CN103884834A - 一种用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的检测工具 - Google Patents
一种用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的检测工具 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种能够筛查禽流感和人流感病毒易感人群的专用检测工具。该检测工具是一种针对唾液样本的凝集素测试芯片，采用环氧化片基，在环氧化片基上仅点样固定有MAL-Ⅱ和SNA两种凝集素。相应的凝集素芯片试剂盒包括该凝集素测试芯片、封闭液、清洗液和孵育缓冲液。本发明还对所述凝集素测试芯片的制备及处理方法进行了优化，从而建立起用于检测唾液样本中唾液糖蛋白糖链末端唾液酸α2-3和α2-6糖链结构的最佳反应体系。本发明的产品制作成本较低，测试针对性强，结合凝集素芯片的固有优势，能够快速、简便、高效、无损伤地检测得到禽流感和人流感病毒易感人群评估结果的信息。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛查禽流感和人流感病毒易感人群的方法以及专用的检测工具。
背景技术
凝集素是非免疫来源的、不具有酶活性的一类糖结合蛋白，能专一地识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖链序列而与之结合。截至目前已经从自然界中发现100多种植物源的凝集素。凝集素有各种应用：如恶性肿瘤等疾病的诊断、设计抗菌抗病毒药物、设计“生物导弹”、以及进行糖链结构的识别和分析等。随着将芯片技术引入糖组学研究领域，凝集素作为解码糖链结构的重要工具越来越引人瞩目。凝集素芯片根据凝集素和糖链之间的特异性相互识别作用，将各种不同来源的凝集素固定于环氧化、醛基化或经其他方式修饰的片基上，再与标记后的糖蛋白、细胞和菌体等待检测样本孵育反应，经一系列后续处理后，才能得到待检测样本中的糖链结构和其识别的凝集素。
流感病毒在自然界中的宿主分布非常广泛，具有复杂的基因结构，且其基因发生重配和突变的概率很高，因此在全球范围内呈周期性流行。迄今，在人类历史上一共爆发了四次大规模的流感流行，包括西班牙大流感(1918年)、亚洲大流感(1957年)、香港大流感(1968年)以及新甲型H1N1流感(21世纪初)，其中在西班牙流感大流行中，死亡人数高达2000-4000万。流感具有发病率及病死率高、传播速度快、波及范围广等特点，一旦爆发起来，将会对人类造成严重的灾难。近年来，H5、H7和H9亚型流感病毒以及2009年出现的甲型H1N1流感病毒都引起了较大的疫情，H5N1和H7N9型的一些毒株能直接感染人类，高感染率和低致病力的H9亚型同样也能由禽类直接传染给人，虽然这几个亚型的病毒还没有引起人类流感大流行，但它们潜在的危害是巨大的。流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)分子与流感病毒宿主细胞表面唾液酸(SA)α2-3半乳糖(Gal)或SAα2-6Gal糖链末端受体的结合，是流感病毒侵染机体的开始。不同流感病毒宿主细胞表面上的糖链受体结构是不同的，禽流感病毒HA主要识别和结合末端为SAα2-3Gal的糖链受体，而人流感病毒HA主要识别和结合末端为SAα2-6Gal的糖链受体。
新的研究报道指出人呼吸道上皮细胞上均有SAα2-6Gal和SAα2-3Gal糖链受体的分布，但以SAα2-6Gal糖链受体的分布为主；另外，SAα2-6Gal在人气管和支气管中呈高密度分布，且随着支气管分级的降低而逐渐减少，至肺泡分布最少；而SAα2-3Gal在气管、支气管以及细支气管中仅呈少量分布，其分布以呼吸细支气管和肺泡为主。人呼吸道上少量SAα2-3Gal的存在是部分H5N1亚型禽流感病毒直接感染人类的最有力证据。
人体唾液由腮腺、下颌下腺、舌下腺和其他一些小腺体分泌，包含核酸、蛋白质、脂类、矿物质和其他小分子物质。另外，唾液中还存在抑制和消灭细菌和病毒的物质。唾液含量和组成上的变化，不管是由口腔局部病变还是机体整体状况引起的，都可能会造成唾液功能缺陷。研究发现，唾液中除了含有一些唾液基本组成性蛋白质（在不同性别和不同年龄段都几乎无差别表达的蛋白质或糖蛋白）外，还含有一些可能反应人体身体健康和生理状况的一些蛋白质，这些蛋白质往往在不同年龄、性别、病理和生理状况的人群中出现差异性表达。
