CN103869067B - 一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法，可有效解决现有技术检测敏感度低，准确率低，容易出现漏检的问题，其解决的技术方案是，包括试纸壳和试纸条，试纸条装在试纸壳内，试纸条由样品垫、胶体金垫、反应膜和背衬构成，背衬中部粘贴有反应膜，反应膜上喷涂有检测线和对照线，背衬尾部粘贴有吸水垫，吸水垫一端扣压在反应膜一端上，背衬上部粘贴有胶体金垫，胶体金垫一端扣压在反应膜另一端上，靠胶体金垫一端的背衬头部粘贴有样品垫，样品垫一端扣压在胶体金垫另一端上，本发明检测敏感度好，准确率高，不容易出现漏检，是流感病毒检测试纸上的创新。

Description

一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及检测试纸，特别是一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法。
背景技术
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种常见的急性呼吸道传染病，以冬春季多见，临床以高热、乏力、头痛、全身酸痛等全身中毒症状重而呼吸道症状较轻为特征。据2002年世界卫生组织公布的数据，估计全球每年流感病例达6亿-12亿。从上世纪初至今，有六次全球性流感大流行，分别是1918年“西班牙流感”、1957年“亚洲流感”、1968年“香港流感”、1977年“俄罗斯流感”、1999年-2000年的欧洲流感大流行事件以及2009年的“墨西哥流感”，每次流感大流行都导致数百万以上的人死亡。除了这六次全球性流感疫情外，流感每年都会发生不同规模的小流行，尽管在波及范围、死亡人数等方面都不像以上六次流感疫情如此严重，但是对当地人民的生命财产和经济发展都带来了严重不良影响。如1976年美国新泽西因一名青年染上猪流感而引发了社会对爆发新疫症的恐慌，于是开始大规模推行疫苗注射；再如1997年在香港爆发的H5N1禽流感疫情，不仅可以在禽类中传播，还引起了人际间的传播，香港受感染的人数为18人，其中6人死亡。由于这次疫情香港政府下令宰杀150万只鸡，对香港的经济带来巨大的冲击。
流感的流行给人民的生命和财产带来了巨大的威胁，造成了较严重的社会影响，快速检测试剂盒，可以在流感病毒流行时，在机场、海关等现场快速检测、确定感染流感病毒的病人，为病人的治疗和隔离防控提供依据。也可用于猪及家禽的流感病毒流行监测，对流感病毒流行的防控具有重要意义。
流行性感冒是国家卫生部认定的乙级传染病之一。继SARS之后，我国卫生部组织制定了《卫生部应对流感大流行准备计划与应急预案》，要求政府相关部门每年都要储备大量的流感诊断检测试剂；同时，医院每年对呼吸道检测试剂需求量约3亿人份，而且这个数量还在不断增加中。因此流感病毒检测试剂盒作为常规检测工具在各个医疗检测窗口诊断中应用越来越多。
随着世界经济一体化的深入，全球人口流动性增加，海关、边境、机场、车站等重要的人口集散地是各国、各地区防控传染病的重要关卡。如我国卫生部甲型HlN1流感临床专家组对我国20个省市的6l家医疗机构于2009年5月10日至6月30日期间的426例新型甲型H1Nl流感患者调查统计发现，有32.9%的患者于口岸筛查时发现；20.2%的患者因密切接触甲型H1Nl确诊者而隔离，并于密切观察期间发病。因此就需要一种尽可能不受实验环境、实验设备和实验人员操作水平等因素影响的流感病毒现场快速检测试剂盒用于海关、机场、车站等重要人口集散地，甚至是野外、农场、社区、住户等疫情感染终端人群的疫情监测。
