JPH05500211A - 造巨核球因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺臣核球因子 この発明は一般的にひと造血系の制御に重要な新規蛋白質因子に関する。さらに 具体的には、この発明は巨核球コロニー形成および巨核球前駆体の分化または成 熟を刺激する新規な蛋白質因子を開示する。また、均質な因子を得る方法および この因子を遺伝子工学技術によって製造する方法を提供する。

発明の背景 巨核球細胞は造血細胞であり、多くは骨髄中ばかりでなく、末梢血や恐らく他の 組織にも存在するもので、血小板（栓球としても知られる）を産生じ、ついで血 小板を循環系に放出する。巨核球は、ひと造血系のすべての造血細胞と同じく、 多くの細胞分裂および相当な分化および成熟を含む複雑な経路を経た後、最終的 に原始的な幹細胞に由来する。

これらの巨核球細胞に由来する血小板は損傷部位の血餅形成を生じさせるのに必 須である。血小板はまた、血餅形成部位に傷の治癒の過程を促進し、かつ他の機 能をも果たす可能性のある成長因子を放出する。しかし、血小板濃度減少（血小 板減少症）にかかっている患者の場合、血餅形成が不可能なことは最も直接的な かつ重大な帰結であり、多くの癌治療による致命的な合併症の可能性が存在する 。このような癌患者は一般に、この問題を血小板輸血で解決している。その他の 血小板輸血を必要とする患者は骨髄移植患者まｔ；は再生不良性貧血患者である 。

このような場合の血小板は正常なドナーの血小板泳動（ｐｌａｔｅｌｅｔｐｈｏ ｒｅｓｉｓ）によって得られる。多くのひと血液産物と同様に、輸血用血小板は 比較的保存期間が短く、患者をひと免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のような危険な ウィルスにさらす危険性がある。

明らかに、血小板欠乏症患者における内在性血小板形成刺激能力は患者の血小板 輸血に対する依存の減少を伴いこれは非常な利益である。さらに、癌のための放 射性治療および化学療法を受けている患者における血小板減少症の改善および予 防の能力はそのような治療をより安全にし、治療の強度を増大させることを可能 にし、それによってより大きい抗癌効果を生じさせる。

このような理由から、多数の研究が巨核球の調節および血小板産生に関連する因 子の同定および精製に行われてきた。かなりの議論があるものの、造血細胞の成 長および成熟巨核球への分化およびそれに伴うこれらの細胞による血小板の産生 を調節する因子は２種類に分類できる考えられている： （１）巨核球コロニー刺激因子（ｍｅｇ−Ｃ３Ｆｓ）であり、培養中巨核球前駆 体の増殖および分化を支持する。

（２）血小板新生（ＴＰＯ）因子であり、血小板の産生および放出をもたらす巨 核球の分化および成熟を支持する。

［例えば、Ｅ、マズル、イクスペリメンタル・ヘマトロジー、１５　：　３４０ −３５０　（１９８７）参照１いずれの種類の因子もバイオアッセイによって定 義されている。

ｍｅｇ−ＣＳＦｓ活性を有する因子は巨核球コロニー形成を支持するが、ＴＰＯ 活性を有する因子は動物に投与した時、循環する血小板の数の増加を誘発する。

これらの活性のいずれかまたは両方を有する因子が何種類あるかは明白でない。

例えば、ひとＩＬ−３は、ひと巨核球コロニー形成を支持するが、少なくとも猿 では、しばしば血小板数の増加も誘発する。

しかしながら、ＩＬ−３は、造血系のすべてにおいて造血細胞の発達に影響を与 え、選択的に巨核球系の細胞と相互に影響し合う遺臣核球および血小板形成の特 定の調節剤とは区別され得る。

現在までに報告された研究から、ｍｅｇ−Ｃ５Ｆｓと同定された活性因子もＴＰ Ｏ活性を有するか、またはその逆かは明らかでない。

文献中の多数の種々の報告が巨楼球系の細胞と相互に影響し合う因子について記 載している。数種の推定的ｍｅｇ−Ｃ３Ｆｓ組成物が血清から誘導されている［ 例えば、Ｒ，ホフマンら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイシ 邂ン、７５：１１７４−１１８２　（１９８５）；Ｊ、Ｅ、ストラネバら、イク スペリメンタル・ヘマトロジー、１５：６５７−６６３　（１９８７）１．マズ ルら、イクスペリメンタル・ヘマトロジー、１３　：１１６４−１１７２　（１ ９８５）参照１゜ＴＰＯ因子に関するより多くの報告が先行文献中に存在する。

［例えば、Ｔ、Ｐ、マクドナルド、イクスペリメンタル・ヘマトロジー、１６： ２０１−２０５　（１９８８）；Ｔ、Ｐ。

マクドナルドら、パオロジカル・メディシン・アンド・メタポリツク・バイオロ ジー、３７：３３５−３４３　（１９８７）；Ｔ、テイリアンら、ジャーナル・ オブ・パオロジカル・ケミストリー、２６２　：　３２６２−３２６８　（１９ ８７）　、その他参照１このような調節因子を一時的に確認した多数の補助的な 報告が存在するが、これらの因子の生化学的および生物学的同定および特徴づけ は天然の資源、例えば、血液および尿から得られる、少量の天然に存在する因子 によって阻まれてきた。

現在、血清由来の産物または血小板に代わって、製薬学的利用のためのｍ　ｅ　 ｇ　−ＣＳ　ＦまたはＴＰＯとして利用し得る単離精製された因子は確認されて いない。

現在採用されている血小板輸血に代わり、インビボでの血小板の産生を刺激また は増強し得る、天然の資源から精製されるかまたは別の方法で製造される均質な 別の蛋白質の必要性が存在する。

発明の要約 この発明の態様の一つは、他のひと蛋白質が実質的に伴わない新規な、ひと遺臣 核球因子（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　：　ｍ 　ｅ　ｇ−Ｃ３Ｆ）を提供するものである。この蛋白質は組み替え遺伝子工学技 術によっても製造され得る。それはまた天然に、または他の因子による誘発によ ってその因子を産生ずる細胞資源から精製され得る。ｍｅｇ−Ｃ５Ｆはまた、化 学的技術または上記の技術の組み合わせによって合成し得る。

この発明のｍｅｇ−ＣＳＦは、ねずみの骨髄標的細胞を用いたア・、・セイで、 中および大寸巨核球からなるコロニーの成長と発達を刺激することが判明した。

ｍｅｇ−Ｃ３Ｆは、このアッセイで５ＸＩＯ’希釈単位希釈臼質ｍｇより大きな 生物学的活性を示す。ｍｅｇ−Ｃ５Ｆはまた、下記の実施例８記載のように、ひ と細胞を用いたアッセイにおいて活性を示す。

活性ｍｅｇ−ＣＳＦは、非還元条件下のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア ミドゲル電気泳動による測定で約２８−３８ｋｄのみかけ分子量を有する。ｍｅ ｇ−ＣＳＦは、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電 気泳動による測定で２Ｏ−２７ｋｄのみかけ分子量を有する。

この約２８−３８ｋｄの活性ｍｅｇ−Ｃ５Ｆは、さらに第１表から第４表の配列 の全部また一部を含むことを特徴とする。ｍｅｇ−Ｃ３Ｆはまた、配列（ａ）か ら（ｄ）として下記に記載される、同じかまたは実質的に同じ４個のアミノ酸配 列またはそれらの７ラグメントを含むことを特徴とする。

この発明の他の態様は、ひとｍｅｇ−Ｃ５Ｆ蛋白質の発現をコード化するＤＮＡ 配列である。このＤＮＡ配列は、上記と同じひとｍｅｇ−Ｃ５Ｆ蛋白質の発現を コード化する孤立したＤＮＡ配列を含むことを特徴とする。ｍｅｇ−ＣＳＦ蛋白 質の全部または一部をコード化するＤＮＡ配列は、同じか、または実質的に同じ である第１．２、または３表中のヌクレオチド配列またはそれらの７ラグメント を含むことを特徴とする。このＤＮＡ配列は補助的なコード化配列を含んでいて もよい。このＤＮＡ配列はまた、ｍｅｇ−（ＳＦコード化配列を７ランクする５ ′および３′ひと非コード化配列であってもよい。ＤＮＡ配列はまた、アミノ末 端シグナルペプチドをコード化していてもよい。第１表はゲノムクローンの５′ 境界の外側に始まり、エクソンＩＩおよび１１１間に存在するイントロン中のＢ ｇ１１１部位で終了する推定上の部分的ゲノム配列を説明する。第１表はエクソ ン■およびエクソンＩ＋の解放型読み枠をコード化する配列を含む。これはまた 、Ｎ−末端エクソンおよび全長Ｍｅｇ　ｃＤＮＡ中に存在するエクソンＩのゲノ ム配列５′中に含まれる他の追加的なエクソンを含んでいてもよい。第２表は、 ひと尿から分離され、ＣＯ３−１細胞中に発現したひとｍｅｇ−Ｃ３Ｆの配列を コード化する部分的ゲノムを形成する他の公知のエクソンＩＮを説明する。

第３表は、このゲノム配列に由来するエクソンＩからＩＩＩを含む配列をフード 化する推定的部分ｃＤＮＡを説明する。

この発明のＤＮＡ配列は生物学的に活性なひとｍｅｇ−Ｃ３Ｆをコード化するこ とができ、また第１．２または３表の別々のＤＮＡ配列と、適当な条件下でハイ ブリダイズすることできるか、または遺伝子コードの縮重がなければ、上記条件 下で７１イプリダイズすることができるであろうＤＮＡ配列を含むことができる ことが判明した。すなわち、この発明のＤＮＡ配列は、非コード化配列、シグナ ル配列または対立遺伝子の変形、種類の変更または計画的修飾に基づくコード化 配列の修飾物を包含し、または含有していることができる。

さらにこの発明の別の態様は、ひと尿からこの発明のｍｅｇ−ｃＳＦ組成物また はそれらの７ラグメントの分離または精製方法である。この発明による精製方法 は尿の濃縮の段階；それをアニオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ；つい でカチオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ；得られた物質をレクチン親和 性カラムクロマトグライーに通し、ついでカチオン交換ファインノ（−７オ一マ ンス液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）にかけ、そし“ｒ各ＨＰＬＣ操 作のための異なる溶媒液を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーにかけるた３ 種の流出物を含む。

さらにこの発明の態様は、尿から精製された、または組み替えまたは合成技術を 用いて製造された均買ｍｅｇ−Ｃ５Ｆである。これは、ねずみのフィブリンクロ ットアッセイで５Ｘ１０’希釈単位／ｍｇより大きい比活性を有することを特徴 とする。

この発明はまた、ベクターＤＮＡおよびひとｍｅｇ−Ｃ３Ｆをコード化するＤＮ Ａ配列を含む組み替えＤＮＡ分子を提供する。このＤＮＡ分子は、選択された宿 主細胞中のｍｅｇ−Ｃ３Ｆの複製および発現に向は得る制御配列と機能可能に結 合したｍｅｇ−Ｃ３ＦＤＮＡを有する。この発明は組み替えｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白 質の発現に用いるために、このようなりＮＡ分子で形質転換された宿主細胞も提 供する。

この発明のＤＮＡ分子および形質転換細胞は別の態様である、組み替えひとｍｅ ｇ−Ｃ３Ｆ蛋白質、またはそれらのペプチド７ラグメントの新規な製造方法にも 用い得る。この方法では、蛋白質の発現を制御し得る適当な制御または発現調節 と機能可能に結合したｍｅｇ−Ｃ５Ｆ蛋白質またはそれらの７ラグメント（また は上記のような組み替えＤＮＡ分子）の発現をコード化するＤＮＡ配列で形質転 換されたセルラインを組み替えＤＮＡの発現を可能にする適当な条件下で培養す る。ついで、発現されたｍｅｇ−ＣＳＦ蛋白質を、適当な通常の手段によって、 宿主細胞、細胞溶解物または培養培地から回収する。この調整培地は、尿からの ｍｅｇ−Ｃ３Ｆの分離に用いたと同じ精製段階か、またはその変更段階によって 処理され得る。クレームされた方法は蛋白質の発現のための宿主細胞として多数 の公知細胞を用いることができる。現時点では、ｍ　ｅ　ｇ　−ＣＳ　Ｆ産生セ ルラインとしては、は乳類セルラインおよび細菌セルラインが好ましい。

