DE19806185C2

DE19806185C2 - Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe

Info

Publication number: DE19806185C2
Application number: DE1998106185
Authority: DE
Inventors: Martin Holtzhauer; Sergej Ovodov; Alexander Knoll
Original assignee: BIOGENES GmbH
Current assignee: BIOGENES GmbH
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2018-02-03
Also published as: DE19806185A1; WO1999039209A1; EP1053476A1; JP2002502037A

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein (Fuc-Protein) in einer biologischen Probe und dazugehörige Reagentiensätze. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Immunoassay zur Bestimmung von fucosyliertem alpha-Fetoprotein (AFP), das bei der Früherkennung des hepatocellulären Carcinoms (HCC) als einer häufigen Krebsform von Bedeutung ist. DOLLAR A Der Immunoassay ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Lectin ausgewählt aus der Gruppe Ulex-europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus-Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA) eingesetzt wird.

Description

Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein (Fuc- Protein) in einer biologischen Probe und dazugehörige Reagentiensätze. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Immunoassay zur Bestimmung von fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP), das bei der Früherkennung des hepatocellulären Carcinoms (HCC) als einer häufigen Krebsform von Bedeutung ist.

Die pathologisch erhöhte Fucosylierung von Glycoproteinen spielt in der Tumordiagnostik eine wichtige Rolle, da zunehmend diese Glycosylierungs formen in der Oligosaccharid-Seitenkette von Glycoproteinen als tumorassoziiert erkannt werden. So wird z. B. in Aoyagi, Q. et al. (1985) Biochim. Biophys. Acta 830, 217-223 und Aoyagi, Y. et al. (1988) Cancer 61, 769-774 oder Wu, J. T. (1990) Ann. Clin. Lab. Sci. 20, 98-105 die Fucosylierung des pathologischen AFP als spezifisch für ein hepatocelluläres Carcinom beschrieben.

Die Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein kann daneben auch bei der Beurteilung von rekombinant hergestellten Glycoproteinen, die als Therapeutika Verwendung finden sollen, eine Rolle spielen, insbesondere bei der Prozeßkontrolle.

Es ist bekannt, pathologisch fucosylierte Proteine mit tels Affinitäts- und Immunoaffinitäts-Elektrophorese, meist nach Blotting auf antikörperbeschichtete Membra nen, nachzuweisen (Taketa K., J. Chromatogr. 569, 229- 241, 1991). Auch Affinitätschromatographie-Verfahren werden verwendet. Zur Anwendung in der klinischen Pra xis sind diese Methoden allerdings ungeeignet.

Zur Unterscheidung von fucosyliertem und nicht-fucosy liertem AFP werden in der Literatur auch Lectin-Enzym immunoassays mit den Lectinen Concanavalin A (ConA), Lens-culinaris-Lectin A (LCA) und Phaseolus-vulgaris- Haemagglutinin E (PHA-E) beschrieben (Yasufumi Suzuki et al., Ann. Clin. Biochem. 1990, 27, 121-128; Noriaki Kinoshita et al. (1989), Clinica Chimica Acta 179, 143- 152). Es hat sich allerdings herausgestellt, daß Lectin-Enzymimmunoassays mit den genannten Lectinen die Anforderungen bezüglich Spezifität und Empfindlichkeit, die an einen klinischen Test zur quantitativen Bestim mung von fucosylierten Proteinen gestellt werden müs sen, nicht erfüllen. Für den Fall der Lectine ConA und LCA wurde zusätzlich auch eine schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse festgestellt.

Von Thompson, S., Stappenbeck, R. & Turner, G. A. wurde in Clin. Chim. Acta 180, 277-284 (1989) die Verwendung des Fucose spezifischen Lectins aus Lotus tetragonolobus in Immunoassays beschrieben. Dabei wird das Lectin als Fänger eingesetzt. Da in Serumproben eine Vielzahl von Proteinen, besonders bei Personen mit der Blutgruppe 0, fucosyliert sind, ist die Empfindlichkeit für ein bestimmtes Protein infolge der Kompetition mit anderen, individuell stark schwankenden fucosylierten Proteinen erheblich herabgesetzt.

