DE10034712A1 - Verbrückte Glykokonjugate - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Glykokonjugate, bei denen ein Proteinanteil über eine Kohlenhydratkette mit einem weiteren Proteinanteil, einer Nukleinsäure oder einem Lipid bzw. einer Micelle kovalent verbrückt ist. Die Verbrückung erfolgt über eine im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen natürlicherweise nicht vorkommende und an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest der Kohlenhydratkette gekoppelte chemische Gruppe. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Glykokonjugate, bei dem in einem ersten Schritt eukaryontische Zellen in Anwesenheit eines nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrats kultiviert werden, und in einem zweiten Schritt ein kovalentes Verbrücken des im ersten Schritt isolierten Glykoproteins mit dem Kohlenhydratanteil eines Glykoproteins, mit einer Nukleinsäure oder einem Lipid über eine dort natürlicherweise nicht vorkommende reaktive chemische Gruppe erfolgt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Glykokonjugate, bei denen ein Proteinanteil über eine Kohlenhydratkette mit einem weiteren Proteinanteil, einer Nukleinsäure oder einem Lipid bzw. einer Micelle kovalent verbrückt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung solcher Glykokonjugate.

Die metabolische Markierung von in vivo exprimierten Proteinen durch Gabe eines Vorläufermoleküls an Zellen, die die Proteine exprimieren und das Vorläufermolekül in den Stoffwechselweg einschleusen und während der Biosynthese in das Protein einbauen, ist eine Standardtechnik der Zellbiologie. Im Falle von Glykoproteinen können zur metabolischen Markierung beispielsweise radioaktiv markierte, physiologische (d. h. im Stoffwechsel von Zellen natürlicherweise vorkommende) Kohlenhydratbausteine verwendet werden, die in die Oligosaccharidseitenketten der Glykoproteine eingebaut werden, wodurch diese Proteine radioaktiv markiert werden.

Es ist auch möglich, chemisch modifizierte unphysiologische Kohlenhydratderivate in den Biosyntheseweg von Zellen einzuschleusen, wobei diese Derivate von den Zellen direkt oder nach metabolischer Umwandlung der Kohlenhydratgrundstruktur in die Glykoproteine eingebaut werden.

Kayser et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992), S. 16934-16938) beschreiben die Markierung von Glykoproteinen in vivo durch die Verabreichung von radioaktiv markiertem N- Propanoyl-D-mannosamin und N-Propanoyl-D-glucosamin an Ratten. Dabei zeigte sich, daß die Propanoylhexosamine in den Stoffwechselweg eingeschleust und als N- Propanoylneuraminsäuren in die Glykoproteine eingebaut wurden.

In einer Reihe anschließender Untersuchungen wurden mit diesem Ansatz, d. h. der Gabe unterschiedlicher N-substituierter Mannosaminderivate, die nach metabolischer Umwandlung als Sialinsäurederivate in die membranständigen Glykoproteine der. Plasmamembran eingebaut werden, die Zelloberflächen verschiedener Zellen modifiziert.

So wurde von Keppler et al. (J. Biol. Chem. 270 (1995), S. 1308-1314) die Sialinsäure­ abhängige Bindung verschiedener Polyoma-Viren an humane B-Lymphomzellen (BJA-B) und an Vero-Zellen untersucht. Zu diesem Zweck wurden in der Zellkultur verschiedene N-acylierte Mannosaminderivate als Sialinsäure-Vorläufermoleküle eingesetzt, wobei die Acyl-Gruppe aus einem Propanoyl-, einem Butanoyl- bzw. einem Pentanoylrest bestand. Es zeigte sich, daß 50% der physiologischen N-Acetylneuraminsäurebausteine der Zelloberflächenglykoproteine durch die jeweiligen modifizierten N- Acylneuraminsäurebausteine ersetzt wurden.

Wieser et al. (FEBS Letters 395 (1996), S. 170-173) untersuchten die Aufnahme von N- Propanoyl-, N-Butanoyl- und N-Pentanoylmannosamin in humane diploide Lungenfibroblasten. Es wurde ein verändertes Wachstumsverhalten beobachtet, was auf die veränderte Zelloberflächensialylierung zurückgeführt wurde.

Herrmann et al. (J. Virol. 71 (1997), S. 5922-5931) untersuchten die Bindung eines Maus-Polyoma-Virus an die Zellinie 3T6 (embryonale Maus-Fibroblasten). Durch Substitution der physiologischen N-Acetylneuraminsäuren auf der Zelloberfläche durch N-Propanoyl-, N-Butanoyl- und N-Pentanoylsialinsäuren nahm die Infektionsrate durch die Viren erheblich ab. Dies wurde auf die reduzierte Bindung des viralen Rezeptors an die artifiziellen Neuraminsäuren zurückgeführt.

Ebenfalls mit dem Ziel, die Zelloberflächen zu modifizieren, wurden von Mahal et al. (Science 276 (1997), S. 1125-1128) verschiedene Zellinien in Anwesenheit von N- Lävulinoylmannosamin kultiviert. Nach metabolischer Umsetzung exponierten die Zellen reaktive Ketongruppen auf der Zelloberfläche, die von den Lävulinoylresten der nicht- physiologischen Neuraminsäuren stammten. Die Ketongruppen wurden dann mit Biotinamidocaproylhydrazid umgesetzt und durch anschließende Bindung von Fluoreszein-Avidin nachgewiesen bzw. zur Bindung eines Ricin-Avidinkonjugats zum selektiven Abtöten der Zellen verwendet.

Von Yarema et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998), S. 31168-31179) wurde ebenfalls die Oberflächenmanipulation von Zellen durch metabolische Umsetzung mit N- Lävulinoylmannosamin und nachfolgender selektiver chemischer Reaktion der durch die Umsetzung auf der Zelloberfläche exprimierten Ketongruppen mit Aminooxy-Galaktose und einem Lactose-Hydrazid beschrieben. Die resultierenden zusätzlichen Galaktose- bzw. Lactosereste wurden anschließend mit Fluorescein-markiertem Ricin nachgewiesen.

Saxon und Bertozzi (Science 287 (2000), S. 2007-2010) konnten zeigen, daß nach Inkubation von Jurkat-Zellen in Anwesenheit von peracetyliertem Azidoacetylmannosamin freie Azido-Gruppen auf der Zelloberfläche exponiert werden, die mit einem Biotinderivat, das eine Phosphingruppe besitzt, zur Reaktion gebracht werden können.

Rekombinante Glykoproteinen, die natürlicherweise nicht vorkommende Neuraminsäuren aufweisen, werden in der DE-OS 193 52 729.2 beschrieben. Nach den Angaben in der Beschreibung weisen die dort beschriebenen Glykoproteine eine veränderte Phamakokinetik auf, insbesondere eine verlängerte Halbwertszeit in der Blutzirkulation.

Neben den vorstehend genannten Verfahren, durch metabolische Umsetzung reaktive chemische Gruppen in die Oligosaccharidseitenketten von Proteinen einzuführen, sind andere Verfahren bekannt, mit denen solche Gruppen in Glykoproteine eingeführt werden können.

Ein diesbezüglich bekanntes Verfahren ist beispielsweise die limitierte Perjodat-Spaltung. Bei dieser Methode werden Zucker gespalten, die zwei cis-ständige Hydroxylgruppen aufweisen, wobei die Hydroxylfunktionen in Carbonylfunktionen überführt werden. Die entstehenden Aldehydgruppen können dann mit weiteren Molekülen zur Reaktion gebracht werden. Bei Glykoproteinen ist diese Reaktion prinzipiell mit Mannose, Galaktose und mit Neuraminsäuren möglich, die am C8 und C9 ein primäres vicinales Diol aufweisen. Nachteilig bei dieser Technik ist, daß die unspezifische Oxidationsreaktion in der Praxis sehr schwierig zu kontrollieren ist, so daß häufig unerwünschte Nebenprodukte entstehen. Darüber hinaus wird bei Mannose und Galaktose der Pyranring durch die Oxidation zerstört, so daß neue strukturelle Elemente innerhalb der Oligosaccharidkette entstehen, was schwer abzuschätzende biologische Konsequenzen haben kann. Entsprechend wird die Reaktion zumeist nur zu analytischen Zwecken eingesetzt, indem die entstandenen Aldehyde nach der Oxidation mit Perjodat mit einem tritiierten Reduktionsmittel umgesetzt werden.

In der US-PS 5,635,603 wird die Herstellung von Antikörperfragmenten beschrieben, die einen natürlicherweise dort nicht vorhandenen Kohlenhydratrest um die Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette herum aufweisen, an den verschiedene organische Moleküle gekoppelt werden.

Ein bekanntes Verfahren zur Einführung einer nichtphysiologischen chemischen Gruppe in Oligosaccharide stellt die enzymatische Oxidation von Galaktoseresten durch Galaktoseoxidase dar. Das Enzym oxidiert bei terminalen Galaktoseresten die Hydroxylgruppe am C6 zu einer Aldehyd-Funktion. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, das bei vielen Glykoproteinen die Galaktose kein terminales Strukturelement darstellt und zum Beispiel durch Sialinsäuren substituiert sein kann. Daher muß vor der eigentlichen Oxidation zum Beispiel eine Neuraminidase-Behandlung durchgeführt werden, um terminale Galaktosereste freizusetzen. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß Galaktosereste, die nicht umgesetzt werden, einen Liganden für den Asialoglykoproteinrezeptor in der Leber darstellen. Präparate, die eine größere Anzahl an Galaktoseresten aufweisen, werden damit sehr schnell aus der Blutzirkulation entfernt und sind entsprechend wenig wirksam.

Angewendet wurden diese bekannten Verfahren beispielsweise, um Glykoproteine auf Festphasen zu immobilisieren. So wird von Keogh in der US-PS 6,017,741 ein Verfahren zur Modifizierung der Oberfläche von medizinischen Geräten oder Implantaten beschrieben. Dabei werden 2-Aminoalkohole durch Perjodat zu Aldehyden oxidiert, die dann mit freien Aminen auf der Oberfläche der medizinischen Geräte eine Schiff-Base bilden können, welche anschließend durch Reduktion in eine stabile Aminbindung überführt wird.

In der US-PS 5,989,552 werden immunogene Konjugate aus einem Mucin-Polypeptid und oxidiertem Mannan beschrieben, wobei durch die Oxidation Aldehydgruppen und durch die Konjugation Schiff-Basen gebildet werden.

