呤即使微量使用也会带来严重的副作用。而本发明的肽来自天然,未见任何副作用。因此,本发明的应用比以往使用的药物有利。
实施例4
具有免疫球蛋白结合能力的肽的免疫复合物病抑制作用的验证(1)在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中具有免疫球蛋白结合能力的肽对免疫复合物病抑制作用-1
材料和方法
使用64只雄性7周龄的Slc:WiStar系大鼠,对于肽R1、R2和R5,每种给予方法(腹腔内给予和尾静脉内给予)分2次进行试验。驯化是供给固型常规饲料CRF-1,喂饲9天以上。给予前一天,剃去动物背部的毛,给予当天,尾静脉内给予OVA+伊文思蓝(Evans blue)染料混合溶液。腹腔内给予时在OVA+伊文思蓝染料混合溶液给予30分钟后、尾静脉内给予时在50分钟后分别给予各肽溶液。关于抗OVA溶液的皮内给予,腹腔内给予时是在受验物质给予30分钟后、静脉内给予时是在10分钟后,以0.1mL/部位的用量对动物的背部皮内给予各肽溶液,局部诱发阿图斯反应。诱发4小时后,使动物安乐死,充分放血后剥离背部皮肤。冲切剥离的皮肤的阿图斯反应部位,由该皮肤过夜提取伊文思蓝染料。对于渗出的染料量,用分光光度计测定伊文思蓝染料的吸光度,使用校正曲线进行定量(关于实施例4中采用的实验方法,参照H.Okamoto,Y.Iwahisa和M.Terasawa:Suppressionof the Arthus reaction by Y-24180,a potent and specific antagonist ofplatelet-activating factor.Agents Actions,35:149~158(1992))。
该实验中使用的各肽溶液如下所示:
<阴性对照物质>
生理盐水
<肽溶液>
将按规定量称量的各肽(肽R1、R2和R5)溶解于生理盐水,制成20mg/ml溶液。2mg/ml溶液的制备是将20mg/mL溶液用生理盐水稀释10倍来制备。5mg/ml溶液的制备是将按规定量称量的各肽溶解于生理盐水,制成制备液。
阿图斯反应
以2ml/kg尾静脉内给予OVA+伊文思蓝染料混合溶液。腹腔内给予时是在OVA+伊文思蓝染料混合溶液的给予30分钟后、尾静脉内给予时是在50分钟后,分别给予各肽溶液。关于抗OVA溶液的皮内给予,腹腔内给予时是在受验物质给予30分钟后、静脉内给予时是在10分钟后,以0.1mL/部位的用量对动物的背部皮内给予各肽溶液,诱发局部阿图斯反应。皮内给予是对1只动物,PBS给予2处、抗OVA溶液给予2处。诱发4小时后,将动物在乙醚麻醉下断颈安乐死,充分放血后剥离背部皮肤。用打孔机冲切剥离的皮肤的阿图斯反应部位,用于染料提取。
染料提取和测定
在用打孔机冲切的皮肤片短条上切数个切口,在2ml染料提取液中浸泡,振荡搅拌10分钟。然后在室温静置过夜。静置过夜后,再次振荡搅拌10分钟,进行离心(1500rpm,15分钟),将其上清作为染料测定用试样。测定使用UV-1600(株式会社岛津制作所),以OD620nm的波长进行测定。渗出染料量根据染料量标准曲线进行计算。
数据的处理和统计处理
关于体重测定值和渗出染料量,是计算组平均值(mean)±标准偏差(SD)。渗出染料量是从2处抗OVA溶液给予处的平均值中减去2处PBS给予处的平均值,将所得作为各动物的值。对渗出染料量进行以下的统计分析。第1次的试验(各肽溶液的腹腔内给予)中,第1组对第2、3组、第1组对第4、5组、第1组对第6、7组分别进行Bartlett的齐性检验,如果方差没有不齐同则通过Dunnett的多重比较检验、如果方差不齐同则通过Steel的多重比较检验,来检验第1组与其它各组之间的平均值的差。第2次的试验(各肽溶液的尾静脉内给予)中,第9组对第10、11、12组之间进行Bartlett的齐性检验,如果方差没有不齐同则通过Dunnett的多重比较检验、如果方差不齐同则通过Steel的多重比较检验,检验第9组与其它各组之间的平均值的差。关于显著水平,Bartlett的齐性检验为5%,其它的检验是双侧5%。
结果
各肽溶液的腹腔内给予的结果如图14所示、尾静脉内给予的结果如图15所示。该实施例中使用的III型变态(阿图斯)反应模型体系中,与对照比较,可见30%左右的伊文思蓝渗出量的减少,可认为对于SLE、肾小球肾炎、关节炎、血管炎等免疫复合物病的抑制有效。肽溶液的腹腔内给予中,在肽R1、R2、R5的全部中均可见明确且充分的免疫复合物病抑制作用。尾静脉给予中,在肽R1、R2中可见明确且充分的免疫复合物病抑制作用。由此可以明确,本发明的肽具有明确且充分的免疫复合物病抑制作用,对于SLE、肾小球肾炎、关节炎、血管炎等的免疫复合物病的处置和预防有用。