血液中有的蛋白质成分也存在于唾液中，唾液能反映出血液中部分蛋白质水平的变化。通过对唾液和血浆与人类全蛋白质组的GO（gene ontology）注释比较，发现唾液和血浆蛋白质组中细胞外基质组分较多，而细胞内液组分较少，提示唾液和血浆蛋白质组具有分泌蛋白质组的特征；在生物学过程和分子功能方面的分析结果提示，唾液蛋白质组和血浆蛋白质组具有相似性。因此，就有可能通过唾液的检测来进行疾病的诊断。
不过，唾液和血浆的蛋白质组比较结果显示，有些蛋白质只在唾液蛋白质组中出现，而没有出现在血浆蛋白质组中，表明两者并不能够等同。
唾液作为人体抵御呼吸道病毒感染的第一道天然屏障，其中的糖蛋白发挥着重要的作用，如唾液中的α-2巨球蛋白，粘蛋白5B和唾液糖蛋白340等可通过其上（α2-3/α2-6）连接末端唾液酸糖链结构与流感病毒HA结合以中和并抑制流感病毒的感染。
我们应用高覆盖率凝集素芯片对三个年龄段健康志愿者的唾液进行了分析，发现了一些与年龄和性别相关的唾液糖蛋白糖链，其中：（1）儿童男性唾液中的糖蛋白糖链结构较女性更为丰富；（2）成年男性与女性之间唾液糖蛋白糖链表达差异最为显著；（3）老年男性与女性之间唾液糖蛋白糖链表达差异不显著。并发现唾液中Siaα2-3Galβ1-4Glc(NAc)和α-1,3连接Man结构随着年龄的增长而表达增加；Fucα1-2Galβ1-4Glc(NAc)结构随着女性年龄的增长表达减少，但在男性唾液中Fucα1-2Galβ1-4Glc(NAc)结构随着年龄增长呈反抛物线型表达。
通过对不同年龄段不同性别健康志愿者的唾液蛋白质及其上糖链的比较研究发现，随着年龄的增长，健康人唾液中的蛋白质含量无明显改变，而其上的糖链结构和数量却发生了显著的变化，如唾液蛋白质上的唾液酸糖链表达明显增多，而其蛋白质表达并无显著改变。同时发现健康老年人唾液通过提供更多的α2-3和α2-6连接末端唾液酸糖链结构与流感病毒血凝素结合，中和并抑制了流感病毒对人体上呼吸道细胞表面特异受体的相互识别。从而推测这一分子机制可以部分解释健康老年人具有更强抵抗流感的能力这一事实。
然而，为何流感暴发时，被传染的人反而多为老年人？目前对其根本原因尚未见明确的解释。根据各类人群流感病毒易感性的临床观察统计，2型糖尿病、高血压和心脏病、癌症、慢性肺部、关节炎和孕妇等较易感染流感病毒（尚未区分禽流感或是人流感）；对于这类情况的老年人，通常解释是慢性病损害了老年人的免疫系统，降低了老年人的免疫抵抗力，除此常识性的因素外，是否还有其它的生理或病理因素的影响，使得这部分老年人易感染流感病毒？其他易感人群又作何解释？因此，为了能够有效指导临床诊断和提高社会公众对自身患病风险的认知，亟需一种检测（筛查）方法和工具以及时获得个体禽流感和人流感病毒易感特质的评估信息。
发明内容
本发明提出一种能够筛查禽流感和人流感病毒易感人群的方法以及专用的检测工具。该检测工具针对唾液样本，制作成本较低，测试针对性强，结合凝集素芯片的固有优势，能够快速、简便、高效地检测得到禽流感和人流感病毒易感人群评估结果的信息。
本发明的方案如下：
该针对唾液样本的凝集素测试芯片，采用环氧化片基，其特殊之处在于：在环氧化片基上仅点样固定有MAL-Ⅱ和SNA两种凝集素。
本发明还对上述凝集素测试芯片的制备及处理方法进行了优化，从而建立起用于检测唾液样本中唾液蛋白末端唾液酸α2-3和α2-6糖链结构的最佳反应体系。
该针对唾液样本的凝集素测试芯片的制备及处理方法，用于生成检测唾液样本中蛋白末端唾液酸α2-3和α2-6糖链结构的反应体系，包括以下步骤：
1）取环氧化片基备用；
2）取凝集素配制浓度均为1mg/mL的两种点样液，有效成分分别为MAL-Ⅱ和SNA；
3）将配制的点样液加到384孔板内；再用点样仪在环氧化片基上点制8区或12区的阵列；
4）将点制好的芯片在湿度为55%-65%的环境中孵育过夜；
5）对孵育好的芯片在37℃的真空干燥器中抽真空，使凝集素固定于芯片上；
6）将凝集素芯片放置在干燥器中,避光保存；即得到前述的凝集素测试芯片；
7）配制终浓度2%（g/mL）BSA、500mmol/L甘氨酸和0.05%（g/mL）吐温20与磷酸盐缓冲液混匀，PH7.4，然后用0.2μm的滤膜过滤，得到封闭液，将步骤6）保存的凝集素芯片置于封闭液中1小时；
