DE19806185C2 - Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe - Google Patents
Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen ProbeInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein (Fuc-Protein) in einer biologischen Probe und dazugehörige Reagentiensätze. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Immunoassay zur Bestimmung von fucosyliertem alpha-Fetoprotein (AFP), das bei der Früherkennung des hepatocellulären Carcinoms (HCC) als einer häufigen Krebsform von Bedeutung ist. DOLLAR A Der Immunoassay ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Lectin ausgewählt aus der Gruppe Ulex-europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus-Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA) eingesetzt wird.
Description
Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay zur
Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein (Fuc-
Protein) in einer biologischen Probe und dazugehörige
Reagentiensätze. In einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung einen Immunoassay zur Bestimmung
von fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP), das bei der
Früherkennung des hepatocellulären Carcinoms (HCC) als
einer häufigen Krebsform von Bedeutung ist.
Die pathologisch erhöhte Fucosylierung von
Glycoproteinen spielt in der Tumordiagnostik eine
wichtige Rolle, da zunehmend diese Glycosylierungs
formen in der Oligosaccharid-Seitenkette von
Glycoproteinen als tumorassoziiert erkannt werden. So
wird z. B. in Aoyagi, Q. et al. (1985) Biochim. Biophys.
Acta 830, 217-223 und Aoyagi, Y. et al. (1988) Cancer
61, 769-774 oder Wu, J. T. (1990) Ann. Clin. Lab. Sci.
20, 98-105 die Fucosylierung des pathologischen AFP als
spezifisch für ein hepatocelluläres Carcinom
beschrieben.
Die Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein kann
daneben auch bei der Beurteilung von rekombinant
hergestellten Glycoproteinen, die als Therapeutika
Verwendung finden sollen, eine Rolle spielen,
insbesondere bei der Prozeßkontrolle.
Es ist bekannt, pathologisch fucosylierte Proteine mit
tels Affinitäts- und Immunoaffinitäts-Elektrophorese,
meist nach Blotting auf antikörperbeschichtete Membra
nen, nachzuweisen (Taketa K., J. Chromatogr. 569, 229-
241, 1991). Auch Affinitätschromatographie-Verfahren
werden verwendet. Zur Anwendung in der klinischen Pra
xis sind diese Methoden allerdings ungeeignet.
Zur Unterscheidung von fucosyliertem und nicht-fucosy
liertem AFP werden in der Literatur auch Lectin-Enzym
immunoassays mit den Lectinen Concanavalin A (ConA),
Lens-culinaris-Lectin A (LCA) und Phaseolus-vulgaris-
Haemagglutinin E (PHA-E) beschrieben (Yasufumi Suzuki
et al., Ann. Clin. Biochem. 1990, 27, 121-128; Noriaki
Kinoshita et al. (1989), Clinica Chimica Acta 179, 143-
152). Es hat sich allerdings herausgestellt, daß
Lectin-Enzymimmunoassays mit den genannten Lectinen die
Anforderungen bezüglich Spezifität und Empfindlichkeit,
die an einen klinischen Test zur quantitativen Bestim
mung von fucosylierten Proteinen gestellt werden müs
sen, nicht erfüllen. Für den Fall der Lectine ConA und
LCA wurde zusätzlich auch eine schlechte
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse festgestellt.
Von Thompson, S., Stappenbeck, R. & Turner, G. A. wurde in
Clin. Chim. Acta 180, 277-284 (1989) die Verwendung des Fucose
spezifischen Lectins aus Lotus tetragonolobus in Immunoassays
beschrieben. Dabei wird das Lectin als Fänger eingesetzt. Da
in Serumproben eine Vielzahl von Proteinen, besonders bei
Personen mit der Blutgruppe 0, fucosyliert sind, ist die
Empfindlichkeit für ein bestimmtes Protein infolge der
Kompetition mit anderen, individuell stark schwankenden
fucosylierten Proteinen erheblich herabgesetzt.
D'Cruz, O. J. & Haas, G. G. Jr. beschreiben in Fertil. Steril. 65,
843-851 (1996) die Verwendung fluoreszenzmarkierter Fucose
spezifischer Lectine in der Durchflußzytometrie. Diese Methode
ist jedoch in keiner Weise mit einem Immunoassay vergleichbar,
da sie nur für Zellen und nicht für Serumproteine verwendbar
sowie technisch auch viel aufwendiger als ein Immunoassay ist.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine Nachweis
methode für fucosylierte Proteine bereitzustellen, die
ausreichend sensitiv, spezifisch und reproduzierbar ist
und in der klinischen Praxis ohne Probleme angewendet
werden kann. Die Nachweismethode soll leicht handhabbar
und auch für Routineuntersuchungen im klinischen Be
reich geeignet sein. Es war insbesondere die Aufgabe
der Erfindung, eine Nachweismethode für fucosyliertes
α-Fetoprotein, einem Tumormarker in der Leberdiagno
stik, bereitzustellen.