Bekannte Verfahren, um Proteinen bzw. Glykoproteinen miteinander zu verknüpfen, beruhen auf der chemischen Umsetzung reaktiver Aminosäureseitenketten. Hierbei werden zum Beispiel Aminogruppen von Lysinresten oder Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten durch homo- oder heterobifunktionelle Vernüpfungsmoleküle kovalent miteinander verbunden, wobei di- oder oligomere Proteineinheiten gebildet werden. Eine Vielzahl derartiger Reagenzien ist kommerziell erhältlich und wurde in den unterschiedlichsten Anwendungen eingesetzt. Ein grundsätzlicher Nachteil des genannten Verknüpfungsverfahrens besteht darin, daß entweder durch den engen Kontakt der Proteine zueinander oder durch die Derivatisierung einzelner Aminosäuren die Funktion der beteiligten Proteine beinträchtigt oder sogar vollkommen zerstört wird. Bei der Verwendung bifunktioneller Verknüpfungsmoleküle mit langen Alkylgruppen, die einen räumlichen Abstand herstellen können, besteht darüber hinaus die Gefahr, das diese Strukturen immunogen wirken.

Eine Methode zur Verknüpfung von Proteinen wird in der US-PS 5,919,758 beschrieben. Dabei wird zunächst ein Teil eines Proteins mit einem Reagenz umgesetzt, das freie Sulfhydrylgruppen exponiert. Ein zweiter Teil des Proteins wird mit einem Reagenz umgesetzt, das freie Maleimidgruppen exponiert. Anschließend werden beide Proteinteile in Kontakt gebracht, so daß jeweils zumindest zwei Proteine nach Reaktion der Sulfhydryl mit der Maleimid Gruppe über eine Thioethergruppe miteinander verknüpft werden. Auf diese Weise konnten Oligomere von Erythropoietin hergestellt werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es auf Proteine beschränkt ist, die keine Cysteinreste mit freien Sulfhydrylgruppen besitzen. Dies ist häufig jedoch nicht der Fall.

Molekularbiologische Techniken erlauben die Produktion von Fusionsproteinen, wobei zwei oder mehrere Proteine über ihre N- oder ihre C-Termini mit oder ohne Einfügen eines Aminosäure-Spacers miteinander verbunden werden können. Ein Nachteil dieser Technik besteht darin, daß die Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine generell sehr aufwendig sind. Darüber hinaus sind nicht bei allen Proteinen die N- oder C-Termini innerhalb der dreidimensionalen Struktur frei zugänglich, so das eine gentechnische Veränderung der Aminosäuresequenz zu einem Verlust der funktionell aktiven dreidimensionalen Struktur führen kann. Ein weiteres Problem liegt darin, daß die Termini auch direkt in die biologische Funktion involviert sein können, so daß diese bei einer Modifikation verlorengeht. Die eingefügten neuen Aminosäuresequenzen können ferner unter Umständen auch immunogene Strukturen ausbilden.

Glykoproteine spielen als Therapeutika eine immer größere Rolle. Mit Hilfe biotechnologischer Techniken können diese Proteine in großen Mengen rekombinant hergestellt werden. Sie werden in der Regel dazu eingesetzt, bestimmte körpereigene Glykoproteine, die aufgrund eines pathologischen Zustandes nicht oder in nicht ausreichendem Maße gebildet werden, zu ersetzen oder zu ergänzen, oder auch um durch Gabe dieser Proteine einen bestimmten biologischen Effekt zu erzielen. Die biologische Effektorfunktion findet sich dabei in der Regel im Proteinanteil und kann zum Beispiel in einer enzymatischen Aktivität (t-PA, Blutgerinnungsfaktoren wie Faktor VIII, Faktor IX) oder einer hormonellen Wirkung im Sinne von Rezeptor-Ligand-Interaktionen liegen (Erythropoietin (EPO), Interleukine, Interferone, GCSF's).

Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, daß die biologische Wirkung solcher Proteinfaktoren häufig erst dann zum Tragen kommt, wenn mehrere Faktoren gleichzeitig auf eine Zelle einwirken. So konnte ein synergistischer Effekt von GM-CSF und SCF ("stem cell factor") auf die Reifung von hämatopoietischen Vorläuferzellen nachgewiesen werden (Lund et al., Exp. Hematol. 27 (1999), S. 762-772).

In der US-PS 5,919,758 werden Homodimere von biologisch aktiven Polypeptiden beschrieben, beispielsweise Erythropoietin, die durch ein heterobifunktionelles Cross- Linking-Reagenz miteinander verbunden sind, wobei die Verbindung des Reagenz mit dem ersten Polypeptid über eine Sulfhydryl-Gruppe und mit dem zweiten Polypeptid über eine Maleimido-Gruppe erfolgt.

Entsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, neue Verfahren zur Verbrückung von Proteinen mit anderen Proteinen bzw. Biomolekülen bereitzustellen, die die genannten Nachteile des Standes der Technik überwinden. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung neuer verbrückter Konjugate von Proteinen mit anderen Proteinen bzw. Biomolekülen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß man Glykoproteine mittels in ihrem Kohlenhydratanteil vorhandener reaktiver Gruppen, die durch metabolische Umsetzung von unphysiologischen Vorläufermolekülen in den Zellen, die die Proteine synthetisieren, in den Kohlenhydratanteil eingeführt werden, mit anderen Glykoproteinen oder mit Nukleinsäuren oder Lipiden bzw. Micellen in einem relativ einfachen Verfahren kovalent verbrücken kann und somit die vorstehend genannten Aufgaben gelöst werden können.

Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Glykokonjugate, bei denen ein Proteinanteil über eine Kohlenhydratkette mit einem weiteren Proteinanteil, einer Nukleinsäure oder einem Lipid bzw. einer Micelle kovalent verbrückt ist, wobei die Verbrückung über eine im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen natürlicherweise nicht vorkommende und an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest der Kohlenhydratkette gekoppelte chemische Gruppe erfolgt.

Beim vorstehend genannten Proteinanteil der erfindungsgemäßen Glykokonjugate handelt es sich um ein Protein bzw. Polypeptid, das bei Expression in eukaryontischen Zellen glykosyliert wird, d. h. dessen Aminosäuresequenz die für die Glykosylierung in eukaryontischen Zellen erforderlichen Signale enthält. Entsprechend handelt es sich vorzugsweise um den Proteinanteil eines normalerweise in eukaryontischen Zellen exprimiertes Glykoproteins oder -polypeptids bzw. eines davon abgeleiteten Proteins oder Polypeptids. Diesbezüglich kommen die verschiedensten glykosylierten Proteine bzw. Polypeptide in Frage. Bevorzugt sind unter anderem Polypeptide, die als Differenzierungs- bzw. Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Hormone wirken, beispielsweise Erythropoietin, CSF (colony stimulating factor), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), LIF (leukemia inhibitory factor), TNF (tumor necrosis factor), Lymphotoxin, PDGF (platelet-derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial cell growth factor), EGF (epidermal growth factor), TGF-α (transforming growth factor α), TGF-β (transforming growth factor β), Thrombopoietin, SCF (stem cell factor), Oncostatin M, Amphiregulin, Mullerian-Inhibiting Substance, B-CGF (B-cell growth factor), MMIF (macrophage migration inhibitory factor) α-Intereron, β- Interferon, γ-Interferon, IL-(Interleukin)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 und IL-17. Diese Proteine sind dem Fachmann ohne weiteres geläufig (siehe die Aufstellung von Literaturstellen bei Sytkowski, US-PS 5,919,758). Ebenfalls bevorzugt sind thrombolytisch wirkende Proteine bzw. Polypeptide, beispielsweise t-PA und Urokinase; Thromboprophylaktika, beispielsweise Antithrombin III; und Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise Faktor VIII und IX. Bevorzugt sind ferner glykosylierte Hüllproteine von Viren, sowohl allein als auch als Teil vollständiger biologisch aktiver Viruspartikel.

Beim Proteinanteil der erfindungsgemäßen Glykokonjugate, z. B. den vorstehend genannten Differenzierungs- bzw. Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Hormonen, Thrombolytika, Thromboprophylaktika, Gerinnungsfaktoren und viralen Hüllproteinen, kann es sich auch um ein rekombinant hergestelltes Protein handeln, d. h. ein Protein, das von Zellen synthetisiert wurde, die mit einem für das Protein kodierenden Expressionsvektor transformiert wurden. Geeignet sind auch durch rekombinante Verfahren hergestellte, gegenüber der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins durch Aminosäureaustausche bzw. Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder Fusion mit weiteren Proteinsequenzen, beispielsweise Fusion mit Glutathion-S-transferase oder β- Galaktosidase bzw. Fragmenten davon, veränderte Proteine.

Die Kohlenhydratkette, über die die Verbrückung des genannten Proteinanteils der erfindungsgemäßen Glykokonjugate erfolgt, umfaßt mindestens eine Oligosaccharidkette, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens durch metabolische Glykosylierung des Proteinanteils in eukaryontischen Zellen gebildet wird, d. h. durch kovalentes Modifizieren des Proteinanteils mittels Anhängen der Oligosaccharidkette an ein entsprechendes Glykosylierungssignal bzw. -motiv innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteinanteils.

Entsprechend ist die Oligosaccharidkette entweder N-glykosidisch an ein innerhalb des Proteinanteils befindliches Asparagin gebunden (N-Glykan) oder O-glykosidisch an ein innerhalb des Proteinanteils befindliches Serin oder Threonin (O-Glykan).

Im Falle einer N-glykosidischen Bindung an den Proteinanteil umfaßt die Kohlenhydratkette der erfindungsgemäßen Glykokonjugate bzw. die von ihr umfasste(n) Oligosaccharidkette(n) vorzugsweise eine relativ einheitliche "Core"-Struktur, die in dem nachstehend beispielhaft für ein tetraantennäres Oligosaccharid des komplexen Typs und des oligomannosidischen Typs wiedergegebenen Struktur enthalten ist, und die auch weniger Antennen als die beispielhaft dargestellten Strukturen aufweisen und gegebenenfalls durch Anhängen weiterer Monosaccharide bzw. Oligosaccharide modifiziert sein kann.

