CN109576375A - 一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和肿瘤学领域，具体涉及一种与甲状腺结节良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物及其应用。本发明提供了一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本（FNA样本）标记物以及生物样本（FNA样本）标记物在甲状腺结节良恶性鉴别和预后评估中的应用，并且提供了一种术前鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒。所述标记物为甲状腺结节术前FNA标本中的PKM2 mRNA。本发明研究发现PKM2 mRNA在甲状腺乳头状癌（PTC）的术前FNA标本中表达增加，显示PKM2 mRNA与甲状腺恶性肿瘤发生、发展有关。利用FNA标本检测PKM2 mRNA，作为鉴别甲状腺结节良恶性的一种新方法，这种方法在细胞学诊断为“不能确诊”时，有利于避免诊断性手术。

Description

一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记 物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和肿瘤学领域，具体涉及一种与甲状腺结节良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物及其应用。

背景技术

甲状腺结节指甲状腺细胞在局部异常生长所引起的散在病变。近年来，甲状腺结节的高发性（借助高分辨率超声的检出率可达20-76%）引起了广泛关注。目前对甲状腺结节的诊治存在下述有待解决的问题：1) 尽管结节均源自甲状腺细胞异常生长，但恶性结节（甲状腺癌，以乳头状甲状腺癌为主）仅占所有结节的5-15%。由于缺少在术前将甲状腺癌从大量的良性结节中鉴别出来、并预测其恶性侵袭程度的良好手段，因此存在患者对甲状腺结节过度恐慌、医疗机构对甲状腺结节过度治疗的现象。2) 术前甲状腺细针穿刺（FNA）病理学检查是唯一能够在手术前获得甲状腺结节标本的方法，也是术前鉴别结节良恶性的重要手段，但是时有出现“无法诊断”或“可疑恶性”的情况，并且不能用于滤泡状甲状腺癌的诊断，仍难为后续处理提供良好依据。3）由于FNA得到的细胞量有限，难以对甲状腺癌中异常表达的某些蛋白（如半乳糖凝集素-3等）施行检测，故甲状腺结节患者在FNA细胞学无法确诊时，只能接受重复穿刺或诊断性手术，增加了患者的精神负担和不必要的手术。所以迫切需要能够利用FNA标本进行检测的、能够协助鉴别甲状腺结节良恶性的标记物。4) 部分甲状腺癌侵袭性强，很快出现转移或复发，或者分化较差，缺少有效的治疗方法，因此在甲状腺结节的术前评估中，不仅希望能够区分良恶性，还迫切需要能够提示恶性结节侵袭程度的标记物。总之，积极寻找有助于甲状腺结节良恶性鉴别诊断、动态监测和预后评估的特异性指标，是最大程度节约医疗资源、保障患者利益的关键所在，具有很强的现实意义。

目前，甲状腺结节中研究较多、成果较突出的分子标记物切入点是促细胞分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路。业内已证实，这两条通路的异常激活是甲状腺癌发生和侵袭度增加的重要原因之一。与通路激活有关的某些改变已显示出在甲状腺结节的鉴别诊断（如BRAFT1799A突变）、甲状腺癌的预后评估（如BRAF T1799A突变）等方面的潜在价值。此外，表观遗传学（基因甲基化、微小RNA、长链非编码RNA） 改变在甲状腺结节发病和诊治中的意义也是研究热点之一。但遗憾的是，目前仍然缺少我们所期望的高效性肿瘤标记物（单个标记物或标记物组合）。因此，我们应当积极开拓研究的新突破点。

细胞生长和代谢必需能量，能量依赖于ATP提供。细胞产生ATP的方式主要有两种：糖酵解和氧化磷酸化。糖酵解指葡萄糖在细胞质内被分解，生成丙酮酸、乳酸和少量ATP的过程。正常细胞仅在缺氧的情况下才以糖酵解作为供能的方式，而在有氧条件下，丙酮酸被转运至线粒体内进一步氧化分解生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，经氧化磷酸化完全分解成水和二氧化碳并产生大量ATP。肿瘤组织代谢旺盛，需要大量能量供给。早在上世纪20年代，Otto Warburg就发现与正常细胞主要依靠经济、高效的氧化磷酸化提供能量不同，肿瘤细胞能量代谢的特点表现在无论是否缺氧，均活跃摄取葡萄糖进行糖酵解，既为肿瘤细胞的不断生长提供能量，也为它们提供生物合成的原料，这被称为“Warburg效应”。肿瘤细胞的这些能量代谢改变成为肿瘤发病机制、早期诊断和靶向治疗的新切入点。受其启发，糖酵解关键酶是否能够作为甲状腺良性结节和甲状腺癌鉴别的分子标记物就成为值得研究的切入点。