Die Aufgabe der Erfindung wird wie in den Ansprüchen
angegeben gelöst. Der erfindungsgemäße Immunoassay zur
Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein in einer
biologischen Probe ist dadurch gekennzeichnet, daß a)
ein immobilisierter Anti-Fuc-Protein-Antikörper oder
ein immobilisiertes Anti-Fuc-Protein-Antikörperfragment
mit der biologischen Probe unter Ausbildung eines Fuc-
Protein-Antikörperkomplexes inkubiert wird, b) ein
Lectin ausgewählt aus der Gruppe Ulex-europaeus-
Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus-Agglutinin (LTA)
und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA) zugesetzt wird,
das geeignete Markierungen aufweist, um die Menge des
Fuc-Protein-Antikörperkomplexes und daraus die Menge an
fucosyliertem Protein in an sich bekannter Weise zu
bestimmen oder b) ein unmarkiertes Lectin ausgewählt
aus der genannten Gruppe zugesetzt wird und der
Nachweis des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes mittels
markierter Anti-Lectin-Antikörper gegen die genannten
Lectine in an sich bekannter Weise erfolgt. Es hat sich
gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Assay und durch
den Einsatz der ausgewählten Lectine UEA, LTA und AAA
eine weit bessere Empfindlichkeit und Spezifität
erreicht wird als mit den in der Literatur
beschriebenen Assays, die die Markerlectine ConA, LCA
und PHA-E nutzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird im
erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassay UEA als Lectin
eingesetzt. Als Fängerantikörper an der festen Phase
können sowohl polyklonale als auch monoklonale
Antikörper Verwendung finden.
In einer Ausführungsform wird der Sandwich-Immunoassay
so durchgeführt, daß dem immobilisierten Anti-Fuc-
Protein-Antikörper ein mit einem Akzeptor markiertes
Lectin ausgewählt aus UEA, LTA und AAA zugesetzt wird
und danach mit einem markierten Rezeptor, der an den
Akzeptor des Lectins bindet, inkubiert wird. Der
Nachweis wird in diesem Fall über den Marker am
Rezeptor geführt. Als Akzeptor zur Markierung des
Lectins können Haptene oder niedermolekulare Liganden
eingesetzt werden, vorzugsweise kommt Biotin zur
Anwendung. Entsprechend finden in einer bevorzugten
Ausführungsform markiertes Avidin, Streptavidin oder
deren Derivate als Rezeptor Verwendung. Werden als
Akzeptor Haptene eingesetzt, so finden als Rezeptor
Hapten-spezifische Antikörper Anwendung.
Als Rezeptormarker können erfindungsgemäß Enzyme,
Farbstoffe, Radioisotope, Metallkolloide, Chelatoren
oder Spinmarker eingesetzt werden. Vorzugsweise wird
als Rezeptormarker ein Enzym wie beispielsweise
Meerrettich-Peroxidase (POD), alkalische Phosphatase,
β-Galaktosidase, Urease oder Glucoseoxidase eingesetzt
und die Menge des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes durch
eine Substratreaktion dieses Enzyms nachgewiesen. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird
erfindungsgemäß POD zur Markierung verwendet und die
Substratreaktion mittels eines chromogenen Substrats,
z. B. mit H2O2-Tetramethylbenzidin, durchgeführt. Es ist
erfindungsgemäß jedoch auch möglich und dem Fachmann
geläufig, daß die Substratreaktionen für die
verschiedensten Enzyme mittels unterschiedlicher
chromogener Substrate, Chemolumineszenz oder
Fluoreszenz nachgewiesen werden können.
Der erfindungsgemäße Immunoassay wird also in einer be
sonders bevorzugten Ausführungsform als Enzymimmuno
assay durchgeführt. Alternativ kann der Rezeptor jedoch
auch mit einem Radioisotop (z. B. 125J), mit einem Fluor
eszenzmarker (z. B. FITC), einem Metallkolloid (z. B.