流感病毒是一种变异速率非常快的RNA病毒，自然界中像流感病毒这样变异频繁、变异幅度大的生物是少有的。在流感病毒的8个基因中，HA变异最快，其次是NA。如甲型流感病毒的HA基因每年每个核苷酸变异的概率为3～4×10-3，而细胞染色体DNA的突变率仅为10-8～10-10。流感病毒的易变异性造成了流感三年小流行、十年大流行的流行规律。而且每当因病毒抗原变异而出现新的病毒品种时，原有的检测方法和预防手段失效而不能及时控制疫情的发生和传播，造成了流感的大流行。以禽流感为例，1968年以来所发生的流行事件的不只是H5N1亚型毒株，还包括有H7N2，H7N3，H7N7和H9N2毒株等它们均可以感染人类。因此流感病毒检测工作越及时、检测结果越可靠，流感防控工作的效果也越好。
目前实时荧光定量PCR方法是检测流感病毒灵敏度和准确率都比较高的方法，该方法在许多国家和地区已经是鉴定流感感染阳性病例的确诊性方法。但是实时荧光定量PCR方法的实验检测条件限制了该方法只能用于流感病毒的最终实验室确定性检测。而敏感度、准确率低于实时荧光定量PCR技术的免疫胶体金技术、酶联免疫检测技术等方法由于操作简便、成本低廉、对实验条件要求低等特点被广泛应用在流感病毒检测的第一线。但是，目前市场上销售的流感病毒免疫胶体金检测试剂盒区分甲型或者乙型流感病毒用的是抗流感病毒核蛋白的单克隆抗体，优点在于可以很好地区分甲型和乙型流感病毒，但缺点在于核蛋白位于病毒核心内，临床标本直接检测敏感度低，容易出现漏检。流感病毒血凝素位于流感病毒表面，是进行快速检测的理想靶点，但是由于流感病毒血凝素易于突变，常用于作为流感病毒亚型分类的依据，是否可以制备出与甲型各亚型均反应的型特异性抗体，制备出高敏感性的快速检测试纸是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸及其制备方法，可有效解决现有技术检测敏感度低，准确率低，容易出现漏检的问题。
本发明解决的技术方案是，包括试纸壳和试纸条，试纸条装在试纸壳内，试纸条由样品垫、胶体金垫、反应膜和背衬构成，背衬中部粘贴有反应膜，反应膜上喷涂有检测线和对照线，背衬尾部粘贴有吸水垫，吸水垫一端扣压在反应膜一端上，背衬上部粘贴有胶体金垫，胶体金垫一端扣压在反应膜另一端上，靠胶体金垫一端的背衬头部粘贴有样品垫，样品垫一端扣压在胶体金垫另一端上。
本发明是利用抗甲型流感病毒血凝素保守区的型特异性单克隆抗体制备的高敏感性甲型流感病毒快速检测试纸，检测敏感度好，准确率高，不容易出现漏检，是流感病毒检测试纸上的创新。
附图说明
图1为本发明的试纸条结构主视图。
图2为本发明的试纸壳结构主视图。
图3为本发明的使用状态图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
由图1-3给出，本发明包括试纸壳和试纸条，试纸条装在试纸壳8内，试纸条由样品垫1、胶体金垫2、反应膜4和背衬7构成，背衬7中部粘贴有反应膜4，反应膜4上喷涂有检测线3和对照线5，背衬7尾部（左为头、右为尾）粘贴有吸水垫6，吸水垫6一端扣压在反应膜4一端上，背衬7上部粘贴有胶体金垫2，胶体金垫2一端扣压在反应膜4另一端上，靠胶体金垫2一端的背衬7头部粘贴有样品垫1，样品垫1一端扣压在胶体金垫2另一端上。
制备时，首先将反应膜4粘贴到背衬7上，再将吸水垫6压到反应膜4靠近背衬末端的一侧，胶体金垫2压到反应膜4的另一侧，样品垫1压到胶体金垫2的另一侧，样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫皆用强力胶固定于背衬上，当整个背衬按要求都贴好后，用切条机沿背衬横截面方向切成4mm宽的条，即成甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸。