D'Cruz, O. J. & Haas, G. G. Jr. beschreiben in Fertil. Steril. 65, 843-851 (1996) die Verwendung fluoreszenzmarkierter Fucose spezifischer Lectine in der Durchflußzytometrie. Diese Methode ist jedoch in keiner Weise mit einem Immunoassay vergleichbar, da sie nur für Zellen und nicht für Serumproteine verwendbar sowie technisch auch viel aufwendiger als ein Immunoassay ist.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine Nachweis methode für fucosylierte Proteine bereitzustellen, die ausreichend sensitiv, spezifisch und reproduzierbar ist und in der klinischen Praxis ohne Probleme angewendet werden kann. Die Nachweismethode soll leicht handhabbar und auch für Routineuntersuchungen im klinischen Be reich geeignet sein. Es war insbesondere die Aufgabe der Erfindung, eine Nachweismethode für fucosyliertes α-Fetoprotein, einem Tumormarker in der Leberdiagno stik, bereitzustellen.

Die Aufgabe der Erfindung wird wie in den Ansprüchen angegeben gelöst. Der erfindungsgemäße Immunoassay zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe ist dadurch gekennzeichnet, daß a) ein immobilisierter Anti-Fuc-Protein-Antikörper oder ein immobilisiertes Anti-Fuc-Protein-Antikörperfragment mit der biologischen Probe unter Ausbildung eines Fuc- Protein-Antikörperkomplexes inkubiert wird, b) ein Lectin ausgewählt aus der Gruppe Ulex-europaeus- Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus-Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA) zugesetzt wird, das geeignete Markierungen aufweist, um die Menge des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes und daraus die Menge an fucosyliertem Protein in an sich bekannter Weise zu bestimmen oder b) ein unmarkiertes Lectin ausgewählt aus der genannten Gruppe zugesetzt wird und der Nachweis des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes mittels markierter Anti-Lectin-Antikörper gegen die genannten Lectine in an sich bekannter Weise erfolgt. Es hat sich gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Assay und durch den Einsatz der ausgewählten Lectine UEA, LTA und AAA eine weit bessere Empfindlichkeit und Spezifität erreicht wird als mit den in der Literatur beschriebenen Assays, die die Markerlectine ConA, LCA und PHA-E nutzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird im erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassay UEA als Lectin eingesetzt. Als Fängerantikörper an der festen Phase können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper Verwendung finden.

In einer Ausführungsform wird der Sandwich-Immunoassay so durchgeführt, daß dem immobilisierten Anti-Fuc- Protein-Antikörper ein mit einem Akzeptor markiertes Lectin ausgewählt aus UEA, LTA und AAA zugesetzt wird und danach mit einem markierten Rezeptor, der an den Akzeptor des Lectins bindet, inkubiert wird. Der Nachweis wird in diesem Fall über den Marker am Rezeptor geführt. Als Akzeptor zur Markierung des Lectins können Haptene oder niedermolekulare Liganden eingesetzt werden, vorzugsweise kommt Biotin zur Anwendung. Entsprechend finden in einer bevorzugten Ausführungsform markiertes Avidin, Streptavidin oder deren Derivate als Rezeptor Verwendung. Werden als Akzeptor Haptene eingesetzt, so finden als Rezeptor Hapten-spezifische Antikörper Anwendung.

Als Rezeptormarker können erfindungsgemäß Enzyme, Farbstoffe, Radioisotope, Metallkolloide, Chelatoren oder Spinmarker eingesetzt werden. Vorzugsweise wird als Rezeptormarker ein Enzym wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase (POD), alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase, Urease oder Glucoseoxidase eingesetzt und die Menge des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes durch eine Substratreaktion dieses Enzyms nachgewiesen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß POD zur Markierung verwendet und die Substratreaktion mittels eines chromogenen Substrats, z. B. mit H₂O₂-Tetramethylbenzidin, durchgeführt. Es ist erfindungsgemäß jedoch auch möglich und dem Fachmann geläufig, daß die Substratreaktionen für die verschiedensten Enzyme mittels unterschiedlicher chromogener Substrate, Chemolumineszenz oder Fluoreszenz nachgewiesen werden können.

Der erfindungsgemäße Immunoassay wird also in einer be sonders bevorzugten Ausführungsform als Enzymimmuno assay durchgeführt. Alternativ kann der Rezeptor jedoch auch mit einem Radioisotop (z. B. ¹²⁵J), mit einem Fluor eszenzmarker (z. B. FITC), einem Metallkolloid (z. B. Gold), einem Chelator (z. B. DTTA), mit Polynucleotiden oder mit einem Spinmarker (z. B. PROXYL) markiert sein.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, das mit einem Akzeptor markierte Lectin und den Rezeptor als präformierten Komplex dem Antigen-Antikörperkomplex zuzusetzten, so daß bei der Durchführung der genannten Assayvariante ein Verfahrensschritt entfällt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Immunoassay auch als direkter Assay durchgeführt werden. In diesem Fall trägt das erfindungsgemäße Lectin selbst die genannten Marker. Auch hier ist die Durchführung als Enzymimmunoassay bevorzugt.

