CN102175879A - 一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法 - Google Patents

一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法 Download PDF

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CN102175879A CN2011100214473A CN201110021447A CN102175879A CN 102175879 A CN102175879 A CN 102175879A CN 2011100214473 A CN2011100214473 A CN 2011100214473A CN 201110021447 A CN201110021447 A CN 201110021447A CN 102175879 A CN102175879 A CN 102175879A
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Abstract

本发明提供一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，以快速、简便、准确检测肝肿瘤的替代生物标志物的表达信息。该方法主要步骤有：1)制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；2)分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用G-25柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；3)将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息。本发明检测过程灵敏度高、检测结论准确，具有安全、无损伤、标本收集简便、容易保存等优点。

Description

一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法
技术领域
本发明涉及一种检测肿瘤的替代生物标志物的方法，具体涉及在唾液、血清和/或尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法。
背景技术
目前，在临床上缺乏灵敏、特异的早期肝癌诊断标志物，能检测出的早期肝癌病例大约占所有肝癌病例的25％。尽管已经发现了很多可以作为肝癌诊断标志物的生物大分子，但是这些标志物检测的结果仍旧停留在对晚期肝癌的诊断。甲胎蛋白(AFP)是目前肝癌诊断的特异性指标，但AFP测定存在假阳性和假阴性的问题。约20％的晚期肝癌病人，直至病故前，AFP测定仍为阴性。而在肝癌治疗方面也未找到特异、有效的分子靶点。因此，寻找和发现新的肝癌标志物和治疗靶点用于肝癌早期诊断和治疗显得尤为重要。
目前对于原发性肝癌经过抽血化验，有4项指标可提供有价值的诊断。血清学检测结合影像学检查使肝癌在亚临床期(还没有出现症状)即可做出诊断，从而明显提高了肝癌的远期疗效。目前医院常用诊断肝癌血清指标有以下几种：甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(AP)、γ-谷氨酰转移酶同工酶II(GGT2)及血清岩藻糖苷酶(AFU)。
甲胎蛋白(AFP)甲胎蛋白是1956年在胎儿血清中发现的一种胚胎专一性甲种球蛋白，1964年有人在肝癌患者血清中测得它。参考值：＜20μg/L。临床意义：正常情况下，这种存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后即迅速消失，如重现于成人血清中，则提示有肝癌的可能。另外，在生殖腺胚胎瘤和少数转移性肿瘤如胃癌，以及在孕妇、肝炎、肝硬化患者血清中甲胎蛋白可呈假阳性，但升高不如肝癌明显。甲胎蛋白现已广泛用于肝细胞癌的普查、诊断、判断治疗效果、预测复发。普查中阳性可早于症状出现8～11个月。甲胎蛋白对肝细胞癌的临床价值可以归纳为：①是一种仅次于病理检查的诊断方法；②为目前最好的早期诊断方法之一，可在临床症状出现前8～11个月做出诊断；③为反映病情变化和治疗效果的敏感指标；④有助于检出亚临床期、复发性与转移性肝癌。
异常凝血酶原(AP)异常凝血酶原也称γ-羧基凝血酶原。参考值：＜250微克/升。临床意义：肝癌患者血清异常凝血酶原阳性率为69.4％。多数资料表明，异常凝血酶原对原发性肝癌有较高的特异性，而良性肝病、转移性肝癌仅少数呈阳性，因此对亚临床肝癌有早期诊断价值。
γ-谷氨酰转移酶同工酶II(GGT2)γ-谷氨酰转肽酶同工酶II对原发性和转移性肝癌诊断的阳性率可达90％，特异性达97.1％，非癌性肝病和肝外疾病患者的阳性率小于5％。γ-谷氨酰转肽酶同工酶II与甲胎蛋白浓度无关，在甲胎蛋白低浓度和假阴性肝癌患者中，γ-谷氨酰转肽酶同工酶II的阳性率也较高。
血清岩藻糖苷酶(AFU)参考值：3.5～10.3单位/升(U/L)。国内报道，血清岩藻糖苷酶诊断原发性肝癌的阳性率为70％～80％，该指标阳性与甲胎蛋白浓度及肿瘤大小无关。血清岩藻糖苷酶对甲胎蛋白阴性肝癌和小肝癌患者的阳性率分别为76.1％和70.8％。对转移性肝癌和肝良性肿瘤均为阴性，但肝硬化、慢性肝炎患者出现假阳性率较高。
