CN1328286C - 无糖产物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开了复合糖、含有该复合糖的治疗组合物和使用该复合糖的治疗方法。确切地说，提供了无糖10B的肽成分，它是致免疫表位，负责抗原被免疫系统识别。这些复合糖可用于预防流感病毒与细胞结合、治疗精神分裂症和诊断与癌症形成有关的慢性病毒性疾病。

Description

无糖产物和使用方法
本申请是1994年2月17日提交的共同未决申请08/198139的部分继续申请，前者结合在此作为参考文献。
发明领域
本发明涉及产物和方法的发现，该产物和方法有助于活体缀合碳水化合物成分病症的诊断和治疗，该活体缀合碳水化合物可引起细胞机能障碍和细胞死亡。
发明背景
过去，关于细胞机能障碍、细胞死亡和特殊疾病状态的很多表面上看来无关的观察结果不被理解也无法被理解，现在，由于本发明的方法和组合物而能够被理解了，本发明第一次定义了无糖病理学的状态与后果、它的产物以及用于它的检测与治疗的产物与方法。
发明概述
本发明在一方面提供了肽，特别是无糖(aglyco)10B的肽成分，它们是负责机体免疫系统识别抗原的致免疫表位。本发明在这方面的一个实施方案提供了分离的复合糖，其中包含至少一种与序列1或序列2所列氨基酸序列缔合的碳水化合物。这些无糖10B的肽成分可在体内产生无糖10B的特异性抗体，抗无糖10B(抗致恶性素抗体)。本发明在这方面的另一个实施方案中，肽各自或联合包括在治疗组合物中，用于在必要时增加患者抗致恶性素抗体的浓度。
本发明在另一方面提供了防止或抑制流感病毒颗粒附着于患者细胞的方法，包括给患者治疗有效剂量的复合糖，从而与所述流感病毒颗粒结合，防止或抑制该颗粒附着于细胞受体。
本发明在另一方面提供了治疗精神分裂症的方法，包括在必要时给患者治疗有效剂量的D-葡糖胺-HCl，从而增加所述患者脑复合糖的浓度。
本发明在另一方面提供了抗具有序列2氨基酸序列的肽的单克隆抗体和抗无糖蛋白10B的单克隆抗体。
本发明在另一方面提供了诊断患者与癌症形成有关的慢性病毒性疾病的方法，包括通过检测患者异常升高的抗无糖蛋白10B抗体水平来检测向恶性细胞的转化。
附图说明
图1是显示精神分裂症与非精神分裂症患者中神经氨酸、己糖胺和己糖数量的条状图。
图2是不同年龄健康个体中存在的抗致恶性素抗体的数量图。
图3是健康个体和患有各种形式癌症的个体中抗致恶性素抗体数量的散点图。
图4是在乳腺癌患者中，在恶性肿瘤期间和癌症治疗数年后观测到的抗致恶性素抗体数量的散点图。
图5是用抗致恶性素抗体进行免疫染色的恶性细胞的照片组合。
图6是显示抗致恶性素抗体对小细胞肺癌细胞生长的体外抑制作用的条状图。
图7是良性增生、炎症和癌症中抗致恶性素抗体浓度的条状图。
图8A和8B是注射12聚体(mer)合成肽后在兔体内产生的抗致恶性素抗体数量的条状图。
图9A和9B是注射16聚体合成肽后在兔体内产生的抗致恶性素抗体数量的条状图。
发明详述
本发明的方法和组合物来自无糖复合物病理学的研究结果。本发明人已经发现，复合糖的碳水化合物成分与脂质或蛋白质共价结合形成复合糖，该成分有助于细胞的稳定性、细胞的受体与识别功能和细胞成分的保护作用，免受天然与外来物质的损害。当这些正常的碳水化合物成分浓度降低或结构改变时，这里一起定义为“无糖状态”和“无糖病理学”，这些碳水化合物的稳定性、受体识别与保护功能减少或丧失，导致细胞机能障碍和细胞死亡，所致疾病状态因细胞机能障碍或细胞死亡的位置而异。这里显示的证据表明，这些例如在神经系统中的疾病状态是细胞机能障碍或细胞死亡(即细胞缺失)的结果。这样的疾病状态包括但不限于痴呆，例如精神分裂症(早发性痴呆)，和脑肿瘤，以及帕金森综合征和阿尔茨海默病。
糖蛋白10B是人脑中一种正常的250KD膜成分。这种复合糖业已显示参与鸽脑中的训练过程。业已假定，在脑成胶质细胞瘤中，细胞分裂接触抑制作用的明显丧失伴随无限制增殖，10B的结构可能已有所改变。的确，人们发现10B的结构在脑成胶质细胞瘤中明显改变：碳水化合物基团在数量上减少大约50％，并存在异质性的丧失。正常10B中，有九种不同的碳水化合物成分；肿瘤10B(无糖10B)中，减少至五或六种。此外，10B的蛋白质部分过度产生或过度表达七至十倍。星形细胞素(astrocytin)是赋予从脑肿瘤10B裂解下来的10KD肽的名称。从生长在组织培养物中的成胶质细胞瘤细胞分离到星形细胞素的等价物，致恶性素，证实它与星形细胞素具有非常密切的结构相关性。之所以称为致恶性素，是因为在组织培养物中这种肽的表达、及其在每mg可提取的膜蛋白中的浓度随每单位时间细胞分裂速率的增加而增加。
认识素M是富含谷氨酸和天冬氨酸的10kD癌多肽抗原，已经从MCF7恶性乳腺细胞中分离得到。这种多肽与已经从神经胶质性脑肿瘤中分离到的致恶性素(Glu13，Asp9，His2)有关。抗认识素M，抗致恶性素的IgM自身抗体已经从人血清中分离得到，以鼠单克隆抗体形式产生，通过用抗原体外作用于人淋巴细胞而产生人型单克隆抗体，还已经从恶性细胞中分离到，该恶性细胞是通过洗脱和免疫吸附于固定纯化抗原，在手术和尸体解剖时得到的。
美国的三家独立实验室和英国的三家医院与一家实验室，有数百名医师参加了一项历时20年的随机主要为盲法的研究，研究证明，血清中抗致恶性素(抗无糖10B)的浓度，以μg/ml计，(1)在30～70岁间的正常健康无肿瘤携带人群中，每10年适度增加，癌症的危险随之增加(p＜.001；N＝1972)(图1)，(2)在高危癌症家族至今尚未明显受累的成员中、增加得更早而且更显著，(p＜.001；N＝1106)(图1和2)，和(3)在人血清中的浓度在发生恶性转化为临床乳腺癌的数周内显著增加，但(在不变量的意义上)不是特征性的，因为它在成功治疗的三个月内恢复正常，并在成功治疗后维持在正常范围内甚至长达27年(图2和3)(p＜.001；首次测定时的假阳性和假阴性＜5％，重复测定时＜1％；N＝600)。
颈部的活组织检查可以提供从发育异常转化为完全侵袭性癌症阶段的病理学证据。同时伴有抗致恶性素浓度的显著上升。手术摘除后，抗致恶性素在三个月内恢复正常。图2和3显示这些改变在双方向上都是有统计学意义的显著变化(p＜.001)。
血清抗致恶性素抗体的定量测定因此受到关注，作为非侵入性生物标记物，可用于表示乳腺癌化学预防试验的成功结果。
另外，纯化的抗致恶性素抗体由于其在致恶性素表位已经暴露的细胞膜的荧光与其它色原染色中已经证明其特异性，在个体和计算机细胞计数中适合于单独使用，或者用作前发育异常或基于发育异常的替代终点生物标记物的一组试验的一部分。
与病理学过程的关系：抗致恶性素
(抗无糖10B)是一种抑制性转化抗体
已经经历恶性转化的人细胞可能经过数年时间增殖才成为临床上的癌症，也可能从不。如果增殖的抑制作用是免疫过程，这一点已经建立起理论，并且诸如在AIDS等免疫缺陷性病症中癌症的发生率升高也已经提示了这一点，但在人类肿瘤中没有直接证据提示存在这样一种免疫过程，而且反应机理也是未知的。除了上述性质以外，抗致恶性素还显示出与患者存活有定量关系。体外，抗原纯化的人抗致恶性素可以无论细胞类型而与癌细胞结合，以不饱和量存在于手术或尸体解剖时摘除的癌细胞上，对恶性神经胶质细胞具有细胞毒性(图4，k和l)，在每孔微微克抗体的浓度下对小细胞肺癌细胞的生长具有抑制作用(图5)。
脑中复合糖的作用和抗糖蛋白10B特异性抗体在多种疾病状态中存在的发现，导致了与疾病状态有关的特异性无糖10B肽和抗这些无糖肽的抗体的进一步发现。上述关于糖蛋白10B的作用、无糖病理学与抗原性无糖肽和抗这些肽的抗体的发现，导致了某些慢性病毒感染、病毒安全屏障与病毒性癌发生之间关系的完全意外的发现，以及对诸如AIDS和乙型或丙型肝炎等慢性病毒感染早期检测和用疫苗进行治疗的新方法的发现。这项工作也实现了用于检测和治疗各种受到无糖病理学影响的病症的方法。