所述的样品垫1由样品处理液和玻纤膜构成，每1000ml样品处理液中含有20g牛血清白蛋白（BSA）、5g曲拉通-100（TritonX-100）和0.01mol、pH为7.4的磷酸缓冲液（PBS），其余为水制成，玻纤膜型号为CB08，把玻纤膜裁切成22mm宽的条，每100μL样品处理液喷涂0.8cm长的玻纤膜，37℃干燥过夜，得样品垫1；
所述的胶体金垫2包括玻纤膜和金标抗体液，玻纤膜型号为CB08，将玻纤膜裁切成7mm宽的条，每100μL金标抗体液喷涂1.7cm长的玻纤膜，冷冻真空干燥或加入干燥剂自然凉干，然后静置密闭容器平衡12小时，即成胶体金垫2；
金标抗体液的制备：
1）胶体金稀释液的配制：每1000ml胶体金稀释液中含有10g牛血清白蛋白、25g蔗糖、0.5g吐温-20（T-20）、1g叠氮钠（NaN3）和0.01mol、pH为7.4的磷酸缓冲液，其余为水制成；
2）胶体金颗粒溶液的配制：取质量浓度为0.01%氯金酸水溶液50ml，微波加热至煮沸，加入质量浓度为1%柠檬酸三钠水溶液600μL，加热至出现酒红色，再加入50ml、4℃预冷的电导率为18.25的纯净水，即成40nm胶体金颗粒溶液，胶体金颗粒溶液吸收峰波长为532-534nm；Abs大于0.400；
3）胶体金标记抗体的配制：取胶体金颗粒溶液10ml，磁力搅拌条件下，加入体积浓度为30%的双氧水水溶液32μL；室温磁力搅拌混合10min后，加入0.2M的碳酸钾水溶液300μL，室温磁力搅拌混匀10min后，加入0.2mg纯化冻干的抗流感病毒单克隆抗体A1-6，抗流感病毒单克隆抗体A1-6冻干前缓冲液为0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液；室温磁力搅拌混匀60min后，加入0.1g牛血清白蛋白，室温磁力搅拌混匀10min后，加入0.01g聚乙二醇6000（PEG6000），室温磁力搅拌混匀30min，得金标抗体，将金标抗体移入离心管，在4℃，用HimacCR21G离心机浓缩，8000rpm,离心10min，弃去上清，酒红色沉淀即为胶体金标记抗体；
4）金标抗体液的配制：胶体金标记抗体用胶体金稀释液溶解以置换溶液体系，然后用胶体金稀释液稀释金标抗体，稀释后的金标抗体标准为：最高吸收峰波长范围532-534nm；OD大于0.400Abs；
所述的检测线3和对照线5分别是由检测抗体点膜液、对照抗体点膜液喷涂在反应膜4上构成：
1）点膜稀释液配制：是由0.01mol/L、pH为7.4的磷酸缓冲液，0.15mol/L氯化钠（NaCl），10mol/L乙二胺四乙酸（EDTA），1g/L叠氮钠，30g/L的甲醇，余量为水制成；
2）检测抗体点膜液配制：将纯化冻干的抗流感病毒单克隆抗体H1-24用点膜稀释液稀释至2mg/mL，抗流感病毒单克隆抗体H1-24纯度大于90%，比活性大于10-5效价/mg蛋白；
3）对照抗体点膜液配制：将买来的山羊抗小鼠多抗（比活性大于10-7/mg蛋白），用点膜稀释液稀释至0.8mg/mL；
4）检测线和对照线的制备：先将反应膜贴到背衬的相应位置，再用点膜机（韩感台式点膜系统型号：T5DD）将检测抗体点膜液及对照抗体点膜液划到反应膜上的相应位置，检测线和对照线的喷制均按每厘米检测线用2μL点膜液喷制，室温晾干，即成；所述的反应膜4的材质是硝酸纤维素膜，型号为：MILLIPORE（美国）,M135（有背衬），制备时将反应膜裁切成宽度为25mm的条；
所述的吸水垫6的材质是加厚吸水纸，在一般的胶体金耗材公司即可买到，将加厚吸水纸裁切成宽度为26mm的条，然后将其粘贴到背衬相应位置上即可。