甲胎蛋白、γ-谷氨酰转肽酶同工酶II、异常凝血酶原对肝癌有肯定的诊断价值，在普查中也有早期诊断意义。γ-谷氨酰转肽酶同工酶II和异常凝血酶原若与甲胎蛋白联合检测，则可大大提高诊断准确率。血清岩藻糖苷酶对肝癌有一定的诊断价值，但特异性不高，若与甲胎蛋白联合检测，可用做甲胎蛋白阴性肝癌患者的辅助诊断。
目前发现人的唾液中有1166种蛋白质。其中大部分蛋白质能同时在血浆和泪液中找到。从这些蛋白质中可以找到与心血管疾病、癌症、肾脏病等疾病相关的生物标志物，从而为今后的临床诊断提供一种非侵袭性新方式。如在不久前发表于《蛋白组学研究杂志》[J Proteome Res 2009，8(1)：239]的一项研究证实，唾液蛋白质与2型糖尿病相关。通过对2型糖尿病患者和对照者的唾液蛋白组学分析，发现了唾液中487种与2型糖尿病有关的蛋白。其中33％的蛋白以前从未被报告出现在人类唾液中。在这些蛋白中，有65种蛋白的水平在患者和对照者唾液中能相差2倍之多。进一步分析显示，一些蛋白水平在2型糖尿病患者的唾液中显著升高，在糖尿病前期患者中也有相应升高趋势，因此，可能作为未来无创诊断2型糖尿病和发现糖尿病前期患者的生物标志物。
科学家们通过一项动物研究，试图挖掘唾液中蛋白随肿瘤改变的机制。在癌症模型小鼠中肿瘤与唾液中蛋白水平改变相关，推测肿瘤和内分泌器官一样，可以分泌激素、淋巴因子和细胞因子，通过血液运输到远端器官，对其产生影响。一旦这些因子到达唾液腺，则唾液中的基因转录谱会发生改变，导致某些蛋白的丰度或种类改变。这些丰度或种类改变的蛋白将可能成为唾液中检测肿瘤的替代生物标志物。研究者在黑色素瘤和非小细胞肺癌的模型小鼠以及对照小鼠中比较了唾液中转录因子水平的差异。结果发现，肿瘤小鼠与正常小鼠相比，其唾液中转录组学改变显著。进一步分析显示，转录组学某些改变在肿瘤组织、血液、唾液腺和唾液中均存在。
目前，相关的替代生物标志物的检测仍处于试验研究，检测灵敏度、结论准确性不高，检测方法需要高度专业、复杂的检测操作才能够实现；因此，亟需一种能够快速、简便、准确检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法。
发明内容
本发明提供一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，以快速、简便、准确检测肝肿瘤的替代生物标志物的表达信息。
本发明的技术方案如下：
一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，包括以下步骤：
1)制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片
1.1)取环氧化片基备用；
1.2)对应于唾液样本，选取以下12种凝集素WFA、AAL、RCA120、PHA-E、LTL、LCA、SNA、MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA中的至少四种配制成浓度为0.1-10mg/ml的点样液；
对应于血清样本，选取以下9种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、SJA、PTL-II、ECA、PWM和GNA中的至少四种配制成浓度为0.1-10mg/ml的点样液；
对应于尿液样本，选取以下7种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、RCA120、DSA和WGA中的至少四种配制成浓度为0.1-10mg/ml的点样液；
1.3)将配制得到的点样液加到384孔板内；再用点样仪器在环氧化片基上点样得到芯片；
1.4)将点制好的芯片在湿度为55％-65％的环境中孵育2.5-3.5小时；
1.5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
1.6)将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以备用，作为分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；
2)分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用G-25柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；
3)将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息；对于任一待检测样本，具体操作步骤如下
3.1)将1-2％牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中；
3.2)将封闭后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤3.1)中未完全固定于芯片上的凝集素，再经甩干后备用；
3.3)对经步骤3.2)甩干后的凝集素芯片加入3-5μg待检测样本和500-800μL的孵育缓冲液，室温孵育；
3.4)将孵育后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤3.3)中未完全结合于凝集素芯片上的待检测样本的蛋白，再经甩干后备用；
3.5)对经步骤3.4)甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白糖链结合的荧光图像；
3.6)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出所述替代生物标志物的表达信息。