本发明在一方面，可以应用如下无糖病理学产物诊断神经病学病症：1)直接测定神经系统复合糖的结构改变，这种改变产生新的无糖产物；或2)因为本发明的新型无糖产物可以充当抗原，所以可以测定机体对该新型无糖抗原产物而产生的新抗体产物。这些无糖细胞抗原产物完全不同于正常细胞成分，因此机体把该新型无糖产物识别为外来物，并产生针对它们的抗体。这些抗体对细胞具有有害或不可取的作用，导致细胞死亡(例如在正常发育的脑中，这是不可取的；但在脑肿瘤中，这种结果是可取的)。通过直接测量或测定针对它们的抗体而对这些无糖产物进行鉴定是病症诊断的辅助或基础，也是治疗的基础。
脑中流感病毒的复合糖受体--“糖诱饵”
复合糖的一种功能是充当流感病毒与脑中靶向细胞附着的受体。当流感病毒接近该细胞时，它特异性地附着于位于细胞膜中的复合糖受体。在脑中，一种含有神经氨酸的复合糖充当受体。神经氨酸被一种特异性流感病毒酶、即神经氨酸苷酶从该受体裂解下来。在一种这样的受体、即脑神经节苷脂复合糖的情况下，神经氨酸的裂解使病毒与己糖胺接触，后者是使DNA从病毒排出的强力诱导剂，并允许病毒DNA转移进入脑细胞内(Bogoch等《病毒学》7，161-165，(1959))。
在防御时，作为病毒靶向的细胞释放含有神经氨(唾液)酸的小分子量物质唾液应答素(sialoresponsins)(Bogoch等《自然》195，180(1962))，后者据信充当病毒圈套，从而防止病毒附着和进入细胞。所产生的唾液应答素浓度与病毒的血细胞凝集浓度有关。
本方法和组合物应用了这种关于复合糖在病毒感染中的作用的知识。含有神经氨酸-己糖胺连接的复合糖或产物、或任何其它被病毒识别为受体的复合糖或结构相似单元均可用作流感和其它病毒或其它利用这种或相似构型作为受体的感染的预防性或治疗性圈套。因此本发明在一方面，将这些无糖圈套经口、经皮、全身(例如静脉内或腹膜内)、或作为鼻腔或呼吸道喷雾剂、或通过任何其它方式给药，使病毒和圈套能够在病毒第一次感染细胞或在离开原始靶向细胞后感染其它细胞之前彼此接触。因此，本发明在这方面提供了防止或抑制流感病毒感染及其后果、即神经氨酸丧失的方法。
精神分裂症中的流感病毒感染、脑细胞损失
和神经氨酸与己糖胺无糖产物缺乏
由发育中的脑流感病毒感染引起的细胞损伤或细胞死亡据信可导致神经元病症，例如精神分裂症，或者在其致病中起一定作用。
以前的定量神经化学研究提示，神经氨酸和己糖胺是复合糖细胞内识别“符号后(sign-post)”系统的一部分，该系统形成承担正常脑发育和行为的神经网络。最近，精神分裂症脑的组织学研究揭示，神经元组织破坏业已提示是由发育损伤导致的。现在，流行病学研究提示，产前感染含有神经氨酸苷酶的流感病毒有易患精神分裂症的倾向。此外，现已发现，脑脊液中缀合的神经氨酸和己糖胺的浓度在精神分裂症患者中定量降低。
从最近的流行病学观察结果可知，在母亲妊娠的中间三个月感染流感病毒的个体(Callaghan等《柳叶刀》337，1248-1250(1991))和患有高频神经节苷脂与其它糖脂病症的人群(Rahav等《美国精神病学杂志》143(10)，1249-1254(1986))中，精神分裂症出现的频率增加。组织学研究证明在精神分裂症脑中有神经元细胞损失和神经元组织破坏(F.E.Bloom，《普通精神病学文献》50，224-227(1993))。神经氨酸被流感病毒酶、神经氨酸苷酶(涎酶)从其缀合物中除去，可能对未成熟脑中的神经元细胞识别分子造成损伤。上述最近的流行病学和组织学发现与定量神经化学数据有关，这些数据显示，精神分裂症患者的脑脊液(CSF)中神经氨酸和己糖胺缀合物的实际浓度降低了(S.Bogoch《美国精神病学杂志》114，172，(1957))。而且，对脑中复合糖(糖脂、糖蛋白)识别物质所进行的有关工作(S.Bogoch《美国化学协会杂志》79，3286，(1957))得出了神经元连接性和神经系统成熟的“符号后”假说(S.Bogoch《记忆的生物化学；脑类粘蛋白功能探索》牛津大学出版社1968)。
以前已经证明，存在于神经系统中的复合糖是识别物质(S.Bogoch《美国化学协会杂志》79，3286，(1957)；S.Bogoch《生物化学杂志》68，319-324，(1958))。脑神经节苷脂的结构首先被测定后，神经节苷脂显示体外既充当流感病毒的受体，也充当刺激蛤心脏和平滑肌的效应器。脑内另外给予的神经节苷脂体内充当“圈套”，抑制脑神经元被流感病毒感染。人脑糖蛋白已经可以大量分离、区分和对其碳水化合物成分进行部分特征鉴定。复合糖已经显示存在于突触膜中，参与哺乳动物神经发育和鸽子的训练与学习任务。神经系统中复合糖的“符号后”功能在发育成熟过程中和在体验中都是建立神经网络的先决条件。
业已显示精神分裂症患者CSF中缀合的神经氨酸和己糖胺比其它精神病患者和正常人显著减少(S.Bogoch《自然》184，1628-1629(1959))。这种减少与疾病的严重性有定量比例关系，并且随着临床状态的改善而朝正常值增加(Bogoch等《新英格兰医学杂志》264，251-258(1961))。
本发明提供了精神分裂症和其它无糖蛋白浓度升高的医学疾患的有益治疗。在治疗精神分裂症的本方法中，复合糖的浓度升高，患者脑中无糖蛋白的量减少。
在治疗精神分裂症的本方法中，将神经氨酸和己糖胺前体D-葡糖胺-HCl给予精神分裂症患者，以改善这些患者的精神病状态。确切地说，给予约50～500mg D-葡糖胺-HCl、优选约100～250mg D-葡糖胺-HCl/天、最优选约200mg D-葡糖胺-HCl/天，通过升高脑中糖蛋白浓度和降低脑无糖浓度，而改善精神分裂症患者的总体临床健康水平。
阿尔茨海默病中的无糖产物
阿尔茨海默病是神经细胞损失的毁灭性消耗病，表现为认知障碍，主要为早期记忆丧失。某些淀粉样蛋白前体蛋白(APP)衍生物是这种疾病特征性异常脑沉积的元凶。尽管APP已知是一种糖蛋白，不过对APP中的碳水化合物还没有引起关注。由于本发明的原因，无糖产物可以这样检测(1)直接对脑脊液中碳水化合物组分减少了的APP衍生物加以分离和特征鉴定，和/或(2)间接对患者血清中的抗无糖APP抗体加以检测和量化。
脑中早期前淀粉样蛋白沉积物已在出现神经原纤维缠结、即神经细胞破坏的产物前显现，并显示参与阿尔茨海默斑块的“成熟”。这些前淀粉样蛋白沉积物象成熟斑块一样含有Ab肽，它是39-42个氨基酸残基长的APP降解产物。由前淀粉样蛋白向成熟的淀粉样蛋白斑块的转变是可能的，因为在唐氏综合征患者脑中出现变性轴突之前，前淀粉样蛋白沉积物可以存在数年。前淀粉样蛋白沉积可能更易治疗，即在发生神经细胞损伤之前，可将之溶解排泄。给予二苯乙内酰脲(DPH)能够提供对抗斑块进一步蓄积的保护作用，本发明证明它升高脑中与蛋白质结合的己糖浓度。DPH可经肌内、皮下或静脉内对患者给药，给药剂量在约每天0.5～2mg/kg体重的范围内，给药持续时间视需要而定。结果是患者脑内与蛋白结合的己糖量增加。
本发明的另一方面，在脑肿瘤和其它疾病状态下，脑复合糖的碳水化合物成分浓度降低，通过给予某些药物例如二苯乙内酰脲(DPH)，可以朝正常浓度升高。DPH的给约剂量范围约为0.5～2mg/kg体重，优选约为1mg/kg体重，即使在没有肿瘤的情况下，也升高与脑蛋白结合的己糖浓度。因此在本发明的这种实施方案中，提供了脑或其它恶性肿瘤的治疗方法，该方法包括给予治疗有效剂量的DPH，该剂量可引起患者复合糖水平升高。约1mg/kg/天给药数天足以升高脑复合糖浓度至正常或接近正常的水平。治疗可以持续必要的时间，优选直到恶性肿瘤体积缩小或完全消失时为止。
其它导致新无糖抗原暴露并导致无糖抗体产生的疾患实例是帕金森氏病和多发硬化，本发明的方法应当适用于这些和其它病症，既适用于脑也适用于其它器官，既适用于诊断也适用于治疗。
无糖抗原肽和抗无糖肽抗体