In einer dritten Variante wird im erfindungsgemäßen Assay unmarkiertes Lectin eingesetzt und der Nachweis über markierte Anti-Lectin-Antikörper geführt. Es können hierbei sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen UEA, LTA oder AAA oder deren Fragmente eingesetzt werden. Auch hier ist die Durchführung als Enzymimmunoassay bevorzugt.

Als biologische Probe ist im Sinne der Erfindung jede Probe einer Körperflüssigkeit von Mensch oder Tier zu verstehen, die fucosylierte Proteine enthalten kann. Beispielsweise kann das Blut, Plasma, Serum, Urin, Gewebeflüssigkeit, Lymphe, Magensaft, Ascites oder Speichel sein. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können fucosylierte Proteine wie z. B. α-Fetoprotein, fucosylierte, gentechnisch erzeugte oder aus biologischem Material gewonnene Pharmaproteine oder Adhäsionsproteine (z. B. CD22) bestimmt werden.

Es hat sich gezeigt, daß der erfindungsgemäße Assay insbesondere zur Differentialdiagnose von Lebererkran kungen geeignet ist und sich durch die Bestimmung der Menge an fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP) im Serum eine zuverlässige Aussage über ein möglicherweise vor handenes hepatocelluläres Carcinom (HCC) treffen läßt, da der Fucose-spezifische AFP-Gehalt bei HCC-Patienten signifikant erhöht ist (vgl. Abb. 1).

Der erfindungsgemäße AFP-Assay enthält in einer besonders bevorzugten Ausführungsform als Fängerantikörper an der festen Phase polyklonale Antikörper oder deren Fragmente aus Maus, Kaninchen oder Huhn. Biotinyliertes UEA wird dem Antigen- Antikörperkomplex zugesetzt und mit einem Avidin-, modifizierten Avidin- oder Streptavidin-POD-Konjugat die Detektion des Fuc-Protein-Antikörperkomplexes durchgeführt.

Die erfindungsgemäße technische Lösung eröffnet also die Möglichkeit, bei Verdacht auf Lebertumor- Erkrankungen den Gesamt-AFP-Gehalt z. B. mittels eines üblichen Enzym-Immunoassays zu bestimmen und parallel dazu den Gehalt an fucosyliertem AFP (z. B. auf einer Mikrotestplatte) festzustellen. Der Aufbau dieser beiden Assays kann beispeilsweise wie nachfolgend dargestellt aussehen:

Assay Gesamt-AFP:

1. Immobilisierter anti-AFP-Antikörper bzw. - Antikörperfragmet der Spezies 1 (z. B. Maus, Kaninchen, Huhn)
2. AFP-Standard-Verdünnung bzw. verdünntes Patientenserum
3. Enzym-markierter anti-AFP-Antikörper bzw. - Antikörperfragment der Spezies 2 (z. B. Maus, Kaninchen, Huhn). Enzym z. B. Meerrettichperoxidase (POD) oder Alkalische Phosphatase (AP)
4. Substratreaktion

Assay fucosyliertes-AFP

1. Immobilisierter anti-AFP-Antikörper bzw. - Antikörperfragmet der Spezies 1 (z. B. Maus, Kaninchen, Huhn)
2. Verdünntes Patientenserum
3. Markiertes Lectin ausgewählt aus UEA, LTA oder AAA (z. B. biotinyliertes UEA)
4. Markierungsspezifisches Enzymkonjugat (z. B. Avidin/Streptavidin-POD-Konjugat bzw. -Komplex)
5. Substratreaktion

Neben dem Bestimmungsverfahren hat die Erfindung auch die zugehörigen Reagentiensätze, wie sie in den Ansprüchen ausgewiesen sind, zum Gegenstand.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 a) Herstellung von Anti-human-AFP-IgG-F(ab)₂-Fragmenten aa) Antiserum-Gewinnung

Kaninchen werden mit hochreinem humanen AFP aus Nabelschnurblut immunisiert. Aus dem Blut der immunisierten Tiere wird nach Koagulation das Antiserum durch Zentrifugation abgetrennt.