さらに、この発明の態様として、組み替えｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白質を提供する。こ の蛋白質は実質的に他のひと蛋白質性物質を含まず、ここに記載したペプチドフ ラグメントまたは配列の１種またはそれ以上をコード化するＤＮＡ配列を含む。

この発明のｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白質はここに記載した物理学的、生化学的、薬理学 的または生物学的活性の１種またはそれ以上を有することを特徴とする。

この発明の別の態様は、均質または組み替えｆｎｅｇ−Ｃ３Ｆの治療的な有効量 、または１種またはそれ以上のそれらの活性ペプチド７ラグメントの有効量を含 む医薬組成物の提供である。これらの医薬組成物は血小板欠乏により特徴づけら れる病的状態または障害の治療法に用いることができる。すなわち、この発明の ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ１または医薬的に有効なそれらの７ラグメントは、化学療法また は血小板減少症によってもたらされる再生不良性貧血の治療に用いることができ る。ｍｅｇ−Ｃ５Ｆは骨髄移植患者の補助的治療として用いることができる。

従って、本発明の別の態様は、適当な製薬担体中の治療有効量の＋ａｅｇ　−Ｃ Ｓ　Ｆ又はその１又はそれ以上のペプチド断片を患者に投与することによる血小 板の欠失から起きるこれらの又は他の病理学的状態を処理する方法である。これ らの治療方法は、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ又はその１又はそれ以上のペプチド断片を 、少なくとも一つの他のＴＰＯ一様因子、サイトカイン、ヘマトポイエチン、イ ンターロイキン、成長因子又は抗体の有効量を同時に又は連続的に投与すること を含みうる。

本発明のさらに別の態様は、ｍａｇ　−ＣＳ　Ｆ又はその断片に向けられた抗体 である。従って、この態様の部分として、本発明はかかる抗体を分泌しうる細胞 系及びそれらの製造法及び診断又は治療方法への用途を請求する。

本発明の他の態様及び利点は、その好ましい実施態様の以下の詳細な記載を考慮 することにより明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図はｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを含む１８．２Ｋｂゲノムクローンの制限エンドヌ クレアーゼ酵素の位置を示す制限地図を示す。図の低い方の部分は、エクソン■ 、■及び■が位置するゲノム部分を示し、制限地図でのそれらの相対位置を示す 。

発明の詳細な説明 本発明により提供される新規ヒト巨核球コロニー刺激因子、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆは、 他のヒト蛋白材料との結合の実質的にない均−蛋白又は蛋白組成物である。この 蛋白は、治療応用に有用な純粋、活性なｍｅｇ−Ｃ５Ｆの大量生成を可能にする 組換え技術を経て生成できる。

別法として、本蛋白は、ヒトの尿、それを分泌又は発現する哺乳動物細胞系から 精製された均一蛋白として得られうる。さらにｍｅｇ　−Ｃ３Ｆ又はその活性断 片は化学的に合成しうる。

本発明のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆは、以下の生化学及び生物学的性質の１又はそれ以 上により特徴づけられる。

（１）　本発明の組成物は、非還元条件下、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、又、不ズミフイブリ ンクロット巨核球コロニー形成パイオアフ七−により測定される約２８−３８Ｋ ｄの明らかな分子量を有する；（２）本発明の組成物は、種々の還元剤、例えば β−メルカプトエタノール又はジチオスレイトールを用いる還元条件下１２％５ ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される約２Ｏ−２７Ｋｄの明らかな分子量を有する： （３）本発明の組成物は、約５Ｘ１０’希釈単位／＋＋＋ｇ蛋白より大きいネズ ミフィブリンクロット巨核球コロニー形成アッセーに特異活性を有する。

（４）本発明のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ組成物は、ｌ又はそれ以上の同−又は実質的 に同一のアミノ酸配列又はその断片を含む。

（ａ）　５４１ｒ　Ａｒｑ　Ｃｙｓ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ 　Ａｒｑ（ｂ）　Ａｒｇ’Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　 ｓｅｒ　（’ｙ＠　ＬｙｓＧユｙ　（Ａｒｇ） （ｃ）　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　（Ｘ）　Ｇｌｙ　Ａｌａ　 Ｓｈｙ：　Ｇユｎτｈｒエエ＠Ｌｙｓ （ｄ）　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　（ｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　 ＴＹｒ　Ｇｌｕ５ｅｒ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａ ｓｎ　Ｐｒ。

（ｅ）アミノ酸配列は以下の第１．ＩＡ、ＩＢｌ　１ｃ、２又は３表に含まれる 。

これらの配列又はこれらの配列の断片は、完全ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ蛋白のそれと 類似の生物学及び生理活性をも有する。配列において、（Ｘ）は残基がまだ完全 に同定されていないことを示すが、ｓｅｒ又はＴｈｒでありうる。そして（）は 残基の仮の同定を示す。上の（ａ）から（ｄ）として同定された配列は、元は、 段階７を除いた精製手順の第３ＨＰＬＰ精製段階、段階８かもの精製材料から測 定された。同一配列は又、全ての８段階を経て精製されるとき、材料から得られ た。表工ないし表■のＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下に詳細に検討される。

（５）本発明のｗａｇ−Ｃ５Ｆ１／ＩＬ成物はｐＨ４，５の酸性条件下５Ｐ−Ｚ ｅｔａ　Ｐｒｅｐと結合しうる。

（６）本発明のｗａｇ−Ｃ５Ｆ組成物は、フムギーセ７アロース及びコンカナバ リン−Ａセファ０−スに結合しうる。

（７）本発明のｍｅｇ−Ｃ５Ｆ組成物は、トリフ０口酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）及びア セトニトリルの溶媒系を用いる逆相Ｃ，ＨＰＬＣカラム上２３−３３％アセトニ トリルの間で溶出する。

（８）本発明のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ組成物は、ピリジン、酢酸及びｎ−グロバノ ールの溶媒系を用いる逆相Ｃ，，ＨＰＬＣカラム上６−１５％ｎ−プロパツール の間で溶出する。

（９）本発明のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ組成物は、ヘプタ７０口酪酸（ＨＦＢＡ）及 びアセトニトリルの溶媒系を用いる逆相Ｃ，ＨＰＬＣカラム上２７−３７％アセ トニトリルの間で溶出する。

本発明のｎａｇ−Ｃ３Ｆｍ成物の生物学的活性は、培養において中間又は大きな 大きさの巨核球よりなるコロニーの成長及び発達を促進する能力により示される 。ネズミフィブリンクロット巨核球コロニー形成アッセーにおいて、本発明のｗ ａｇ　−ＣＳ　Ｆ組成物は、平均３−６巨核球のコロニーを促進する。ネズミ寒 天ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆアッセーにおいて、本発明のｍｅｇ−Ｃ３Ｆ組成物は巨核 球のコロニーを促進する。本発明のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ組成物は、ヒトプラズマ クロット巨核球コロニー形成アッセーにおいて、活性を気まぐれに示した。

ｍｅｇ−Ｃ５Ｆは、初め骨髄移植のヒト患者の尿に検出された。これらの患者は 、増加したレベルのｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ活性を示す。ヒトｍｅｇ−Ｃ５Ｆは、は じめ、以下の実施例１に特に記載された一連の精製段階及び技術によりこのヒト の尿から精製された。しかしながら、この因子は、又、他の超厚、例えば、ヒト 細胞系から精製され、又は、これらの細胞系から組換え手段を経て生成されうる 。

ヒトの尿からｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを得るのに用いる精製技術は、以下の段階を含 む。精製段階は、プールされた骨髄移植患者尿をアミコンＹＭ−１０フイルター を経て濃縮することを含む。濃縮尿は、アニオン交換クロマトグラフィカラムを 通して通過液をカチオン交換クロマトグラフィカラムに結合する。次いで、尿蛋 白溶出液をプールすること、透析すること及び加熱すること、レクチンアフイニ ティクロマトグラフィ力ラムに適用することに付した。この溶出液を次いで透析 し、カチオン交換ＦＰＬＣカラムに適用する。最後に、この溶出液を、異なる溶 媒系を用いる逆相ＨＰＬＣの３つのサイクルを通す。

以下に記載されるネズミフィブリンクロットアッセーにおいて最高レベルのｍｅ ｇ　−ＣＳ　Ｆを有するバッチは、半調製スケール（３０と１００リツトルの間 の尿相当）でさらに精製用に選ばれ、回収又は収量を最大にする。

即ち、均−ｍｅｇ−ＣＳＦは、実施例１に詳細に記載される上記精製手段を、ヒ トの尿又は、他のヒトｍｅｇ−ＣＳＦ源、例えば活性化末梢血白血球及びヒト胎 盤に適用することにより得られうる。他の組織源及び細胞系、例えばＣＩＯ−Ｍ Ｊ２（ＨＴＬＶＩ−転換Ｔ細胞系）及びＨＥＫ（−次ヒト胎児性腎臓細胞）も、 この蛋白の起源でありうる。ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを生成するのに見られうる細胞 源を培養する手段は、この分野の当業者に知られる。

ｒｎｅｇ−Ｃ３Ｆ又はその１又はそれ以上のペプチド断片も組換え技術を経て生 成しうる。ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ又はその１又はそれ以上の断片酔うのゲノムＤＮ Ａ及びｃＤＮＡ配列を得るために、精製、配列決定ポリペプチドのトリスシン消 化を調製した。即ち、慣用技術により上記（ａ）ないしくｄ）のように確認した トリプシン。

実施例５に詳細に記載するように、以下のオリゴヌクレオチドプローブを、遺伝 暗号を用いて合成して、トリプシン断片のアミノ酸配列又は、ｍｅｇ　−ＣＳ　 Ｆの上記確認アミノ末端配列をコードする全ての可能な配列を予言した。プロー ブは、ヒト胎盤λファージＤＮＡライブラリィ（ヒトゲノムライブラリィ）をス クリーンするのに用いた。プローブの一つは、１８．２ＫｂゲノムＤＮＡ挿入に ハイブリッド形成した。この挿入の制限地図は、第１図の最上部に示される。

図のより低い部分は、３つの推定エキソンＩ、Ｉ［及び■をコードするゲノム配 列を含む制限地図の５Ｋｂ部分を示す。ゲノム配列を３つの部分：ＮｏｔＩない しＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩないしＢｇｌｌ［及びＢｇｌ■ないしＢｇｌＩ［で得 た。配列は互いにこれらの部位で結合して、第１表に報告される一つの長い連続 伸びのゲノム配列を産生ずる。しかしながら、これらの接合部では、第１表に示 されない小さい欠失があるかも知れない可能性がある。

第１表の配列は、極端な５′周辺（ｂｏｒｄｅｒ）で始まるゲノムｍｅｇ−Ｃ３ Ｆクローンの部分配列である（第１図の５’ＮｏｔＩ部位に隣接）。

−１ないし−６４により示されるヌクレオチドはポリリンカーヌクレオチドであ る。ゲノム配列の第１ヌクレオチドは、配列中ｎｌとして示される。表Ｉ配列は 、エクソン■及びエクソン■の間のイントロン配列における第２ＢｇｌｌＩ部位 で終わる。この配列は約７５０５ヌクレオチドを含む。４つの酵素、ＫｐｎＩ、 ＰｖｕＩ［、ＥｃｏＲＩ及び５ｎａＢＩは、この配列を切る能力を有し、クロー ニング部位のポリリンカーに存在し、ゲノム配列の５′−周辺に隣接するＮｏｔ Ｉもこの配列を切ることができる。これらの予期された切断部位は、表Ｉにおい て、星印により印した大体の部位に示す。この配列が、少なくとも２つのエクソ ンを含むことは想像れるが、エクソンＩの５′周辺の位置及び付加のエクソンの 存在は何らはっきりとは決定されていない。エクソンＩのアミノ酸配列は明確に は決定されていない。