上述步骤3.1)、3.2)和3.4)中的磷酸盐缓冲液pH7.4，含有NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L；磷酸盐缓冲液-吐温20：10mmol/L磷酸盐缓冲液中含质量分数0.05-0.5％吐温20。
上述步骤3.3)中的孵育缓冲液：磷酸盐缓冲液-吐温20中含质量分数1％牛血清白蛋白和质量分数10-20％羟胺。
上述荧光试剂采用Cy3或Cy5。
上述点样仪器采用晶芯48点样系统为佳。
上述步骤3.3)的较佳取值是对甩干后的凝集素芯片加入4μg待检测样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育2小时。
本发明具有以下优点：唾液、血清、尿液分析检查有非侵袭性、简单、快速等优点，而且具有安全、无损伤、标本收集简便、容易保存等优点，检测过程灵敏度高、检测结论准确。
附图说明
图1为本发明实施例中唾液样本检测结果。
具体实施方式
凝集素是一类具有糖链专一性、可促使细胞凝集的蛋白质，它具有与糖链专一性、非共价、可逆结合的能力。凝集素芯片是将各种不同来源的凝集素固定于醛基化、环氧化或经其它方式修饰后的玻璃片基上，再与标记后的糖蛋白、菌体、细胞等待检测样品反应，经后续处理后，以检测待检测样品的糖链结构。凝集素芯片能简便、快速、高通量的检测分析蛋白质的糖基化修饰，在短时间内给出待检测样品的糖结构指纹图谱。
本发明通过下面的大量实验研究发现：
(1)应用CCl4成功诱导小鼠肝纤维化模型研究发现：凝集素MAL-II，LTL，SBA，PSA和WGA识别的唾液酸(sialic acid)α-2，3连接，岩藻糖(Fucose)α-1，3乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)，Fucoseα-1，6GlcNAc，多价唾液酸(multivalent Sia)和唾液酸化的路易斯寡糖-抗原(sialyl-Lewisx antigen)糖链结构高表达，而STL识别的GlcNAc末端糖链结构则低表达。
(2)通过转化生长因子-β(TGF-β)诱导的发生纤维化肝星状细胞系LX-2的研究发现：凝集素LTL，AAL识别的α-1，3/1，4岩藻糖分支结构，凝集素DBA，PNA，VVA，MPL识别的Tn/T抗原，SNA识别的唾液酸α-2，6结构，PHA-E识别的平分型N乙酰葡糖胺和双天线N-连糖链结构，SJA，BPL，GSL-I识别的末端N乙酰半乳糖胺及α半乳糖结构在纤维化的肝星状细胞系LX-2中高表达；而MAL-II识别的唾液酸α-2，3结构，PSA识别的α-1，6核心岩藻糖结构，HHL，GNA，NPA识别的Non-substituted α1-6Man结构，PWM，WGA识别的聚LacNAc和(GlcNAc)n结构在纤维化肝星状细胞系LX-2中低表达。
(3)通过对肝癌细胞系(SMMC-7721和Hep G2)与正常肝细胞系(QZG)的对比研究发现：肝癌细胞中凝集素MAL-II，PNA，AAL，LTL，LEL，STL识别的Siaα-2，3连接，Tn抗原，岩藻糖，Fucoseα-1，3连接，聚N-乙酰乳糖胺(poly-LacNAc)和(GlcNAc)n糖链结构高表达，而PTL-I，RCA120，GSL-I，UEA-I识别的α-乙酰半乳糖胺(GalNA)c和α-半乳糖(Galactose)，Galβ-1，4Glc(NAc)，α-1，2岩藻糖分支糖链结构低表达。
(4)通过对60份肝癌病人血清和60份健康人血清的比较研究发现：凝集素HHL，AAL，GSL-I和PSA识别的甘露糖(mannose)α-1，3(-6)连接，岩藻糖，末端乙酰半乳糖胺(GalNAc)和Tn抗原糖链结构在肝癌病人血清中高表达，而SJA，PTL-II识别αGalNAc和αGalactose以及半乳糖苷(galactosides)β型的糖链结构低表达。
(5)通过对2对肝癌病人肝癌组织样本和癌旁正常组织的比较研究发现：凝集素PHA-E+L，PHA-E识别的平分型N-乙酰葡糖胺，分支N-糖链结构，MAL-I，MAL-II识别的唾液酸α-2，3结构，GNA，NPA识别的是Non-substitutedα1-6Man结构，SBA，VVA，DBA，Jacalin识别的T/Tn抗原，AAL，LTL识别的岩藻糖α-1，3/1，4连接，SNA识别的唾液酸α-2，6结构，LCA，PSA识别的α-1，6核心岩藻糖结构在肝癌组织中高表达；而WFA识别的末端N乙酰半乳糖胺，DSA，STL，EEL识别的Poly-LacNAc，分支LacNAc和(GlcNAc)n结构在肝癌组织中低表达。
(6)通过对2对肝癌病人唾液和同龄同性别健康人唾液的研究发现：凝集素WFA，AAL，RCA120，PHA-E，LTL，LCA，SNA识别的末端GalNAc，岩藻糖，Galβ-1，4Glc(NAc)，平分型乙酰葡萄糖胺(bisecting GlcNAc)和双天线型N-糖链(biantennary N-glycans)，岩藻糖α-1，3，核心岩藻糖α-1，6和Siaα-2，6糖链结构在肝癌病人唾液中高表达，而MAL-II，BS-I，PTL-II，SBA，GNA识别的Siaα-2，3连接，α-GalNAc和αGal，Manα-1，3连接的糖链结构低表达。
(7)通过对11份肝癌病人尿液和33份健康人尿液的研究发现：通过对11份肝癌病人尿液和33份健康人尿液的研究发现：凝集素HHL，AAL，GSL-I和PSA识别的Manα-1，3(-6)连接，岩藻糖，αGalNAc和α-Gal，Tn抗原以及Fucoseα-1，6GlcNAc糖链结构在肝癌病人尿液中高表达，而RCA120，DSA和WGA识别的Galβ-1，4Glc(NAc)，β-1，4GlcNAc和乙酰乳糖胺(LacNAc)以及多价唾液酸(multivalent Sia)糖链结构低表达。