无糖脑糖蛋白10B及其特异性抗体(单克隆或多克隆)是在脑肿瘤和其它恶性肿瘤中发现的两种无糖产物。无糖10B是从正常糖蛋白10B中除去碳水化合物后得到的。无糖10B和若干无糖10B片段的氨基酸结构已经通过若干独立的方法加以测定。无糖10B肽已经被若干方式消化为有用的12聚体和16聚体肽片段，它们已经显示具有抗原性。抗无糖10B抗体是IgM型的，可导致细胞死亡。
纯化无糖10B的三种肽成分的氨基酸序列通过碘代苯甲酸与胰蛋白酶水解、埃德曼降解、自动水解与微波水解和质谱法加以测定。尽管清楚地了解这些肽是无糖10B的成分，但最初并不知道这些肽是否是实际意义上的免疫表位(免疫学上的活性抗原片段)。现已测定，两个较长的序列代表免疫表位，负责被机体免疫系统识别并由此在体内产生特异性抗体、即抗无糖10B(抗致恶性素抗体)。为了确认这个事实，无糖10B序列的知识已被用于体外合成相同序列的合成肽。将这些合成肽注射给动物，这些动物产生特异性抗致恶性素抗体、即抗无糖10B，这一点已应用固定完整无糖10B通过标准免疫吸附技术进行过验证。因此，无糖10B是抗原，这些肽片段是真正的表位，用于抗无糖10B(抗致恶性素抗体)的产生和结合。这些合成肽在注射给动物时，可诱导抗致恶性素抗体浓度升高，因此严格地确认，天然生物无糖物质事实上参与人类肿瘤中发现的免疫应答。另外，这些合成肽作为合成疫苗，可用于提高机体自身的抗致恶性素抗体浓度。以前已经确认，血清中抗致恶性素抗体浓度与癌症患者存活长短有定量关系，已经生产出合成抗癌疫苗。
在很多不同细胞类型的常见恶性肿瘤中都观察到抗无糖蛋白10B抗体(抗无糖10B或抗致恶性素)的绝对浓度升高，例如肺、乳腺、结肠等的癌症。抗体的增加说明无糖病理学是普遍存在的病理学现象，并不限于脑。抗无糖10B浓度升高的检测是一种有用的恶性肿瘤诊断方法。
无糖产物和方法用于病毒性疾病的早期诊断
和治疗，该病毒被保护在细胞内的安全屏障中
若干病毒，例如乙型肝炎和丙型肝炎病毒，感染后可引起肝细胞癌，再如HIV，可导致AIDS和若干恶性肿瘤的频率增加，它们都部分地耐受通过给予抗病毒制剂而进行的诊断和治疗，这是因为病毒局限在细胞内，处于慢性潜伏状态，已知称为细胞内的安全屏障。因此，尽管已有大量有效的抗病毒制剂，例如用于HIV的抗蛋白酶，能够灭活或破坏存在于细胞外液中的HIV病毒，但它们不能根除体内所有病毒，因为有些病毒存在于细胞安全屏障内，例如在淋巴细胞内。因此，尽管现在通过抗病毒制剂治疗可达到血液的无病毒状态，但当这些治疗停止后，安全屏障内的病毒经常迅速地释放到细胞外，进入血流，并感染新的细胞。因此，这些潜伏的病毒可以在任意时间复制并释放进入细胞外液，感染其它细胞，最终战胜宿主。
病毒利用安全屏障的另一个例子是，乙型或丙型肝炎病毒以在肝、淋巴细胞或其它细胞中持续潜伏或慢性感染达很多年，通过既定的病毒致癌作用，导致肝细胞癌。由乙型或丙型肝炎致癌作用所导致的癌症通常经过数年才达到临床可检测的状态，在本发明之前没有办法更早地检测恶性细胞，从而更早地治疗癌症。
现已发现，这些病毒安全屏障可以比以前的检测方法提前数年被检测到。被感染细胞向恶性(永生)状态的转化是频繁的，也许需要方法以建立和维持病毒安全屏障，因此，甚至在感染后的前几年，这些安全屏障也能够通过给予无糖10B或无糖10B合成抗原表位(疫苗)或抗无糖10B产物(抗体)加以破坏(治疗)。
肝内癌发生是人乙型或丙型肝炎病毒感染的既定后果(据估计，该病毒在美国的感染人群超过1％，在亚洲为2％)，但是肝细胞癌(HCC)存在与否的检测仅在该恶性肿瘤生长的晚期才是可能的(通常在最初的病毒感染之后10至25年)。这种检测借助于标记物例如甲胎蛋白、去-γ-凝血酶原和血小板衍生的内皮细胞生长因子水平，或者借助扫描技术分辨可以看见的癌(0.5-1cm，代表数十亿细胞)，但所有的方法也仅在疾病晚期才是完全有效的，此时其它恶性肿瘤迹象也已经在临床上表现出来。
向恶性肿瘤的转化包括细胞的永生化，使细胞永远存活，也不分裂。这种情况为病毒创造稳定的细胞屏障。在恶性肿瘤进展的第二阶段，细胞分裂增加(增殖)，这提供了在本发明之前的唯一迹象，说明第一阶段的转化在事实上已经发生了。不幸的是到那时候(10～25年后)，增殖阶段产生临床可检测到的肿瘤，例如临床上明显的肝细胞癌，成功治疗该恶性肿瘤是极其困难的。
本发明中，存在于肝恶性肿瘤中恶性转化早期阶段的特异性无糖应答提供了早期检测的可能。而且，由于所检测的无糖改变的性质，本发明方法提供了新颖的潜伏性病毒感染的特异性治疗。通过患者血液中特异性无糖产物增加的检测，现已发现，肝细胞向恶性状态转化比以前所认为的要早发生数十年--在感染后的前几年内。
病毒性无糖病症的诊断和治疗
本发明提供了肝细胞癌和其它癌症的早期检测和治疗方案。在病毒性无糖病症的诊断和治疗中，可以采用单独的下列通用程序，或者与其它已知的治疗方法联合应用，或者用于病毒检测，该检测可用于早期治疗(在临床癌症清晰可见之前)已经转化为恶性状态的细胞以及破坏病毒感染动物的细胞内安全屏障。
a)通过熟知的标准程序诊断诸如乙型或丙型肝炎或HIV等病毒性病症或其它慢性病毒感染，例如通过现在常用的既定方法测量对抗病毒蛋白质的特异性血清抗体；
b)可以通过下列实施例所述程序测定血清中升高的抗致恶性素抗体水平证实转化(恶性、永生)细胞的存在；
c)可以进行患者血液中病毒基线(预处理)浓度的测定(例如血清中特异性病毒RNA的定量测定，例如HIV-1 RNA测定法)；
d)可以进行血液和其它体液中无糖10B或其片段肽的存在和浓度的测定，其片段肽例如无糖10B“碘肽”和“胰蛋白酶肽”(见实施例)；
e)注射一种或多种根据本发明的合成肽疫苗，优选为皮下注射，注射量例如约为50～200微克，优选约为100微克，重复注射，例如但不限于每14天，或由主治医师确定的其它适合时间，直到通过血清中的定量测定观察到抗致恶性素抗体达到最大增量时为止；
f)通过本领域既定的方法施行抗病毒化学疗法(例如蛋白酶抑制剂，阿昔洛韦)，以破坏或中和已经从细胞内安全屏障释放到细胞外的病毒；
g)血液中的病毒浓度可以再次按照程序c)(预处理)加以测定(后处理)。
h)无糖10B或其片段肽的存在和浓度按照程序d)加以测定。
i)程序a)至h)可以重复进行直到下列指标提示所有转化的恶性细胞都被破坏时为止，这在最后一次疫苗注射后大约90～120天：按照程序b)，血清中的抗致恶性素抗体恢复至正常水平(低于135μg/ml)；根据程序c)的测定结果，病毒没有进一步释放进入血液；如程序d)所示，无糖10B或其片段肽不存在，这些都说明，转化的恶性细胞(含有无糖抗原产物)不再存在于体内。
j)可以验证在上述治疗结束时不存在转化为恶性肿瘤的细胞，并且恶性细胞的细胞增殖程度可以在上述治疗过程中这样加以目测、定量和监测：将与99锝或其它适合的放射体缀合的抗致恶性素抗体通过静脉内方式给药，用(计数器进行记录，例如在乙型或丙型肝炎的情况下记录肝中恶性细胞群的数量和体积，其体积小于用非特异性扫描技术所检测到的结果，再如在HIV感染和AIDS的情况下记录淋巴结、脾和脑。
k)任何顽固的病毒安全屏障都可以通过抗致恶性素抗体或任意其它优先破坏恶性细胞的肿瘤化疗药物加以治疗。
类似地，下面是在临床癌症清晰可见之前或在恶性肿瘤病程中用于已经转化为恶性状态的细胞的早期治疗、破坏或灭活的程序，其中该转化剂不是病毒。可以采用下列步骤或部分步骤的任意组合。这些步骤和方法可以与其它已知的检测和治疗癌症的方法联合使用。
a)通过测定血清中升高的抗致恶性素抗体水平测定转化(恶性、水生)细胞的存在；
b)测定血液和/或其它体液中无糖10B或其片段肽的存在和浓度；
c)注射一种或多种根据本发明的合成肽疫苗，优选为皮下注射，注射量例如约为50～200微克，优选约为100微克，重复注射，例如但不限于每14天，直到通过血清中的定量测定观察到抗致恶性素抗体达到最大增量时为止；
d)无糖10B或其片段肽的存在和浓度按照程序b)和/或通过测定血清中升高的抗致恶性素抗体水平加以测定；