8）将封闭后的凝集素芯片依次用吐温20磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液分别清洗1次，每次5分钟，再经甩干后备用；
9）对甩干后的凝集素芯片加入150-200μL的孵育缓冲液，作为与待测样本的反应环境；
所述磷酸盐缓冲液以1L总量计，组分为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g；
所述吐温20磷酸盐缓冲液是还含有体积分数0.05-0.5%吐温20的所述磷酸盐缓冲液；
所述孵育缓冲液是还含有质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺的所述吐温20磷酸盐缓冲液。
上述步骤4）将点制好的芯片在湿度为60%的环境中孵育12小时为最佳。
本发明还提供一种用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的凝集素芯片试剂盒，或者说该凝集素芯片试剂盒在筛查禽流感和人流感病毒易感人群方面的用途。该凝集素芯片试剂盒包括权利要求1所述的凝集素测试芯片、封闭液、清洗液和孵育缓冲液，其中
封闭液是配制终浓度2%（g/mL）BSA、500mmol/L甘氨酸和0.05%（g/mL）吐温20与磷酸盐缓冲液混匀，PH7.4，然后用0.2μm的滤膜过滤所得；
清洗液为吐温20磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液这两种溶液的组合，所述磷酸盐缓冲液以1L总量计，组分为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g；所述吐温20磷酸盐缓冲液是还含有体积分数0.05-0.5%吐温20的所述磷酸盐缓冲液；
孵育缓冲液是还含有质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺的所述吐温20磷酸盐缓冲液。
本发明具有以下优点：
本发明确立了能够用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的MAL-Ⅱ和SNA这两种分别识别的末端唾液酸α2-3和α2-6糖链结构的凝集素，测试针对性强，制作成本较低；并建立起用于检测唾液样本中的糖蛋白糖链末端唾液酸α2-3和α2-6糖链结构的最佳反应体系，为快速、简便、高效、无损伤地检测得到禽流感和人流感病毒易感人群评估结果的信息提供了极大的便利。
附图说明
图1为本发明的一种凝集素芯片布局图；阴性质控为磷酸盐缓冲液或牛血清白蛋白（BSA）；阳性质控为β-Actin抗体。
图2为本发明健康对照老年男/女性和2型糖尿病患者老年男/女性唾液混合样本的检测结果图；MH：健康老年男性对照样本，FH：健康老年女性对照样本，MD：2型糖尿病患者老年男性样本，FD：2型糖尿病患者老年女性样本。
图3为本发明健康男性、乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液混合样本的检测结果图；H：健康男性对照样本，HB：乙肝患者样本，HC：肝硬化患者样本，HCC：肝癌患者样本。
图4为本发明健康对照老年男/女性和和老年胃癌男/女性患者唾液混合样本的检测结果图；MH,健康男性对照样本，FH：健康女性对照样本，MG：男性胃癌患者样本，FG：女性胃癌患者样本。
具体实施方式
全唾液样本采集：已确诊的45岁～65岁男性乙肝患者，肝硬化患者和肝癌患者各17例；50岁～65岁2型糖尿病男性和女性患者各26例；50岁～65岁胃癌男性患者27例以及45岁～65岁健康男性和女性各30例，饭后两小时，约9点到10点之间，生理盐水漱口三次后迅速采集自然分泌的全唾液。唾液采集至少1mL并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂(每毫升唾液加入10μL)防止蛋白降解。
主要实验步骤为：
1）制备凝集素芯片；
1.1）取环氧化片基备用；
1.2）将凝集素配制成浓度为1mg/mL的点样液；
1.3）将配制的点样液加到384孔板内；再用晶芯48点样系统在环氧化片基上点样；
1.4）将点制好的芯片在湿度为60%的环境中孵育12小时；
1.5）对孵育好的芯片在37℃的真空干燥器中抽真空3小时，使凝集素固定于芯片上；