以唾液样本为例，本发明具体检测步骤如下：
1)制备凝集素芯片
1.1)取环氧化片基备用；
1.2)将12种凝集素(WFA、AAL、RCA120、PHA-E、LTL、LCA、SNA、MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA)配制成浓度为1mg/ml的点样液；
1.3)将配制的点样液加到384孔板内；再用晶芯48点样系统在环氧化片基上点样；
1.4)将点制好的芯片在湿度为60％的环境中孵育3小时；
1.5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
1.6)将固定好的凝集素芯片放置在4℃干燥器中以备用。
2)唾液样本原液的采集和处理；于收集前2h禁饮食。0.9％生理盐水漱口，静坐低头，舌尖顶住上颚，用无菌离心管收集自然分泌全唾液。每份唾液样本采集1ml。运输时密封离心管口，0℃冰袋冷藏，时间不超过30min。于4℃10000g低温离心1h，取上清。用0.45μm的滤膜进行过滤，加入蛋白酶抑制剂。BCA法或Bradford法进行蛋白定量。分装后保存于-80℃冰箱中；
然后用荧光试剂Cy3对一份处理好的唾液样本进行标记，用G-25柱去除多余荧光；分装冻存于-20℃以下的环境中。
3)将标记样本加载到凝集素芯片上以获得样本中糖蛋白糖链谱
3.1)将2％牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液1小时；
3.2)将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再经甩干后备用；
3.3)对甩干后的凝集素芯片加入4μg标记好的样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时；
3.4)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再甩干；
3.5)对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白结合的荧光图像；参见图1。
3.6)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中4种以上的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出受检者肝肿瘤的替代生物标志物的表达信息。唾液样本中糖链结构分析结果如下表一所示，通过这些糖链分析显示此受检者肝肿瘤呈阳性。
表一
  凝集素   特异识别的糖链结构   表达信息
  WFA   Terminal GalNAc   ++
  AAL   Fucose   +++
  RCA120   Galβ-1，4Glc(NAc)   +++
  PHA-E Bisecting GlcNAc and biantennary N-glycans   +
  LTL   Fucoseα-1，3GlcNAc   +++
  LCA   Fucoseα-1，6GlcNAc   +
  SNA   Siaα-2，6Gal   +
  MAL-II   α-2，3Sia   --
  BS-I   α-Gal and α-GalNAc   --
  PTL-II   β-galactosides   --
  SBA   Terminal GalNAc(especially GalNAcα1-3Gal)   --
  GNA   Terminalα-1，3mannose   --
+：糖链结构在样本中高表达；-：糖链结构在样本中低表达。
对于血清样本的检测，其步骤与前述唾液样本检测步骤相同，其中血清样本原液的采集处理具体是：抽取一定量的血液，室温或4℃静置半小时，3000rpm离心5分钟，分离血清。血清分离后分装，于-80℃保存。血清使用前12000g，4℃离心15min，吸取中间层用于实验。
表二给出了血清样本中糖蛋白糖链谱。根据下表中凝集素对应的糖链谱结果可以判断出此受检者肝肿瘤呈阳性。
表二
  凝集素   特异识别的糖链结构   表达信息
  HHL   non-substitutedα-1，6Man   ++
  AAL   Fucose   +++
  GSL-I   αGalNAc，GalNAcα-Ser/Thr(Tn)and αGal   +++
  PSA   Fucoseα-1，6GlcNAc   +
  SJA   terminal in GalNAc and Gal   --
  PTL-II   β-Gal ---
  ECA   Galβ-1，4Glc(NAc) --
  PWM   poly-LacNAc and(GlcNAc)n --
  GNA   terminalα-1，3mannose -
+：糖链结构在样本中高表达；-：糖链结构在样本中低表达。
对于尿液样本的检测，其步骤与前述唾液样本检测步骤相同，其中尿液样本原液的采集处理具体是：收集晨尿50mL(最好中间段)，快速存放于4℃冰箱。4℃，14000g离心60min除去杂质，收集上清。先后用滤纸(抽滤)和0.2μm滤膜各过滤一次，进一步去除杂质。用分子筛(3KD截流柱)去除色素、小分子等物质，溶液由黄色变为澄清或微黄。用丙酮沉淀方法浓缩，-20℃保存。