e)程序a)至d)可以重复进行直到下列指标提示所有转化的恶性细胞都被破坏时为止，这在最后一次疫苗注射后大约90～120天：按照程序b)，血清中的抗致恶性素抗体恢复至正常水平(低于135μg/ml)；按照程序d)，无糖10B或其片段肽不存在，这些都说明，转化的恶性细胞(含有无糖抗原产物)不再存在于体内；
f)可以验证在上述治疗结束时不存在转化为恶性肿瘤的细胞，并且恶性细胞的细胞增殖程度可以在上述治疗过程中这样加以目测、定量和监测：将与99锝或其它适合的放射体缀合的抗致恶性素抗体通过静脉内方式给药，用(照相机进行记录；
g)任何顽固的恶性细胞通过抗致恶性素抗体或任意其它优先破坏恶性细胞的肿瘤化疗药物加以治疗。
实施例
实施例1
我们在这里所阐述的双盲研究证明，与非精神分裂症的精神病患者相比，精神分裂症的CSF中缀合的神经氨酸和己糖胺减少。19名患者中，有两名患者因为临床诊断不明确而被排除在外。其余17名患者，如果临床上符合，则被称为“精神分裂症”(N＝11)，若诊断不是精神分裂症，则称为“非精神分裂症”的其它精神病(N＝6)。这些诊断是在仔细的临床准备下提出的，包括由已经完成最少三年的精神病住院医师培训的精神病专家收集患者的全程病史，以及用精神病特征量表(Campbell等《美国精神病学杂志》123，952-962(1967))评价精神状态，所有诊断经过高级精神病学专家的确认。
提供17名患者的腰穿CSF标本，各为5～18ml，编号，没有临床信息。将每份样本冻干，在0-5下彻底地对蒸馏水透析(玻璃纸孔径约为MW12000道尔顿)，以除去游离的神经氨酸和游离的己糖，不可透析的部分一式两份，通过比阿耳氏苔黑酚和硫代巴比妥酸(TBA)法定量分析缀合的神经氨酸，缀合的己糖胺和缀合的己糖已如前述(S.Bogoch《生物化学杂志》235，16-20(1960))。所有样本的神经化学试验都完成后，解密患者的标识码。尽管样本量小，双尾t检验显示精神分裂症组具有统计学上显著低的缀合的神经氨酸浓度(p＜.025)和缀合的己糖胺浓度(p＜.006)，而缀合的己糖浓度不低。81.8％精神分裂症患者中缀合的神经氨酸值低于7.5μg/ml CSF，而83.3％非精神分裂症患者中缀合的神经氨酸值高于7.5μg/ml CSF。用三名患者重复试验，一名非精神分裂症和两名精神分裂症患者，他们分隔数周抽取CSF，神经化学分析结果与随机双盲样本的相似。不过，用TBA法测定缀合的神经氨酸是不可靠的(Bogoch等《自然》195，180(1962))。应当强调的是，在本项和所有以前进行的体外和体内研究中，只有缀合的、而不是游离的神经氨酸对精神分裂症具有生物学活性或起皱性(creased)。
因此，由以前的神经化学数据得出正常的“符号后”假说，但是复合糖的病理学性质直到本发明之前还不被人所理解。作为复合糖的神经氨酸和己糖胺的浓度降低的意义以前还不被人所理解。由病毒或其它急性或慢性原因引起的这些复合糖在分娩前或分娩后的减少是精神分裂症发病机理中的关键，这一点仅在现在才被认识到。综合考虑在妊娠中间三个期间，流感病毒感染与精神分裂症频率之间关系的流行病学证据，脑细胞损失和结构破坏的组织学证据，以及复合糖中神经氨酸和己糖胺浓度定量降低的直接证据，得出了本项无糖病理学发现。
实施例2
给精神分裂症患者应用神经氨酸和己糖胺前体，产生改善作用。
将D-葡糖胺HCl每天200mg经口给予住院的慢性精神分裂症患者，连续30天。应用精神病学特征等级量表以及全面的临床观察，检测改善作用的有无。一半以上的患者有良好反应，不存在事与愿违的反应。
实施例3
鸽子在训练过程中，脑复合糖己糖和14C-葡萄糖的掺入增加。
比较静息和在Skinner箱内训练的鸽子的脑的(a)复合糖己糖的绝对量和(b)掺入脑复合糖的14C-葡萄糖。
结果如下。
(a)复合糖己糖的绝对浓度
    鸽子数     平均复合糖己糖mg/g脑湿重
  静息-从未训练     21     0.63
  静息-3至11个月     11     0.69
  训练后
  训练-10分钟     1     9.0
  20分钟     1     8.8
  30分钟     5     10.0，9.8，3.9，3.5，2.7
  45分钟     1     3.5
  60分钟     5     7.8，5.5，2.4
(b)掺入鸽脑复合糖中的14C-葡萄糖
在静息期或训练期之前，给鸽子静脉注射90微居里14C-葡萄糖，经过一定时间后处死鸽子。然后提取脑蛋白，对每只鸽脑进行色谱分析，在闪烁计数器上测定放射性。在所分离的脑蛋白彻底透析后，测定该部分的总放射性，然后使该部分受到逐步酸水解，同时对定量测定的自由释放的糖进行透析。然后用薄层色谱法分离，这些糖成分用真空吸滤法提取染色的斑点以及空白，计数。
    注射后的分钟数     总脑复合糖的计数/分钟
    训练     静息
    10分钟     2000     -
    20分钟     15000     -
    30分钟     21000     1000
    45分钟     6000     35000
    60分钟     1500     -
    120分钟     -     32000
    25.5小时     -     10000
掺入的时间-过程在训练状态与静息状态明显不同。在训练状态，最大掺入发生在30分钟内，而在静息状态，此时仅掺入了同样数量的1/20。
实施例4
将小鼠分成两组，一半皮下接种脑室管膜瘤，另一半不接种。这两组各自再分成两组。一半每天接受1mg/kg体重的皮下注射DPH，另一半不接受DPH，仅注射盐水。在室管膜瘤充分生长到将要破裂皮肤表面时处死动物。在DPH给药的情况下肿瘤的生长显著减少。收集每个亚组的脑，同实施例3提取与蛋白质结合的己糖，得到下列结果。
肿瘤 脑中与蛋白质的己糖，以蛋白质的％表示
没有给予DPH 给予DPH
    不存在     4.6，5.5     7.9，8.0
    存在     2.6，2.3     6.8，7.0
无论肿瘤是否存在，给予DPH都引起脑中与蛋白质结合的己糖浓度升高。
实施例5
无糖产物的体外合成：12聚体与16聚体的合成肽
我们体外合成了测定的两个无糖10B序列(实施例8)，即12聚体的“胰蛋白酶肽”GLSDGSNTESDI和16聚体的“碘肽”YKAGVAFLHKKNDIDE。在Genosys肽合成设备中，采用Abacus系统高偶联效率的标准Fmoc化学方法，结合氨基酸的TBTU活化，与非溶胀性恒定体积的PEG聚苯乙烯树脂偶联，该树脂有助于维持高浓度的活化氨基酸，以驱使每个偶联反应进行完全。产品的纯化采用C8柱，用100％A至20％A：80％B洗脱。A是0.1％三氟乙酸(TFA)的蒸馏水溶液。B是0.1 TFA的乙腈溶液。收集所有的峰。洗脱液在220nm下读数。纯化标准如下：峰组分用质谱法测量(Perspective生产的Maldi-TOF)。进行HPLC(Perspective Biosystems生产的BioCad)以确保纯度＞95％。每种肽用质谱法和分析性HPLC进行分析，以确认肽的结构，然后再次进行制备性HPLC，分离所需的峰，终产物再次用反相HPLC和质谱法分析，得到肽的最终纯度。在12聚体肽和16聚体肽的情况下，合成肽的序列分别确认为正是用无糖10B的质谱法所测定的序列，即“胰蛋白酶肽”和“碘肽”。
实施例6
合成的无糖12聚体与16聚体肽是
体内和体外产生抗无糖产物的疫苗
在无糖10B中所测定的肽序列是用于抗致恶性素抗体产生的真正表位的证据
a) 12聚体合成肽