2013年，在甲状腺癌的术后组织标本中，发现糖酵解关键酶之一M2型丙酮酸激酶（PKM2）表达较甲状腺正常组织明显增加，且与甲状腺癌的侵袭相关。推测在甲状腺结节的术前FNA标本中检测PKM2可以作为良恶性鉴别和侵袭性判断的标记物。鉴于FNA获得的生物样本量非常有限，不足以用来进行蛋白水平的检测，因此本发明开展了探讨其中PKM2 mRNA表达意义的相关研究。利用术前FNA标本检测PKM2基因表达及其作为标记物、术前鉴别甲状腺结节良恶性的价值尚未见报道。

发明内容

鉴于现有技术的缺陷，为了实现对甲状腺结节的合理诊治，本发明的目的在于提供一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本（FNA样本）标记物以及生物样本（FNA样本）标记物在甲状腺结节良恶性鉴别和预后评估中的应用，并且提供了一种术前鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒。所述标记物为甲状腺结节术前FNA标本中的PKM2 mRNA。本发明经研究发现 PKM2 mRNA在甲状腺乳头状癌（PTC）的术前FNA标本中表达增加，显示PKM2mRNA与甲状腺恶性肿瘤发生、发展有关。利用FNA标本检测PKM2 mRNA，作为鉴别甲状腺结节良恶性的一种新方法，这种方法在细胞学诊断为“不能确诊”时，有利于避免诊断性手术。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物，所述标记物为甲状腺结节术前FNA标本中的PKM2 mRNA。

一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物的应用，制备成术前鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒。

一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物在甲状腺结节良恶性鉴别和预后评估中的应用，利用甲状腺结节的FNA标本检测PKM2的mRNA表达水平，根据结果进行甲状腺结节良恶性的判别。

一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本（FNA样本）标记物在诊断恶性甲状腺结节的具体步骤如下。

1）甲状腺结节的FNA标本置于500μL TRIzol中。TRIzol中的标本使用前保存于-80℃冰箱中。

2）按照试剂说明书TRIzol提取甲状腺结节FNA标本中总RNA，Nanodrop®ND ⁃2000分光光度计检测mRNA的浓度和纯度。

3）将mRNA逆转为cDNA（5×Prime Script® RT Master Mix试剂盒），后进行qPCR扩增（StepOnePlus荧光定量PCR仪），反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTM，内参：β-Actin。

- PKM2引物：上游引物5’-ATAACGCCTACATGGAAAAGTGT-3’，下游引物 5’-TAAGCCCATCATC CACGTAGA-3’。

- β-Actin引物：上游引物5’-CATGTACGT -TGCTATCCAGGC-3’，下游引物 5’-CTCCTTAATGTCAC GCACGAT-3’。

- 反应条件：95℃ 20s预变性；95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。在PCR仪上进行扩增，得到CT值，采用2-ΔΔCt 法对基因进行相对定量分析。

4）构建ROC曲线，选择Youden指数最大值（Ymax=2.00）作为PKM2 mRNA诊断恶性甲状腺结节的截点。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

1）当甲状腺结节FNA细胞学结果为“不确定诊断”类别时，仍可能对甲状腺结节的良恶性进行鉴别。FNA获得的少量甲状腺结节标本即可以检测，无需诊断性手术获得组织标本。mRNA检测方法较为简单，能够提供定量信息。

2）甲状腺结节的FNA标本中可检测出PKM2 mRNA。PKM2 mRNA在甲状腺癌中的表达量显著高于正常甲状腺细胞和良性结节。其诊断甲状腺癌的特异性和阳性预测值分别为95.7%和95.8%。因此，可以利用FNA标本检测PKM2 mRNA，作为鉴别甲状腺结节良恶性的一种新方法；这种方法在细胞学诊断为“不能确诊”时，有利于避免诊断性手术。