ab) Isolierung der Gesamt-IgG-Fraktion

Das Serum wird auf eine AFP-Sepharose gegeben. Ungebundene Serumprotein werden mit TRIS-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (TBS) ausgewaschen. Anließend wird das Anti-AFP-IgG mit einem 0,2 M Glycin- HCl Puffer pH 2,5 eluiert, mit 1 M Tris-HCl pH 7,5 neutralisieret, mit Centricon-30-kD-Kartuschen konzentriert und gegen 50 mM Acetat-Puffer pH 4,0; 0,5 M NaCl, 0,02% NaN₃ umgepuffert.

ac) Antikörperfragmentierung mittels Pepsin

Es wird ein Enzym-IgG-Verhältnis von E : P = 1 : 50 eingestellt und 4 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird mit 1 M Tris-HCl pH 7,5 beendet. Anschließend werden die Anti-AFP-F(ab)2-Fragmente durch Immunaffinitätschromatographie an einer AFP-Säule wie unter ab) beschrieben isoliert, konzentriert, gegen TBS dialysiert und bei 4°C gelagert.

b) Immunoassay zur Gesamt-AFP-Bestimmung

Die Vertiefungen einer Mikrotestplatte sind mit anti human-AFP-IgG (F(ab)2-Fragment, Kaninchen) durch Ad sorption aus einer Lösung von 10 µg F(ab)2/ml in Bicar bonatpuffer pH 8,5-9,5 belegt. Eine unspezifische Pro teinadsorption ist durch Blockierung der Plastoberflä che mit einer Inertprotein-Lösung (z. B. Rinderserumal bumin in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalz lösung (PBS)) reduziert. In die so beschichteten Ver tiefungen wird entweder eine Standard-Verdünnungsreihe von humanem AFP (Konzentrationsbereich 2 bis 300 ng/ml) bzw. eine zentrifugierte, 1 : 5 bis 1 : 10 verdünnte Probe Patientenserum gegeben. Ungebundenes Material wird aus gewaschen, dann wird mit einer geeigneten Verdünnung antihuman-AFP-IgG-POD-Konjugat inkubiert. Ungebundenes Material wird ausgewaschen, dann wird die Substratreak tion mit H₂O₂-Tetramethylbenzidin gestartet und nach einer definierten Zeit mit Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wird bei 450 nm gemessen. Der Gehalt an AFP im Patientenserum wird anhand der Standard-Verdünnungs reihe ermittelt.

Beispiel 2 Erfindungsgemäßer Immunoassay zur Fuc-AFP-Bestimmung

Die Vertiefungen einer Mikrotestplatte sind mit anti human-AFP-IgG (F(ab)2-Fragment, Kaninchen), wie in Beispiel 1a hergestellt, durch Adsorption aus einer Lö sung von 10 µg F(ab)2/ml in Bicarbonatpuffer pH 8,5-9,5 belegt. Eine unspezifische Proteinadsorption ist durch Blockierung der Plastoberfläche mit einer Inertprotein- Lösung (z. B. Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS)) reduziert. In die so beschichteten Vertiefungen wird eine zentrifugierte, 1 : 5 bis 1 : 10 verdünnte Probe Patientenserum gegeben. Ungebundenes Material wird ausgewaschen, dann wird mit einer geeigneten Verdünnung biotinyliertes Ulex-euro paeus-Lectin (bio-UEA) inkubiert. Ungebundenes Material wird ausgewaschen, dann wird mit einer geeigneten Ver dünnung Acylavidin-biotinylierte POD-Komplex (AbP) in kubiert. Ungebundenes Material wird ausgewaschen, dann wird die Substratreaktion mit H₂O₂-Tetramethylbenzidin gestartet und nach einer definierten Zeit mit Schwefel säure gestoppt. Die Absorption wird bei 450 nm gemes sen.

Beispiel 3

Es werden die Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 für ver schiedene Probanden dargestellt (Abb. 2). Es wird deut lich, daß der Gesamt-AFP-Gehalt nicht mit dem Gehalt an UEA-reaktivem AFP korreliert, so daß erst mit dem er findungsgemäßen Test wirklich festgestellt werden kann, ob bei erhöhten AFP-Werten tatsächlich auch eine erhöhte Menge an fucolysiertem AFP vorliegt.