第1天，测定两只3～9月龄，以前没有经过注射的新西兰白兔#508和#507血清抗致恶性素抗体的基线浓度后，给每只兔子皮下注射100微克12聚体合成肽GLSDGSNTESDI，该肽是体外合成的，并与KLH(钥孔状透明血清蛋白)佐剂和弗罗因德氏佐剂缀合。在第14天和第42天，进行相同肽的加强注射。从动物耳动脉放血，通过前述标准方法测定抗致恶性素抗体浓度，如图6所示；也就是说，抗体被免疫吸附到完整的、固定的无糖10B(致恶性素)上，后者是从生长在组织培养基中的恶性成胶质细胞瘤细胞中分离得到的。在第21天、第26天和第55天对兔血清进行抗体测定。两只(2/2)兔子都产生了超过未注射基线血清水平的抗致恶性素抗体。
图7A显示#508兔每次放血时的抗致恶性素抗体浓度，既有快结合抗体(F-TAG，空心柱)，也有慢结合抗体(S-TAG，实心柱)。我们看到S-TAG浓度增加到最大量时大约是基线水平的七倍。
图7B显示#507兔每次放血时的抗致恶性素抗体浓度，既有快结合抗体(F-TAG，空心柱)，也有慢结合抗体(S-TAG，实心柱)。我们看到S-TAG浓度与基线水平相比，增加大约三倍，F-TAG浓度与基线水平相比，增加大约五倍。图7B还显示了#507兔第26天放血和#508兔较少程度第21天放血表明的事实，即F-TAG的增加在S-TAG浓度的最大增加之前。这种先于S-TAG增加的F-TAG增加与体外观察结果相同，该结果观察了完整的无糖10B诱导组织培养物中所分离的淋巴细胞产生抗致恶性素抗体(《 癌症的检测和预防》12：313-320，1988)。给兔子注射合成肽表位重复出现这种现象进一步确认这样的事实，合成肽确实复制抗致恶性素抗体的产生并释放进入血清。
除了产生新颖的合成产物以外，这些合成肽在注射给动物时诱导高浓度抗致恶性素抗体产生的事实确立了天然生物无糖物质事实上参与在人癌症中所发现的免疫应答(见图6)。
正如以前在1988年的一项研究( 《癌症的检测和预防》12：313-320，1988)中所测定的，对抗无糖10B的抗致恶性素抗体是IgM型的，没有或几乎没有IgG型。在现在的研究中，将全合成的抗原、即12聚体的合成肽注射给兔子，单独测定所产生的抗体，以测定是否IgG是更普遍的。于是也用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定抗肽抗体效价，其中游离的合成16聚体肽结合在固相中(1μg/ml)。结果以血清稀释度的倒数表示，OD405为0.2。利用生物素标记的抗兔IgG、HRP-SA缀合物和ABTS进行检测。两只兔子#507和#508注射后的IgG水平与注射前没有区别--都低于50。不过，参见下列16聚体合成肽的结果。
b) 16聚体合成肽
类似地在第1天，测定两只3～9月龄，以前没有经过注射的新西兰白兔#505和#506血清抗致恶性素抗体的基线浓度后，给每只兔子皮下注射100微克16聚体合成肽YKAGVAFLHKKNDIDE，该肽如下所述体外合成，并与KLH(钥孔状透明血清蛋白)佐剂和弗罗因德氏佐剂缀合。在第14天和第42天，进行相同肽的加强注射。从动物耳动脉放血，通过如图6所示的标准方法测定抗致恶性素抗体浓度。也就是说，抗体被免疫吸附到完整的、固定的无糖10B(致恶性素)上，后者是从生长在组织培养基中的恶性成胶质细胞瘤细胞中分离得到。在第21天、第26天和第55天对兔血清进行抗体测定。两只(2/2)兔子都产生了另外的抗致恶性素抗体。
关于16聚体的合成肽，图8A显示#505兔每次放血时的抗致恶性素抗体浓度，既有快结合抗体(F-TAG，空心柱)，也有慢结合抗体(S-TAG，实心柱)。我们看到S-TAG浓度增加了，但没有图7A或7B中12聚体合成肽增加的那么多。
图8B显示#506兔每次放血时的抗致恶性素抗体浓度，既有快结合抗体(F-TAG，空心柱)，也有慢结合抗体(S-TAG，实心柱)。我们看到S-TAG浓度增加了大约2.5倍。
类似地，用12聚体合成肽或16聚体合成肽诱导在组织培养基中体外分离的淋巴细胞，用量为1～10mg/ml，以复制抗致恶性素抗体。在这种产生作用中，刺激性肽是合成的12聚体或16聚体肽，而不是完整的无糖10B，我们所用的方法见《癌症的检测和预防》12：313-320，1988。
正如以前在1988年的一项研究中所测定的，若“生物学”完整的无糖10B是抗原，则体内和体外产生的抗致恶性素抗体都是IgM型的，没有或几乎没有 IgG型。在现在的研究中，将全合成的抗原、即16聚体的合成肽注射给兔子，单独测定所产生的抗体，以测定是否存在IgG。于是也用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定抗肽抗体效价，其中游离的合成16聚体肽结合在固相中(1μg/ml)。结果以血清稀释度的倒数表示，OD405为0.2。利用生物素标记的抗兔IgG、HRP-SA缀合物和ABTS进行检测。与用12聚体合成肽所得结果相反，关于16聚体合成肽，两只兔子#507和#508注射后的IgG水平上升到非常高的水平。#507和#508兔的注射前水平都低于50；#507兔第26天水平为18031，#508兔为71326；#507和#508兔第55天水平都超过204800。因此，通过16聚体合成肽的注射，不仅产生IgM型产物，而且已经产生了IgG型抗致恶性素抗体。
由于以前注射“生物学”完整的无糖10B给动物和淋巴细胞的组织培养基都总是产生IgM型抗致恶性素抗体，而且从人血清中分离的人抗体也是IgM型的，因此假定这种抗体不转化为IgG型，与大多数、但不是全部抗体的情况相同。因此通过16聚体合成肽的注射而产生的IgG型抗致恶性素抗体是一种新型抗体。IgG型优于IgM型，因为IgG型分子量更小(150000对900000道尔顿)，因此将比IgM型更容易进入细胞外与细胞内间隙。这与抗体的扫描和治疗用途都有关，而且抗体可以单独使用或者作为化疗药物的载体。
实施例7
抗致恶性素抗体的正常浓度与升高浓度范围
的确定
升高的抗体仅与恶性转变有关
在上述研究的继续和扩展研究中，有9873名个体，包括健康对照、医学病症、乳腺癌和其它与细胞类型无关的常见癌症，向恶性状态的转变已经显示与在数天内增加134μg/ml以上)的特异性抗体、即血清抗致恶性素抗体(AMAS)浓度有关，浓度用免疫吸附法对抗固定化无糖10B抗原测定(正常水平为0～134μg/ml血清)。这些水平已经在本研究中得到证实。如图10所示，在炎症状态没有恶性转化的情况下不发生抗致恶性素抗体浓度的增加；在没有转化的纯增殖状态，如在良性肿瘤中，也没有抗致恶性素抗体浓度的增加。图6显示，在并非恶性或终末期的早期活动型临床癌症中，浓度增加超过正常水平仅发生于恶性转化，如图6(原发性)肝癌和其它癌症。由于癌细胞膜糖蛋白10B的碳水化合物单元丧失而发生这种免疫应答，结果潜在的肽表位暴露，这些表位被识别为外来物质，随后产生抗致恶性素抗体。图6中包括正常个体的结果，作为肝炎/肝硬化结果的对照。
图6显示了在美国和亚洲个体中测定的抗无糖10B抗体(抗致恶性素抗体)浓度。美国和亚洲健康对照出现“假阳性”(上升)的比例分别为4.5％和8％，相形之下，发现抗致恶性素抗体浓度增加超过134μg/ml的比例，在乙型或丙型肝炎/肝炎后肝硬化患者中为35.5％，在慢性乙型或丙型肝炎病毒感染继发的明确临床癌症患者中为75％(有些可能是终末期，于是抗体减少)，其它癌症为95％。由于全部对照组个体随机散布于肝炎病例中，并采取育法测定，因此对照组与肝炎病例之间的差异是非常显著的(p＜.001)。由于这种抗体浓度在很多其它病毒病症，其它炎症，其它感染性或医学病症，或者与肝炎、肝硬化或恶性肿瘤无关的健康对照中不增加，因此可以得出结论，如其他肿瘤一样，所观察到的抗致恶性素抗体增加意味着恶性细胞的存在。因此，乙型或丙型肝炎阳性个体抗致恶性素抗体浓度的测定(1)使人病毒致癌发生的早期阶段检测成为可行，(2)使乙型或丙型肝炎病毒感染中进行恶性转变比先前可能更早的检测和治疗成为可行。
此外，恶性肿瘤表位的序列已经通过水解和质谱法加以测定，并合成。这些合成的肽作为疫苗，可用于增加对癌细胞特异性的免疫应答。这些肽已经显示可以增加抗致恶性素抗体的浓度，该抗体在皮下注射后，在微微克(费摩尔)每癌细胞剂量下具有细胞毒性(图5)。