Gold), einem Chelator (z. B. DTTA), mit Polynucleotiden
oder mit einem Spinmarker (z. B. PROXYL) markiert sein.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, das mit einem
Akzeptor markierte Lectin und den Rezeptor als
präformierten Komplex dem Antigen-Antikörperkomplex
zuzusetzten, so daß bei der Durchführung der genannten
Assayvariante ein Verfahrensschritt entfällt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann
der Immunoassay auch als direkter Assay durchgeführt
werden. In diesem Fall trägt das erfindungsgemäße
Lectin selbst die genannten Marker. Auch hier ist die
Durchführung als Enzymimmunoassay bevorzugt.
In einer dritten Variante wird im erfindungsgemäßen
Assay unmarkiertes Lectin eingesetzt und der Nachweis
über markierte Anti-Lectin-Antikörper geführt. Es
können hierbei sowohl polyklonale als auch monoklonale
Antikörper gegen UEA, LTA oder AAA oder deren Fragmente
eingesetzt werden. Auch hier ist die Durchführung als
Enzymimmunoassay bevorzugt.
Als biologische Probe ist im Sinne der Erfindung jede
Probe einer Körperflüssigkeit von Mensch oder Tier zu
verstehen, die fucosylierte Proteine enthalten kann.
Beispielsweise kann das Blut, Plasma, Serum, Urin,
Gewebeflüssigkeit, Lymphe, Magensaft, Ascites oder
Speichel sein. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
können fucosylierte Proteine wie z. B. α-Fetoprotein,
fucosylierte, gentechnisch erzeugte oder aus
biologischem Material gewonnene Pharmaproteine oder
Adhäsionsproteine (z. B. CD22) bestimmt werden.
Es hat sich gezeigt, daß der erfindungsgemäße Assay
insbesondere zur Differentialdiagnose von Lebererkran
kungen geeignet ist und sich durch die Bestimmung der
Menge an fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP) im Serum
eine zuverlässige Aussage über ein möglicherweise vor
handenes hepatocelluläres Carcinom (HCC) treffen läßt,
da der Fucose-spezifische AFP-Gehalt bei HCC-Patienten
signifikant erhöht ist (vgl. Abb. 1).
Der erfindungsgemäße AFP-Assay enthält in einer
besonders bevorzugten Ausführungsform als
Fängerantikörper an der festen Phase polyklonale
Antikörper oder deren Fragmente aus Maus, Kaninchen
oder Huhn. Biotinyliertes UEA wird dem Antigen-
Antikörperkomplex zugesetzt und mit einem Avidin-,
modifizierten Avidin- oder Streptavidin-POD-Konjugat
die Detektion des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes
durchgeführt.
Die erfindungsgemäße technische Lösung eröffnet also
die Möglichkeit, bei Verdacht auf Lebertumor-
Erkrankungen den Gesamt-AFP-Gehalt z. B. mittels eines
üblichen Enzym-Immunoassays zu bestimmen und parallel
dazu den Gehalt an fucosyliertem AFP (z. B. auf einer
Mikrotestplatte) festzustellen. Der Aufbau dieser
beiden Assays kann beispeilsweise wie nachfolgend
dargestellt aussehen:
- 1. Immobilisierter anti-AFP-Antikörper bzw. - Antikörperfragmet der Spezies 1 (z. B. Maus, Kaninchen, Huhn)
- 2. AFP-Standard-Verdünnung bzw. verdünntes Patientenserum
- 3. Enzym-markierter anti-AFP-Antikörper bzw. - Antikörperfragment der Spezies 2 (z. B. Maus, Kaninchen, Huhn). Enzym z. B. Meerrettichperoxidase (POD) oder Alkalische Phosphatase (AP)
- 4. Substratreaktion
- 1. Immobilisierter anti-AFP-Antikörper bzw. - Antikörperfragmet der Spezies 1 (z. B. Maus, Kaninchen, Huhn)
- 2. Verdünntes Patientenserum
- 3. Markiertes Lectin ausgewählt aus UEA, LTA oder AAA (z. B. biotinyliertes UEA)
- 4. Markierungsspezifisches Enzymkonjugat (z. B. Avidin/Streptavidin-POD-Konjugat bzw. -Komplex)
- 5. Substratreaktion
Neben dem Bestimmungsverfahren hat die Erfindung auch
die zugehörigen Reagentiensätze, wie sie in den
Ansprüchen ausgewiesen sind, zum Gegenstand.
Kaninchen werden mit hochreinem humanen AFP aus
Nabelschnurblut immunisiert. Aus dem Blut der
immunisierten Tiere wird nach Koagulation das Antiserum
durch Zentrifugation abgetrennt.
Das Serum wird auf eine AFP-Sepharose gegeben.
Ungebundene Serumprotein werden mit TRIS-gepufferter
physiologischer Kochsalzlösung (TBS) ausgewaschen.