さらに、この配列に含まれる如何なる添加エクソンのアミノ酸配列の妥当な解読 わくも明確には決定されていない。妥当な解読わくの明確な同定がないなか、第 １Ａ、ＩＢ及び１０表は、それぞれ、ゲノムクローン第１表の第１ゲノムヌクレ オチドで始まる解読わく（解読わ＜Ａ）、第１表の第２ヌクレオチドにより（解 読わ＜Ｂ）及び第１表の第３ヌクレオチド（解読わ＜Ｃ）に対する推定アミノ酸 配列を含む。全ての３つの解読わくは、分泌性配列を含むありそうな候補者とし てコンピュータにより同定された潜在的Ｎ−末端Ｍｅｔ−含有オープンリーディ ングフレームを含む。かかる配列の一つは、第１Ａ表において、ヌクレオチド＃ ４８９７ないし５０７３（下線した）に及ぶ。第１表のヌクレオチド＃５７４２ ないし＃５９６１のアミノ酸配列（解読わくＡ内）はエクソンＩの暗号づけ部分 に対応して決定された。従って、第１Ａ表は、エクソンエ（下線した）を含み、 補正解読わく配列であり得、どのヌクレオチドも配列において削除されないか不 正確に繰り返されないと仮定する。。ヌクレオチド＃５７４２ないし＃’５９６ １に対応する第」Ｂ及びＩｃ表中のアミノ酸は削除された。

エクソン■は解読わくＢにおけるヌクレオチド＃７３４０ないし＃７４５９に及 ぶ。他の潜在的オープンリーディングフレーム配列は解読わくＢに含め、配列は ヌクレオチド＃４２０２ないし＃４４６５に及び、又、配列はヌクレオチド＃４ ４６６ないし＃４９１５に及ぶ。解読わくＣでは、かかる潜在的配列の一つはヌ クレオチド＃２１５９ないし＃２７３２に及ぶ。

第１ないし３表の配列は、ヒトｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの部分ゲノムクローンから得 られ、以下に記載されるように得られたエクソンＩ、Ｉ［及び■を含む。プロー ブにハイブリッド形成した部分は、サブクローン化し、配列を決めて、表工にお いて、エクソン■を標識したオープンリーディングフレームで示され、それは第 １図において■を評議した棒グラフを直接に表すＢｇｌｌｌ断片上に見られる。

１８．２ｋｇゲノムＤＮＡ断片も２つの付加的プローブにハイブリッド形成した 。ハイブリッド形成部分は、個々にサブクローン化され、配列を決められて、オ ープンリーディングフレーム内にエクソンＩ及び■として、それぞれ第１及び２ 表に示される配列を含むことを示す。全ての４つのトリプシン（ｔｒｙｐｔｉｃ ）配列は、３つのエクソンに存在する。

２つのトリプシンはイントロン／エクソン結合に重複し、エクソン■のボーダー を明らかにする。得られる推定ｃＤＮＡ及びｍｅｇ　−Ｃ３Ｆ部分ｃＤＮＡ配列 を含む単一解読わくにおける３つのエクソン（１，ｎ、ｍ）の予言されたアミノ 酸配列（３文言コード）は、以下の表■に報告される。部分配列は、１８２アミ ノ酸及び５４６ヌクレオチドを含み、全ての４つの上記トリプシン配列を含む。

このｃＤＮＡの５′及び３″ボーダーは、正確に同定されず、Ｎ−末端Ｍｅｔ− 含有エクソンが現在同定されておらず、エクソンｍに対する可能な余分のエクソ ン３′も同様であることを示す。エクソンＩの５′ボーダーに対する可能部位（ 即ち、Ｎ−末端Ｍｅｔ−含有エクソン又は５′−隣接エクソンが継ぐ所）は、上 記第１Ａ％　ＩＢ又はＩＣ表に位置される下線した配列（エクソンエ及び■の下 線した配列以外）に起きることが現在推定される。

第１表 エクソンＩを含む５’　Ｎｏｔｌがら第２Ｂｇ１１１部位までの部分ゲノムクロ ーン Ｎｏｔｌ Ｓａｌ　工　ｎｌ ＳｎａＢ工 Ｐｖｕ工 ＴＴＴＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴ　ＴＡＴＴＴＧＴＡＡＡ　ＴＧＴＧ ＧＡＴＧＡ’Ｋ　６１６ＴＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＴ　ＴＴＴＧ ＴＧＡＧＡＡ　ＴＴＡＡＡＴＧＣＡＧ　６５６ＧＣＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣ ＴＣＡＧＡ　ＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡ　ＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡ　１５７６ＡＡＴＧ ＴＡＴＡＴＴ　ＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧ　ＧＴＡＴＡＡＧＴＡＴ　ＡＴＡＡん＼’ ｒｃＴ入　１６コ、６ＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＡＡＣＡＣＴＡＧＧ　ＴＡＡＡ’ Ｉ’ＩＴＣＡＡ　ＡＧＣＴＡＣＣＴ？Ｉ”　１６５６ＧＣＴＡＧＡＴＴＴＡ　Ａ ＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡ　ＡＡＴＧＡＴＡＣＣＡ　１６９６Ｇ ＴＡＴＧＴＧＡＡＴ　ＡＴＴＴＴＡＡＡＧＴ　ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡ　ＡＴＡＴ ＡＣＴＡＧＴ　１７：１６ＣＡＡＡＧＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＴＴ　ＴＡＣ ＣＡＴＣＴＣＡ　ＧＧＡＣＡＡＴＴＴＧ　１７７６ＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＡ ＧＡＡＡＴＴＡ　ＧＡＡＡＴＧＴＧＣＴ　ＣＴＧＧＣＣＡＡＴＡ　１８１６ＣＡ ＴＣＴＡＡＡＴＴ　ＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧ　ＴＡＧＴＣＡＴＴＴＴ　ＧＣＴＴＡ ＡＴＧＧＡ　ｌＢ５６ＡＧＴＧＴｒＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＡＡＧＴＣ ＴＡＧＴ　ＣＧＴＣＴＧＧＧＣＣ１８９６ＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴ　ＡＡＡＴＧＡ ＧＧＡＡ　ＡＧＴＴＴＧＡＴｒＴ　ＣＡＴＡＧＧＴＴＧＴ　１９３６ＣＡＣＴＧ ＴＴＧＡＴ　ＴＴＴＧＴＣＴＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＣＴＡ　ＡＴＴＧＧＴＴＣＡ Ｔ　１９７６ＣＣＣＡＣＴＧＴＡＴ　ＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴ　ＡＴＡＴＡＡＧＡ ＣＴ　ＣＣＣＡＧＧＡＣＧＴ　２０１６ＧＧＧＡＴＡＡＡＣＴ　ＣＡＴＣＴＡＴ ＣＣＴ　ＴＴＡＣＧＧＧＴＡＡ　ＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴ　２０５６ＴＧＡＡＡＡ ＧＧＡＴ　ＴＡＴＧＴＴＴＡＴＧ　ＣＡＡＴＡＣＡＣＣＴ　ＧＴＴＧＧＡＡＧＣ Ｃ２１７６ＴＴＴＧＡＡＴＴＴＡ　ＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴ　ＴｋＡＧＡＡｋＡＡ Ｇ　ＴＴＧＧＡＡＣＡＧＴ　２２１６ＡＡＣＴＣＣＡＴＧＡ　ＴＧＣＴＴＡＴＴ ＡＡ　ＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＡＧ　２２５６ＡＡＴＡＡＣＧＴ ＧＧ　ＣｒＧＡＧＧＧＴＧＡ　ＣＴＴＧＡＴＴＴＧＴ　ＴＣＴＧＣＡＴＭＧ　２ ４１６ＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴ　ＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡ　ＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧ　 ＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡ　２５３６ＧＣＣＴ入ｉ％Ｇ丁ＴＡ　ＧＴＧＧＴＧＡＧＡ Ｔ　ＧＡＡＡＧＡＧＣ丁Ｇ　Ｔｒ’ｌ’ｌＸ’ＣＴＧＡＴＡ　２５７６ＥＣｏ　 Ｒ工 ＡＧＣＴＴＴＧＧＡＴ　ＴＴＴ１’ＣＴＴ’ｒＴＣ’Ｉ’ｒＴＴＣＴｒＴＴＣＣ ’ｆ〒ｎ’ＧＴＴＣＣ３４５６ＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡ　ＧＣＡｊｉＡＡＴＣＴＧ 　ＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡ　八人τＣＡＡＧＡＴＴ　３４９６ＴＴＡＣＡＧＧＣＣ ＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴ　ＧＣＣＣＧＧＴＴＡＡ　ＴＴＴＴｒＧＴＡＴ！’　４ ４４６Ｔｎ”ＡＧＴＡＡＡＧ　ＡＣＡＧＧＴｒＴＴＡ　ＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧ　 ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴ　４４５６ＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴ　ＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣ ＴＡＴＴＡＡＣＴＡＧ　ＴＣＧＴＧＴＧＡＴＡ　５３７６ＡＴＧＡＧＣＡＡＧＴ 　ＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴ　ＴＣＴＧＴＧＴＴｒＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＡ　５４１ ６Ｐｖｕ工工 ＧＣＴｒＧＴＧＡ’ｌ’ｒ　ＡＴｒＧＧＧＧＡＧＧ　ＧＴＡＡＧＧＧＧＡＧ　Ｃ ＣＴＧＧＭＧＴＣ６２１１゜ＴＧＴＣＡＣＩＴＧＣＡＣＡＡＧＧＴｒＡＴ　τＧ τＣｒＡＧＴｒＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＧ　６２５１ＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴ　ＡＴ ｒＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＣ７１７１ＴＧＧ ＧＡＴＡＣＣＡ　ＴＣＴＡＡＴＴｒＴｒ　ＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴ　ＧＴＡＣｒＣ Ｃ入入Ａ　へ人　７２１１ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴ　７５０５第１ Ａ表 読み枠Ａ（ヌクレオチドＮｏ、１−７５０３）ｎ４８９フ ｎ５９６１ 読み枠Ｂ（ヌクレオチドＮｏ、２−７５０４）Ｅｎｄ　Ｔｒｏ　Ｌｙｓ　Ｃｖｓ 　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｅｎｄ　Ｖａｌ　Ｅｎｄ　Ｓａｒ 　５ｅｒｎ４４６５　ｎ４４６６ 〔ヌクレオチドＮｏ、　５７４２−　Ｎｏ、　５９６１　（エクソンｌ）の読み 枠は読み枠Ａであると決定されたコ 第１Ｃ表゛ 解読枠Ｃ（ヌクレオチドＮｏ、３−７５０５）ｎ２５５９ ｎ２７コ２ ＧＩＹ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｃｙ５　Ｌ＠ｕ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　 Ｃｖｓ　Ａｓｔ＋　Ｔｈｒ　丁１ａ　ＧＩＶエクソンＩのコード配列はヌクレオ チドＮｏ、　５７４２−　Ｎｏ、　５９６１Ｅある０第■表 エクソン■を含む部分クローン ＴＴＴＴＡＴＡＧＣＡ　ＡＴＧＣＡＴＣＣＴＴ　ＡＧＣＴＴＡＡＡＴＧ　ＧＡＧ ＴＡＴＴＣＧＴ　４０ＧＴＴＧＡＧＣＴＧＧ　ＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧ　ＣＡＣＴ ＧＧＣＴＧＴ　ＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣ８０ＴＡＣＴＣＴＴＧＭ　ＧＣＴＡＧＡＴ ＧＣＡ　ＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴ　ＴＣＡＣＡＧＴＴＡＧ　１２０ＡＧＣＴＧＣＴ ＧＡＴ　ＧＡＡＣＡＴＡＡＡＣＭＧＡＴＧＴＴＡＡ　ＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣ１６ ０ＴＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＣＡ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＭＴ　ＣＣＣＡＣＡ　ＴＣＡ 　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　２００Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　５ａｒＡＴＣＡＡＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＣＡＡＡ 　ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＣＣＣＡＡＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＣ２７８工ｌｅ　Ｌｙ ｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒ ｏ　Ｐｒｏ　ＡｓｎＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＡ 　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＡＴＣＡＡＡ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　３５６Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ工１ｅ工１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　Ａｌａ？ｒＣＴＴＡ　ＧＡＴ　Ｇ入Ａ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＴＧＴ　ＡＧＧ　Ｔ ＧＡＣＴＧＣＴＴＡ　３９０ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｃｙｓ　ＡｒｇＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡ　ＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＡＴＡＡＡＡＡ ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣ５８０ＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧ　ＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡ 　ＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴ　ＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡ　７４０ＴＣＣＡＧＡＴＡＣｒ 　ＴＧＴＡＧＡＣｒＡＧ　ＴＡＡＡＴＡＧＣＡＣＴｒＣＩＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴ ＧＡＴＣＣ ７１３０第１表 ８２０　ｍｅｇ−Ｃ３Ｆの推定部分ｃ　ＤＮＡＡ、ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒ ｇコＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｐｒ ｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＧｉｎっＣｙｓ工１ｅ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　（Ｃｙｓ 　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ 　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　５ＰｈｅＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ 　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＩＬｙｓ　Ｔｙ ｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅ ｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　）ＡＴＧ　ＡＣＡ Ｍａｔ　Ｔｈｒ ＴＧＴ　ＡＧＧ Ｃｙｓ　Ａｒｇ 上述のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ配列を含む２つのゲノムクローンは、１９’９０年８ 月３日に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の要求 により、アメリカ合衆国、メリーランド２０８５２、ロックフィル、バークロー ン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄 託されている。