3）本发明采用RT-PCR方法和人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒检测PKM2在良性甲状腺结节、乳头状甲状腺癌（PTC）以及结节周边正常甲状腺组织FNA标本中PKM2 mRNA的表达量和BRAF基因突变情况，并验证了PKM2 mRNA的表达在PTC中的表达量显著高于正常甲状腺组织和良性结节，其表达量与肿瘤最大径有相关性，而与患者淋巴结转移、BRAFV600E突变及AJCC分期无显著相关性。术前FNA标本中PKM2 mRNA的表达量与术后组织免疫组化PKM2蛋白的表达水平呈正相关，PKM2联合BRAFV600E检测具有更高的诊断效能。

4）本发明检测了甲状腺细针穿刺标本中PKM2 mRNA的表达水平，结合免疫组化技术检测甲状腺术后组织中PKM2蛋白的表达情况，构建受试者工作曲线（ROC）评价PKM2诊断PTC的价值。本发明的PKM2是在本发明之前已有报道的已知基因，PKM2在术后PTC组织中的表达明显高于甲状腺正常组织和良性结节。然而，PKM2基因在甲状腺结节FNA标本中的表达及其术前指导PTC诊断的价值尚未见报道。实施例中分析了PKM2基因在正常甲状腺、良性结节以及PTC的FNA标本中的表达差异，证实了PKM2基因检测应用于PTC术前诊断的价值。

附图说明

图1 是PKM2基因在正常甲状腺细胞、良性结节及PTC中的相对表达量， ^aP<0.01。

图2 是PKM2基因诊断PTC的ROC曲线。

图3 是PKM2基因与BRAF^V600E诊断PTC的互补关系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

FNA标本检测PKM2 mRNA在鉴别甲状腺结节良恶性中的应用及其与BRAFV600E突变的关系。

1 . FNA取样。

选取2016年1月至2018年3月于南京医科大学第一附属医院超声诊断科行FNA检查的甲状腺结节患者。入选139名患者共145例结节。入选标准：（1）直径≥5mm的实性结节；（2）甲状腺影像报告和数据系统（thyroid imaging reporting and data system，TIRADS）3级及以上结节。排除标准：（1）术前甲状腺功能（FT3、FT4及TSH）异常的患者；（2）提取mRNA浓度或纯度不达标者；（3）细胞学结果为BSRTC II类，随访少于1年或随访1年及以上但三维超声提示任何一个维度的最大径增加超过20%，且尚未手术的结节；（4）细胞学结果为BSRTC I、III、IV、V 或 VI类且未手术的结节；（5）病理类型为甲状腺非乳头状癌者。手术患者以术后组织病理为诊断金标准。细胞学结果为BSRTC II类的结节经超声随访1年，直径未见明显增大者视为良性结节。细针穿刺标本分别置于液基中检测膜式液基薄层细胞学、180μL细胞裂解液中检测BRAFV600E基因突变、500μL TRIzol中提取RNA。另外，单独穿刺1针结节周边正常甲状腺细胞（距结节≥10mm）置于500μL TRIzol中。TRIzol中的标本使用前保存于-80℃冰箱中。

145例结节的临床资料结果如表1所示。

2 . FNA标本的DNA分离提取。

采用厦门艾德生物医药科技公司石蜡包埋组织切片核酸提取试剂盒（AmoyDX，FFPE DNA kit）分离样品DNA，操作按说明书进行（其中Buffer DTL、Proteinase KSolution、Buffer DES、Buffer DTB、Buffer DW1、 Buffer DW2、Buffer DTE 均为试剂盒提供现成品），具体步骤如下。

1) 根据石蜡包埋组织切片（FFPE）组织面积的大小，刮取 1~5 片 FFPE 样品至1.5 mL离心管中，加入 1 mL 二甲苯，振荡混匀 10 s。

2) 室温 13000×g 离心 2 min，小心去除上清(勿吸到沉淀)。

3) 加入1mL无水乙醇，振荡混匀10s，室温下13000×g离心2min，小心去除上清(勿吸到沉淀)。

4) 室温开盖放置 10 min 或 37°C下开盖放置 5 min，使乙醇充分挥发。

5) 加入 180 μL Buffer DTL 及 20 μL Proteinase K Solution，振荡混匀，56°C消化 1 h，如样品量较多，可消化过夜。

6) 加入10μLBufferDES，混匀后放入温度已升至90°C的恒温加热器中，孵育 1 h。

7) 掌式离心机离心 5~10 s。如有需要，可加入 2 μL 100 mg/mL RNase A，室温放置 5 min 以去除 RNA；加入 200 μL Buffer DTB 和 200 μL 无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心 5~10 s。