Bevorzugte "Core"-Struktur von Oligosacchariden der N-Glykane erfindungsgemäßer Glykokonjugate

= Neuraminsäure
Gal = Galaktose
GlcNAc = N-Acetylglucosamin
Man = Mannose

Im Falle einer O-glykosidischen Bindung umfaßt die Kohlenhydratkette der erfindungsgemäßen Glykokonjugate O-Glykane, die unter anderem folgende Strukturen aufweisen können:

Beispiele von Oligosaccharide von O-Glykanen erfindungsgemäßer Glykokonjugate

Bei in der Kohlenhydratkette der erfindungsgemäßen Glykokonjugate enthaltenen N- Glykanen weist eine "Antenne" der Oligosaccharidseitenkette vorzugsweise etwa 8 bis 12 Kohlenhydrateinheiten auf. Bei in der Kohlenhydratkette der erfindungsgemäßen Glykokonjugate enthaltenen O-Glykanen kann die Antennenlänge zwischen 2 und 20 Einheiten variieren. Bei beiden Glykan-Arten ist der letzte Zuckerrest vorzugsweise eine Neuraminsäure. Vorzugsweise ist die Neuraminsäure ferner α-glykosidisch an Gal, GalNAc oder GlcNAc gebunden.

Die im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen natürlicherweise nicht vorkommende chemische Gruppe, über die die kovalente Verbrückung in den erfindungsgemäßen Glykokonjugaten erfolgt, ist an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest der Kohlenhydratkette gekoppelt, vorzugsweise an den Neuraminsäurerest. Die Kopplung der chemischen Gruppe an den Neuraminsäurerest, den Galactosaminrest oder den Glucosaminrest erfolgt ferner vorzugsweise über ein Stickstoffatom.

Besonders geeignete chemische Gruppen sind in diesem Zusammenhang jene, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β-Aminothiol-, α-Halogencarbonyl- und Azidgruppe. Besonders bevorzugt sind Keton- oder Aldehydgruppen, insbesondere Ketongruppen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nimmt die chemische Gruppe an der Ausbildung einer Verbrückungsgruppe V teil, die unter für Proteine nicht denaturierenden Reaktionsbedingungen gebildet werden kann. Bevorzugte Verbrückungsgruppen V im Sinne der Erfindung sind dabei insbesondere Hydrazon-, Oxim-, Thiosemicarbazon-, Thiazolidin- oder Thioestergruppen, oder Gruppen mit der folgenden Strukturformel:

Die Kohlenhydratkette der erfindungsgemäßen Glykokonjugate umfaßt gegebenenfalls zusätzlich eine Linkergruppe L, die über die Verbrückungsgruppe V mit einem Monosaccharidbaustein der Kohlenhydratkette verbunden ist, und über eine Verbrückungsgruppe V' mit dem weiteren Proteinanteil, der Nukleinsäure oder dem Lipid verbunden ist, wobei V' die gleichen Bedeutungen wie V annehmen kann und V und V' gleiche oder voneinander verschiedene Verbrückungsgruppen sein können.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Linkergruppe L um eine säurespaltbare Linkergruppe. Die Linkergruppe L kann ferner eine biologisch aktive Gruppe enthalten bzw. eine biologisch aktive Gruppe sein, z. B. ein Toxin oder ein Steroidhormon, beispielsweise ein Androgen, ein Gestagen oder ein Glucocorticoid.

Geeignet als Linkergruppe L im Sinne der Erfindung sind insbesondere lineare oder cyclische, unverzweigte oder verzweigte, gesättigte oder ein oder mehrfach ungesättigte, einfach oder mehrfach durch Fluor, Chlor, Brom, Jod, oder einen Hydroxy-, Epoxy-, Carbonyl-, Carboxyl-, Amino-, Mercaptan-, Phenyl-, Phenol-, oder Benzylrest substituierte Gruppen mit 2 bis 18 C-Atomen, vorzugsweise 2 bis 12 C-Atomen, ganz besonders bevorzugt 2 bis 8 oder 2 bis 6 C-Atomen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Glykokonjugate handelt es sich um Dimere, bei denen ein Proteinanteil über eine oder mehrere Kohlenhydratkette(n) mit einem weiteren Proteinanteil verbrückt ist. Glykokonjugate, bei denen ein Proteinanteil über eine oder mehrere Kohlenhydratkette(n) mit zwei oder mehreren weiteren Proteinanteilen zur Bildung von Trimeren, Tetrameren oder von Oligomeren mit mehr als vier verbrückten Proteinanteilen verbrückt ist, sind jedoch für bestimmte Anwendungen ebenfalls bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Glykokonjugate liegen vorzugsweise in gereinigter Form vor. Der Begriff "gereinigt" bedeutet in diesem Zusammenhang nicht notwendigerweise, daß die Glykokonjugate praktisch bis zur Homogenität gereinigt vorliegen müssen, wenngleich dies von der Bedeutung dieses Begriffs natürlich umfaßt wird. Im Sinne der Erfindung "gereinigte" Glykokonjugate liegen zumeist in einer Mischung aus verschiedenen Isomeren und in einem Gemisch (z. B. Lösung oder Lyophilisat) mit weiteren Stoffen vor, z. B. mit den Bestandteilen von Pufferlösungen oder mit Trägerstoffen oder Trägerproteinen wie Rinderserumalbumin (BSA) und dergleichen. "Gereinigt" meint in diesem Zusammenhang, daß die erfindungsgemäßen Glykokonjugate gegenüber anderen Bestandteilen des Ausgangsmaterials ihrer Herstellung spezifisch angereichert sind. Vorzugsweise sind die Glykokonjugate der Erfindung so gereinigt, daß sie sich abgesehen von bestimmten Verunreinigungen in einem im wesentlichen definierten Gemisch mit anderen Stoffen befinden.

Bevorzugte Glykokonjugate der vorliegenden Erfindung weisen die allgemeine Formel

auf, wobei
P einen Mono-, Di- oder Oligosaccharidrest mit bis zu 40 glykosidisch miteinander verknüpften, gegebenenfalls verzweigten Zuckerresten bedeutet, die Furanose- und/oder Pyranoseringe darstellen und 5 bis 230 C-Atome enthalten und N- oder O- glykosidisch an den Proteinanteil des Glykokonjugats gebunden sind;
R₁ ein Rest der allgemeinen Formel AVBX ist, in dem
A einen linearen oder cyclischen, unverzweigten oder verzweigten, gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten, hydroxylierten und/oder ketylierten (C₂-C₆)-Acylrest, insbesondere einen (C₂-C₆)-Alkanoylrest bedeutet, oder einen linearen oder cyclischen, unverzweigten oder verzweigten, gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten, hydroxylierten und/oder ketylierten (C₂-C₆)-Hydrocarbylrest, insbesondere einen (C₂-C₆)-Alkyl, -Alkenyl- oder -Alkinylrest;
V die vorstehend angegebene Bedeutung hat;
B einen Mono-, Di- oder Oligosaccharidrest mit bis zu 40 glykosidisch miteinander verknüpften, gegebenenfalls verzweigten Zuckerresten bedeutet, die Furanose- und/oder Pyranoseringe darstellen und 5 bis 230 C-Atome enthalten, und N- oder O-glykosidisch an X gebunden ist; und
X ein weiterer Proteinanteil ist;
oder ein Rest der allgemeinen Formel AVLV'BX ist, in dem
A, V, V', L, B und X die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben;
oder ein Rest der allgemeinen Formel AVX' oder AVLV'X' ist, in dem
A, V, V' und L die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, und
X' eine Nukleinsäure oder ein Lipid bzw. eine Micelle ist;
R₂, R₃, R₄ und R₅, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (C_nH_2n+2, n = 1 bis 20), vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; einen linearen oder verzweigten Alkenylrest mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen (C_nH_2n, n = 3 bis 20, Position der Doppelbindung an C_n n = 2 bis 19), vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen linearen oder verzweigten Alkinylrest mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen (C_nH_2n-2, n = 3 bis 20, Position der Dreifachbindung an C_n n = 2 bis 19), vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen Alkenyl- bzw. Alkinylrest mit 2 oder mehr Doppelbindungen bzw. Dreifachbindungen mit 4 bis 20, vorzugsweise 7 bis 12 Kohlenstoffatomen; einen Arylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen Phenylrest; einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Acylrest (-CO-R₆) mit insgesamt 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere Acetylrest, einschließlich seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga; einen Aroylrest mit 6 bis 20, vorzugsweise 6 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen Carbonylamidrest der Formel -CONH₂ oder -CONHR₆; einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Tbioacylrest (-CS- R₆) mit insgesamt 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; oder einen Thiocarbamidrest der Formel -CS-NH₂ oder -CS-NHR₆ bedeuten; wobei R₆ jeweils für ein Wasserstoffatom oder einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen steht und jeder der vorgenannten Reste außer H gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann durch Halogen-, insbesondere Fluor, Chlor Brom oder Jod, Hydroxy-, Epoxy-, Amino-, Mercaptan-, Phenyl-, Phenol- oder Benzylgruppen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stehen die Reste R₂, R₃, R₄ und R₅ jeweils für ein Wasserstoffatom oder CH₃ oder (C₁-C₇)-Acyl, insbesondere Acetyl, einschließlich seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga.

Ferner sind solche Glykokonjugate besonders bevorzugt, bei denen A zusammen mit der chemische Gruppe, die an der Ausbildung der Verbrückungsgruppe V teilnimmt, und/oder zusammen mit der chemische Gruppe, die an der Ausbildung der Verbrückungsgruppe V' teilnimmt, einen Lävulinoylrest bildet.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Glykokonjugate liegt darin, daß die innerhalb der Kohlenhydratkette enthaltenen Oligosaccharide keine starre Konformation aufweisen, wie man dies etwa von Aminosäureketten innerhalb von Proteinen kennt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die erstaunlich freie Drehbarkeit der kovalenten Bindungen zwischen den einzelnen Kohlenhydratresten der Gesamtstruktur eine enorme Flexibilität verleiht und dazu beiträgt, daß etwaige sterische Effekte der Verbrückung für die Aktivität der biologisch aktiven Bestandteile der erfindungsgemäßen Glykokonjugate praktisch keine Rolle spielen. Gleichzeitig übt die Kohlenhydratkette der erfindungsgemäßen Glykokonjugate, bedingt durch ihre Größe und Flexibilität, eine abschirmende bzw. maskierende Funktion aus, so daß große Teile des Proteinanteils bzw. der Proteinanteile von Molekülen des Immunsystems nicht mehr erkannt werden und entsprechend nicht immunogen wirken können.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Glykokonjugate besteht darin, daß die Kohlenhydratseitenketten einen nur geringen oder überhaupt keinen direkten Einfluß auf die biologische Funktion des Proteinbestandteils bzw. der Proteinbestandteile nehmen. Bei Glykoproteinen beschränkt sich der Einfluß der Kohlenhydratseitenketten zumeist auf die Phase der Biosynthese des Proteinanteils, wo sie häufig in den Faltungsmechanismus involviert sind, oder auf die chemisch-physikalischen Eigenschaften des gereiften Proteins.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Glykokonjugate. Entsprechend wird ein Aspekt der Erfindung von einem Verfahren zur Herstellung von Glykokonjugaten gebildet, das folgende Schritte umfaßt:

• a) Kultivieren eukaryontischer Zellen in Anwesenheit eines nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrats, das geeignet ist, eine dort natürlicherweise nicht vorkommende und an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest gekoppelte reaktive chemische Gruppe W in den Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen der Zellen einzuführen, und Isolieren eines von den kultivierten Zellen exprimierten Glykoproteins, das die genannte chemische Gruppe W in seinem Kohlenhydratanteil aufweist;
• b) kovalentes Verbrücken des gemäß Schritt a) isolierten Glykoproteins mittels der genannten chemischen Gruppe W mit dem Kohlenhydratanteil eines Glykoproteins, mit einer Nukleinsäure oder einem Lipid, über eine dort natürlicherweise nicht vorkommende reaktive chemische Gruppe W'.