イ・コリのプラスミド中５’ＫｐｎＩ部位を３’５ｎａＢＩ部位につないでいる 約１２ｋｂのゲノム断片（Ｍｅｇ　−Ｋ　ｐｎ　−Ｓ　ｈａＢ　Ｉと称する）（ 第１図参照）は受託番号ＡＴＣＣ−を与えられた。第１図（１８−５６６５と称 する）のバタテリオファージλＤＮＡに挿入された完全な１８．２ｋｂ　Ｎｏ＋ Ｉ配列は受託番号ＡＴＣＣ−で寄託された。

予備実験はＫｐｎ　Ｉ　／　Ｓ　ｈａＢ　Ｉ断片はＣＯ８細胞中に活性タンパク 質を生成するようである。

このｍ＋４−Ｃ３Ｆ配列のヌクレオチド配列、特にＥｘｏＩとＥｘａｍはタンパ ク質とＤＮＡデータバンクに記録されるヌクレオチド配列と比較された。血清接 着分子であるビトロネクチンのＮ末端が最も高い水準の配列の類似性をもつこと を観察した。Ｎ末端部分はまたソマトメジンＢと呼ばれ循環系中で発見されたペ プチドである。その他の顕著な配列の類似性は内皮細胞と巨核球によりつくられ た７オンビルプラント因子のＢ領域に対してタンパク質とＤＮＡレベルにて、そ して、ＩｇＧ分泌形賃細胞で発見された膜糖タンパク質の二量体であるマウスＰ Ｃ−１の細胞外ドメイン中にタンパク質レベルにて発見された。これらのペプチ ドは未知機能をもつソマトメジンＢとＰＣ−１と機能上無量である。

完全なゲノムとｃＤＮＡ配列を得るために、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆのアミノ末端とカル ボキシ末端を種々の手順により決定できる。

ある手順は活性ヒト末梢白血球又は他起源のｍｅｇ−Ｃ３Ｆ　ＲＮＡからのｃＤ ＮＡライブラリーの製造と、プローブとして３種既知エクソンを使用してハイブ リッド形成することによる全長ｃＤＮＡの抽出を含む。第２の方法はＣＯ５細胞 中でクローン化した後の発現である。例えば、１８．２ｋｂゲノム挿入物の種々 の部分をＣＯ５細胞中へサブクローン化し、種々の活性を同定する。もしタンパ ク質が確認されたら、そのクローンのＲＮＡを分離し、ＣＤＮＡはそこから製造 し、発現させ、タンパク質を得る。例えば、全長ヒトゲノムクローン（１８−５ ６６５と称する）、Ｋｐｎ　Ｉ　／　５ｈａＢ　Ｉクローン、又は１８．２ｋｂ ゲノム挿入物の種々の部分の発現ベクターへのサブクローン化、ＣＯＳ細胞ヘノ 移入、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ移入ＣＯＳ細胞からのｅＤＮＡライブラリーの製造、およ びハイブリッド形成によるｍｅｇ−Ｃ３Ｆ　ＤＮＡの選別を含む。

別法として、Ｎ末端メチオニンを含む完全を配列は、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆのマウス相 同体との比較により同定できる。またｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの細胞起源の１ＱＲＮ Ａを、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドを暗号化しているｃＤＮＡを同定するグ ローブを用いて、選別可能なｃＤＮＡライブラリーをつくるのに使用できる。ｃ ＤＮＡ起源における選別技術は、エクソン−■からのプライマーの製造とｃＤＮ Ａ転写物を分離増幅するためのＰＣＲ技術の使用を含む。

全長ヒトゲノムクローン又はそこからの断片もまた、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆのマウスゲ ノム対応物を交差ハイブリッド形成により分離するためにプローブとして使用で きる。ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆマウスゲノムクローン又はその断片はマウスｃＤＮＡ ライブラリーの作成に使用可能なｍｅｇ−Ｃ３Ｆ（７）ｍＲＮＡ原料の同定に使 用できる。マウスｃＤＮＡは、−緒にスプライスして全長ヒトｃＤＮＡを作り得 るヒトｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子中の相当するエクソン類を同定するのに使用で きる。

完全なｃＤＮＡは同定されると、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆの活性断片を暗号化するｃＤＮ Ａまたはその一部はｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆまｔ；はそこからの断片の１またはそれ 以上における発現系をつくるために様々な発現ベクターのどれか１つへ導入でき る。

そのような組換え技術の使用により、１又はそれ以上のトリブチン断片を暗号化 するＤＮＡ配列または上記の部分配列を含むｍｅｇ　−Ｃ３Ｆポリペプチド暗号 化ＤＮＡ配列が得られる。

本発明は、このようなりＮＡ配列であってと他のタンパク質を暗号化するＤＮＡ 配列の随伴がなく、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドの発現をコード化している ものを含む。これらのＤＮＡ配列は、上記ペプチド配列の全部または断片を暗号 化する配列または部分クローン配列およびＤＮＡ配列へ緊縮ハイブリッド形成条 件下で［Ｔ、マニアテイスなど、モレキュラ　クローニング（ラボラトリ−マニ ュアル）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（１９８２）ページ３８７ −３８９参照］ハイブリツド形成する配列を含む。

このような緊縮ハイブリッド形成の条件の一例は６５°Ｃで４ＸＳＳＣ中ハイプ リント形成し、続いて６５°Ｃで１時間０．ｌＸ５ＳＣ中洗浄することである。

別法として、典型的なハイブリッド形成の条件は５０％ポルムアミド中、４２℃ で４ＸＳＳＣである。

緩和ハイブリッド形成条件下で、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの配列にハイブリッド形成 されるＤＮＡ配列であってｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの生物学的性質を有するｍｅｇ　 −ＣＳ　Ｆペプチドの発現を暗号にするＤＮＡ配列もまた新しいｍｅｇ　−ＣＳ 　Ｆポリペプチドを暗号化する。そのような非緊縮ハイブリッド形成の条件の例 は５０℃で４ＸＳＳＣであるか、４２°Ｃで３０−４０％ホルムアミドを用いて のハイブリッド形成である。

例えばｍｅｇ−Ｃ３Ｆの配列をもつ顕著な相同性をもつ領域たとえば糖鎖形成部 分また＋Ｊ、ジスルフィド連結部分を共有するＤＮＡ配列であってｍｅｇ−ＣＳ Ｆの生物学的性質を１またはそれ以上もつタンパク質を暗号化するものは、たと えそのようなりＮＡ配列がｍｅｇ−Ｃ３Ｆ配列に緊縮的にハイブリッド形成しな くても、明らかにｍｅｇ　−ＣＳＦポリペプチドを暗号化している。

ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆのペプチド配列を暗号するＤＮＡ配列の対立遺伝子変異（に アミノ酸変化をもたらすかもたらさない種集団中の天然の塩基変化）はまた類似 体、または誘導体と同様、本発明に含まれる。

同様に、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドを暗号化するがＤＮＡ配列は、遺伝子 暗号の縮重または活性、半減期、暗号化しているポリペプチドの産生を増進させ るために誘導された修飾もしくは点変異により導びかれるｍａｇ　−ＣＳ　Ｆの ＤＮＡ配列における変化のために、遺伝子暗号において異なるＤＮＡ配列もまた 本発明に含まれる。

ｍｅｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドはまた既知常用化学合成により生成できる。合成手 段による本発明のポリペプチドを構成する方法は当技術における熟練者に知られ ている。合成で構成したｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペメチド配列は、ＩＩＩｅｇ　 −ＣＳ　Ｆペプチドと第１，２．３次構造特性と配座特性を共有することにより 、ｍｅｇ−Ｃ５Ｆに共通の生物学的性質を所有できる。、したがって、それらは 天然の精製ｍｅｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドに対する生物学的に活性なまたは免疫学 的な置換物として、治療および免疫学的方法に使用できる。

ペプチドまたはｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを暗号化するＤＮＡ修飾は既知技術の使用し て当技術の熟練者により実施できる。ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ配置における興味のあ る修飾は暗号化配列における選択的アミノ酸残基の置換、挿入、欠失を含むこと ができる。そのような置換、挿入または欠失の変異誘発の技術は当業界における 熟練者によく知られている。［例、アメリカ合衆国特許４，５１８，５８４参照 １ｍｅｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドの配列の具体的な変異は糖鎖形成部位の修飾を含 むことができる。

糖鎖形成の欠乏もしくは、部のみの糖鎖形成は、アスパラギン連結糖鎖形成認識 部位もしくは〇一連結炭水素化物により修飾された分子部位でアミノ酸の置換も しくは欠失に由来する。アスパラギン連結糖鎖形成認識部位は、適当な細胞糖鎖 形成酵素により特別に認識されるトリペプチド配列を含む。

これらのトリペプチド配列はＡｓｐ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｐ−Ｘ−３ｅｒであ り、そのＸは任意のアミノ酸であることができる。糖鎖形成認識部位の第一もし くは第３アミノ酸位の片方もしくは両方での多様なアミノ酸置換もしくは欠失（ および／又は第２部位でのアミノ酸欠失）は修飾トリペプチドでの非糖鎖形成を もたらす。そのように変化したヌクレオチドの発現はその部位で糖鎖形成されな い変異体を生成する。

全体又は部分的にｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの活性保持を期待されるｍｅｇ−Ｃ３Ｆの 配列の他の類似体および、誘導体もまた、本明細書の開示を与えられた当技術に おける熟練者によって容易につくることができる。

このような修飾の１つは、ＰＥＧ部分の付加を可能にするための常用技術による 、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ配列中に存在するりジン残基へのエチレングリコール（Ｐ 　Ｅ　Ｇ）の付加またはりジン残基の１またはそれ以上もしくはＰＥＧまたはＰ ＥＧ誘導体と反応できる他のアミノ酸残基の配列への挿入である。このような修 飾は、この発明に含まれると考えられる。

本発明はまた、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドもしくはその活性断片を生産す る方法を提供する。本発明の１つの方法はｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの発現系をつくる ための発現ベクターへのｍｅｇ−Ｃ５Ｆポリペプチド暗号化ｃＤＮＡの導入を含 む。選択宿主細胞はベクターを用いて形質転換されて培養される。従って本発明 の方法は、既知調節配列の制御下でｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドの発現を暗 号化するＤＮＡ配列を用いて形質転換した適当な細胞もしくは細胞系を培養する ことを含む。調節配列は、プロモーター断片、ターミネータ−断片および適当な 宿主細胞中でのタンパク質の発現を導く他の適当な配列を含む。発現された因子 は当技術の熟練者の知られる適当な手段により培地（もしくは、細胞内に発現さ れるなら、細胞）から回収され、分離され、精製される。

適当な細胞または細胞系は、は乳類の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵 巣細胞（ＣＨＯ細胞）もしくは３Ｔ３細胞であることができる。適切なは乳類の 宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、選別の方法と生産物の製造、精製 法は当技術において知られている。ゲシングおよびサムブック、ネイチュア２９ ３：６２０−６２５（１９８１）または、カウフマン等、モレキュラー・アンド ・セルラー・バイオロジー５　（７）：１７５０−１７５９　（１９８５）もし くはハウリー等、米国特許第４．４１９．４４６号参照。その他の適当な哺乳類 の細胞系はサルＣＯ３−１細胞系とＣＶ−１細胞系である。更に哺乳類宿主細胞 の例は、形質転換細胞を含めて、特に霊長類の細胞系とげっ書類細胞系を含む。