类似地，在AIDS患者中出现临床癌症之前很久就已观察到这种血清抗无糖10B(抗致恶性素)抗体浓度上升超过134μg/ml。因此得出结论，早期恶性转化提示细胞的永生化已经发生了，从而成为HIV病毒的安全屏障。因此，这些安全屏障可以象治疗乙型或丙型肝炎一样加以治疗。
实施例8
大量人群血液和其它体液中12聚体与
16聚体肽的定量测定的自动化方法
以前没有描述过12聚体与16聚体肽表位的常规定量测定方法，事实上也没有适合于诊断用途的血液或其它体液中完整无糖10B抗原常规定量测定方法，更没有适用于大量人群的方法。目前可用于血液中抗原测定的方法例如使用肿瘤标记物CEA、PSA和CA125，不是非常可靠，实际应用也有限，因为它们得出大量假阴性和假阳性结果。例如，前列腺特异性产物释放进入血清的PSA假阳性率范围为15％～70％，反映了良性前列腺增生或运动，而不是前列腺癌。数以千计的实验室在进行测定时很少进行实验室间的质量控制，导致实验室之间的结果没有可比性。因此，需要发明新的更加可靠的方法，适合于大量人群，经济实用。此外，因为血清抗致恶性素抗体浓度测定的使用作为恶性或终末期癌症诊断的辅助手段不是很有效，因为此时抗体的免疫应答失败而且已知在疾病晚期更常发生抗原释放进入血液，所以，测定释放进入血液的抗原的方法更加有用，但是直到本发明以前还没有可以利用的方法。
下列方法可用于无糖10B的12聚体与16聚体肽(抗原)的测定，此外还可用于血液或其他细胞外液中任何已知的肿瘤标记物或任何其它可检测产物。可用于该方法的是一种试剂盒，含有(1)无菌的、带条形码的、带刻度的、塑料收集吸移管，具有膨大的头部，包括可压缩的球(“球部”)和带刻度的透明锥形茎(“茎部”)，直径约0.1～0.3mm，长约3～10cm，例如由Corning Samco制造的转移吸移管。吸移管茎部内壁涂有抗致恶性素抗体、蛋白酶抑制剂和抗凝剂；(2)无菌的柳叶刀，用于刺破手指取一滴血；和(3)申请表。将一滴血吸入吸移管尖，将试剂盒邮寄到指定的实验室。所收集和运送的试剂盒优选为足够小的，以便装入大约4×9-10英寸的带条形码的商业信封内。
涂有抗体、蛋白酶抑制剂和抗凝剂的收集吸移管的制备
将吸移管涂以抗致恶性素抗体，优选借助吸移管头的可压缩球部从溶液储液器(“抗体储液器”)中吸取吸移管茎部全长的溶液，该溶液含有约200μg/ml的抗致恶性素抗体加蛋白酶抑制剂(例如，每50ml一片Boehringer Mannheim“完全”蛋白酶抑制剂，其中还含有EDTA抗凝剂)，使溶液留在吸移管内，优选过夜，以便抗体能够吸附于吸移管壁。然后排出溶液。该制备过程可以通过仪器(“自动吸移管装填-排放器”)自动进行，其中，每支吸移管茎顶部被挤压夹垂直固定，一系列吸移管就这样保持在适当的位置，仪器内还含有两个水平金属条，大约1/4英寸厚，1英寸宽，吸移管头排列在它们之间。通过同时移动两个水平金属条，挤压吸移管头部的可压缩球部，排出吸移管的内容物。通过分开两个水平金属条，放松吸移管头部的可压缩球部，从浸在储液器液体中的吸移管尖将储液器液体吸入吸移管茎部。将溶液排放到储液器后，将吸移管内壁风干，方法是在没有储液器的存在下，反复自动地挤压和释放可压缩球部，使空气吸入和吹出吸移管尖，直到吸移管干燥为止。填装一系列吸移管后测定储液器液体的浓度；如果储液器内抗体浓度低于100μg/ml，那么向储液器溶液中加入抗体和蛋白酶抑制剂，使浓度重新达到大约200μg/ml。吸移管装填-排放器整体能够倾斜大约45度，以便在一种位置时将吸移管尖放入储液器，在另一种位置时将吸移管尖放入另一个储液器或废液排放容器或空气中。
用于实验室测定的样本获得和运送
在血液样本的情况下，试剂盒优选含有至少一支涂过溶液的吸移管、柳叶刀和申请表，申请表含有吸取血液和运送给实验室的要求，以及医师的姓名和地址，以便实验室将测定结果发送给医师。个人可以填好申请表，放入邮件。仔细地洗手，刺破指尖，然后压缩吸移管头的球部，将血液吸入吸移管茎尖。然后将样本邮寄给实验室。
在除血液以外的体液样本情况下，试剂盒内可以包括特别的要求。
12聚体与16聚体肽的实验室定量测定
实验室收到试剂盒后，进行下列常规操作，不过技术人员在必要时可以进行修改：(1)实验室技术员将每支吸移管在自动吸移管装填-排放器中按顺序夹好；(2)用条形码读数器自动记录每支吸移管的条形码数，输入对自动吸移管装填-排放器进行操作的计算机(测定结果也列在该数字下)；(3)技术员将每支吸移管内的血液体积和所有申请表数据记录在计算机中的条形码数下；(4)血液通过自动吸移管装填-排放器排放到废液容器(储液器A)中；(5)自动吸移管装填-排放器自动从另一个储液器(储液器B)中吸取磷酸盐缓冲盐水(PBS)，洗涤吸移管内壁两次，每次洗液自动排放到废液容器(储液器A)中，方法是将自动吸移管装填-排放器交替倾斜45度，以便吸移管尖交替与废液容器和含有磷酸盐缓冲盐水的储液器接近；(6)将抗致恶性素抗体从另一个储液器(储液器C)中吸入吸移管，保持与吸移管壁接触两小时，然后排放到废液容器(储液器A)中；(7)吸移管再次用PBS洗涤两次，同上步骤(5)；(8)将大约100μg/ml的与抗人抗体，例如羊或兔抗人抗体结合的发光发射体，例如吖啶_酯吸入吸移管，保持与吸移管壁接触30分钟；(9)按照上步(5)将吸移管用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次；(10)用发光计测量所发射的光，将发光计旋转调整到适当的位置，使其接收发光的端口指向吸移管的茎部；和(11)每支吸移管的发光结果以发光单位计数，通过相同操作测定基于已知量的12聚体与16聚体肽的等摩尔混合物的标准曲线，由该曲线经过计算将发光结果转化为肽的微克数，结果对每支吸移管内最初血液体积进行修正，打印出来和/或传送到任意的电子数据储存文档中。
家用试剂盒
或者，尤其对于日常监测血液或其他体液(下称“血液”)抗12聚体与16聚体肽抗体浓度来说，不用将血液邮寄给实验室，向个人或有能力的亲属提供用于在家中进行测定的设备和指导，发光计的读数不被个人观测到，而是通过国际互连网或其它电子装置自动传送给实验室或医师。于是，个人通过电子方式输入申请表信息，通过电子方式读取和输入吸移管内血液体积，将装有血液的吸移管放入冰箱(0～5℃)(不冷冻)约两个小时，取出吸移管，将血液排放到将要邮寄给实验室的、拉锁密封的塑料废液容器中，用所提供的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤吸移管两次，PBS排放到废液容器中，将大约100μg/ml的与抗人抗体，例如羊或兔抗人抗体结合的发光发射体，例如但不限于吖啶_酯吸入吸移管，保持与吸移管壁接触30分钟。将吸移管内容物排放到废液容器中，吸移管用PBS洗涤两次，PBS也排放到废液容器中。将吸移管插入发光计数，测量所发射的光。每支吸移管的结果以发光单位计，通过国际互联网或其它电子装置自动传送给实验室或医师，通过相同操作测定基于已知量的抗致恶性素抗体的标准曲线，由该曲线经过计算将发光结果转化为抗致恶性素抗体蛋白的微克数，结果对吸移管内最初血液体积进行修正，打印出来和/或传送到任意的电子数据储存文档中。
实施例9
大量人群血液和其它体液中抗12聚体与
16聚体肽特异性抗体的定量测定的自动化方法
现在可用于测定抗这两种肽抗体(抗致恶性素抗体)的方法尽管小心操作，是定量和可靠的，但在实际应用却明显受限，因为它们需要特殊的管子用于吸取和运送，需要实验室、静脉切开者或医师从静脉采集血样，需要用于凝血、冷冻离心、立即在干冰上运送过夜的操作--所有这些都费时，或者在大多数地区不易获得，并且价格昂贵。另外，目前的试剂制备方法是用生物学方法从生长在组织培养基中的恶性成胶质细胞瘤细胞产生的共价结合的致恶性素，经提取、分离、纯化和与溴乙酰纤维素共价结合得到的--立即用昂贵的、手工的、非自动化的6小时免疫吸附法测定，该方法按照标准要求更多的人员训练，并在操作中需要极其仔细小心。因此，适合于大量人群的经济实用的新方法是必要的。