Für die Zwecke des erfindungsgemäßen Verfahrens sind im Prinzip alle eukaryontischen Zellen geeignet, z. B. primäre Zellen, Gewebe oder Zellinien, die das gewünschte, in Schritt a) zu isolierende Glykoprotein exprimieren. Besonders geeignet sind Zellinien, die mit einem Expressionsvektor zur rekombinanten Expression transient oder stabil transformiert wurden, der für das in Schritt a) zu isolierende Glykoprotein kodiert. Als bevorzugte Wirtszellinien für die rekombinante Expression sind insbesondere NIH3T3- Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, HeLa-Zellen, HEK293-Zellen oder CHO-Zellen, aber auch Insektenzellen, z. B. SF9-Zellen (Schneider-Zellen), zu nennen. Besonders bevorzugt sind CHO-Zellen und BHK-Zellen.

Im Rahmen von Schritt a) des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens werden Glykoproteine erhalten, z. B. rekombinante Glykoproteine, die in ihrem Kohlenhydratanteil eine oder mehrere natürlicherweise nicht im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen vorkommende reaktive chemische Gruppen W aufweisen. Der Proteinanteil dieser Glykoproteine bildet anschließend den Proteinanteil bzw. einen ersten Proteinanteil der nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhaltenen Glykokonjugate. Entsprechend handelt es sich bei dem Glykoprotein, das im Rahmen von Schritt a) isoliert wird, vorzugsweise um eines der vorstehend im Zusammenhang mit dem Proteinanteil der Glykokonjugate als geeignet bzw. bevorzugt genannten eukaryontischen Glykoproteine. Im Falle der Verwendung transformierter Zellen in Schritt a) wird der zur Transformation verwendete Expressionsvektor vorzugsweise so gewählt, daß er für das entsprechende Glykoprotein kodiert, dessen Proteinanteil anschließend den rekombinanten Proteinanteil bzw. die rekombinanten Proteinanteile des herzustellenden erfindungsgemäßen Glykokonjugats bilden soll.

Wie vorstehend erwähnt, kann es von Vorteil sein, die rekombinant hergestellten Proteinanteile gegenüber ihrer natürlichen Aminosäuresequenz zu verändern. Als weitere geeignete Veränderung ist in diesem Zusammenhang die Einführung zusätzlicher N- bzw. O-Glykosylierungsstellen bzw. -signale in die Aminosäuresequenz oder das Entfernen bzw. Zerstören in der Aminosäuresequenz enthaltener N- bzw. O-Glykosylierungsstellen. Auf diese Weise können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verbrückung geeignete Kohlenhydratketten in Proteinanteile eingeführt werden, die ansonsten keine oder für eine Verbrückung zu wenige oder nicht geeignete Kohlenhydratketten aufweisen würden. Ferner können unerwünschte Kohlenhydratketten aus einem zu verbrückenden Proteinanteil entfernt werden.

Schritt a) des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens wird in Anwesenheit eines nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrats durchgeführt, das dem Nährmedium, in dem die Zellen kultiviert werden, zugesetzt wird. Der Begriff "nichtphysiologisches Vorläuferkohlenhydrat" meint einen Kohlenhydratbaustein, der von der enzymatischen Maschinerie der Zellen als Baustein der Glykosylierung von Glykoproteinen akzeptiert wird, d. h. in unveränderter oder leicht abgewandelter Form in den Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen der Zellen eingebaut wird, und eine oder mehrere zusätzliche reaktive chemische Gruppen enthält, die bei natürlich vorkommenen Vorläuferbausteinen der Glykosylierung nicht vorhanden sind. Erfindungsgemäß handelt es sich insbesondere um Vorläuferbausteine, die in den Zellen zu Neuraminsäure-, Galactosamin- oder Glucosaminderivaten mit reaktiven chemischen Gruppen umgewandelt werden, die wiederum von der enzymatischen Maschinerie der Zellen in den Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen eingebaut werden.

Trotz der Kultivierung der Zellen in Anwesenheit nichtphysiologischer Vorläuferkohlenhydrate im Sinne der Erfindung bleibt das physiologische Sialylierungsmuster im Vergleich zu unbehandelten Zellen gleich bzw. im wesentlichen gleich. So werden etwa bei Verwendung erfindungsgemäßer nichtphysiologischer Vorläuferkohlenhydrate der Neuraminsäurebiosynthese nur sehr wenige freie Galaktosereste (die einen Hinweis auf einen unvollständigen Einbau von Neuraminsäurebausteinen darstellen) auf den nach Schritt a) isolierten rekombinanten Proteinen exprimiert.

Durch Auswahl geeigneter Konzentrationen an nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydraten läßt sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens die Stöchiometrie bzw. Anzahl der in Glykoproteine eingebauten modifizierten Kohlenhydratderivate, insbesondere der Neuraminsäure-, Galactosamin- oder Glucosaminderivate mit den entsprechenden reaktiven chemischen Gruppen, effizient und einfach kontrollieren. Nach Kultivierung der Zellen unter diesen Bedingungen können dann bestimmte Glykoproteine von Interesse aus den Kulturüberständen oder den Zellextrakten mit Hilfe gängiger, dem Fachmann bekannter Verfahren, isoliert werden. Die so gewonnenen Glykoproteine weisen nun eine oder mehrere natürlicherweise im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen nicht auftretende, reaktive chemische Gruppe(n) auf, je nach eingesetztem nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrat. Die metabolische Modifikation gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt somit eine sehr einfache und gleichzeitig effektive Methode dar, um reaktive chemische Gruppen in den Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen einzuführen, die dann weiter mit anderen biologisch aktiven Molekülen, wie anderen Glykoproteinen, Nukleinsäuren oder Lipiden, die entsprechende reaktive chemische Gruppen als Reaktionspartner tragen, zur Bildung neuer Glykokonjugate mit vorteilhaften Eigenschaften umgesetzt werden können.

Die im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen natürlicherweise nicht vorkommende reaktive chemische Gruppe W ist in den erfindungsgemäßen nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydraten vorzugsweise über ein Stickstoffatom an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest gekoppelt. Besonders bevorzugt als chemische Gruppe W sind in diesem Zusammenhang solche Gruppen, die ausgewählt sind aus der Gruppe chemischer Gruppen bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β- Aminothiol-, α-Halogencarbonyl- und Azidgruppe. Besonders bevorzugt sind Keton- oder Aldehydgruppen, insbesondere Ketongruppen.

Insbesondere bevorzugt als nichtphysiologische Vorläuferkohlenhydrate sind Kohlenhydrate der allgemeinen Formel

wobei
R₈ ein Rest der allgemeinen Formel AW ist, in dem A und W die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben
und
R₂ und R₃ ebenfalls die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, und R₆ und R₇ die gleichen Bedeutungen haben können wie R₂ und R₃.

Vorzugsweise stehen die Reste R₂, R₃, R₆ und R₇ bei den erfindungsgemäßen nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydraten jeweils für ein Wasserstoffatom, CH₃, oder einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Acylrest mit insgesamt 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 7 C-Atomen, besonders bevorzugt für einen Acetylrest, einschließlich seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga.

Ferner sind unter anderem solche Vorläuferkohlenhydrate besonders geeignet, bei denen A und W zusammen einen Lävulinoylrest bilden.

Spezielle Beispiele besonders bevorzugter nichtphysiologischer Vorläuferkohlenhydrate sind N-Lävulinoylmannosamin, peracetyliertes N-Lävulinoylmannosamin, N- Azidoacetylmannosamin und peracetyliertes N-Azidoacetylmannosamin.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der genannten nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrate für die Herstellung der erfindungsgemäßen Glykokonjugate bzw. die Verwendung im erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren.

Nach dem Kultivieren der eukaryontischen Zellen in Anwesenheit des nicht- physiologischen Vorläuferkohlenhydrats wird eines (oder mehrere, z. B. bei Zellen, die mit mehreren Expressionsvektoren cotransformiert wurden, oder die mehrere Glykoproteine exprimieren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Glykokonjugate von Interesse sind) der von den kultivierten Zellen exprimierten Glykoproteine isoliert. In diesem Zusammenhang zeigt sich ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens, da zur Isolierung der nunmehr reaktive Gruppen W in ihrem Kohlenhydratanteil aufweisenden Glykoproteine auf bekannte und standardisierte Verfahren zur Isolierung bzw. Reinigung dieser Glykoproteine zurückgegriffen werden kann. Gemäß Schritt a) wird das Glykoprotein soweit isoliert, daß es in einer Form vorliegt, die ein effizientes kovalentes Verbrücken gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt.

Gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt anschließend das kovalente Verbrücken des isolierten Glykoproteins mittels der genannten chemischen Gruppe W mit dem Kohlenhydratanteil eines Glykoproteins, mit einer Nukleinsäure oder einem Lipid, die jeweils eine dort natürlicherweise nicht vorkommende reaktive chemische Gruppe W' enthalten.