所述的背衬7尺寸为77mm×4mm。
所述的胶体金垫2尺寸为7mm×4mm。
所述的反应膜4尺寸为25mm×4mm。
所述的检测线3和对照线5尺寸为2-3mm×4mm。
所述的吸水垫6尺寸为26mm×4mm。
所述的样品垫1尺寸为22mm×4mm。
所述的试纸壳8上有样本孔9和检测结果区10。
所述的样品垫1一端扣压住胶体金垫21mm，胶体金垫2一端扣压住反应膜41mm，吸水垫6一端扣压住反应膜41mm。
样品垫上含有处理样品成分的化学试剂，当含有流感病毒的样品液滴到其上时，它会溶解样品垫中的化学试剂，对样品中的流感病毒进行裂解、调整反应体系的离子强度和pH值等，并对非特异杂质进行封闭，使其更符合抗原抗体反应条件，有利于样品中的病毒抗原与金垫上的抗体结合。金垫上含有胶体金标记的抗流感病毒特异性单克隆抗体及其相关化学试剂，显示酒红色。当这些胶体金标记的抗流感病毒特异性单克隆抗体在俘获到流感病毒抗原后，随着液体侧向流，流感病毒抗原又与相应的检测线处的另一特异性抗流感病毒单克隆抗体结合而大量聚集，肉眼就可见红色或粉红色条带。反应膜上划有检测线和对照线，是免疫显色反应线的形成处。检测线处固定有特异的抗流感病毒单克隆抗体，可以和随液体侧向流扩散过来的流感病毒抗原与胶体金标记的流感病毒单克隆抗体复合物结合，对流感病毒抗原形成双抗体夹心，通过胶体金显色，指示出检测阳性带。对照线处固定有羊抗鼠抗体，可以和未与检测带结合的胶体金标记的单克隆抗体结合（鼠源性单克隆抗体），以确定反应体系是正常的。吸收垫的作用是在反应完全后对反应体系多余液体进行吸收、存储。
本发明甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的组装如下：背衬的作用是支撑整个试纸条，是一种常见的普通胶体金耗材，在金标耗材试剂公司都可以买到，背衬尺寸为77mm×300mm。首先将反应膜贴于背衬相应位置，按反应膜的制备方法完成反应膜的制备后，将吸水垫参压到反应膜靠近背衬末端的一侧，注意要参压反应膜1mm；胶体金垫参压到反应膜的另一侧，同样要参压反应膜1mm；样品垫参压到胶体金垫的另一侧，同样要参压金垫1mm；样品垫区、胶体金垫区、反应膜区和吸水垫区皆用强力胶固定于背衬上。当整个背衬按要求都贴好后，用切条机沿背衬横截面方向将试纸切成4mm的窄条，这样一个有检测功能的试纸条就制备出来了。
本发明甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸检测方法：
1．样本收集
采集咽拭子时，病人坐下，头后倾，张大嘴，由检查者用压舌板固定舌头。用棉签采集舌腭弓后，扁桃体隐窝至咽后壁，反复擦拭3～5次，收集粘膜细胞，避免触及舌、口腔粘膜和唾液。采集鼻拭子时，将鼻拭子插入鼻孔分泌物较多处，轻轻转动并推动鼻拭子，直至鼻甲（离鼻孔约2.5cm）受阻处，贴鼻壁旋转拭子三次.采好样品的拭子，置于预加有0.3ml标本提取液的离心管中，漩涡振荡混匀，置于4℃冰箱备用（样品最多保存8h）。
2．检验方法
测试前请将所有试剂恢复至室温，测试应在室温下进行。
1）样本处理
a在离心管内垂直加入300ul样本提取液。
b将采样后的鼻咽拭子插入样本提取管的溶液内，紧靠离心管内壁旋转约10次，使标本尽可能溶解在提取溶液中。
c沿离心管内壁挤压鼻拭子的棉签头，使液体尽可能留在管内，取出并弃去鼻拭子。
d用漩涡混合器混匀30秒，待用。
2）检测程序
a沿铝箔袋撕口处打开，将测试卡（即本发明试纸）取出平放。
b向测试卡的样本孔中加入100ul处理后的标本提取物。
c15～20分钟内观察显示的结果，在20分钟后显示的结果无效。
3．检验结果的判读（如图3所示）