正常二倍体細胞、−次組縁と一次外植片のインビトロ培養由来の細胞株もまた適 している。

候補細胞は選択遺伝子が遺伝子型欠失であるかまたは、優性に活動する選択遺伝 子を含み得る。その他の適する哺乳細胞系は）（ｅ　Ｌ　ａｓマウスＬ−９２９ 細胞、スイス、Ｂａ１ｂ−ｃ又はＮＩＨマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫ又ＨａＫ ハムスター細胞系を含むが、これらに制限されない。

本発明に適する宿主細胞として同様に有用なものは、細菌細胞である。例えば、 イ、コリの様々な株（例えば、ＨＢＩＯＩ、ＭＣｌ０６１、および以下の実施例 に使用される株）はバイオテクノロジーの分野においてよく知られている。バチ ルス・サブチリス、シュードモナスの様々な株と他の桿菌類等もまたこの方法に おいて使用できる。

当技術の熟練者に知られる酵母菌細胞の多くの株もまた本発明の宿主細胞として 利用できる。更に、望むならば、昆虫細胞は本発明の宿主細胞として利用できる 。

ミラー等、ジエネティック　エンジニアリング、８：２７７−２９８（ブレニウ ム　プレス　１９８６）とそこに引用された参考資料参照。

本発明は、新しいｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドの発現方法で使用されるベク ターもしくは組換え型分子もまた提供する。これらのベクターはここで引用され 単独でまたは他の配列と共に本発明のｍｅｇ　−Ｃ３Ｆポリペプチド又は活性断 片を暗号化する新しいｍｅｇ　−ＣＳ　ＦＤＮＡ配列を含む。さらに、上記の修 飾配列を取り込むベクターもまた本発明の具体例であり、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポ リペプチドの製法において有用である。その方法で使用されるベクターは、本発 明の配列を暗号化するＤＮＡと機能するように結合した、選択宿主細胞中で複数 と発現を導くことができる選択調節配列もまた含む。

１つの望ましいベクターはｐＸＭ［Ｙ、Ｃ，ヤング等セル、４７：３−１０（１ ９８６）］ である。ここで述べられる哺乳類細胞発現ベクターは当技術の熟練者によく知ら れる技術で合成できる。ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エン ハンサ−、プロモーター等は天然源から得ることができ、まｔ；既知の手順を合 成できる。カウフマン等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１ ５９：５１１−５２１（１９８２）およびカラマン、プロシーデインダス・オブ ・ザナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ、８２　：　 ６８９−６９３　（１９８５）参照。別法として、ベクターＤＮＡはアシパピロ ーマウィルスゲノムの全部または一部を含有できル［ラスキー等、セル、３６： ３９１−４０１　（１９８４）］そして安定なエピゾーム要素としてＣ１□アマ ウス細胞のような細胞系に搬ｇ−Ｃ５Ｆポリペプチドの発現をもたらすことがで きる。

哺乳類、昆虫、酵母菌、真菌、細菌での発現に関する当技術において知られる多 数の型の他の適当な発現ベクターもこの目的に使用できる。

したがって、細胞起源から均質に精製されるかまたは組み換え的にまたは合成的 に製造されるｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆもしくは活性断片は、血小板減少症、再生不良 性貧血および他の血小板の病気の治療のために化学両方もしくは骨髄移植に発す 後の血小板回後を促進するための医薬剤または製剤の製造において使用できる。

これらのｍｅｇ−Ｃ３Ｆポリペプチド組成物によるそのような血小板の障害また は欠乏の治療は現在利用できる血清由来因子またはヒト血小板の輸血による治療 により起こる望ましくない副作用を回避できる。薬の製剤には、上記ペプチドの ようなｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの１またはそれ以上のペプチド断片もまた使用できる 。

本発明のポリペプチドは、また上記状態の治療ｔこおいて数独でまたは他のサイ トカイン類、ヘマトポイエチン類、インターロイキン類、成長因子類、抗体類と 組合せて使用できる。

従って、本発明のもう一つの見地は上述状態を治療するための治療組成生成物類 である。そのような組成物類は製薬上の許容しうるキャリアーとの混合物にとし て、治療上有効量のｍｅｇ−Ｃ５Ｆタンパク質もしくは治療効果のある断片を含 む。この組成物は組織的に非経口で投与できる。別法として、その組成物は静脈 内に投与しうる。所望により、組成物は皮下に投与できる。計画的に投与される 時、本発明において使用のための治療組成物は、発熱物質のない非経口的に許容 しうる水溶液の形である。ｐＨ，等優性、安定性に必要な注意を払ったそのよう な薬学的に許容しうるタンパク質溶液を調整することはこの分野の当業者の範囲 内にある。

上述の状態を治療する方法において要求される用量管理は薬の作用を変える様々 な要因、例えば、患者の健康状態、体重、性別、食事、感染の度合、投与時間を 考慮する医師により決定される。一般に、日々の生活規制は、体重Ｋ　ｇ当りｍ ｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質又はその断片の１　１０００ｍｇ、又は、タンパク質の ５０−５０００単位（即ち／１単位はマウスフィブリン血餅巨核球コロニー形成 を定量において最大コロニーを生成するｍｅｇ−タンパク質の最少濃度である。

）。範囲にあるべきである。

治療方法と治療上の組成物と本発明のポリペプチドは、また他の徴候と血小板欠 失により特徴づけられる病気の状態の治療に他のサイトカイン、ヘマトボイエチ ン類、インターロイキン、成長因子、抗体と単−又は組合せて使用できる。もし ＴＰＯ活性をもたないなら、この分子は、ＩＬ−３，ＩＬ−６又はＧＭ−Ｃ３Ｆ のような一般造血促進因子と、又は他の巨核球促進因子またはＴＰＯのような活 性をもつ分子とともに血小板減少症のある症状の治療に有用であることを証明す ることが予期される。このような同時投与のための付加的典型的サイトカイン又 はヘマトポイエチン類は、ＴＰＯＳＧ−Ｃ３Ｆ、Ｃ３Ｆ−１、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｉ Ｌ−１，ＩＬ−１１（係争中の米国特許用！［ＳＮ　０７’／４４１，１００で はＩＬ−１０と記載される。これを引用して明細書記載の一部とする。）ＩＬ− ３、ＩＬ−４、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−７、エリスロポエチンをともに投与するため の付加調節のサイトカインもしくはヘマトポイエチンは含む。

前述の用量は治療上の組成物中にそのような添加成分を補うことで調整される。

調整される患者の経過は常用方法で監視できる。

これらの新しいポリペプチドの他の使用はインビボまたはインビトロで診断学的 もしくは治療学的使用のための、標準方法により製造された抗体の発達において である。そのような抗体はモノクローナルもポリクローナルも両方含み、キメラ 抗体または既知技術で製造する組み換え型抗体も含む。またこの発明により、抗 原と］、２てｍｅ　ｇ−Ｃ３Ｆ又はその断片を与えることにより生じた細胞系を 次いである種の癌細胞と融合させることにより既知技術により不滅にされた細胞 系をつくったセルラインを提供する。本発明のヒｔ・ｍｅｇ−Ｃ３Ｆポリペプチ ドの全部又は一部に向けられたそのような細胞系と抗体を生成するのに使用され る方法はまたこの発明に含まれる。

本発明の抗体は、抗体を検出可能な標識または標識系と関連させることにより、 インビボとインビトロでの診断目的のために利用できる。別法として、これらの 抗体は、この技術の熟練者に知られている毒性または治療的化合と組合わせるこ とにより、インビボとイ〕・ビトロでの治療目的に使用しうる。これらの抗体は また研究試薬として利用できる。

以下の例＋：Ｌ実施例どし、て、本発明の同種ヒｈｒｎｅｇ−Ｃ３Ｆの精製と特 徴とその他方法と生成物を記述する。これらの例は実施例としてであり、本発明 の範囲を限定するものではない。

実施例１ 床からのｍ　ｅ　ｇ　−ＣＳ　Ｆの精製以下の手順はヒｉ−骨髄移植患名の尿か ら均一なｍｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク員を得るのに現在使用される。他の病気を合併 する再生不良性貧血または血小板減少症の、を者からの尿はこの精製を用いる因 子の起源として使用できる。

第１段階二尿は移植後５−１８ａ間、骨髄移植患者から捕集された。ためＩ；塚 の１００１２はプロテアーゼ阻害物質、フェニルメチル−フッ化スルホニル（Ｐ ＭＳＦ）とエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理された。このためられた 尿はアミコンＹＭ−１０７４ルター（１０，０００分子量取９除く）で濃縮し過 剰の色素を除去し体積を減少させた。プロテアーゼ阻害物質のカクテル（ロイペ プチン、アプロチニン、エチレングリコール−ビス−４酢酸とＮ−エチルマレイ ミド（ＮＥＷ））はタンパク質分解を最小類にするために、この段階と次の３段 階で尿に加えられる。尿濃縮物のｐＨは８゜０に調整されて、７　ｍ　Ｓ　／　 ｃ　ｍの伝導率に希釈された。

第２段階：第１段階の精製物の保持物はｐＨ８，０でＱＡＥゼータプレプ［り石 で陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。ＱＡＥ気流は１Ｍ酢酸でｐＨ４， ５に調整した。

第３段階：第２精製段階からの流れをｐＨ４，５で陽イオン交換クロマトカラム 、ＳＰ−ゼータプレプ力ラム［クツ］に結合した。

ｍｅｇ−Ｃ５Ｆを含む結合タンパク質をｐＨ４，５でＩＭＮａＣｌを用いて溶出 した。溶出物を溜めて、プロテアーゼ阻害物質をそれに加えて、その試料を更に クロマトグラフィーを実施するまで一８０°Ｃで保存する。溶出物をトリス緩衝 液（ＴＢＳ）で第一段階で記載したプロテアーゼ阻害物質を加えて透析した。こ の透析液を５６℃で３０分間加熱した。プロテアーゼの添加は、タンパク質の回 収に必須ではないが、この方法においてプロテアーゼにより分解しなかった多量 のタンパク質のこの段階からの回収を可能にした。この段階でためた物質を上被 球種の成長因子の存在について分析した。

これらのためられた物質はｍｅｇ−ＣＳＦ活性含有することが発見された。

第４段階：生じた試料をレクチンアフイニイテイークロマトグラフィー力ラム、 小麦圧変セファロースカラム［ファルマシア］に加えて、ＴＢＳ中０．２５Ｍア セチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｇｌｃＮＨ２）を用いて溶出した。尿中のｍｅｇ −Ｃ３Ｆはこのカラムに結合することが判った。結合タンパク質を第３段階に記 した理由のため加えられた第１段階でのプロテアーゼ阻害物質の存在下に、ｐＨ ４，５で２０ｍＭ　酢酸ナトリウムによりこのカラムから溶出した。

段階５：この透析物をｌｏ＋ｍ１ｓ−トヨペアールＦＰＬＣ陽イオン交換カラム に適用し、０−１Ｍ　ＮａＣ１の２０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４，５の直 線グラジェントを用いて溶出した。この段階から溶出したタンパクは、以下に記 載したフィブリン凝塊検定（フィブリン・クロット・アッセイ）でｍｅｇ　−Ｃ Ｓ　Ｆ活性を試験した。ＩＩｌｅｇ−Ｃ５Ｆ活性が２本に分かれたピークは溶出 されるのが観察された。

主要な活性は０．１Ｍ−０，２５Ｍ　ＮａＣ１の間に溶出された。小さいが再現 性のある活性が０．３　０．５Ｍ　ＮａＣ１の間に溶出された。

２個の活性はタンパクまたは単一タンパクの炭水化物修飾物に帰属することがで きる。しかしながら、さらに本明細書で提示されるデータは、主要なタンパクに 関して言及する。

段階６：この５番目の精製段階からの溶出物は次いで逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）カラ ム（ビダック；　ｌ　ｃｍＸ　２５ｃｍ）で、２３−３３％アセトニトリルの０ ．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液の１線グラジエントで溶出して精製した 。この段階で豊富な３０キロダルトンのタンパク夾雑物を除去する。