Anließend wird das Anti-AFP-IgG mit einem 0,2 M Glycin-
HCl Puffer pH 2,5 eluiert, mit 1 M Tris-HCl pH 7,5
neutralisieret, mit Centricon-30-kD-Kartuschen
konzentriert und gegen 50 mM Acetat-Puffer pH 4,0; 0,5 M
NaCl, 0,02% NaN3 umgepuffert.
Es wird ein Enzym-IgG-Verhältnis von E : P = 1 : 50
eingestellt und 4 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion
wird mit 1 M Tris-HCl pH 7,5 beendet. Anschließend
werden die Anti-AFP-F(ab)2-Fragmente durch
Immunaffinitätschromatographie an einer AFP-Säule wie
unter ab) beschrieben isoliert, konzentriert, gegen TBS
dialysiert und bei 4°C gelagert.
Die Vertiefungen einer Mikrotestplatte sind mit anti
human-AFP-IgG (F(ab)2-Fragment, Kaninchen) durch Ad
sorption aus einer Lösung von 10 µg F(ab)2/ml in Bicar
bonatpuffer pH 8,5-9,5 belegt. Eine unspezifische Pro
teinadsorption ist durch Blockierung der Plastoberflä
che mit einer Inertprotein-Lösung (z. B. Rinderserumal
bumin in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalz
lösung (PBS)) reduziert. In die so beschichteten Ver
tiefungen wird entweder eine Standard-Verdünnungsreihe
von humanem AFP (Konzentrationsbereich 2 bis 300 ng/ml)
bzw. eine zentrifugierte, 1 : 5 bis 1 : 10 verdünnte Probe
Patientenserum gegeben. Ungebundenes Material wird aus
gewaschen, dann wird mit einer geeigneten Verdünnung
antihuman-AFP-IgG-POD-Konjugat inkubiert. Ungebundenes
Material wird ausgewaschen, dann wird die Substratreak
tion mit H2O2-Tetramethylbenzidin gestartet und nach
einer definierten Zeit mit Schwefelsäure gestoppt. Die
Absorption wird bei 450 nm gemessen. Der Gehalt an AFP
im Patientenserum wird anhand der Standard-Verdünnungs
reihe ermittelt.
Die Vertiefungen einer Mikrotestplatte sind mit anti
human-AFP-IgG (F(ab)2-Fragment, Kaninchen), wie in
Beispiel 1a hergestellt, durch Adsorption aus einer Lö
sung von 10 µg F(ab)2/ml in Bicarbonatpuffer pH 8,5-9,5
belegt. Eine unspezifische Proteinadsorption ist durch
Blockierung der Plastoberfläche mit einer Inertprotein-
Lösung (z. B. Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter
physiologischer Kochsalzlösung (PBS)) reduziert. In die
so beschichteten Vertiefungen wird eine zentrifugierte,
1 : 5 bis 1 : 10 verdünnte Probe Patientenserum gegeben.
Ungebundenes Material wird ausgewaschen, dann wird mit
einer geeigneten Verdünnung biotinyliertes Ulex-euro
paeus-Lectin (bio-UEA) inkubiert. Ungebundenes Material
wird ausgewaschen, dann wird mit einer geeigneten Ver
dünnung Acylavidin-biotinylierte POD-Komplex (AbP) in
kubiert. Ungebundenes Material wird ausgewaschen, dann
wird die Substratreaktion mit H2O2-Tetramethylbenzidin
gestartet und nach einer definierten Zeit mit Schwefel
säure gestoppt. Die Absorption wird bei 450 nm gemes
sen.
Es werden die Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 für ver
schiedene Probanden dargestellt (Abb. 2). Es wird deut
lich, daß der Gesamt-AFP-Gehalt nicht mit dem Gehalt an
UEA-reaktivem AFP korreliert, so daß erst mit dem er
findungsgemäßen Test wirklich festgestellt werden kann,
ob bei erhöhten AFP-Werten tatsächlich auch eine
erhöhte Menge an fucolysiertem AFP vorliegt.
Es zeigen:
Abb. 1: Gehalt an fucosyliertem AFP in Patienten-
Serumproben
control - gesunde Probanden, SLE - systemi scher Lupus erythromateus, AIH - autoimmune Hepatitis, PBC - polynucleare billäre Cir rhose, HCC - hepatocelluläres Carcinom,
control - gesunde Probanden, SLE - systemi scher Lupus erythromateus, AIH - autoimmune Hepatitis, PBC - polynucleare billäre Cir rhose, HCC - hepatocelluläres Carcinom,
Abb. 2: Vergleich des Gehalts an Gesamt- und fucosy
liertem AFP in verschiedenen HCC-Patienten-
Seren.