1.6）将固定好的凝集素芯片放置在4℃干燥器中，避光保存以备用。
2）制备生物样本；
2.1）采集所需的唾液样本；
2.2）离心过滤纯化样本全蛋白；
2.3）对纯化的全蛋白样本进行浓缩定量，使终浓度大于1mg/mL即可；
2.4）用荧光试剂对浓缩样本进行标记，去除未反应的荧光试剂；
2.5）将标记好的样本分装冻存于-20℃或-80℃的冰箱中。
3）将生物样本加载到凝集素芯片上以获得样本中糖蛋白上糖链结构；
3.1）配制的终浓度2%BSA，500mmol/L甘氨酸和0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PH7.4）为封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液1小时；
其中，磷酸盐缓冲液本身以1L总量计，组分为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g；吐温20磷酸盐缓冲液是还含有体积分数0.05-0.5%吐温20的所述磷酸盐缓冲液；
3.2）将封闭后的凝集素芯片用吐温20磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液分别清洗1次，每次5分钟，再经甩干后备用；
3.3）对甩干后的凝集素芯片加入2μg标记好的样本和200μL的孵育缓冲液，并在室温孵育2小时；孵育缓冲液是还含有质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺的所述吐温20磷酸盐缓冲液；
3.4）将孵育后的凝集素芯片用吐温20磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，再甩干；
3.5）对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白结合的荧光图像；参见图2-4。
3.6）通过GenePix3.0软件对MAL-Ⅱ和SNA荧光点进行中值分析，对图像中凝集素所对应的糖链结构核对后得出唾液样本中唾液酸α2-3和α2-6糖链结构表达的变化结果。
步骤3.6）具体操作是：从凝集素芯片扫描结果图中获取各个凝集素和唾液蛋白结合的荧光信号值，将大于2倍背景标准偏差的值作为有效值。一张片子上的每个区中MAL-Ⅱ和SNA都有3个重复点，选取每种凝集素的荧光信号值的中值，求得平均值和标准偏差值。比较疾病患者和健康对照的唾液糖蛋白糖链结构表达水平差异。计算疾病患者唾液样本荧光信号和健康对照唾液样本荧光信号的比值（Ratio）。一般的情况，统计学理论将Ratio值在0.66到1.5之间的值作为无显著差异的值，而Ratio值大于1.5和小于0.66的作为存在差异的值。
以下表一、表二、表三为MAL-Ⅱ和SNA凝集素以及相应的测试结果。
表一为本发明健康对照老年男/女性和2型糖尿病患者老年男/女性唾液混合样本样本的检测结果。
表一
注：MH,健康老年男性对照样本，FH：健康老年女性对照样本，MD：2型糖尿病患者老年男性样本，FD：2型糖尿病患者老年女性样本，其中*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
表二为本发明健康男性、乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液混合样本的检测结果。
表二
注：H：健康男性对照样本，HB：乙肝患者样本，HC：肝硬化患者样本，HCC：肝癌患者样本，其中*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
表三为本发明健康对照老年男/女性和和老年胃癌男/女性患者唾液混合样本的检测结果。
表三
注：MH：健康男性对照样本，MG：男性胃癌患者样本，FH：健康女性对照样本，FG：女性胃癌患者样本，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