段階７：　ＨＰＬＣ段階を種々溶媒系で繰り返し、段階６で溶出した後、酢酸お よびピリジンの２部分で希釈した。精製物質はＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（０， ４６Ｘ　２５ｃｍ）上、６−１５％ｎ−プロプラノロールのピリジンおよび酢酸 溶液で溶出した。この段階の後に産生じた物質を検定した場合、ネズミ検定で報 告された５Ｘ１０’希釈単位よりも大きい特異活性が得られた。この所望による 段階により、主要な夾雑物であるリボヌクレアーゼのバルクが調製物より除去さ れる。

段階８：　ＨＰＬＣ段階は、０４カラム（ビダック、０．４６Ｘ２５ａｍ）上で 、０．１５％ＨＦＢＡのアセトニトリル溶液を用いてもう一度繰り返した。この 物質は２７−３７％アセトニトリルで溶出された。最後のＨＰＬＣ段階により、 段階７以降に存在した全ての残存リボヌクレアーゼおよびタンパク性夾雑物を実 質的に途去した。

この精製ｍｅｇ−ＣＳＦ物質を次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、生物検定 し、Ｉ！Ｊで標識化した。段階７を省いたこの方法により同種（ホモジーナス） タンパクが得られ、これは以下に記載しｔ；不ズミ巨核球コロニー検定において 、タンパクミリグラムあたり約５Ｘ１０’から約２−５Ｘ１０”希釈単位の範囲 の特異活性を有した。

実施例２−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製タンパクは、ラムエリ［ラムエリ、Ｕ、に、ネイチャー２２７巻６８０−６ ８５頁（１９７０年）１の方法に準じて実施した５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、１２ ％アクリルアミド平板ゲル（厚み０．７５ｍｍ）上で分析した。電気泳動後、ゲ ルをオートラジオグラフィーに供して１２Ｊ標識化ｍｅｇ−Ｃ３Ｆを可視化する か、もしくは銀染色に供するか、または０．５−１ｃｍ切片に切断し、０．３％ 脱イオン化ＢＳＡを含むＴＢＳｏ、５ｍｌで４℃で一晩溶出し、ｍｅｇ　−ＣＳ 　Ｆ活性を検定した。見掛けの分子量は以下のタンパク標準を用いて決定した： ＢＲＬ予染色分子量マーカー、１４ｃ分子量標準［ＮＥＮ］、または低分子量５ ＤＳ−ＰＡＧＥ標準［ビオラッド１゜活性ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを含有する、実施 例１の段階６．７および８から得られたタンパクの小分画をヨード化し、５ＤＳ −ＰＡＧＥに供した。逆相の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元条件）は段階８から のｍｅｇ−Ｃ３Ｆを精製し、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ活性の前に溶出したいくつかの 分画で始まり、活性分画中ずつと継続し、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ活性のピークの後 に溶出した分画で終わるが、２８−３０キロダルトンの大きさの範囲の１つの異 種（ヘテロジーナス）タンパクの帯の存在を示した。

平行なゲル溝からのタンパクの溶出により、ネズミ巨核球コロニー形成検定にお ける生物活性はゲル中のヨード化ｍｅｇ−’Ｃ３Ｆ帯の存在に相関することが示 された。

還元によりタンパクの大部分が約２０−２７キロダルトンの分子量を有する。こ の知見に基づいて、ｍａｇ−ＣＳＦは二量体でもよしＸ、。

このタンパクは標準的な条件下ではＮ−グリカナーゼに消化されないようである 。

実施例３−タンパクの回収 尿５ＣＩＱから開始して最終的に貯留されたＨＰＬＣ力ラム力うらの活性分画は 、精製ｍｅｇ−Ｃ３Ｆのアミノ酸組成から推測して約２５μｇのタンパクを含有 した。２８−３８キロダルトンのｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆタンパクの特異活性は、以 下に記載したネズミフィブリン凝塊検定において約５ＸＩＯ’希釈単位／ｍｇよ りも大きいと評価された。活性の１単位はコロニー形成を最大に刺激する最大希 釈の逆数として定義する。１個の上被球コロニーは３個またはそれ以上のセルと して定義する。

実施例４−ｍｅｇ−Ｃ５Ｆタンパク組成実施ｆｌＩ＋の段階７を省く８番目の精 製段階から得られた＋ｎｅｇ−Ｃ５Ｆを配列決定用のトリプシン処理断片を得る ために用いた。精製ｍａｇ　−ＣＳ　Ｆ調製物２５μｇを逆相方ラムで脱塩した 。主なるピークを次に十分還元し、アルキル化したが、これはそこに存在する多 くのシスティンによるものである。この物質を再び逆相カラムを通して溶出し、 タンパクピークを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。マーカーとして１１２ｓｉ［激化 物質を用い、約２０−２７キロダルトンで走ったタンパクをゲルから切除し、メ タノール：酢酸：水で固定し、水ですすいだ。ゲル切片を膨潤した。Ｏ，１Ｍ　 ＮＨ，ＨＣＯ，溶液（２００μａ）で中性にし、続いてゲルマトリックス内に含 有するタンパクをトリプシン（２％重重量型量）消化した。

配列決定により４個のペプチド配列が得られた：（ａ）　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙ ｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ（ｂ）　Ａｒｇ　Ｖａｌ 　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　（Ａｒｇ）（ｃ）　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　（χ）　ＧＩ Ｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ工１ａ　Ｌｙｓ（ｄ）　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｐｈａ　ＣｙｓＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｘは同定が不明確であったアミノ酸を表し、これはＳまたはＴである。（）は同 定が試験的であったアミノ酸を表す。

これらの４個のトリプシン処理ペプチドは全てエクソンで見出され、ｍｅｇ−Ｃ ＳＦの推定上のｃＤＮＡ配列である。

実施例５−尿ｍａｇ　−ＣＳ　Ｆのゲノムクローニングオリゴヌクレオチドのプ ールまたは唯一のオリゴヌクレオチドから成るプローブは、Ｒ，ラーセ、ジャー ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１８３巻１号１−１２頁（１９８５年 ）の方法に準じて上記のトリプシン処理配列から作製した。以下のオリゴヌクレ オチドプローブは自動ＤＮＡ合成機で合成し；Ｎは４個のヌクレオチドＡ、Ｔ、 Ｃ，またはＧの何れかを表し、ＲはヌクレオチドＡまたはＧを表し；Ｙはヌクレ オチドＣまたはＴを表し；ＨはヌクレオチドＡ、ＴまたはＣを表す： （４）　ＡＡＲＧＣＮＣＣＮＣＣＮＣＣＮ（５）　ＧＣＮＡＧＹＣＡＲＡＣＮＡ ＴＫＡＡ（５）　ＧＣＮＴＣＮＣ思ＧＮＡＴ）ＬＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣ 遺伝子コードが同義性であるので（１個以上のコドンが同じアミノ酸をコードで きる）選択的なトリプシン処理断片またはその一部のアミノ酸配列をコード化す るあり得る全てのヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドの混合物が合 成される。コドンの用法に基づいてプローブ混合物中のオリゴヌクレオチド数を 減じることができる場合もある。なぜならば真核細胞遺伝子ではほとんど用いら れないコドンもあり、真核細胞のコード化配列においてジヌクレオチドＣｐＧの 頻度が比較的低いためである［Ｊ、Ｊ、トールら、ネイチャー３１２巻３４２− ３４７頁（１９８４年）参照］。プローブ作製に用いられるアミノ酸配列の領域 は、可能な所で同義性コドンを高度に回避して選択する。オリゴヌクレオチドは 自動ＤＮＡ合成機で合成し、次いでプローブはポリヌクレオチドキナーゼおよび ５ｉｐ−ＡＴＰで放射活性を標識化する。

同義性ヌクレオチドプローブは次に、確立された技術［Ｋ、ヤコブスら、ネイチ ャー３１３巻８０６−８１０頁（１９８５年）参照］を用いて胎盤から調製した ゲノムライブラリー［ストラタジーン・クローニング・システムズ、う・ジョラ 、カリフォルニア州〕からふるい分けするために用いる。このライブラリーから の組み換え体をプレートし、複製ニトロセルロースおよび／またはナイロンレプ リカをプレートで作る。典型的には、オリゴヌクレオチドを３２ＰガンマＡＴＰ でキナーゼ処理し、３Ｍ　ＴＭＡＣ溶液中４８℃で４８−９６時間フィルターに 交雑する。次いでフィルターを３Ｍ　ＴＭＡＣの５０ｍＭトリス溶液中５０℃で １時間洗浄し、続いて２回室温で３０分間、各々２ＸＳＳＣで洗浄する［Ｋ、ヤ コブスら、ヌクレイツク・アシッズ・レス、１６看４６３７−４６５０頁（１９ ８８年）参照］。対を成して陽性であるプラークを精製する。

１８．２キロベースのゲノム断片（図Ｉ）が４個のトリプシン処理配列全てに交 雑したことが示された。１８．２キロベースの挿入物中に含有され単離および配 列決定される最初の部分的ゲノムサブクローンが１個のトリプシン処理配列（ａ ）を単一のエクソン（エクソン■）中に、およびエクソン■に含有され隣接する コード化配列とオーバーラツプする２側の部分的トリプシン処理配列（ｂおよび ｄ）を含有することが示された。エクソン■はトリプシン処理（Ｃ）から作られ るプローブで同定された。エクソンＩはトリプシン処理（ｂ）の５′末端に作ら れたプローブで同定された。

これらの部分的ゲノムクローンを組み合わせて、予想したｃＤＮＡおよび予想し たアミノ酸を上記表■に報告するが、これはｍｅｇ　−Ｃ３Ｆタンパクの領域を コード化する。一方、この部分的配列によりコード化されるペプチドは活性ｍｅ ｇ　−ＣＳ　Ｆ断片を製造できるが、この配列はアミン末端Ｍｅｔおよび任意の 規定された３′境界部分を欠損する。ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆゲノム配列の残余を得 るために、ゲノムＤＮＡ配列の全長をＣｏＳ細胞で発現でき、ｃＤＮＡライブラ リーをＣＯ８細胞ＲＮＡから調製でき、そして、ｃＤＮＡはそれを源としてクロ ーンできる。また別法として、配列の残余は、交叉交雑したネズミゲノムｒｎｅ ｇ　−ＣＳ　Ｆ配列と配列比較することにより推定できる。この配列は末梢血リ ンパ球または胎盤からも入手することができ、これら２つはｍＲＮＡの潜在的な 入手源である。

実施例６−組み換えヒトｍｅｇ−Ｃ３Ｆの発現ｍｅｇ−Ｃ３Ｆまたはそれの活性 断片を産生ずるために、それをコード化するとｃＤＮＡを適当な発現ベクターに 移すが、このベクターの非常に多くの型が標準的な分子生物学的技術によるヒト 、毘虫、酵母、菌類および細菌発現用として当業者間に公知である。哺乳動物用 のこのようなベクターの１つがｐＸＭである［Ｙ、Ｃ，ヤングら、セル４７巻３ −１０頁（１９８６年）］。コノベクターはＳＶ４０複製原およびエンハンサ− 、アデノウィルス主要後期プロモーター、アデノウィルス３部分先導配列のｃＤ ＮＡコピー、小さいな交雑介在配列、５Ｕ４０ポリアデニル化信号およびアデノ ウィルスＶＡ■遺伝子を適切な関係で含有し、補乳動物細胞中望ましいＤＮＡの 高レベル発現を指令する［例えばカウフマン、プロシーディング・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オ ブ・アメリカ８２巻６８９−６９３頁（１９８５年）参照１゜ｐＸＭベクターは エンドヌクレアーゼ酵素Ｘｈｏｌで直線化し、続いてＸｈｏＩ相補的末端を作り 、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの発現を構築する合成オリゴヌクレオチド［コルラポラテ イブ・リサーチ、レキシントン、マサチューセッツ州１を添加することにより改 変したｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆをコード化するｃＤＮＡと、同等モル量で別々にライ ゲートする。