8) 将全部液体转移至 DNA 吸附柱中，10000×g 离心 1 min，倒掉收集管中的液体。

9) 往 DNA 吸附柱中加入 600 μL Buffer DW1，10000×g 离心 1 min，倒掉收集管中的液体。

10) 往 DNA 吸附柱中加入 600 μL Buffer DW2，10000×g 离心 1 min，丢弃收集管。

11)换用新的收集管，13000×g离心3min，丢弃收集管。

12)将吸附柱小心转移至干净的 1.5 mL离心管中，往 DNA 吸附膜中心滴加 30~100 μL Buffer DTE(勿碰到 DNA 吸附膜)，室温静置 1~5 min，13000×g 离心 1 min，收集样品 DNA并保存。

13)经Nanodrop®ND-2000分光光度计检测所提取的DNA浓度和纯度，质量要求OD260/OD280在1.8-2.0之间。所有标本提取的DNA均符合该质量要求。

3 . BRAFV600E突变检测。

采用厦门艾德生物医药科技公司的人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）检测FNA样本的BRAFV600E突变。试剂盒内含有 Taq 酶、反应混合液和 BRAF 阳性质控品。其中反应混合 液主要成分包括特异性引物、双环探针、dNTPs、氯化镁、硫酸铵、氯化钾等；阳性质控品是由 BRAF 基因 V600E 突变合成模板按比例和基因组 DNA 混合而成。操作按说明书进行，具体步骤如下。

1)在常温下把混合液予以解冻，在涡旋器上将反应混合液混匀15秒，再将反应混合液快速离心15秒，按照每管35μL 加入0.4μL 的Taq酶的比例将反应混合液与Taq酶混合。

2)以每管35μL 的量将上述混有Taq酶的反应混合液分装到PCR反应管中。

3)将待检的DNA样品、阳性质控品和阴性对照（纯化水）依次取5μL 加入PCR反应管中，小心盖上PCR反应管。

4)离心PCR反应管，使所加试剂聚集到反应管底部。

5)将PCR反应管放入到ABI 7900型实时荧光定量PCR仪中，按如下程序进行反应设置。

第一阶段：预变性（95℃ 5min）。

第二阶段：15个循环退火（95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s）。

第三阶段：31个循环延伸（93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s）。

6)结果判定：阳性（突变型）：样本CT值<28，反之阴性（野生型）。

7) 实验结果：47例良性甲状腺结节中均为检出突变型BRAF基因。98例恶性甲状腺结节中，72.4%（71例）检出BRAFV600E突变。

4. FNA标本的总RNA提取。

1）将已置于500μL TRIzol的FNA样本从-80℃冰箱中取出，冰上静置复温。

2）加入100μL 氯仿，盖紧管盖，上下剧烈震荡15s，冰上静置10min。

3）将高速低温离心机预冷至4℃，然后放入EP管，12000g离心15min。

4）将离心好的EP管小心取出，吸取上清液至新的去酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，盖紧EP管盖子，轻柔的上下颠倒混匀15s，冰上静置10min，4℃ 12000g离心10min。

5）取出离心好的EP管，小心的将上清液吸去，注意保留管底部的白色沉淀。向每个管中加入1ml 75% DEPC处理水配制的酒精溶液，用移液器轻微吹打，将沉淀冲洗干净。4℃，7500g，离心5min。

6）将EP管取出，吸去上清，重复步骤5一次。

7）取出离心好的EP管，吸去上清，室温干燥10min，然后向每个EP管中加入RNase-Free ddH2O，充分溶解RNA。

8）Nanodrop®ND⁃2000分光光度计检测mRNA的浓度和纯度：RNA样本的OD 260/OD280值为1.8-2.2之间。所有标本提取的RNA均符合该质量要求。

5. 逆转录合成cDNA。

采用5×Prime Script® RT Master Mix试剂盒进行cDNA反转录，用逆转录缓冲液对l μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用20 μL反应体系，每个样品取1 μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20°C冰箱备用，实验操作按照产品说明书进行，具体操作如下。