(2)在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中具有免疫球蛋白结合能力的肽对于免疫复合物病抑制作用-2
材料和方法
使用45只雄性7周龄的Slc:WiStar系大鼠,对于肽R13和R19,每种给予方法(腹腔内给予和尾静脉内给予)分2次进行试验。驯化是供给固型常规饲料CRF-1,喂饲6天或8天。给予前一天,剃去动物背部的毛,给予当天,尾静脉内给予OVA+伊文思蓝染料混合溶液。腹腔内给予时是在OVA+伊文思蓝染料混合溶液的给予30分钟后、尾静脉内给予时是在50分钟后,分别给予各肽溶液。关于抗OVA溶液的皮内给予,腹腔内给予时是在受验物质给予30分钟后、静脉内给予时是在10分钟后,以0.1ml/部位的用量对动物的背部皮内给予各肽溶液,诱发局部的阿图斯反应。诱发4小时后,将动物安乐死,充分放血后剥离背部皮肤。冲切剥离的皮肤的阿图斯反应部位,由该皮肤过夜提取伊文思蓝染料。对于渗出的染料量,用分光光度计测定伊文思蓝染料的吸光度,使用校正曲线进行定量。
该实验中使用的各肽溶液如下所示:
<阴性对照物质>
生理盐水
<阳性对照物质给予液>
将按规定量称量的氢化可的松加入到乳钵中,用研磨棒破碎,然后加入生理盐水,使终浓度为10mg/ml,制备悬浮液。
<肽溶液>
将按规定量称量的各肽(肽R13和R19)溶解于生理盐水,制成20mg/ml溶液。2mg/ml溶液的制备时将20mg/mL溶液用生理盐水稀释10倍来制备。5mg/ml溶液的制备是将按规定量称量的各肽溶解于生理盐水,制成制备液。
阿图斯反应
以2ml/kg尾静脉内给予OVA+伊文思蓝染料混合溶液。腹腔内给予时是在OVA+伊文思蓝染料混合溶液的给予30分钟后、尾静脉内给予时是在50分钟后,给予各肽溶液。关于抗OVA溶液的皮内给予,腹腔内给予时是在受验物质给予30分钟后、静脉内给予时是在10分钟后,以0.1mL/部位的用量对动物的背部皮内给予各肽溶液,诱发局部的阿图斯反应。皮内给予是对1只动物,PBS给予2处、抗OVA溶液给予2处。诱发4小时后,将动物在乙醚麻醉下断颈安乐死,充分放血后剥离背部皮肤。用打孔机冲切剥离的皮肤的阿图斯反应部位,用于染料提取。
染料提取和测定
在用打孔机冲切的皮肤片短条上切数个切口,在2ml染料提取液中浸泡,振荡搅拌10分钟。然后在室温静置过夜。静置过夜后,再次振荡搅拌10分钟,进行离心(1500rpm,15分钟),将其上清作为染料测定用试样。测定使用UV-1600(株式会社岛津制作所),以OD620nm的波长进行测定。渗出染料量根据染料量标准曲线来计算。
数据的处理和统计处理
关于体重测定值和渗出染料量,是计算组平均值(mean)±标准偏差(SD)。渗出染料量是从2处抗OVA溶液给予处的平均值中减去2处PBS给予处的平均值,将所得作为各动物的值。对渗出染料量进行以下的统计分析。第1次(受验物质的腹腔内给予)试验中,对第1、2、3组、第1、4、5组分别进行Bartlett的齐性检验,如果方差没有不齐同则通过Dunnett的多重比较检验、如果方差不齐同则通过Steel的多重比较检验,来检验第1组与其它各组之间的平均值的差。第1组与第6组之间进行F检验,方差没有不齐同则通过Student的t检验、方差不齐同则通过Aspin-Welch的t检验,来检验2组间的平均值的差。第2次(受验物质的尾静脉内给予)试验中,在第7、8、9组之间进行Bartlett的齐性检验,如果没有方差不齐同,则通过Dunnett的多重比较检验、如果方差齐同则通过Steel的多重比较检验,来检验第7组与其它各组之间的平均值的差。显著水平在Bartlett的齐性检验中为5%,在其它的检验中为双侧5%。
结果
各肽溶液的腹腔内给予的结果如图16、尾静脉内给予的结果如图17所示。腹腔内给予试验中,在10mg/kg和100mg/kg给予肽R13两组中,与阴性对照物质给予组比较,可见显著的抑制效果。特别是在100mg/kg给予组中,可见非常显著的抑制效果(抑制约60%),这是比给予50mg/kg阳性对象物质氢化可的松时更强的抑制效果。关于肽R19给予组,在10mg/kg给予组中,与阴性对照物质给予组比较,显示25~30%的低值,可见抑制效果。另外,在100mg/kg给予组中,可见约50%的抑制效果,可见与阳性对照物质同样的抑制效果。第2次的尾静脉给予试验中,在肽R13给予组可见约70%的抑制效果,与阴性对照物质给予组比较,是非常显著的抑制效果。另外,肽R19给予组与阴性对照物质给予组比较,也可见约50%的抑制效果。该结果与同序列、L构型合成的肽比较,是非常显著的抑制效果。可证实,通过制成D构型肽,可以以更强的效果显示明确且充分的III型变态(阿图斯)反应的抑制效果,还由该结果表明,本肽对于肾小球肾炎、SLE、关节炎、血管炎等免疫复合物病的处置和预防有用。已知氢化可的松被分类为类固醇药物,即使微量使用也会带来严重的副作用。而本发明的肽来自天然,未见任何副作用。因此,与以往使用的药物相比,本发明的使用是非常有利的。