ＣＨＯ細胞でｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを発現するために用いることができるもう１つ のベクターはｐＥＭｃ２Ｂ１である。このベクターは、アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロツ’）ビル、メリーランド州（米国） で受け入れ番号ＡＴＣＣ４０３４８で寄託されているｐＭＴ２ｐＣから誘導でき る。このＤＮＡを、プラスミドＰｓｔＩで消化することにより直線化する。次い で、このＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてプラントする。オリゴヌクレ オチド３’ＴＧＣＡＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡ　ＴＴＣＣＴＣＧＡ　３’を次に ＤＮＡにＤＮＡにライゲートし、５′末端でＰｓｔＩ部位を再合成し、ＥｃｏＲ Ｉ部位およびＸｈｏ１部位をＤＨＦＲｃＤＮＡのＡＴＧの前に加える。このプラ スミドをｐＭＴ２１と称する。ｐＭＴ２］をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し 、２個の隣接するクローニング部位で開裂する。５０８塩基対のＥＭｃＶ断片を ｐＭ　Ｔ　ｚ　Ｅ　ＣＡ　Ｔ　Ｉ［Ｓ、に−ジョングら、ジャーナル・オブ・ピ ロロジー６３巻１６５ｉ１６６０頁（１９８９年）］から制限酵素ＥｃｏＲＩお よびＴａｑａＩで切断した。長さが６８ヌクレオチドの１対のオリゴヌクレオチ ドを合成し、ＥＭＣＶ配列をＡＴＧまで複製した。ＡＴＧをＡＴＴに変換し、Ｃ を加え、３″末端でＸｈｏＩ部位を合成した。Ｔａｑσ■部位は５′末端に位置 する。オリゴヌクレオチドの配列は：およびこれの相補的鎖である。

Ｔａｑａｌ断片へ、およびＴａｑ　ａ　Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉオリゴヌクレオチド にライゲートし、ベクターｐＥＭｃ２Ｂｌを産生じた。このベクターはＳＶ４０ 複製原およびエンハンサ−、アデノウィルス主要後期プロモーター、アデノウィ ルス３部分先導配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小さな交雑介在配列、Ｓ’Ｖ４ ０ポリアデニル化信号およびアデノウィルスＶＡ　Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲおよびβ −ラクタマーゼマーカー並びにＥＭＣ配列を適切な関係で含有し、補乳動物細胞 中望ましいｃＤＮＡの高レベル発現を指令する。ＥＭＣ２Ｂ１ベクターをエンド ヌクレアーゼ酵素ＥｃｏＲＩで直線化し、続いてＥｃｏＲＩ相補的末端を作り、 発現を構築する合成オリゴヌクレオチドを添加することにより予め改変したｍｅ ｇ　−ＣＳ　Ｆをコード化するｃＤＮＡと、同等モル量で別々にライゲートする 。

ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを含有する望ましいベクターを、次に通常の遺伝子工学技術 により適当な宿主細胞に導入する。形質転換した細胞を培養し、発現したｍｅｇ 　−ＣＳ　Ｆを回収し、標準的な技法を用いて培養培地から精製する。

Ａ、Ｉ！乳動物細胞発現 哺乳動物の宿主細胞中にｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドの発現を得るために、 ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ　ＤＮＡ配列を含有するｐＸＭベクターをＣＯ８細胞上にトラン スフェクトする。トランスフェクトしたＣｏＳ細胞からのならし培地は、ネズミ の検定で測定されるようにｍｅｇ−Ｃ３Ｆ生物学的活性を含有する。同様にｍｅ ｇ　−ＣＳ　ＦのためのｃＤＮＡを含有するｐＥＭｃ２Ｂｌ構築はＣＨＯ細胞に トランスフェクトされる。

本明細書に記載した哺乳動物細胞発現ベクターは、当業者間に周知の技術により 合成できる。１画業者が、たとえば適当な酵素を有するプラスミドからのｗａｇ 　Ｃ５Ｆ（７）ＤＮＡ配列を挿入し、周知の組み換え体遺伝子工学技術を用いて ｐＸＭベクターに、並びにｐＪＬ３および１）ＪＬ４［ゴーら、エンポ・ジエイ ９．４巻６４５−６５３頁（１９８５年）］およびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦ 　で開始、ＡＴＣＣ第６７１２２号、ＰＣＴ出１［ＰｃＴ／ＵＳ第８７１０　Ｏ Ｏ３３号参照）のようなその他の既知のベクターに匹敵するその他の哺乳動物発 現ベクターを酵素することもできる。

ＣｏＳ細胞以外の哺乳動物宿主細胞をｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ発現に用いることもで きる。たとえば、好ましくはベクターＤＮＡを安定して組み込むために、および 組み込んだベクターＤＮＡを続いて増幅するために、両者共常法により、ＣＨＯ 細胞を哺乳動物宿主細胞として選択し用いることができる。

一度ベクターおよび宿主細胞を選択し、形質転換すると、次ｌ／’で、産生物の 発現のために安定した形質転換体を、標準的な免疫学的、生物学的または酵素検 定、たとえば以下の実施例８に記載した検定法によりふるい分ける。ｍｅｇ　− ＣＳ　Ｆポリペプチドがコード化されたＤＮＡおよびｍＲＮＡが存在すれば、サ ガンおよびノーザンブロツティングのような標準的な方法により検出できる。適 切な宿主細胞に発現ベクターＤＮＡを導入した後数日間、ポリペプチドをコード 化したＤＮＡの一過性の発現が、培養培地中のタン／＜りの活性または免疫学的 検定、たとえばネズミフイブリン凝塊検定により選別されることなく測定される 。

Ｂ、細菌発現系 同様に、１画業者がｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドをコード化した配列を操作 し、コード化配列を７ランキングする任意のヒト制御配列を除去し、細菌細胞に より本発明のｍｅｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドを細胞内にまたは細胞外に発現する細 菌ベクターを作り出すために細菌の制御配列を挿入することができた。ポリペプ チドをコード化するＤＮＡは、当業界で公知であるように、さらに改変して細菌 の発現を至適化する種々コドンを含有することができる。成熟ｍｅｇ−ＣＳＦを コード化する配列は、これもまた当業界に公知の方法により、成熟ｍｅｇ　−Ｃ Ｓ　Ｆポリペプチドの発現、分泌および加工を可能にする分泌の先導ポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列にフレーム中効果的に連結するのが好ましい。

このような分泌系を用いたエシェリキア・フリにおけるｍｅｇ−Ｃ３Ｆの発現は 、活性ポリペプチドを結果的に分泌することが期待される。この研究法により活 性キメラ抗体の断片が生み出された［たとえば、ビターら、サイエンス２４０巻 １０４１−１０４３頁（１９８３年）参照〕。また別に、ｍｅｇ−ＣＳＦをエシ ェリキア・コリ中の細胞質タンパクとして発現できる。この場合、この方法もま た当業界で公知であるが、分子はほぼ間違いなく塩酸グアニジンで完全に変性さ れた後再び折り畳まれなければならないであろう。細胞内に発現したタンパクの 単離および再折り畳みの方法は、たとえば米国特許第４５１２９２２号を参照さ れたい。

細菌宿主細胞のいずれかの糸路を通して発現された化合物を、次に回収し、精製 し並びに／または物理化学的、生化学的および／または臨床パラメータに関して 特性化できるが、これらは全て公知の方法によるものである。

Ｃ１昆虫または酵母細胞発現 同様の操作を行い、昆虫細胞中にｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチドを発現する昆 虫ベクターを構築することができる。［たとえば、公開された欧州特許出願第１ ５５４７６号に開示された方法を参照されたい。］ 同様に酵母ベクターを、前駆体をフード化するｃＤＮＡを発現する酵母制御配列 を用いて構築し、酵母中細胞外活性ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを分泌する。また別に、 ポリペプチドは酵母中細胎内にも発現でき、ポリペプチドは単離され、再折り畳 みされて活性ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを生じる。［たとえば、公開されたＰＣＴ出願 ＷＯ第８６１０　Ｏ６３９号および欧州特許出１１ＥＰ第１２３２８９号に開示 された方法を参照されたい。］ 実施例７：高レベルのｒｒｒｅｇ　−ＣＳ　Ｆを発現するＣＨＯセルラインの構 築 哺乳動物細胞から本発明のｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆタンパクを高レベルで産生ずる１ つの方法には、ｍｅｇ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡの多重コピーを含有する細 胞の構築がある。

ｃＤＮＡを増幅可能なマーカー、たとえばカウフマンおよびシャープ、ジャーナ ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（１９８２年）上記の方法に準じて、細 胞が濃度上昇したメントレキセート（ＭＴＸ）を含有するためのＤＨＦＲ遺伝子 と共に、トランスフェクトする。この研究法は多種の細胞型で用いることができ る。また別に、＋ｍｅｇ−Ｃ５Ｆ　ｃＤＮＡおよび薬剤耐性選別遺伝子（たとえ ばＤＨＦＲ）を同じベクターに導入することができる。この研究法に好ましいベ クターはｐＥＭｃ２Ｂ１である。

たとえば、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子を含有し、それの発現を可能にするその他 のプラスミド配列と関与して効果を発揮するｐＸＭベクターを、ＤＨＦＲ欠損Ｃ ＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩｊ：、ＤＨＦＲ発現プラスミドたとえばｐＡｄＤ　 ２６　Ｓ　ＶｐＡ　３　［カウフマン、プロシーディング・オブ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテイテツド・ステータ・オブ ・アメリカ８２巻＝６８９−６９３頁（１９８５年）］と共に、リン酸カルシウ ム共沈降およびトランスフェクションにより導入する。

また別に、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子を含有し、それの発現を可能にする他のプ ラスミド配列と関与して効果的に働＜　ｐ　Ｅ　Ｍ　Ｃ２Ｂ　１ベクターを、プ ロトンプラスト融合およびトランスフェクションによりＤＨＰＲ−欠損ＣＨ○細 胞、ＤＵＫＸ−Ｂ　Ｉ　Ｉへ導入する。ｍｅｇ　−Ｃ３Ｆ遺伝子およびＤＨＦＲ マーカー遺伝子は、ｍｅｇ−Ｃ３ＦをｐＥＭＣ２Ｂｌに導入した場合に共に効果 的に発現する。ｗａｇ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子は前ｌこ記載したとおりｐＭＴ２に導 入でき、結果的に産生じたベクターはｐＸＭ／ｍｅｇ　−ＣＳ　ＦおよびｐＡｄ Ａ２６ＳＶ（Ａ）３の代わりに用いることができる。

ＤＨＦＲＨＦ形質転換体を選別し、アルファ培地中透析したウシ胎仔血清と共に 成長させる。形質転換体を生物検定、免疫検定またはＲＮＡブロッティングによ りｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの発現を検査し、続いて陽性のプールを選別し、カウフマ ンら、モル、セル・ビオール。

５巻１７５０頁（１９８３年）で報告されたように、ＭＴＸ濃度を上げながら（ ＭＴＸｏ、０２．０．２．１．０８よび５　μＭ？逐次段１ｓｉり成長させるこ とにより増幅する。増幅されたラインをクローン化し、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆタン ３フ発現をフィブリン凝塊検定により監視する。ｍｅｇ−ＣＳＦ発現がＭＴＸ抵 抗のレベル上昇に伴って増加するのが期待される。

上述の任意の発現系において、結果的にできるセルラインはさらに、薬剤を適当 に選択することにより増幅でき、結果的にできるセルラインは再度クローン化さ れ、発現レベルは上述の不ズミフィプリン凝塊検定を用いて検査する。

ｍｅｇ−ＣＳＦ発現ＣＨＯセルラインは、血清不合培地における成育に適用する ことができる。同種のｍｅｇ−Ｃ３Ｆをこのセルラインのならし培地から、当業 界に知られた方法を用いて単離することができるが、この方法にはたとえばレク チン親和クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等の技術がある。

実施例８：と）＋ｎｅｇ−Ｃ３Ｆの生物学的活性実施例１に記載された精製ｍｅ ｇ　−ＣＳ　Ｆを用いて以下の検定を行った。分子の組み換え体はこれらの同じ 検定またはその他の検定において、ｍｅｇ−ＣＳＦ生物学的特性を呈することが 期待される。