1）利用分光光度计测量提取出的RNA溶液浓度及纯度，按照反转录试剂盒说明书，计算需要的RNA溶液体积。

2）配制去基因组DNA反应混合液，具体配方如表2所示（10μl体系）。

反应体系为42°C，2min。

3）配制反转录反应混合液，具体配方如表3所示（20μl体系）。

反应条件为42℃ 15min，85℃ 5s，将反应结束后获得的cDNA置于深低温冰箱中长期保存。

6 Real-time qPCR扩增。

用SYBR® Premix Ex TaqTM反应体系和StepOnePlus荧光定量PCR仪进行扩增，实验操作按照产品说明书进行。引物设计：PKM2上游引物5’-ATAACGCCTACATGGAAAAGTGT-3’，下游引物 5’-TAAGCCCATCATCCACGTAGA-3’；β⁃Actin上游引物5’-CATGTACGT -TGCTATCCAGGC-3’，下游引物 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。扩增程序为：95℃ 20s预变性；95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。所有样本重复3次。在PCR仪上进行扩增，得到CT值，采用2-ΔΔCt 法对基因进行相对定量分析。

1）反应体系见表4。

2）向PCR八连管孔中加入23μl上述混合反应液，每孔加入2μl cDNA模板，涡旋混匀后掌式离心机离心。

3）将PCR八连管置于StepOnePlus荧光定量PCR仪，设置扩增程序进行扩增。

4上述反应结束后，取5μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用快速胶回收试剂盒进行切胶回收，取部分测序，结果用blast软件进行同源性分析。

5）实验结果：实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现象，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式:2^-ΔΔCt×100%，比较PKM2在FNA标本中（PTC、正常甲状腺细胞和良性结节）的表达水平。结果显示: qRT-PCR扩增结果稳定，PKM2在PTC中的表达量显著高于正常甲状腺细胞和良性结节（P<0.01，见图1）。PTC中PKM2基因的相对表达量是良性结节的1.40倍。而PKM2基因在良性结节、正常甲状腺细胞间的表达无显著差异。统计分析进一步发现，PKM2基因在PTC中的表达量与肿瘤最大径具有相关性（P<0.05），而与患者年龄、性别、结节数目、淋巴结转移及BRAF^V600E突变、AJCC分期无显著相关性（P>0.05，见表5）。

注： 与d≤ 20mm相比，^aP<0.05。

构建ROC曲线（见图2），选择Youden指数最大值（Ymax=2.00）作为PKM2诊断PTC的截点，其准确性、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、曲线下面积分别为62.8%、46.9%、95.7%、95.8%、46.4%和0.673。进一步分析发现，PKM2基因与BRAFV600E突变诊断PTC之间存在互补关系（见图3）。PKM2联合BRAFV600E检测显著提升诊断的准确性和敏感性，分别达到87.6%、83.7%，与其单一基因检测相比，差异具有统计学意义（见表6）。

注：与PKM2相比，^aP<0.01；与BRAF^V600E相比，^bP<0.05，^cP<0.01。

Claims (4)

1.一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物，其特征在于，所述标记物为甲状腺结节术前FNA标本中的PKM2 mRNA。

2.一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物的应用，其特征在于，制备成术前鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒。

3.一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物在甲状腺结节良恶性鉴别和预后评估中的应用，其特征在于，利用甲状腺结节的FNA标本检测PKM2的mRNA表达水平，根据结果进行甲状腺结节良恶性的判别。

4.一种与甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断相关的生物样本标记物在诊断恶性甲状腺结节的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）甲状腺结节的FNA标本置于500μL TRIzol中，TRIzol中的标本使用前保存于-80℃冰箱中；

2）按照试剂说明书TRIzol提取甲状腺结节FNA标本中总RNA，Nanodrop®ND ⁃2000分光光度计检测mRNA的浓度和纯度；

3）将mRNA逆转为cDNA（5×Prime Script® RT Master Mix试剂盒），后进行qPCR扩增（StepOnePlus荧光定量PCR仪），反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTM，内参：β-Actin；

- PKM2引物：上游引物5’-ATAACGCCTACATGGAAAAGTGT-3’，下游引物 5’-TAAGCCCATCATC CACGTAGA-3’；

- β-Actin引物：上游引物5’-CATGTACGT -TGCTATCCAGGC-3’，下游引物 5’-CTCCTTAATGTCAC GCACGAT-3’；

- 反应条件：95℃ 20s预变性；95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环；

在PCR仪上进行扩增，得到CT值，采用2-ΔΔCt 法对基因进行相对定量分析；

4）构建ROC曲线，选择Youden指数最大值（Ymax=2.00）作为PKM2 mRNA诊断恶性甲状腺结节的截点。