Für den Fall, daß die Verbrückung mit dem Kohlenhydratanteil eines weiteren Glykoproteins erfolgt, ist die reaktive chemische Gruppe W' vorzugsweise wie auch die reaktive chemische Gruppe W über ein Stickstoffatom an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest im Kohlenhydratanteil des genannten Glykoproteins gekoppelt. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung des nach Schritt a) isolierten Glykoproteins zur Verbrückung mit sich selbst, wobei auf diese Weise kovalent verbrückte Homo-Oligomere des in Schritt a) erhaltenen Glykoproteins entstehen. Besonders bevorzugt als Homo-Oligomere sind Homo-Dimere des gemäß Schritt a) isolierten Glykoproteins. Diesbezügliche Beispiele geeigneter homo-dimerer Glykokonjugate im Sinne der Erfindung sind CSF-CSF, SCF-SCF, G-CSF-G-CSF, GM- CSF-GM-CSF, LIF-LIF, EPO-EPO, TNF-TNF, Lymphotoxin-Lymphotoxin, PDGF- PDGF, FGF-FGF, VEGF-VEGF, EGF-EGF, TGF-α-TGF-α, TGF-β-TGF-β, Thrombopoietin-Thrombopoietin, SCF-SCF, Oncostatin M-Oncostatin M, Amphiregulin- Amphiregulin, Mullerian-Inhibiting Substance-Mullerian-Inhibiting Substance, B-CGF-B- CGF, MMIF-MMIF, α-Interferon-α-Interferon, β-Interferon-β-Interferon, γ-Interferon-γ- Interferon, IL-1-IL-1, IL-2-IL-2, IL-3-IL-3, IL-4-IL-4, IL-5-IL-5, IL-6-IL-6, IL-7-IL-7, IL-8-IL-8, IL-9-IL-9, IL-10-IL-10, IL-11-IL-11, IL-12-IL-12, IL-13-IL-13, IL-14-IL-14, IL-15-IL-15, IL-16-IL-16 und IL-17-IL-17. Bevorzugt sind insbesondere GM-CSF-GM- CSF, EPO-EPO, α-Interferon-α-Interferon, β-Interferon-β-Interferon, γ-Interferon-γ- Interferon, IL-2-IL-2, IL-15-IL-15, IL-16-IL-16 und IL-17-IL-17, t-PA-t-PA, Urokinase- Urokinase, Antithrombin III-Antithrombin III, Faktor VIII-Faktor VIII und Faktor IX- Faktor IX.

Bevorzugt für den Verbrückungsschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind jedoch auch andere gemäß dem Verfahren nach Schritt a) hergestellte Glykoproteine, so daß Hetero-Oligomere, vorzugsweise Hetero-Dimere gebildet werden. Diesbezügliche Beispiele geeigneter hetero-dimerer Glykokonjugate im Sinne der Erfindung sind GM- CSF-SCF, GM-CSF-IL-2, GM-CSF-IL-3, CSF-IL-1 und IL-2-IL-3.

Für den Fall, daß die Verbrückung mit einer Nukleinsäure oder einem Lipid bzw. einem Lipid innerhalb einer aus Lipiden aufgebauten Micelle erfolgt, kann die reaktive chemische Gruppe W' an jeder geeigneten Position innerhalb der Nukleinsäure oder des Lipids vorliegen, die die gewünschte Funktion der Nukleinsäure bzw. des Lipids oder der das Lipid enthaltenden Micelle innerhalb des durch die Verbrückung entstehenden Glykokonjugats nicht oder nicht wesentlich beeinträchtigt. Diesbezüglich geeignete Positionen können vom Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl bekannter Verfahren zur Einführung erfindungsgemäß geeigneter oder bevorzugter reaktiver chemischer Gruppen W' in die Nukleinsäure oder das Lipid bekannt.

Im Zuge des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens werden die Vorläuferkohlenhydrate in Schritt a) statistisch in die Kohlenhydratseitenketten bzw. deren Zweige oder "Antennen" eingebaut. Dies gilt insbesondere auch für Proteine, die mehr als eine Glykosylierungsstelle aufweisen und entsprechend mehrere Kohlenhydratseitenketten aufweisen, die wiederum jeweils mehrere Antennen enthalten können. Entsprechend läßt sich die genaue Stereochemie der in Schritt b) erhaltenen Glykokonjugate nicht genau vorhersagen, bzw. man wird gegebenenfalls ein Gemisch verschieden verknüpfter Konjugate erhalten. Dies spielt jedoch im Hinblick auf die biologische Funktion der Konjugate keine oder eine nur untergeordnete Rolle, da die Kohlenhydratseitenketten, insbesondere die Neuraminsäuren, in der Regel nicht direkt in die biologische Funktion von Glykoproteinen involviert sind. Darüber hinaus sind die Oligosaccharidketten hinreichend lang und flexibel, um eine sterische Zugänglichkeit der einzelnen funktionell aktiven Proteindomänen auf dem (den) verbrückten Protein(en) zu gewährleisten. Im Hinblick auf Glykoproteine mit mehreren Glykosylierungsstellen ist es auch möglich, die Zahl der möglichen Isomeren durch Entfernen oder Zerstören von Glykosylierungsstellen, die für die Biosynthese unkritisch sind, einzuschränken.

Wie vorstehend erwähnt läßt sich ferner unter anderem durch die Konzentration des nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrats im Kultivierungsmedium in Schritt a) die Stöchiometrie des Einbaus effizient steuern, so daß die Bildung von Homo- oder Hetero- Dimeren gegenüber der Bildung von Homo- oder Hetero-Oligomeren wirksam beeinflußt werden kann. Eine weitere diesbezügliche Steuerungsmöglichkeit bietet sich für den Fachmann durch die Auswahl geeigneter Konzentrationen und Reaktionszeiten und - bedingungen bei der Verbrückungsreaktion gemäß Schritt b), durch die je nach Wunsch prozentual mehr über den Kohlenhydratanteil verbrückte Dimere oder Oligomere erhalten werden können. Ferner lassen sich durch weitere, dem Fachmann geläufige Verfahrensschritte und -maßnahmen, z. B. durch Gelfiltration oder andere chromatographische Verfahren, die in Schritt b) erhaltenen Glykokonjugate in die einzelnen Isomere, d. h., Homo- oder Hetero-Dimere bzw. Homo- oder Hetero-Oligomere (d. h. Trimere, Tetramere oder größere Konjugate) niedrigeren oder höheren Molekulargewichts auftrennen.

Wie auch die vorstehend genannte reaktive chemische Gruppe W wird die reaktive chemische Gruppe W' vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe chemischer Gruppen bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β-Aminothiol-, α-Halogencarbonyl- und Azidgruppe. Dabei können die Gruppen W und W' jeweils gleich oder voneinander verschieden sein. Für den Fall, daß W und W' gleich sind, erfolgt das kovalente Verbrücken gemäß Schritt b) über ein homobifunktionelles Linkermolekül. Für den Fall, daß W und W' nicht gleich sind, kann das kovalente Verbrücken sowohl direkt durch Umsetzung von W mit W' erfolgen, als auch über ein heterobifunktionelles Linkermolekül.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die reaktiven Gruppen W und/oder W' (im Falle der Verbrückung mit einem oder mehreren anderen Proteinanteilen) auf einer Neuraminsäure exponiert und sind eine Aldehyd- oder Ketongruppe. Diese Gruppe wird in diesem Fall vorzugsweise durch metabolische Umsetzung gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Mannosaminderivat als nicht natürlich vorkommendem Vorläuferkohlenhydrat, das mit einer aldehyd- oder einer ketonhaltigen Gruppe N-acyliert ist, in das in diesem Schritt isolierte Glykoprotein eingebracht. Besonders bevorzugt ist in diesem Zusammenhang peracetyliertes N-Lävulinoyl-D-mannosamin. Die Zellen verstoffwechseln die Substanz so, daß die neu synthetisierten Glykoproteine die reaktive Gruppe W bzw. W' als Teil von N-Lävulinoylneuraminsäure(n) exponieren.

Das Verbrücken gemäß Schritt b) erfolgt vorzugsweise unter für Proteine nicht denaturierenden Reaktionsbedingungen. Auf diese Weise können Glykokonjugate erhalten werden, die die biologische Aktivität des Proteinanteils beibehalten, die wiederum durch die kovalente Verbrückung mit weiteren biologisch aktiven Biomolekülen, d. h. Glykoproteinen, Nukleinsäuren oder Lipiden verstärkt bzw. ergänzt oder moduliert wird.

Für den Fall, daß die Verbrückung gemäß Schritt a) ohne Verwendung eines Linkermoleküls erfolgt, nehmen die reaktiven chemischen Gruppen W, W' in dem entstehenden erfindungsgemäßen Glykokonjugat gemeinsam an der Ausbildung einer Verbrückungsgruppe V teil. Bei Verwendung eines homo- oder heterobifunktionellen Linkermoleküls reagieren die Gruppen W, W' nicht direkt miteinander, sondern nehmen jeweils getrennt voneinander an der Ausbildung von Verbrückungsgruppen V, V' teil, die sie jeweils mit im Linkermolekül vorhandenen reaktiven chemischen Gruppen Z, Z' bilden.

Bei den Verbrückungsgruppen V bzw. V' handelt es sich vorzugsweise um eine Hydrazon-, eine Oxim-, eine Thiosemicarbazon-, eine Thiazolidin- oder eine Thioestergruppe, oder um eine Gruppe der folgenden Formel:

wobei V und V' jeweils gleich oder voneinander verschieden sein können.

Bevorzugte Linkermoleküle im Sinne der Erfindung sind solche der Formel ZLZ', wobei Z und Z' ausgewählt sind aus der Gruppe chemischer Gruppen bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β-Aminothiol- und α-Halogencarbonylgruppe sowie der chemischen Gruppe mit der folgenden Formel:

und, wie vorstehend erwähnt, gleich oder verschieden sein können, wobei L die vorstehend angegebenen Bedeutungen hat. Insbesondere sind bei den in Schritt b) gegebenenfalls verwendeten homobifunktionellen Linkermolekülen die reaktiven chemischen Gruppen Z, Z' gleich, während sie bei den gegebenenfalls verwendeten heterobifunktionellen Linkermolekülen voneinander verschieden sind. Besonders bevorzugt als homobifunktionelles Linkermolekül gemäß der Erfindung ist 1,4-Bis- (hydroxyamino)ethan, 1,4-Bis-(hydroxyamino)propan oder 1,4-Bis-(hydroxyamino)butan, wobei das zuletzt genannte Linkermolekül besonders bevorzugt ist.

Der Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, geeignete reaktive chemische Gruppen W, W' bzw. Z, Z' zur Bildung der Verbrückungsgruppen V, V' auszuwählen. Für die selektive chemische Kopplung bzw. Verbrückung kommen die unterschiedlichsten reaktiven Gruppen W, W', Z, Z' in Frage. Vorzugsweise werden die Gruppen W, W', Z, Z' so ausgewählt, daß ihre Umsetzung spezifisch zur Verbrückung führt, und daß unter den gewählten Bedingungen der Proteinanteil (bzw. im Falle der Verbrückung mit demselben oder einem weiteren Glykoprotein, die Proteinanteile) nicht irreversibel denaturiert wird (werden) und dadurch die biologische Funktion verlorengeht oder beeinträchtigt wird. Eine Übersicht derzeit bekannter und bevorzugter Reaktionen, welche die genannten Kriterien erfüllen und entsprechend bevorzugte Kombinationen reaktiver chemischer Gruppen im Sinne der Erfindung darstellen, ist in Fig. 1 gegeben. Auf der Grundlage dieser Beispiele und seines Fachwissens ist der Fachmann ohne weiteres in der Lage, im Sinne der vorliegenden Erfindung geeignete Gruppen W, W', Z, Z' auszuwählen.