从以上2型糖尿病患者，乙肝，肝硬化和肝癌以及胃癌患者与相应健康人对照的唾液中唾液酸α2-3和α2-6糖链结构表达水平比较结果可见：2型糖尿病患者、乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液中，唾液酸α2-3糖链结构表达水平显著下调，α2-6糖链结构表达水平变化不显著；胃癌患者唾液中唾液酸α2-3和α2-6糖链结构表达水平变化没有显著差别。由此可以推定：2型糖尿病患者、乙肝、肝硬化和肝癌患者属于禽流感病毒易感人群，但对人流感病毒有正常的抵抗力；胃癌患者对感禽流感和人流感病毒都有正常的抵抗力。
经查询大量临床病例，证实了2型糖尿病患者、乙肝、肝硬化和肝癌患者，在禽流感、人流感传播期间，较多出现了禽流感症状，较少出现人流感症状；相比而言，胃癌患者在禽流感、人流感传播期间，较少出现感禽流感和人流感症状。
以上实施例通过对2型糖尿病患者、乙肝、肝硬化和肝癌以及胃癌患者的实验分析，佐证了本发明的凝集素测试芯片及其试剂盒在筛查禽流感和人流感病毒易感人群的有效性；有理由确信，本发明能够广泛应用于各类人群禽流感和人流感病毒易感特质的筛查。
Claims (4)
1.一种用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的凝集素测试芯片，采用环氧化片基，其特征在于：该凝集素测试芯片针对唾液样本，在所述环氧化片基上仅点样固定有MAL-Ⅱ和SNA这两种凝集素。
2.权利要求1所述凝集素测试芯片的制备及处理方法，用于生成检测唾液样本中糖蛋白糖链末端唾液酸α2-3和α2-6糖链结构的反应体系，包括以下步骤：
1）取环氧化片基备用；
2）取凝集素配制浓度均为1mg/mL的两种点样液，有效成分分别为MAL-Ⅱ和SNA；
3）将配制的点样液加到384孔板内；再用点样仪在环氧化片基上点制8区或12区的阵列；
4）将点制好的芯片在湿度为55%-65%的环境中孵育过夜；
5）对孵育好的芯片在37℃的真空干燥器中抽真空，使凝集素固定于芯片上；
6）将凝集素芯片放置在干燥器中,避光保存；即得到权利要求1所述的凝集素测试芯片；
7）配制终浓度2%BSA、500mmol/L甘氨酸和0.05%吐温20与磷酸盐缓冲液混匀，PH7.4，然后用0.2μm的滤膜过滤，得到封闭液，将步骤6）保存的凝集素芯片置于封闭液中1小时；
8）将封闭后的凝集素芯片依次用吐温20磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液分别清洗1次，每次5分钟，再经甩干后备用；
9）对甩干后的凝集素芯片加入150-200μL的孵育缓冲液，作为与待测样本的反应环境；
所述磷酸盐缓冲液以1L总量计，组分为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g；
所述吐温20磷酸盐缓冲液是还含有体积分数0.05-0.5%吐温20的所述磷酸盐缓冲液；
所述孵育缓冲液是还含有质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺的所述吐温20磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的凝集素测试芯片的制备及处理方法，其特征在于：步骤4）将点制好的芯片在湿度为60%的环境中孵育12小时。
4.一种用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的凝集素芯片试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的凝集素测试芯片、封闭液、清洗液和孵育缓冲液，其中
封闭液是配制终浓度2%BSA、500mmol/L甘氨酸和0.05%吐温20与磷酸盐缓冲液混匀，PH7.4，然后用0.2μm的滤膜过滤所得；
清洗液为吐温20磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液这两种溶液的组合，所述磷酸盐缓冲液以1L总量计，组分为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g；所述吐温20磷酸盐缓冲液是还含有体积分数0.05-0.5%吐温20的所述磷酸盐缓冲液；
孵育缓冲液是还含有质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺的所述吐温20磷酸盐缓冲液。
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