实施例5
具有免疫球蛋白结合能力的肽对大鼠胶原关节炎模型的关节炎抑制作用
使用大鼠胶原关节炎模型,研究以肽R13给出的肽的关节炎抑制效果。
将500μg来自牛的II型胶原对Lewis系雌性大鼠免疫,初次免疫后第7天和第14天,追加免疫100μg同胶原,诱发胶原关节炎。自关节炎完全发病12天后,连续25天、1天1次给予R13肽、错义肽(dYdPdYGdFdL)或甲氨蝶呤,通过临床评分研究关节炎的抑制效果。
对照药物是给予0.15mg/kg甲氨蝶呤。
肽溶液的制备方法
各肽是根据动物的体重计算必需量。缓慢加入生理盐水,使其悬浮,制备100mg/ml和10mg/ml。
临床评分观察
以用来自牛的II型胶原进行初次免疫当天作为第0天,自关节炎发病的第12天至第36天,在3的倍数日,按照如下标准观察全部实验例的四肢的临床评分。四肢的合计最高为16分。
<临床评分>
0:无变化
1:足根关节部或足背足底有轻度红斑和肿胀或者最多2根足趾有红斑和肿胀
2:足根关节部或足背足底有红斑和肿胀或者3根以上足趾有红斑和肿胀
3:足全体肿胀和红斑
4:最大强度的足全体肿胀和红斑
结果
如图18所示,以100mg/kg、10mg/kg 1天1次给予R13肽的组中可见关节炎抑制效果。特别是在以100mg/kg给予R13肽的组中,可见比给予甲氨蝶呤时更大的抑制效果。而错义肽中未见抑制效果。由此可以明确,本发明的肽具有关节炎抑制效果,对于关节炎和相关的疾病的处置和预防有用。另外,在任何所使用的肽中均未见一般症状的异常和对体重的作用。组织学观察也表明,由于给予肽,可见破坏关节部位的TNF表达显著降低,也可抑制破骨细胞的诱导。已知甲氨蝶呤即使微量使用也会带来严重的副作用。而本发明的肽来自天然,未见任何副作用。因此,与以往使用的药物相比,本发明的使用是有利的。
实施例6
使用具有免疫球蛋白结合能力的肽研究抗体检测试剂
材料和方法
蛋白质印迹法中,研究使用生物素化肽代替2次抗体,是否可以检测1次抗体。将肽R5进行生物素化,将该步骤委托GL Biochem(Shanghai)公司制作。
将BSA用12%SDS-PAGE电泳,并转印至PVDF膜上。将转印的PVDF膜用5%脱脂乳封闭。将PVDF膜浸渍在将抗BSA IgG(兔)稀释2000倍所得的溶液中,在室温下反应1小时。用TBST洗涤3次。将生物素化肽R5溶解于DMSO,使浓度为10mg/ml,将10μl该溶液加入到10ml的TBST中(稀释1000倍),在室温下反应1小时。用TBST洗涤3次。使用VECTOR laboratories公司制造的ABC试剂盒进行显色。显色液使用硫酸镍和二氨基联苯,底物使用过氧化氢水。
结果
结果如图19所示。通过使用生物素化的本发明的肽代替2次抗体,可检测PVDF膜上的抗体。由此可知,将本发明的肽生物素化,在抗体的检测中是有用的。
实施例7
使用具有免疫球蛋白结合能力的肽研究抗体纯化柱
材料和方法
对于使用具有免疫球蛋白结合能力的肽的抗体纯化柱进行研究。对照是使用Protein A。
肽柱的制作
将1ml NHS-activated Sepharose 4B Fast Flow填充于PD-10空白柱,用10ml 1mM HCl洗涤,用10ml PBS平衡。将5mg肽R4溶解于1ml PBS,添加到柱中,在室温下旋转4小时。将柱用5ml PBS洗涤,然后添加1ml的1M甘氨酸,在室温下旋转2小时,由此封闭未反应的NHS。除去1M甘氨酸,用10ml PBS洗涤,平衡。
抗体的纯化
亲和纯化用柱中加入1mg抗BSA IgG(兔)(抗牛血清白蛋白IgG(兔)),在室温下旋转2小时。用15ml PBS洗涤。加入5ml的0.1M甘氨酸-HCl(pH3.2),洗脱,在加入了100μl的1M Tris的微量管中,每1ml洗脱5次。用DC Protein Assay Kit(DC蛋白质测定试剂盒)(Bio-Rad)对洗脱组分中的蛋白质量进行定量。对于人IgG也进行同样的吸附-洗脱试验。
结果