Fig. 2 ist eine beispielhafte schematische Darstellung der Verbrückung gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierter Glykoproteinmonomere. Wie vorstehend erwähnt können die Monomere beispielsweise zu Homooligomeren oder zwei verschiedene Glykoproteine zu Heterooligomeren (im Falle von Fig. 2 zu Homo- bzw. Heterodimeren) verknüpft werden. Die Verknüpfung kann dabei direkt über die chemisch reaktiven Gruppen W, W' erfolgen (Fig. 2a). Eine Alternative hierzu ist die indirekte Verknüpfung der reaktiven Gruppen W und W' über homo- oder heterobifunktionellen Linkermoleküle (Fig. 2b bzw. 2c), wobei diese Verbrückungsmoleküle, wie vorstehend erwähnt, selbst biologisch aktiv sein können. Die Kombinationen reaktiver chemischer Gruppen gemäß Fig. 2 sind ebenso geeignet für die Verbrückung von gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellter Glykoproteine mit Nukleinsäuren oder Lipiden, die die entsprechenden reaktiven Gruppen tragen.

Wie sich aus den vorstehenden Erläuterungen ergibt, bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine Reihe von Vorteilen. So können die verschiedensten Glykoproteine nach dem Baukastenprinzip miteinander oder mit anderen biologisch aktiven Molekülen verknüpft und dadurch unterschiedliche biologische Funktionen miteinander kombiniert werden.

Die Verbrückung über die Kohlenhydratkette des Proteinanteils bzw. der Proteinanteile der erfindungsgemäßen Glykokonjugate stellt dabei eine ideale Verbindung der verschiedenen durch die verbrückten Moleküle verkörperten Funktionen dar, da die darin enthaltenen Oligosaccharide extrem flexibel und wenig oder überhaupt nicht immunogen sind und in der Regel keine unspezifische Adsorption verursachen. Da die Kohlenhydratanteile durch die metabolische Einführung reaktiver Gruppen gemäß Schritt a) nur geringfügig modifiziert werden und hinreichend lang sind, können beispielsweise zwei Proteine miteinander verknüpft werden, ohne das ihre jeweilige Funktion maßgeblich beeinträchtigt wird. Ferner kann man auf bereits etablierte Verfahren zur Isolierung bzw. Reinigung des zu verknüpfenden Glykoproteins bzw. der zu verknüpfenden Glykoproteine zurückgreifen.

Beispiele bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung sind unter anderem über ihren Kohlenhydratanteil verbrückte, multifunktionelle Antikörper. Mit Hilfe molekularbiologischer Techniken ist es heutzutage ohne weiteres möglich, "minimalisierte" Proteine herzustellen, d. h. Proteinfragmente beziehungsweise einzelne Domänen von Proteinen, die die Funktionalität des Gesamtproteins beibehalten haben, oder bei Proteinen mit mehreren Funktionen eine dieser Funktionen isoliert aufweisen. Ein Beipiel hierfür sind sogenannte "single-chain antibody fragments", die erheblich kleiner sind als die natürlich vorkommenden Antikörpermoleküle. Der Nachteil der rekombinanten Herstellung solcher Proteine besteht jedoch darin, daß diese Moleküle in vivo aufgrund ihrer geringen Größe sehr schnell durch renale Filtration aus der Blutzirkulation entfernt werden und somit für eine therapeutische Funktion nicht mehr zur Verfügung stehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet diesbezüglich die Möglichkeit, entsprechende rekombinante Proteinfragmente, etwa die genannten "single-chain antibody fragments", über ihren Kohlenhydratanteil zu oligomerisieren. Hierzu werden Proteinfragmente, die beispielsweise eine N-Glykosylierungstelle der Sequenz Asn-X-Ser/Thr besitzen, in Säugerzellen in Anwesenheit beispielsweise von N-Lävulinoylmannosamin rekombinant hergestellt, wodurch die so hergestellten Glykoproteinfragmente reaktive Ketongruppen in ihrem Kohlenhydratanteil aufweisen. Nach der Isolierung gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens können diese Glykoproteinfragmente dann gemäß Schritt b) durch Verbrückung zu größeren Oligomereinheiten kovalent verknüpft werden. Hierdurch werden die Moleküle zum einen größer und entsprechend nicht mehr so schnell durch renale Filtration aus der Blutzirkulation entfernt. Zum anderen können etwa im Falle von verbrückten Antikörperfragmenten die entstandenen Oligomere durch die erhöhte Avidität ihrer Bindung wesentlich effizienter an antigene Strukturen binden als einzelne "single-chain fragments".

Ein weiteres Problem von Antikörpern und rekombinanten Fragmenten bei "in vivo" Anwendungen stellt häufig die mangelnde Spezifität dar. Da eine bestimmte antigene Struktur nicht nur auf einem Zelltyp vorhanden ist, binden die Antikörper an eine Vielzahl von Zellen. Die Spezifität kann jedoch erheblich verbessert werden, indem zum Beispiel heterospezifische Antikörper des IgG-Typs eingesetzt werden, die an zwei verschiedene Epitope auf einer Zelle binden können. Während diese Antikörper bisher in einem aufwendigen und langwierigen Verfahren hergestellt werden müssen, erlaubt die Verbrückungstechnologie der vorliegenden Erfindung einen einfachen Zugang zu Heterooligomeren, nämlich über ihren Kohlenhydratanteil kovalent verbrückte Heterooligomere, deren individuelle stöchiometrische Zusammensetzung gezielt gewählt werden kann. Hierdurch können in einfacher Weise maßgeschneiderte Antikörpermoleküle mit den gewünschten Bindungseigenschaften hergestellt werden.

Bei Fehlen von Glykosylierungsmotiven in der natürlichen Aminosäuresequenz können z. B. entsprechend der WO 98/49198 auch Minimalantikörper mit einer artifiziellen Glykosylierungsstelle versehen werden. Diese können dann mittels metabolischen Einbaus gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeführte reaktive chemische Gruppen mit sich selbst oder mit anderen so hergestellten Minimalantikörpern verknüpft werden. Daraus ergeben sich erfindungsgemäße Oligomerkonjugate mit maßgeschneiderten Bindungseigenschaften.

Ein weiteres Anwendungsgebiet der Erfindung sind Polypeptidhormone. Viele Proteine oder Polypeptide mit hormoneller Wirkung, die natürlicherweise im Körper vorkommen, werden rasch durch renale Filtration aus der Blutzirkulation entfernt. Hierzu zählen Proteine aus der Gruppe der Interleukine, Interferone und der Wachstumshormone. Um mit diesen Proteinen jedoch einen therapeutischen Effekt im Sinne einer pharmakologischen Anwendung zu erzielen, ist es häufig wünschenswert, über einen längeren Zeitraum eine erhöhte Konzentration im Serumspiegel zu erzielen. Ein Beispiel hierfür stellt humanes rekombinantes EPO dar, das als Monomer eine relativ kurze Halbwertszeit im Blut aufweist. In der US-PS 5,919,758 wird ein EPO-Dimer beschrieben, welches durch "cross-linking" über Aminosäureseitenketten eine verlängerte Verweildauer in der Blutzirkulation und damit eine erhöhte biologische Wirksamkeit besitzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet hier eine einfache Alternative. So können erfindungsgemäß Polypeptidhormone durch die Verbrückung über ihren Kohlenhydratanteil zu erfindungsgemäßen Glykokonjugaten di- oder oligomerisiert werden, so das hochspezifische und äußerst aktive Therapeutika mit vorteilhafter Pharmakokinetik entstehen. Ein Beispiel eines bevorzugten erfindungsgemäßen Glykokonjugats ist ein Homo-Dimer von Erythropoietin, das gegenüber dem monomeren Polypeptid eine verbesserte Pharmakokinetik aufweist.

Auch bei anderen kleinen Glykoproteinen kann durch Di- oder Oligomerisierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verbrückungsverfahren die kritische minimale Grösse überschritten werden, so daß sie nicht durch renale Filtration aus der Blutzirkulation entfernt werden und damit eine verbesserte Pharmakokinetik aufweisen.