Es zeigen:

Abb. 1: Gehalt an fucosyliertem AFP in Patienten- Serumproben
control - gesunde Probanden, SLE - systemi scher Lupus erythromateus, AIH - autoimmune Hepatitis, PBC - polynucleare billäre Cir rhose, HCC - hepatocelluläres Carcinom,

Abb. 2: Vergleich des Gehalts an Gesamt- und fucosy liertem AFP in verschiedenen HCC-Patienten- Seren.

Claims

1. Immunoassay zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein (Fuc-Protein) in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein immobilisierter Anti-Fuc-Protein-Antikörper oder ein immobilisiertes Anti-Fuc-Protein- Antikörperfragment mit der biologischen Probe unter Ausbildung eines Fuc-Protein-Antikörperkomplexes inkubiert wird und
b) ein Lectin ausgewählt aus der Gruppe Ulex- europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus- Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA) zugesetzt wird, das geeignete Markierungen aufweist, um die Menge des Fuc-Protein- Antikörperkomplexes und daraus die Menge an fucosyliertem Protein in an sich bekannter Weise zu bestimmen oder
c) ein unmarkiertes Lectin ausgewählt aus Gruppe Ulex-europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolo bus-Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Aggluti nin (AAA) zugesetzt wird und der Nachweis des Fuc- Protein-Antikörperkomplexes mittels markierter Anti-Lectin-Antikörper oder deren Fragmente gegen die genannten Lectine in an sich bekannter Weise erfolgt.

2. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß b) ein mit einem Akzeptor markiertes Lectin gemäß Anspruch 1 zugesetzt wird, mit einem markierten Rezeptor, der an den Akzeptor des Lectins bindet, inkubiert wird und in üblicher Weise mittels des Markers am Rezeptor die Menge des Fuc-Protein- Antikörperkomplexes und daraus die Menge an fucosyliertem Protein bestimmt wird.

3. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an fucosyliertem Protein direkt bestimmt wird durch b) Zusatz eines derart markierten Lectins, daß die Bestimmung der Menge des Fuc- Protein-Antikörperkomplexes mittels des Markers am Lectin erfolgen kann.

4. Immunoassay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP) bestimmt wird.

5. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Lectin eingesetzt wird, das mit einem Hapten oder einem niedermolekularen Liganden als Akzeptor markiert ist.

6. Immunoassay nach den Ansprüchen 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lectin mit Biotin als Akzeptor markiert ist und als Rezeptor Avidin, Streptavidin oder deren Derivate eingesetzt werden.

7. Immunoassay nach den Ansprüchen 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lectin mit einem Hapten markiert ist und als Rezeptor ein Hapten-spezifischer Antikörper einge setzt wird.

8. Immunoassay nach den Ansprüchen 2 und 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezeptormarker ein Enzym, ein Farbstoff, ein Radioisotop, ein Metallkolloid, ein Chelator, ein Nucleotid oder ein Spinmarker eingesetzt wird.

9. Immunoassay nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Lectinmarker ein Enzym, ein Farbstoff, ein Radioisotop, ein Metallkolloid, ein Chelator, ein Nucleotid oder ein Spinmarker eingesetzt wird.

10. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Marker der Anti-Lectin-Antikörper ein Enzym, ein Farbstoff, ein Radioisotop, ein Metallkolloid, ein Chelator, ein Nucleotid oder ein Spinmarker eingesetzt wird.

11. Testkit zur Bestimmung der Menge an fucosyliertem Protein (Fuc-Protein) in einer biologischen Probe enthaltend markiertes oder unmarkiertes Lectin aus gewählt aus der Gruppe Ulex-europaeus-Agglutinin (UEA), Lotus-tetragonolobus-Agglutinin (LTA) und Anguilla-anguilla-Agglutinin (AAA)

12. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er einen anti-Fuc-Protein-Antikörper oder ein Anti- Fuc-Protein-Antikörperfragment beinhaltet.

13. Testkit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß er ein mit einem Akzeptor markiertes Lectin und einen markierten Rezeptor, der an den Akzeptor des Lectins bindet, beinhaltet, die gegebenenfalls auch bereits als präformierter Komplex vorliegen können.

14. Testkit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er als mit einem Akzeptor markiertes Lectin biotinyliertes UEA beinhaltet.

15. Testkit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß er unmarkiertes Lectin und markierte Anti-Lectin- Antikörper gegen dieses Lectin beinhaltet.

16. Testkit nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Be stimmung der Menge an fucosyliertem α-Fetoprotein (AFP).