在抗体的吸取、运送和立即测定时，采取大多数上述预防措施以避免由于在抗体吸附管内贮存血清或在低于-70℃的温度下贮存超过8小时而发现的损失或再现性( 《癌症的检测和预防》11：100，1987)。现已发现，这些昂贵和费时的预防措施不便普及，但如果在含有抗凝剂和蛋白酶抑制剂的容器内收集和运送全血，并且肽或抗体分别用与发光底物结合的肽抗体自动测定，那么这些措施是不必要的。本发明提供一种价格适宜的抗致恶性素抗体的测试方法，适用于大量人群。
下列方法用于抗12聚体与16聚体合成肽(抗原)抗体的一般测定，此外还能用于血液或其它细胞外液中的任何其它抗体的测定。
下列试剂盒可用于进行该操作，它含有(1)无菌的、带条形码的、带刻度的、塑料收集吸移管，具有膨大的头部，包括可压缩的球(“球部”)和带刻度的透明锥形茎(“茎部”)，直径约0.1～0.3mm，长约3～10cm，例如由Corning Samco制造的转移吸移管。吸移管茎部内壁涂有12链节和16链节合成肽等摩尔混合物、蛋白酶抑制剂和抗凝剂；(2)无菌的柳叶刀，用于刺破手指取一滴血；和(3)申请表。将一滴血吸入吸移管尖，将试剂盒邮寄到指定的实验室。所收集和运送的试剂盒是足够小的，以便装入大约4×9-10英寸的带条形码的商业信封内。
涂有12聚体与16聚体合成肽、蛋白酶抑制剂
和抗凝剂的收集吸移管的制备
将吸移管涂以12聚体与16聚体合成肽的等摩尔混合物(“肽”)，优选借助吸移管头的可压缩球部从溶液储液器(“肽储液器”)中吸取吸移管茎部全长的溶液，该溶液含有约200μg/ml的12聚体与16聚体合成肽的一种或等摩尔混合物，加蛋白酶抑制剂(例如，每50ml一片Boehringer Mannheim“完全”蛋白酶抑制剂，其中还含有EDTA抗凝剂)，使溶液留在吸移管内，优选过夜，以便抗体能够吸附于吸移管壁。然后排出溶液。该制备过程可以通过仪器(“自动吸移管装填-排放器”)自动进行，其中，每支吸移管茎顶部被挤压夹垂直固定，一系列吸移管就这样保持在适当的位置，仪器内还含有两个水平金属条，大约1/4英寸厚，1英寸宽，吸移管头排列在它们之间。通过同时移动两个水平金属条，挤压吸移管头部的可压缩球部，排出吸移管的内容物。通过分开两个水平金属条，放松吸移管头部的可压缩球部，从浸在储液器液体中的吸移管尖将储液器液体吸入吸移管茎部。将溶液排放到储液器后，将吸移管内壁风干，方法是在没有储液器的存在下，反复自动地挤压和释放可压缩球部，使空气吸入和吹出吸移管尖，直到吸移管干燥为止。填装一系列吸移管后测定储液器液体的浓度；如果储液器内抗体浓度低于100μg/ml，那么向储液器溶液中加入抗体和蛋白酶抑制剂，使浓度重新达到大约200μg/ml。吸移管装填-排放器整体能够倾斜大约45度，以便在一种位置时将吸移管尖放入储液器，在另一种位置时将吸移管尖放入另一个储液器或废液排放容器或空气中。
用于实验室测定的样本获得和运送
在血液样本的情况下，试剂盒优选含有至少一支涂过溶液的吸移管、柳叶刀和申请表，申请表含有吸取血液和运送给实验室的要求，以及医师的姓名和地址，以便实验室将测定结果发送给医师。个人可以填好申请表，放入邮件。仔细地洗手，刺破指尖，然后压缩吸移管头的球部，将血液吸入吸移管茎尖。然后将样本邮寄给实验室。
在除血液以外的体液样本情况下，试剂盒内可以包括特别的要求。
抗无糖10B 12聚体与16聚体肽抗体
的实验室定量测定
实验室收到试剂盒后，(1)实验室技术员将每支吸移管在自动吸移管装填-排放器中按顺序夹好；(2)用条形码读数器自动记录每支吸移管的条形码数和所有申请表数据，输入对自动吸移管装填-排放器进行操作的计算机(测定结果也列在该数字下)；(3)技术员将每支吸移管内的血液体积记录在计算机中的条形码数下；(4)血液通过自动吸移管装填-排放器排放到废液容器(储液器A)中；(5)自动吸移管装填-排放器自动从另一个储液器(储液器B)中吸取磷酸盐缓冲盐水(PBS)，洗涤吸移管内壁两次，每次洗液自动排放到废液容器(储液器A)中，方法是将自动吸移管装填-排放器交替倾斜45度，以便吸移管尖交替与废液容器和含有磷酸盐缓冲盐水的储液器接近；(6)将抗致恶性素抗体从另一个储液器(储液器C)中吸入吸移管，保持与吸移管壁接触两小时，然后排放到废液容器(储液器A)中；(7)吸移管再次用PBS洗涤两次，同上步骤(5)；(8)将大约100μg/ml的与抗人抗体，例如羊或兔抗人抗体结合的发光发射体，例如吖啶_酯吸入吸移管，保持与吸移管壁接触30分钟；(9)按照上步(5)将吸移管用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次；(10)用发光计测量所发射的光，将发光计旋转调整到适当的位置，使其接收发光的端口指向吸移管的茎部；和(11)每支吸移管的发光结果以发光单位计数，通过相同操作测定基于已知量抗致恶性素抗体的标准曲线，由该曲线经过计算将发光结果转化为肽的微克数，结果对每支吸移管内最初血液体积进行修正，打印出来和/或传送到任意的电子数据储存文档中。
家用试剂盒
或者，尤其对于日常监测血液或其他体液(下称“血液”)抗12聚体与16聚体肽抗体浓度来说，不用将血液邮寄给实验室，向个人或有能力的亲属提供用于在家中进行测定的设备和指导，发光计的读数不被个人观测到，而是通过国际互连网或其它电子装置自动传送给实验室或医师。于是，个人通过电子方式输入申请表信息，通过电子方式读取和输入吸移管内血液体积，将装有血液的吸移管放入冰箱(0～5℃)(不冷冻)约两个小时，取出吸移管，将血液排放到将要邮寄给实验室的、拉锁密封的塑料废液容器中，用所提供的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤吸移管两次，PBS排放到废液容器中，将大约100μg/ml的与抗人抗体，例如羊或兔抗人抗体结合的、发光发射体、例如但不限于吖啶_酯吸入吸移管，保持与吸移管壁接触30分钟。将吸移管内容物排放到废液容器中，吸移管用PBS洗涤两次，PBS也排放到废液容器中。将吸移管插入发光计，测量所发射的光。每支吸移管的结果以发光单位计数，通过国际互联网或其它电子装置自动传送给实验室或医师，通过相同操作测定基于已知量的抗致恶性素抗体的标准曲线，由该曲线经过计算将发光结果转化为抗致恶性素抗体蛋白的微克数，结果对吸移管内最初血液体积进行修正，打印出来和/或传送到任意的电子数据储存文档中。
实施例10
无糖10B的结构
A.无糖10B的碘代苯甲酸水解之后进行埃德曼降解，得到具有下列序列的肽(“碘肽”)：
                Y  K  A  G  V  A  F  L  H  K  K  N  D  I  D  E
氨基酸残基编号：1  2  3  4  5  6  7  8  9  10 11 12 13 14 15 16
B.质谱法之后利用Perkin Elmer Sciex仪器公司的MacBioSpec Software Manual 013048-A，PESCIEX进行计算，得到肽YKAGVAFLHKKNDIDE的下列性质：
N-端基团：                       氢C-端基团：游离酸
MH+单同位素质量＝1847.9656amu    HPLC指数＝43.40
MH+平均质量＝1849.0998amu        Bull & Breese值＝-80
等电点(pl)＝8.0                  元素组成：C84H131N22O25