Ein weiteres Problem, das beim therapeutischen Einsatz von Polypeptidhormonen häufig auftritt, liegt darin, daß mehrere verschiedene Polypeptidhormonmoleküle gleichzeitig an ihren Rezeptor auf der Zelloberfläche binden müssen, um eine spezifische zelluläre Signalkaskade und somit einen bestimmten biologischen Effekt auszulösen. Beispiele hierfür sind die Colony Stimulating Factor- und Interleukin-1 (IL-1)-abhängige Proliferation von Microgliazellen, oder die Differenzierung von hematopoetischen Vorläuferzellen durch GM-CSF und IL-3. Es kann daher vorteilhaft sein, Funktionen verschiedener Polypeptidhormone in einem Molekül zu vereinigen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt diesbezüglich das einfache kovalente Verbrücken von zwei oder mehreren verschiedenen glykosylierten Polypeptidhormonen über ihren Kohlenhydratanteil. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, ein spezifisches Linkermolekül, zum Beispiel ein mit geeigneten reaktiven Gruppen versehenes Steroidhormon, zu verwenden, das selbst hormonelle Wirkung besitzt. Auf diese Weise können hochspezifische und äußerst aktive chimäre Therapeutika hergestellt werden. Beispiele solcher vorteilhafter erfindungsgemäßer chimärer Konjugate sind solche, bei denen ein GM-CSF-Polypeptid mit einem IL-2- oder IL-3-Polypeptid über reaktive chemische Gruppen verbrückt ist, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in ihren Kohlenhydratanteil eingeführt wurden.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auch virale Hüllproteine bzw. ganze Viruspartikel herstellen und isolieren, die in ihrem Kohlenhydratanteil reaktive chemische Gruppen aufweisen und dann im Verbrückungsschritt sehr einfach mit einem "Target"-Protein oder einem anderen "Target"-Molekül, z. B. einer Nukleinsäure oder einem Lipid bzw. einer Micelle verknüpft werden können. Für eine Vielzahl von Anwendungen sind in den letzten Jahren virale Expressionsvektoren entwickelt worden, mit denen genetische Information effizient in Zellen eingebracht werden kann. Hierbei stellt die zielgerichtete Infektion von Zellen jedoch immer noch ein Problem dar, wobei bestimmte Zelltypen entweder überhaupt nicht infiziert werden können oder die Viren eine sehr breite Spezifität haben, was vor allem in vivo zu einer nicht kontrollierbaren Ausbreitung der Infektion führt. Um dieses Problem zu lösen wurden zum Beispiel Alpha- Viren hergestellt, die modifizierte Hüllproteine aufweisen und Protein G auf der Virusoberfläche exponieren. An dieses Protein können nun über den Fc-Teil beliebige Antikörper an das Virus gebunden werden, welche dann zu einem zielgerichteten Befall von bestimmten Zelltypen führen. Während die beschriebene Technik derzeit nur für Alpha-Viren einsetzbar ist, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Oberflächen sämtlicher Viren zielgerichtet modifiziert werden, die in ihrer Hülle Glykoproteine besitzen. Hierzu werden die Viren in einer Zelllinie in Kultur beispielsweise in Anwesenheit von N-Lävulinoylmannosamin hergestellt. Anschließend werden die Viruspartikel isoliert und mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Linkermolekül und einem Überschuß des gewünschten "Target"-Glykoproteins, das beispielsweise ebenfalls N-Lävulinoylneuraminsäuren aufweist, umgesetzt. Auf diese Weise kann jedes beliebige Zielglykoprotein auf eine Virusoberfläche aufgebracht werden. Ist das "Target"- Glykoprotein zum Beispiel ein Antikörper, der bestimmte antigene Strukturen auf einer Krebszelle erkennt, können Viruspartikel hergestellt werden, die bevorzugt Krebszellen befallen. Es ist erfindungsgemäß auch möglich, einen Liganden auf dem Virus-Partikel zu immobilisieren, für den nur ganz bestimmte Zellen einen Rezeptor besitzen, so das nur diese Zellen von dem Virus befallen werden. Solche Konjugate sind auch als hochspezifische Fähren für den Transfer von in Virus-Partikeln verpackter Nukleinsäuren etwa zum Zwecke der Transfektion von Zellen oder Geweben bzw. für die Gentherapie geeignet.

Ferner kann man gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Verbrückung gemäß Schritt b) mit einem Lipid unter Bedingungen durchführen, die unterhalb der kritischen micellaren Konzentration des betreffenden Lipids liegt. Nach der Verbrückungsreaktion kann dann die Konzentration des betreffenden Lipids erhöht bzw. weitere Lipide zugegeben werden, so daß sich Micellen bilden, in die die gebildeten Glykokonjugate mit ihrem Lipidanteil eingebaut werden. Vorzugsweise werden die Bedingungen dabei so gewählt, daß der Proteinanteil der in den Micellen enthaltenen Glykokonjugate nach außen weist. Die Glykokonjugate enthaltenden Micellen enthalten vorzugsweise biologisch bzw. pharmazeutisch aktive Substanzen, z. B. Toxine, RNA oder DNA oder cytostatische oder cytotoxische Wirkstoffe. Der nach außen weisende Proteinanteil der in den Micellen enthaltenen Glykokonjugate wird dabei ferner vorzugsweise so gewählt, dass er eine gewisse Zell- oder Gewebsspezifität aufweist. Auf diese Weise lassen sich zell- bzw. gewebsspezifische Transportreagenzien auf der Basis von Micellen herstellen, die beispielsweise für die Transfektion von Zellen oder für die Tumor- oder Gentherapie geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen Glykokonjugate eignen sich insbesondere zur Verwendung als wirksame Medikamente bzw. zu deren Formulierung. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Anteil an einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Glykokonjugate enthält. Die Glykokonjugate liegen in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung vorzugsweise in einer Form vor, die an die jeweilige Darreichungsform angepaßt ist, und werden gegebenenfalls in ein diesbezüglich geeignetes Salz oder Derivat überführt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können ferner geeignete pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe bzw. andere Zusatzstoffe enthalten.

Beispiel 1 Herstellung von peracetyliertem N-Lävulinoylmannosamin

Zu einer Lösung von 2,85 ml Lävulinsäure (27,8 mmol) in 77 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran werden 4,2 ml Triethylamin (30,2 mmol) gegeben. Die Mischung wird anschließend 30 min unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Dann werden tropfenweise 3,31 ml Isobutylchlorformat (25,5 mmol) zugegeben. Anschließend wird der Ansatz 3 h bei RT gerührt, wobei sich ein weißer Niederschlag aus Lävulinoylisobutylcarbonsäureanhydrid bildet. Zur Umsetzung mit Mannosamin werden 5 g Mannosaminhydrochlorid (23 mmol) in 154 ml eines Gemisches aus Wasser und Tetrahydrofuran (5 : 4) gegeben, mit 3,6 ml Triethylamin (25,5 mmol) versetzt und 5 min gerührt. Anschließend wird dem Reaktionsgemisch tropfenweise das aufgeschlämmte Lävulinoylisobutylcarbonsäure­ anhydrid zugesetzt und der Ansatz 24 h gerührt. Das Lösungsmittel wird anschließend im Vakuum abgezogen.

Zur Peracetylierung werden 100 mg des entstandenen N-Lävulinoylmannosamins (0,38 mmol) in 8 ml Pyridin gelöst und mit 4 ml Essigsäureanhydrid (44 mmol) und einer katalytischen Menge an 4-Dimethylaminopyridin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf 0°C gekühlt und 12 h gerührt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur werden 100 ml Dichlormethan zugesetzt. Die organische Phase wird dann dreimal mit je 50 ml 1 M HCl, einmal mit 50 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und einmal mit 50 ml 1 M Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wird anschließend durch Chromatographie an Silicagel gereinigt.

Beispiel 2 Darstellung von N-Lävulinoylneuraminsäure-haltigem Erythropoietin (EPO) durch metabolische Umsetzung

Zur Gewinnung von N-Lävulinoylneuraminsäure-haltigem EPO werden stabil mit einem EPO-Expressionsvektor transfizierte CHO-Zellen in RPMI-Medium bis zu einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium in einer Spinner-Apparatur kultiviert. Anschließend werden 400 µl/100 ml Kulturmedium einer Lösung von peracetyliertem N- Lävulinoylmannosamin in einem Gemisch aus Ethanol und DMSO (10 : 1) zugesetzt, so daß die entstehende Lösung 0,5 mM N-Lävulinoylmannosamin enthält. Nach 6 h wird das Medium gewechselt, wobei die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und in Medium, das peracetyliertes N-Lävulinoylmannosamin enthält (0,5 mM), auf eine Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt werden. Nach vier Tagen Kultur bei 37°C unter 5% CO₂ Atmospäre werden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und die das sezernierte rekombinante EPO enthaltenden Kulturüberstände gesammelt.

Beispiel 3 Reinigung von EPO

Die vereinigten Kulturüberstände aus Beispiel 2 werden bei 10.000 × g zentrifugiert. Die partikelfreie Lösung wird dann mit einer Flußrate von 0,5 ml/min auf eine Immunaffinitätssäule (3 × 1,8 cm), die einen kovalent gebundenen monoklonalen anti- EPO Antikörper enthält, gegeben. Anschließend wird die Säule mit 5 Säulenvolumen PBS gewaschen. Das gebundene EPO wird in einem Säulenvolumen mit 100 mM Glycin/HCl bei pH 2,9 eluiert. Das Eluat wird sofort durch Zugabe von 1 M TRIS pH 7,4 neutralisiert. Das Eluat wird dann erschöpfend gegen PBS dialysiert und in Ultrafiltrationsröhrchen (Centricon 30, Amicon) aufkonzentriert.

Beispiel 4 Verbrücken von EPO und Trennung der Oligomere

Zum Verbrücken der EPO-Monomeren werden 2 ml der Proteinlösung (1 mg/ml EPO in PBS) mit 1,4-Bis-(Hydroxyamino)butan (2 mmol) versetzt. Der Ansatz wird 2 h bei RT inkubiert. Zum Abtrennen der nicht umgesetzten Linkermoleküle und zur Auftrennung der entstandenen verbrückten Oligomere, die aus einer, zwei oder mehreren EPO- Einheiten bestehen, wird eine Gelfiltration durchgeführt. Hierzu wird eine Sephacryl- Säule (Pharmacia) mit PBS als Laufmittel eingesetzt. Von dem Reaktionsgemisch werden 0,5 ml bei einer Flußrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Das Eluat wird in 1 ml Fraktionen gesammelt. Die so erhaltenen Protein-Fraktionen werden dann mittels SDS-PAGE mit nachfolgender Coomassie-Färbung untersucht, um die Fraktionen zu identifizieren, in denen die EPO-Dimeren enthalten sind.

Claims (31)

1. Glykokonjugat, bei dem ein Proteinanteil über eine Kohlenhydratkette mit einem weiteren Proteinanteil, einer Nukleinsäure oder einem Lipid bzw. einer Micelle kovalent verbrückt ist, wobei die Verbrückung über eine im Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen natürlicherweise nicht vorkommende und an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest der Kohlenhydratkette gekoppelte chemische Gruppe erfolgt.

2. Glykokonjugat nach Anspruch 1, wobei das Glykokonjugat in gereinigter Form vorliegt.

3. Glykokonjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die chemische Gruppe über ein Stickstoffatom an den Neuraminsäurerest, den Galactosaminrest oder den Glucosaminrest gekoppelt ist.

4. Glykokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die chemische Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe chemischer Gruppen bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β-Aminothiol-, α- Halogencarbonyl- und Azidgruppe.

5. Glykokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die an den Neuraminsäurerest, den Galactosaminrest oder den Glucosaminrest gekoppelte chemische Gruppe an der Ausbildung einer Verbrückungsgruppe V teilnimmt, die unter für Proteine nicht denaturierenden Reaktionsbedingungen gebildet werden kann.

6. Glykokonjugat nach Anspruch 5, bei dem es sich bei der Verbrückungsgruppe V um eine Hydrazon-, eine Oxim-, eine Thiosemicarbazon-, eine Thiazolidin- oder eine Thioestergruppe handelt, oder um eine Gruppe der folgenden Formel:

7. Glykokonjugat nach Anspruch 5 oder 6, bei dem die Kohlenhydratkette ferner eine Linkergruppe L umfaßt, die über die Verbrückungsgruppe V mit einem Monosaccharidbaustein der Kohlenhydratkette verbunden ist, und über eine Verbrückungsgruppe V' mit dem weiteren Proteinanteil, der Nukleinsäure oder dem Lipid verbunden ist, wobei V' die gleichen Bedeutungen wie V annehmen kann und V und V' jeweils gleiche oder voneinander verschiedene Verbrückungsgruppen sein können.