结果如图20所示。在使用了本发明的肽的柱中,用于纯化的兔抗体中,可回收70~80%。该回收率比对照的Protein A优异。可知使用本发明的肽的亲和纯化用柱也适用于人IgG的纯化(图21)。由此可知,将本发明的肽固定的手段在抗体纯化中是极为有用的。
产业实用性
根据本发明,可得到具有免疫球蛋白结合能力的肽和与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸等,因此可在免疫球蛋白的检测、分离、纯化、类风湿性关节炎、以及SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等免疫复合物病等的、由C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物领域中利用。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:2:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:3:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:4:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:5:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:6:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:7:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:23:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:24:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:25:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:26:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:27:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:28:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:29:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:30:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:31:免疫球蛋白结合肽
SEQ ID NO:32:免疫球蛋白结合肽
Claims (32)
1.肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换。
2.权利要求1所述的肽,其中,肽中的半胱氨酸被丝氨酸置换。
3.权利要求2所述的肽,该肽具有SEQ ID NO:28~32的任意的氨基酸序列。
4.肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
5.权利要求4所述的肽,其中,所有的氨基酸均可被对应的D-氨基酸置换。
6.权利要求5所述的肽,该肽具有dPro Gly dLeu dTyr dTyr dPhe所示的氨基酸序列。
7.肽,该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽,选自
(a)具有SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列的肽;
(b)具有下述氨基酸序列的肽,其是在SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列;以及
(c)具有下述氨基酸序列的肽,其是与SEQ ID NO:1~7的任意的氨基酸序列具有66.7%以上同源性的氨基酸序列,
其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换,且肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
8.权利要求7所述的肽,其中,肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换,且所有的氨基酸均可被对应的D-氨基酸置换。