阳性：两条红色/粉色反应线，即在检测区（T）及质控区（C）各出现一条红色/粉色/棕色反应线。
阴性：一条红色/粉色反应线，即仅在质控区（C）出现一条红色/粉色反应线。
无效：质控区（C）无红色反应线出现或检测区（T）出现其他颜色的条带，检测无效，建议此时用新试卡重新检测。
注：条带显色深浅与提取样本中所含的被测物质含量有关，不论颜色强度多少，都应按照条带是否显色判断结果。本发明内含质控过程，当C区出现红色条带，表明操作正确有效，否则测试无效。
表1PCR/ELISA/本发明胶体金检测结果对照
检测方法 甲型流感病毒 与PCR检测符合率 乙型流感病毒 与PCR检测符合率 对照标本 与PCR检测符合率
PCR检测结果 98 100 56 100 198 100
ELISA检测结果 97 99 55 98 198 100
胶体金检测结果 98 100 57 98 198 100
综上，本发明对病人无创取材、操作简便，快速，可在十分钟内出结果，无需仪器设备，检测成本低，检测过程无污染产生、对甲型流感病毒各亚型均可检测，适用于对流行病现场进行快速、大规模批量检测，具有良好的经济和社会效益。

Claims (9)

1.一种甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，包括试纸壳和试纸条，其特征在于，试纸条装在试纸壳(8)内，试纸条由样品垫(1)、胶体金垫(2)、反应膜(4)和背衬(7)构成，背衬(7)中部粘贴有反应膜(4)，反应膜(4)上喷涂有检测线(3)和对照线(5)，背衬(7)尾部粘贴有吸水垫(6)，吸水垫(6)一端扣压在反应膜(4)一端上，背衬(7)上部粘贴有胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端扣压在反应膜(4)另一端上，靠胶体金垫(2)一端的背衬(7)头部粘贴有样品垫(1)，样品垫(1)一端扣压在胶体金垫(2)另一端上；首先将反应膜(4)粘贴到背衬(7)上，再将吸水垫(6)压到反应膜(4)靠近背衬末端的一侧，胶体金垫(2)压到反应膜(4)的另一侧，样品垫(1)压到胶体金垫(2)的另一侧，样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫皆用强力胶固定于背衬上，当整个背衬按要求都贴好后，用切条机沿背衬横截面方向切成4mm宽的条，即成甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸；
所述的样品垫(1)由样品处理液和玻纤膜构成，每1000ml样品处理液中含有20g牛血清白蛋白、5g曲拉通-100和0.01mol、pH为7.4的磷酸缓冲液，其余为水制成，把玻纤膜裁切成22mm宽的条，每100μL样品处理液喷涂0.8cm长的玻纤膜，37℃干燥过夜，得样品垫(1)；
所述的胶体金垫(2)包括玻纤膜和金标抗体液，将玻纤膜裁切成7mm宽的条，每100μL金标抗体液喷涂1.7cm长的玻纤膜，冷冻真空干燥或加入干燥剂自然凉干，然后静置密闭容器平衡12小时，即成胶体金垫(2)；
金标抗体液的制备：
1）胶体金稀释液的配制：每1000ml胶体金稀释液中含有10g牛血清白蛋白、25g蔗糖、0.5g吐温-20、1g叠氮钠和0.01mol、pH为7.4的磷酸缓冲液，其余为水制成；
2）胶体金颗粒溶液的配制：取质量浓度为0.01%氯金酸水溶液50ml，微波加热至煮沸，加入质量浓度为1%柠檬酸三钠水溶液600μL，加热至出现酒红色，再加入50ml、4℃预冷的电导率为18.25的纯净水，即成40nm胶体金颗粒溶液，胶体金颗粒溶液吸收峰波长为532-534nm；Abs大于0.400；