Claims (16)
1. Immunoassay zur Bestimmung der Menge an
fucosyliertem Protein (Fuc-Protein) in einer
biologischen Probe,
dadurch gekennzeichnet, daß
- a) ein immobilisierter Anti-Fuc-Protein-Antikörper oder ein immobilisiertes Anti-Fuc-Protein- Antikörperfragment mit der biologischen Probe unter Ausbildung eines Fuc-Protein-Antikörperkomplexes inkubiert wird und
- b) ein Lectin ausgewählt aus der Gruppe Ulex- europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus- Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA) zugesetzt wird, das geeignete Markierungen aufweist, um die Menge des Fuc-Protein- Antikörperkomplexes und daraus die Menge an fucosyliertem Protein in an sich bekannter Weise zu bestimmen oder
- c) ein unmarkiertes Lectin ausgewählt aus Gruppe Ulex-europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolo bus-Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Aggluti nin (AAA) zugesetzt wird und der Nachweis des Fuc- Protein-Antikörperkomplexes mittels markierter Anti-Lectin-Antikörper oder deren Fragmente gegen die genannten Lectine in an sich bekannter Weise erfolgt.
2. Immunoassay nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
b) ein mit einem Akzeptor markiertes Lectin gemäß
Anspruch 1 zugesetzt wird, mit einem markierten
Rezeptor, der an den Akzeptor des Lectins bindet,
inkubiert wird und in üblicher Weise mittels des
Markers am Rezeptor die Menge des Fuc-Protein-
Antikörperkomplexes und daraus die Menge an
fucosyliertem Protein bestimmt wird.
3. Immunoassay nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Menge an fucosyliertem Protein direkt bestimmt
wird durch b) Zusatz eines derart markierten
Lectins, daß die Bestimmung der Menge des Fuc-
Protein-Antikörperkomplexes mittels des Markers am
Lectin erfolgen kann.
4. Immunoassay nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Menge an fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP)
bestimmt wird.
5. Immunoassay nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
ein Lectin eingesetzt wird, das mit einem Hapten
oder einem niedermolekularen Liganden als Akzeptor
markiert ist.
6. Immunoassay nach den Ansprüchen 2 und 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Lectin mit Biotin als Akzeptor markiert ist und
als Rezeptor Avidin, Streptavidin oder deren
Derivate eingesetzt werden.
7. Immunoassay nach den Ansprüchen 2 und 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Lectin mit einem Hapten markiert ist und als
Rezeptor ein Hapten-spezifischer Antikörper einge
setzt wird.
8. Immunoassay nach den Ansprüchen 2 und 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Rezeptormarker ein Enzym, ein Farbstoff, ein
Radioisotop, ein Metallkolloid, ein Chelator, ein
Nucleotid oder ein Spinmarker eingesetzt wird.
9. Immunoassay nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Lectinmarker ein Enzym, ein Farbstoff, ein
Radioisotop, ein Metallkolloid, ein Chelator, ein
Nucleotid oder ein Spinmarker eingesetzt wird.
10. Immunoassay nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Marker der Anti-Lectin-Antikörper ein Enzym,
ein Farbstoff, ein Radioisotop, ein Metallkolloid,
ein Chelator, ein Nucleotid oder ein Spinmarker
eingesetzt wird.
11. Testkit zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem
Protein (Fuc-Protein) in einer biologischen Probe
enthaltend markiertes oder unmarkiertes Lectin aus
gewählt aus der Gruppe Ulex-europaeus-Agglutinin
(UEA), Lotus-tetragonolobus-Agglutinin (LTA) und
Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA)
12. Testkit nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß
er einen anti-Fuc-Protein-Antikörper oder ein Anti-
Fuc-Protein-Antikörperfragment beinhaltet.
13. Testkit nach Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet, daß
er ein mit einem Akzeptor markiertes Lectin und
einen markierten Rezeptor, der an den Akzeptor des
Lectins bindet, beinhaltet, die gegebenenfalls auch
bereits als präformierter Komplex vorliegen können.
14. Testkit nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß
er als mit einem Akzeptor markiertes Lectin
biotinyliertes UEA beinhaltet.
15. Testkit nach Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet, daß
er unmarkiertes Lectin und markierte Anti-Lectin-
Antikörper gegen dieses Lectin beinhaltet.
16. Testkit nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Be
stimmung der Menge an fucosyliertem α-Fetoprotein
(AFP).
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