9.核酸,该核酸是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸,选自
(a)编码权利要求1所述的肽的核酸;
(b)具有SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列的核酸;
(c)具有下述核苷酸序列的核酸,其是在SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列中,缺失、置换或附加1个或多个核苷酸得到的核苷酸序列;
(d)可与上述(b)或(c)的核酸或其互补链在严谨的条件下杂交形成的核酸;
(e)具有下述核苷酸序列的核酸,其是与SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列具有50%以上同源性的核苷酸序列。
10.权利要求9所述的核酸,该核酸具有SEQ ID NO:33~37的任意的核苷酸序列。
11.载体,该载体含有权利要求9或10所述的核酸。
12.融合蛋白,其是权利要求1~3中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。
13.融合蛋白,其是权利要求4~8中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。
14.核酸,该核酸编码权利要求12所述的融合蛋白。
15.载体,该载体含有权利要求14所述的核酸。
16.细胞,该细胞含有权利要求9或10所述的核酸或权利要求14所述的核酸、或者权利要求11或15所述的载体。
17.具有免疫球蛋白结合能力的肽的制备方法,该方法包含以下步骤:
(a)使用权利要求11所述的载体来转化细胞;
(b)培养该细胞以生产肽。
18.具有免疫球蛋白结合能力的肽,该肽可通过权利要求17所述的方法得到。
19.融合蛋白的制备方法,该融合蛋白是具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的,所述方法包含:
(a)使用权利要求15所述的载体来转化细胞;
(b)培养该细胞以生产融合蛋白。
20.权利要求19所述的方法,该方法进一步包含由融合蛋白获取目标蛋白质的步骤。
21.融合蛋白,该融合蛋白可通过权利要求19或20所述的方法得到。
22.用于使免疫球蛋白结合的组合物,该组合物包含权利要求1~8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白。
23.权利要求22所述的组合物,该组合物用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。
24.用于使免疫球蛋白结合的手段,该手段是将权利要求1~8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白固定。
25.权利要求24所述的手段,该手段用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。
26.使免疫球蛋白结合的方法,该方法包含:
(a)将权利要求1~8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白添加到试样中;
(b)检测肽或融合蛋白与免疫球蛋白的结合体。
27.试剂盒,该试剂盒用于在权利要求26所述的方法中使用,包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。
28.由C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物,该药物组合物包含权利要求1~8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白。
29.权利要求28所述的药物组合物,其中,疾病是类风湿性关节炎。
30.权利要求28所述的药物组合物,其中,疾病是系统性红斑狼疮简写成SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病。
31.标记的权利要求1~8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白。
32.试样中抗体的检测方法,其特征在于:使权利要求31所述的标记肽或融合蛋白与试样中的抗体反应,接着检测与抗体结合的该肽或融合蛋白。
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