表三给出了尿液样本中糖蛋白糖链谱。根据下表中凝集素对应的糖链谱结果可以判断出此受检者肝肿瘤呈阳性。
表三
  凝集素   特异识别的糖链结构   表达信息
  HHL   Non-substitutedα-1，6Man   ++
  AAL   Fucose   +++
  GSL-I   αGalNAc，GalNAcα-Ser/Thr(Tn)andαGal   +++
  PSA   Fucoseα-1，6GlcNAc   +
  RCA120   Galβ-1，4Glc(NAc)   --
  DSA   β1-4GlcNAc and LacNAc   --
  WGA   multivalent Sia   -
+：糖链结构在样本中高表达；-：糖链结构在样本中低表达。

Claims (6)

1.一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，包括以下步骤：
1)制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片
1.1)取环氧化片基备用；
1.2)对应于唾液样本，选取以下12种凝集素WFA、AAL、RCA120、PHA-E、LTL、LCA、SNA、MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA中的至少四种配制成浓度为0.1-10mg/ml的点样液；
对应于血清样本，选取以下9种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、SJA、PTL-II、ECA、PWM和GNA中的至少四种配制成浓度为0.1-10mg/ml的点样液；
对应于尿液样本，选取以下7种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、RCA120、DSA和WGA中的至少四种配制成浓度为0.1-10mg/ml的点样液；
1.3)将配制得到的点样液加到384孔板内；再用点样仪器在环氧化片基上点样得到芯片；
1.4)将点制好的芯片在湿度为55％-65％的环境中孵育2.5-3.5小时；
1.5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
1.6)将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以备用，作为分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；
2)分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用G-25柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；
3)将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息；对于任一待检测样本，具体操作步骤如下
3.1)将1-2％牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中；
3.2)将封闭后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤3.1)中未完全固定于芯片上的凝集素，再经甩干后备用；
3.3)对经步骤3.2)甩干后的凝集素芯片加入3-5μg待检测样本和500-800μL的孵育缓冲液，室温孵育；
3.4)将孵育后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤3.3)中未完全结合于凝集素芯片上的待检测样本的蛋白，再经甩干后备用；
3.5)对经步骤3.4)甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白糖链结合的荧光图像；
3.6)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出所述替代生物标志物的表达信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3.1)、3.2)和3.4)中的磷酸盐缓冲液pH7.4，含有NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L；磷酸盐缓冲液-吐温20：10mmol/L磷酸盐缓冲液中含质量分数0.05-0.5％吐温20。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3.3)中的孵育缓冲液：磷酸盐缓冲液-吐温20中含质量分数1％牛血清白蛋白和质量分数10-20％羟胺。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述荧光试剂采用Cy3或Cy5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1.3)所述点样仪器采用晶芯48点样系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3.3)是对甩干后的凝集素芯片加入4μg待检测样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育2小时。
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