3）胶体金标记抗体的配制：取胶体金颗粒溶液10ml，磁力搅拌条件下，加入体积浓度为30%的双氧水水溶液32μL；室温磁力搅拌混合10min后，加入0.2M的碳酸钾水溶液300μL，室温磁力搅拌混匀10min后，加入0.2mg纯化冻干的抗流感病毒单克隆抗体A1-6，抗流感病毒单克隆抗体A1-6冻干前缓冲液为0.01M，pH7.4的磷酸缓冲液；室温磁力搅拌混匀60min后，加入0.1g牛血清白蛋白，室温磁力搅拌混匀10min后，加入0.01g聚乙二醇6000，室温磁力搅拌混匀30min，得金标抗体，将金标抗体移入离心管，在4℃，用HimacCR21G离心机浓缩，8000rpm,离心10min，弃去上清，酒红色沉淀即为胶体金标记抗体；
4）金标抗体液的配制：胶体金标记抗体用胶体金稀释液溶解以置换溶液体系，然后用胶体金稀释液稀释金标抗体，稀释后的金标抗体标准为：最高吸收峰波长范围532-534nm；OD大于0.400Abs；
所述的检测线(3)和对照线(5)分别是由检测抗体点膜液、对照抗体点膜液喷涂在反应膜(4)上构成：
1）点膜稀释液配制：是由0.01mol/L、pH为7.4的磷酸缓冲液，0.15mol/L氯化钠，10mol/L乙二胺四乙酸，1g/L叠氮钠，30g/L的甲醇，余量为水制成；
2）检测抗体点膜液配制：将纯化冻干的抗流感病毒单克隆抗体H1-24用点膜稀释液稀释至2mg/mL，抗流感病毒单克隆抗体H1-24纯度大于90%，比活性大于10-5效价/mg蛋白；
3）对照抗体点膜液配制：将比活性大于10-7/mg的山羊抗小鼠多抗用点膜稀释液稀释至0.8mg/mL；
4）检测线和对照线的制备：先将反应膜贴到背衬的相应位置，再用点膜机将检测抗体点膜液及对照抗体点膜液划到反应膜上的相应位置，检测线和对照线的喷制均按每厘米检测线用2μL点膜液喷制，室温晾干，即成；所述的反应膜(4)的材质是硝酸纤维素膜，型号为：MILLIPORE,M135，制备时将反应膜裁切成宽度为25mm的条；
所述的吸水垫(6)的材质是加厚吸水纸，将加厚吸水纸裁切成宽度为26mm的条，然后将其粘贴到背衬相应位置上即可。
2.权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述的背衬(7)尺寸为77mm×4mm。
3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的胶体金垫(2)尺寸为7mm×4mm。
4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的反应膜(4)尺寸为25mm×4mm。
5.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的检测线(3)和对照线(5)尺寸为2-3mm×4mm。
6.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的吸水垫(6)尺寸为26mm×4mm。
7.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的样品垫(1)尺寸为22mm×4mm。
8.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的试纸壳(8)上有样本孔(9)和检测结果区(10)。
9.根据权利要求1所述的甲型流感病毒胶体金诊断检测试纸，其特征在于，所述的样品垫(1)一端扣压住胶体金垫(2)1mm，胶体金垫(2)一端扣压住反应膜(4)1mm，吸水垫(6)一端扣压住反应膜(4)1mm。
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