C.质谱法：上述1A中通过碘代苯甲酸水解得到的“碘肽”的序列独立通过无糖10B片段质谱法加以确认，该片段是通过如下所述溶液中的无糖10B和固定在溴乙酰纤维素上的无糖10B(无糖10BC或A10BC)的四种不同酸水解而得到的。这些水解作用产生13种重叠的水解片段(其中下面两个6-10和6-12是用两种不同的水解方法得到的)。这些重叠片段一起独立确认了“碘肽”YKAGVAFLHKKNDIDE的肽序列如下。
  鉴定的片段(氨基酸残基编号) MH+(质量) 序列*   获得片段的方法
Aalvco 10B自动水解** A10BC自动水解 A10BC微波5秒 A10BC微波30秒
    1-31-52-62-74-115-76-76-106-106-126-127-810-1611-1412-15   381.21537.30445.28592.35899.55336.19237.12615.36615.36857.50857.50279.17861.43489.27476.20   ()YKA(G)()YKAGV(A)(Y)KAGVA(F)(Y)KAGVAF(L)(A)GVAFLHKK(N)(G)VAF(L)(V)AF(L)(V)AFLHK(K)(V)AFLHK(K)(V)AFLHKKN(D)(V)AFLHKKN(D)(A)FL(H)(H)KKNDIDE()(K)KNDI(D)(K)NDID(E) ++++ +++++ ++     ++++
*氨基酸的标准字母代码如下：Y＝酪氨酸；K＝赖氨酸；A＝丙氨酸；G＝甘氨酸；V＝缬氨酸；F＝苯丙氨酸；L＝亮氨酸；H＝组氨酸；N＝天门冬酰胺；D＝天门冬氨酸；I＝异亮氨酸；E＝谷氨酸。()＝与片段N-端和C-端氨基酸连接的氨基酸。
**溶液中的完整无糖10B是强酸，等电点约为2.7，置于室温下数小时或0-5℃下更长时间可自动水解。
C.无糖10B的胰蛋白酶水解之后进行埃德曼降解，得到具有下列序列的肽(“胰蛋白酶肽”)：
                G  L  S  D  G  S  N  T  E  S  D  I
氨基酸残基编号：1  2  3  4  5  6  7  8  9  10 11 12
D.无糖10B水解片段质谱法之后利用Perkin Elmer Sciex仪器公司的MacBioSpec Software Manual 013048-A，PESCIEX进行计算，得到“胰蛋白酶肽”GLSDGSNTESDI的下列性质：
N-端基团：氢                     C-端基团：游离酸
MH+单同位素质量＝1194.5126amu    HPLC指数＝0.70
MH+平均质量＝1195.1817amu        Bull & Breese值＝2690
等电点(pl)＝4.4                  元素组成：C46H76N13O24
E.质谱法：上述2C中通过胰蛋白酶水解得到的“胰蛋白酶肽”的序列独立通过无糖10B片段质谱法加以确认，该片段是通过如下所述溶液中的无糖10B和固定在溴乙酰纤维素上的无糖10B(无糖10BC或A10BC)的四种不同酸水解而得到的。这些水解作用产生7种重叠的水解片段，这些重叠片段独立确认了“胰蛋白酶肽″(G)LSDGSNTESD(I)的肽序列的2-11残基如下。
鉴定的片段(氨基酸残基编号) MH+(质量) 序列*   获得片段的方法
  Aalvco 10B自动水解**   A10BC自动水解   A10BC微波5秒   A10BC微波30秒
    2-73-54-64-115-86-108-10  592.26278.10278.10824.29378.16537.22336.14 (G)LSDGSN(T)(L)SDG(S)(S)DGS(N)(S)DGSNTESD(I)(D)GSNT(E)(G)SNTES(D)(N)TES(D) + ++     ++++
*氨基酸的标准字母代码如下：G＝甘氨酸；L＝亮氨酸；S＝丝氨酸；D＝天门冬氨酸；N＝天门冬酰胺；T＝苏氨酸；E＝谷氨酸；I＝异亮氨酸。
**溶液中的完整无糖10B是强酸，等电点约为2.7，在室温下数小时或0-5℃下更长时间可自动水解。
F.无糖10B的CNBr水解之后进行埃德曼降解，得到具有下列序的二肽(“CNBr肽”)：M  D
氨基酸残基编号：    1  2
G.无糖10B中，存在色基(“发色团”)，使无糖10B的浓溶液(＞100μm/ml)微呈黄色，并显示如图5所示的吸收光谱。在整个纯化阶段，包括高效液相色谱法在内，发色团都保留在无糖10B中。
通过排空和热密封含有无糖10B溶液的玻璃管，用氮取代氧，则无糖10B溶液变为深绿色。
若玻璃管敞开在空气中，则溶液立即回复为黄色。
由于从氧合状态的黄色转变为缺氧状态的深绿色、再回到氧合状态的黄色是可逆的转变，仅与氧的存在或不存在有关，因此得出结论，颜色改变是发色团的可逆性氧化-还原性质。
H.克隆无糖10B的基因
通过本领域熟知的方法，无糖10B以及具有完整氨基酸序列的10B的基因利用上述“碘肽”或上述“胰蛋白酶肽”或二者加以衍生，以构建正常和转化神经胶质细胞文库的RNA和cDNA探针。无糖10B和糖蛋白10B的基因整体或其结构片段可以用作疫苗。另外，完整的基因或其部分可被引入各种熟知的表达系统，以产生完整的10B糖复合蛋白或无糖10B，这些产物可作为疫苗用于患者或动物，以产生抗完整分子或其片段的特异性抗体。由于已知糖蛋白10B参与所有动物的认识和认知训练，因此能够通过给药来改善动物和人的认知功能。
序列表
<110>Bogoch，Samuel
     Bogoch，Elenore S.
<120>无糖产物和使用方法
<130>09425/468762
<140>
<141>
<150>09/146,755
<151>1998-09-04
<150>08/198,139
<151>1994-02-17
<160>2
<170>patentIn Ver.2.0
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>脑神经胶质瘤
<400>1
Tyr Lys Ala Gly Val Ala Phe Leu His Lys Lys Asn Asp Ile Asp Glu
  1               5                  10                  15
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>脑神经胶质瘤
<400>2
Gly Leu Ser Asp Gly Ser Asn Thr Glu Ser Asp Ile
  1               5                  10

Claims (13)

1、一种分离的复合糖，包含至少一种碳水化合物部分，该部分与具有序列1的氨基酸序列的肽共价结合。
2、具有序列1的氨基酸序列的分离的肽。
3、权利要求1的分离的复合糖或权利要求2的分离的肽在制备用于抑制或防止流感病毒颗粒附着于人类患者细胞的药物中的用途。
4、权利要求3的用途，其中该复合糖包含神经氨酸-己糖胺键。
5、权利要求3的用途，其中该患者处于妊娠的第一个或第二个三月期。
6、一种纯化的单克隆抗体，该抗体特异性识别具有序列1的氨基酸序列的肽。
7、用于增加有需要的患者抗致恶性素抗体浓度的治疗组合物，包含一种肽，该肽是序列1的肽。
8、序列1的肽在制备用于治疗慢性病毒感染的药物中的用途。
9、权利要求8的用途，其中该慢性病毒感染是HIV。
10、包含纯化抗体的治疗组合物，该抗体特异性识别一种肽，该肽是序列1的肽。
11、用于测定存在于患者血液中的抗致恶性素抗体浓度的试剂盒，包含至少一支血液收集管或吸移管和具有序列1的氨基酸序列的肽。
12、权利要求11的试剂盒，其中该肽是包被在试管或吸移管内表面上的。
13、分离的核酸，编码具有序列1的氨基酸序列的肽。
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