8. Glykokonjugat nach Anspruch 7, bei dem es sich bei der Linkergruppe L um eine säurespaltbare Linkergruppe handelt.

9. Glykokonjugat nach Anspruch 7 oder 8, bei dem die Linkergruppe L eine biologisch aktive Gruppe ist.

10. Glykokonjugat nach Anspruch 9, wobei die Linkergruppe L ein Toxin oder ein Steroid ist.

11. Glykokonjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Linkergruppe L eine lineare oder cyclische, unverzweigte oder verzweigte, gesättigte oder ein oder mehrfach ungesättigte und gegebenenfalls einfach oder mehrfach durch Fluor, Chlor, Brom, Jod, oder einen Hydroxy-, Epoxy-, Carbonyl-, Carboxyl-, Amino-, Mercaptan-, Phenyl-, Phenol-, oder Benzylrest substituierte Gruppe mit 2 bis 18 C-Atomen bedeutet.

12. Glykokonjugat nach einem der Ansprüche 1-11, das folgende allgemeine Formel aufweist:
wobei
P einen Mono-, Di- oder Oligosaccharidrest mit bis zu 40 glykosidisch miteinander verknüpften, gegebenenfalls verzweigten Zuckerresten bedeutet, die Furanose- und/oder Pyranoseringe darstellen und 5 bis 230 C-Atome enthalten und N- oder O-glykosidisch an den Proteinanteil des Glykokonjugats gebunden sind;
R₁ ein Rest der allgemeinen Formel AVBX ist, in dem
A einen linearen oder cyclischen, unverzweigten oder verzweigten, gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten, hydroxylierten und/oder ketylierten (C₂-C₆)-Acylrest, insbesondere einen (C₂-C₆)-Alkanoylrest bedeutet, oder einen linearen oder cyclischen, unverzweigten oder verzweigten, gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten, hydroxylierten und/oder ketylierten (C₂-C₆)-Hydrocarbylrest, insbesondere einen (C₂-C₆)-Alkyl, -Alkenyl- oder -Alkinylrest;
V die vorstehend angegebene Bedeutung hat;
B einen Mono-, Di- oder Oligosaccharidrest mit bis zu 40 glykosidisch miteinander verknüpften, gegebenenfalls verzweigten Zuckerresten bedeutet, die Furanose- und/oder Pyranoseringe darstellen und 5 bis 230 C-Atome enthalten, und N- oder O-glykosidisch an X gebunden ist; und
X ein weiterer Proteinanteil ist;
oder ein Rest der allgemeinen Formel AVLV'BX ist, in dem
A, V, V', L, B und X die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben;
oder ein Rest der allgemeinen Formel AVX' oder AVLV'X' ist, in dem
A, V, V' und L die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, und
X' eine Nukleinsäure oder ein Lipid bzw. eine Micelle ist;
und
R₂, R₃, R₄ und R₅, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (C_nH_2n+2, n = 1 bis 20); einen linearen oder verzweigten Alkenylrest mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen (C_nH_2n, n = 3 bis 20, Position der Doppelbindung an C_n n = 2 bis 19); einen linearen oder verzweigten Alkinylrest mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen (C_nH_2n-2, n = 3 bis 20, Position der Dreifachbindung an C_n n = 2 bis 19); einen Alkenyl- bzw. Alkinylrest mit 2 oder mehr Doppelbindungen bzw. Dreifachbindungen mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen; einen Arylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen; einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Acylrest (-CO-R₆) mit insgesamt 1 bis 20 Kohlenstoffatomen einschließlich seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga; einen Aroylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen; einen Carbonylamidrest der Formel -CONH₂ oder -CONHR₆; einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Thioacylrest (- CS-R₆) mit insgesamt 1 bis 20 Kohlenstoffatomen; oder einen Thiocarbamidrest der Formel -CS-NH₂ oder -CS-NHR₆ bedeuten; wobei R₆ jeweils für ein Wasserstoffatom oder einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen steht und jeder der vorgenannten Reste außer H gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann durch Halogen-, Hydroxy-, Epoxy-, Amino-, Mercaptan-, Phenyl-, Phenol- oder Benzylgruppen.

13. Glykokonjugat nach Anspruch 12, bei dem die Reste R₂, R₃, R₄ und R₅ jeweils für ein Wasserstoffatom, CH₃ oder (C₁-C₇)-Acyl stehen, insbesondere Acetyl, einschließlich seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga.

14. Glykokonjugat nach Anspruch 12 oder 13, bei dem A zusammen mit der chemischen Gruppe, die an der Ausbildung der Verbrückungsgruppe V teilnimmt, und/oder zusammen mit der chemische Gruppe, die an der Ausbildung der Verbrückungsgruppe V' teilnimmt, einen Lävulinoylrest bildet.

15. Verfahren zur Herstellung von Glykokonjugaten, umfassend folgende Schritte:

• a) Kultivieren eukaryontischer Zellen in Anwesenheit eines nichtphysiologischen Vorläuferkohlenhydrats, das geeignet ist, eine dort natürlicherweise nicht vorkommende und an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest gekoppelte erste reaktive chemische Gruppe W in den Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen der Zellen einzuführen, und Isolieren eines von den kultivierten Zellen exprimierten Glykoproteins, das die genannte chemische Gruppe W in seinem Kohlenhydratanteil aufweist;
• b) kovalentes Verbrücken des gemäß Schritt a) isolierten Glykoproteins mittels der genannten chemischen Gruppe W mit dem Kohlenhydratanteil eines Glykoproteins, mit einer Nukleinsäure oder einem Lipid, über eine dort natürlicherweise nicht vorkommende weitere reaktive chemische Gruppe W'.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die eukaryontischen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe von Zellen bestehend aus NIH3T3-Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, HeLa-Zellen, HEK293-Zellen, CHO-Zellen und SF9-Zellen.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die chemische Gruppe W über ein Stickstoffatom an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest im Kohlenhydratanteil des gemäß Schritt a) isolierten Glykoproteins gekoppelt ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die kovalente Verbrückung gemäß Schritt b) mit dem Kohlenhydratanteil eines Glykoproteins erfolgt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die chemische Gruppe W' über ein Stickstoffatom an einen Neuraminsäurerest, einen Galactosaminrest oder einen Glucosaminrest im Kohlenhydratanteil des Glykoproteins gekoppelt ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die chemischen Gruppen W und W' jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe chemischer Gruppen bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β- Aminothiol-, α-Halogencarbonyl- und Azidgruppe, und gleich oder voneinander verschieden sein können, wobei für den Fall, daß W und W' gleich sind, das kovalente Verbrücken über ein homobifunktionelles Linkermolekül erfolgt, und wobei für den Fall, daß W und W' nicht gleich sind, das kovalente Verbrücken gegebenenfalls über ein heterobifunktionelles Linkermolekül erfolgt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, bei dem die chemischen Gruppen W und W' nach dem kovalenten Verbrücken gemeinsam an der Ausbildung einer Verbrückungsgruppe V oder jeweils getrennt voneinander an der Ausbildung von Verbrückungsgruppen V, V' teilnehmen, und das Verbrücken unter für Proteine nicht denaturierenden Reaktionsbedingungen durchgeführt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, bei dem es sich bei der Verbrückungsgruppe V bzw. V' um eine Hydrazon-, eine Oxim-, eine Thiosemicarbazon-, eine Thiazolidin- oder eine Thioestergruppe handelt, oder um eine Gruppe der folgenden Formel:

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, bei dem das kovalente Verbrücken über ein Linkermolekül der Formel ZLZ' erfolgt,
wobei
Z und Z' ausgewählt sind aus der Gruppe chemischer Gruppen bestehend aus Aldehyd-, Keton-, Thiocarboxylat-, Hydrazid-, Aminooxy-, Thiosemicarbazid-, β-Aminothiol- und α-Halogencarbonylgruppe sowie der chemischen Gruppe mit der folgenden Formel:
und gleich oder verschieden sein können; und
L die vorstehend angegebenen Bedeutungen annehmen kann.

24. Glykokonjugat bzw. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, bei dem das Glykoprotein, dessen Proteinanteil verbrückt ist, bzw. bei dem das in Schritt a) isolierte Glykoprotein ein rekombinant hergestelltes Glykoprotein ist.

25. Glykokonjugat bzw. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, bei dem es sich bei dem Glykoprotein, dessen Proteinanteil verbrückt ist, bzw. bei dem in Schritt a) isolierten Glykoprotein, um ein Glykoprotein aus der Gruppe der Differenzierungs- bzw. Wachstumsfaktoren, Cytokine, Hormone, Thrombolytika, Thrombo­ prophylaktika, Gerinnungsfaktoren, viralen Hüllproteine, einschließlich vollständiger biologisch aktiver Viruspartikel, und Antikörper, einschließlich biologisch aktiver Antikörperfragmente, handelt.

26. Glykokonjugat bzw. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, bei dem das Glykoprotein durch die Verbrückung ein Homo-Dimer bildet.

27. Glykokonjugat bzw. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, bei dem das Glykoprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erythropoietin, CSF, G- CSF, GM-CSF, LIF, TNF, Lymphotoxin, PDGF, FGF, VEGF, EGF, TGF-α, TGF- β, Thrombopoietin, SCF, Oncostatin M, Amphiregulin, Mullerian-Inhibiting Substance, B-CGF, MMIF, α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, t-PA, Urokinase, Antithrombin III, Faktor VIII und Faktor IX.

28. Glykokonjugat bzw. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, bei dem das Glykoprotein durch die Verbrückung ein Hetero-Dimer bildet.

29. Glykokonjugat bzw. Verfahren gemäß Anspruch 28, bei dem das Hetero-Dimer ein Hetero-Dimer ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GM-CSF-SCF, GM-CSF-IL-2, GM-CSF-IL-3, CSF-IL-1 und IL-2-IL-3.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Glykokonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bzw. 24 bis 29, gegebenenfalls in Form eines galenisch geeigneten Salzes oder Derivats, sowie einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe oder Zusatzstoffe.

31. Verwendung eines Vorläuferkohlenhydrats der allgemeinen Formel
wobei
R₈ ein Rest der allgemeinen Formel AW ist, in dem A und W die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben
und
R₂ und R₃ ebenfalls die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, und R₆ und R₇ die gleichen Bedeutungen haben können wie R₂ und R₃,
zur Herstellung eines Glykokonjugats bzw. in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29.