Ａ、ネズミフィブリン凝塊検定 実施例１の精製技術の段階７から得られたｍｅｇ−Ｃ３Ｆは、上被球コロニー形 成検定を実質的にＳ、クリヤら、エクスプ・ヘマトール、１５巻８９６−９０１ 頁（１９８７年）で報告されたように実施して活性を試験した。９６−ウェルプ レート中２．５Ｘ１０’マウス骨髄細胞を含有するフィブリン凝塊が形成された 。希釈試料を塊の回りに層にして置き、６日間恒温培養した。その後、細胞を同 定し、上被球をネズミ巨核球の特異的マーカーであるアセチルコリンエステラー ゼのために染色した。コロニーは単位面積あたり３個またはそれ以上の上被球で あると定義した。２つの型の上被球コロニーが通常的な方法で観察された：他に 細胞型を含有しない純粋な上被球コロニー、およびさらに非上被球細胞塁を含有 する混合巨核球コロニー。

以下の対照試料を各々の検定で用いた。陽性対照はＷＥＨＩならし培地（ネズミ ＩＬ−３）であり、これは凝塊あたり７−２５（平均１２）の上被球を産生し、 約５０％が純粋、約５０％が混合巨核球コロニーであった。もう１つの陽性対照 は致命的に放射線照射を受け、血小板数が最低になったイヌから採った血清［マ ズールら、エクスプ・ヘマトール、１３巻１１６４−１１７２頁（１９８５年） 参照］であり、これは凝塊あたり６−２２（平均１５）の上被球コロニーを産生 し、これの約７０％が純粋、３０％が混合巨核球コロニーであった。陰性対照は イスコベス培地で、これは凝塊あたり２−４上被球コロニーを産生した。

この検定では、ｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆはタンパクｍｇあたり約５Ｘ　１０’希釈単 位以上の特異活性を有する。活性の単位は実施例３に記載するとおりに定義する 。

骨髄移植体尿から得られ、実施例１の精製において５−１−ヨペアール陽イオン 交換カラムクロマトグラフィ一段階から溶出される主要なｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆを 、この検定を単独で、−緒におよび他のサイトカインと組み合わせて分析した。

フィブリン凝塊検定では、６−１６（平均１３）の上被球コロニーが産生され、 ５０−７０％が純粋巨核球コロニーであった。

各検定において、試料は２回ずつ３希釈で試験した。

Ｂ、ヒト血漿凝塊ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ検定 本発明のｍｅｇ−Ｃ３Ｆをまたヒト活性の検定すなわちＥ、マズールら、ブラッ ド、５７巻２７７−２８６頁（１９８１年）に報告されたものを改変した血漿凝 塊ｍｅｇ−ＣＳＦ検定で試験した。未付着末梢血細胞をロイコパックスから単離 し、画分化して凍結した。試験試料を血小板に乏しいヒトＡＢ血漿と混合し、２ ４ウェルプレート中１．２５ＸｌＯ’セルにし、カルシウムを添加して凝塊させ た。１２日間恒温培養した後、血小板グリコプロティンＩ［ｂ／ＩＩＩａおよび 西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ色素原検出系に対して導かれ たモノクローナル抗体を用いて上被球を同定した。組み換えヒトＩＬ−３［ジェ ネティックス・インスティテユート・インコーポレーティッド］を陽性対照とし て用い、凝塊あたり１２−３対照として眉いたが、これは凝塊あたり５−１０巨 核球コロニーを産生じ、これの約５０％がｌＯセル以下しか含有しない純粋な上 被球コロニーであり、５０％が４０以上の上被球を含有する混合巨核球コロニー であった。陰性対照はアルファ培地であり、これは凝塊あたり０−１上被球コロ ニーを産生じた。

上記精製計画の段階８からのｍｅｇ−Ｃ３Ｆ産生物はこの検定において活性であ る。

Ｃ，ネズミｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆ検定 Ｐ、Ｊ　、クエン七ンベリーら、ブラッド６５巻１号２１４−２１７頁（１９８ ５年）に準拠して、精製段階７からのｍｅｇ　−ＣＳ　Ｆの検定を実施した。こ の検定では、ｍｅｇ−Ｃ３Ｆはコロニーあたり平均４−１５セルを含有するアセ チルコリンエステラーゼ陽性巨核球コロニーの成長を刺激する。上被球の大きさ は小さい未成熟細胞から形態学的に大きな成熟細胞まで範囲が広い。

Ｄ、その他の検定 ネズミ骨髄細胞を用いたいくつかの上被球検定をさらに実施したが、これにはイ シパシら、ブラッド６９巻１７３７−１７４１頁（１９８７年）の液体アセチル コリンエステラーゼ誘導検定およびバヌッチーら、エクスプ・ヘマトール、１６ 巻９１６−９２１頁（１９８８年）の液体セロトニン取り込み検定がある。

分画をまた、いくつかの因子に依存性のセルラインで通常的に検定し、単独また は組み合わせてコロニー形成を刺激すると思われる成長因子の存在をふるい分け した。用いたセルラインは、ヒト赤白血病セルラインＴＦ−１．ヒト巨核球芽セ ルラインＭＯ−７，ネズミＩＬ−６依存性セルラインＴ１１６５、およびネズミ ＩＬ−３依存性セルラインＤＡ−１ａである。

前述の説明はここで本発明の好ましい態様を詳記する。実際には本発明の非常に 数多くの改変および変法が当業者で行われることが予期される。このような改変 および変法は以下の請求の範囲内に包含される。

国際調査報告 １Ｍ＋−＠ｍ１１−嘗Ｍｓｍｌｂ璧＊ｌ１１１．ＰＣＴ／ＵＳ９０１０４４２１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）他の蛋白性物質の随伴が実質的にない巨核球コロニー刺激因子。 （２）第３表のアミノ酸ナンバー１からアミノ酸ナンバー１８２と同じかまたは 実質的に同じアミノ酸配列の全部または一部を含む請求項１記載の蛋白質または その生物活性フラグメント。 （３）下記群 （ａ）第１表におけるのと同じまたは実質的に同じＤＮＡ配列、（ｂ）第２表に おけるのと同じまたは実質的に同じＤＮＡ配列、（ｃ）第３表におけるのと同じ または実質的に同じＤＮＡ配列、（ｄ）上記（ａ）−（ｃ）の配列フラグメント 、（ｅ）上記（ａ）−（ｄ）の何れかにハイブリダイズし得るＤＮＡ配列から選 ばれたＤＮＡ配列によってコードされている請求項１記載の蛋白質。 （４）第１図の制限地図により特徴づけられるＤＮＡ配列によってコードされて いる請求項１記載の蛋白質。 （５）ＡＴＣＣ に含まれるゲノムＫｐｎ−ＳｎａＢＩ ＤＮＡ配列によってコードされている請求項１記載の蛋白質。 （６）ＡＴＣＣに に含まれるゲノム配列１８−５６６５ によってコードされている請求項１記載の蛋白質。 （７）中および大寸巨核球細胞からなるコロニーの成長と発達を刺激する能力を もつ請求項１記載の蛋白質。 （８）ねずみフィブリンタロツト巨核球コロニー形成アッセイで約５×１０７希 釈単位／蛋白質ｍｇより大きな比活性により生物学的に特徴づけられる請求項１ 記載の蛋白質。 （９）ねずみフイブリンクロット巨核球コロニー形成アッセイで２×１０■希釈 準位／ｍｇの比活性により生物学的に特徴づけられる請求項１記載の蛋白質。 （１０）下記特性 １．非還元条件下の１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気 泳動およびねずみフイブリンクロット巨核球コロニー形成バイオアッセイによる 測定で約２８−３８ｋｄのみかけ分子量、 ２．還元条件下の１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳 動による測定で約２０−２７ｋｄのみかけ分子量、 ３．ｐＨ４．５の酸性条件下でＳＰ−ゼータ・ブレブに結合する能力、 ４．小麦胚芽セフアロースおよびコンカナバリンＡセフアロースに結合する能力 、 ５．逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）カラムから、トリフルオロ酢酸中アセ トニトリル溶媒系におけるアセトニトリル２３−３３％で溶出する能力、 ６．逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）カラムから、ピリジンおよび酢酸中 ｎ−プロパノール溶媒系におけるｎ−プロバノール６−１５％で溶出する能力、 ７．逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）カラムから、アセトニトリル中ヘプクフルオロ酪酸溶 媒系におけるアセトニトリル２７−３７％で溶出する能力の１つまたはそれ以上 をもつ、請求項１記載の蛋白質。 （１１）下記段階 （ａ）尿を濃縮し、 （ｂ）得られた残留物をアニオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ、 （ｃ）段階（ｂ）の通過物をカチオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ、 （ｄ）段階（ｃ）から得た物質をレクチン親和性カラムクロマトグラフィーに通 し、 （ｅ）段階（ｄ）の流出物をカチオン交換フアイソバーフォーマンス液体クロマ トグラフィーにかけ、 （ｆ）段階（ｅ）の流出物を２部のＴＦＡで希釈し、それをアセトリトリル・ト リフルオロ酢酸溶媒系中で逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、 （ｇ）段階（ｆ）の流出物を２部のピリジンと酢酸で希釈し、それをｎ−プロパ ノール・ピリジン・酢酸溶媒中で第２の逆相高速クロマトグラフィーにかけ、 （ｈ）所望により、段階（ｇ）の流出物をヘプトフルオロ酪酸中アセトリトリル 溶媒系中で第３の逆相高速液体クロマトグラフィーにかけることを含む精製法に ひと骨髄移植患者の尿をかけることにより製造される、請求項１記載の蛋白質。 （１２）発現制御配列と機能可能に結合したｍｅｇ−ＣＳＦ発現コード化ＤＮＡ 配列で形質転換されたセルラインを培養することにより製造される、請求項１記 載の蛋白質。 （１３）ＤＮＡ配列が下記のもの （ａ）第１表におけるのと同じまたは実質的に同じＤＮＡ配列、（ｂ）第２表に おけるのと同じまたは実質的に同じＤＮＡ配列、（ｃ）第３表におけるのと同じ または実質的に同じＤＮＡ配列、（ｄ）上記（ａ）−（ｃ）の配列のフラグメン ト、（ｅ）上記（ａ）−（ｄ）の何れかにハイブリダイズし得るＤＮＡ配列から なる群から選ばれる、請求項１記載蛋白質。 （１４）ｍｅｇ−ＣＳＦが後のカラムから単一ピークで流出するものである、骨 髄移植患者の尿を請求項９記載の精製段階にかけることを含む均質ｍｅｇ−ＣＳ Ｆの製造法。 （１５）発現制御配列と機能可能に結合したｍｅｇ−ＣＳＦ発現コード化ｃＤＮ Ａ配列で形質転換されたセルラインを培養することを含む、ｍｇ−ＣＳＦの製造 法。 （１６）下記のもの （ａ）第１表におけるのと同じまたは実質的に同じＤＮＡ配列、（ｂ）第２表に おけるのと同じまたは実質的に同じＤＮＡ配列、（ｃ）第３表におけるのと同じ または実質的に同じＤＮＡ配列、（ｄ）上記（ａ）−（ｃ）の配列フラグメント 、（ｅ）上記（ａ）−（ｄ）の何れかにハイブリダイズし得るＤＮＡ配列からな る群から選ばれる、ｍｅｇ−ＣＳＦコード化ＤＮＡ配列。 （１７）発現制御配列と機能可能に結合した請求項１６記載のＤＮＡ配列で形質 転換された細胞。 （１８）ほ乳類または細菌細胞を含む請求項１７記載の細胞。 （１９）ねずみフィブリンタロツト巨核球コロニー形成アッセイでボリベブチド ｍｇ当り約５×１０７希釈単位より大きな比活性をもつ均質ｍｅｇ−ＣＳＦ。 （２０）比活性ポリペプチドｍｇ当り２×１０■希釈単位である請求項１９記載 の蛋白質。 （２１）下記段階 （ａ）第１表のヌクレオチドナンバー１からナンバー７５０５を含むＤＮＡ配列 、そのフラグメントまたはそれらと実質的に相同性の配列により形質転換された 細胞を培養し、（ｂ）培養培地から、第３表に示すアミノ酸ナンバー１からナン バー１８２、そのフラグメントまたはそれらと実質的に相同性の配列を含む蛋白 質であって、巨核球細胞の成長と発達を刺激する能力を有する蛋白質を分離し精 製することにより製造される造巨核球蛋白質。 （２２）医薬として有効な媒質中に治療的有効量のｍｅｇ−ＣＳＦまたはそのフ ラグメントを含む医薬組成物。 （２３）さらに治療的有効量の他のサイトカイン、ヘマトポイエチン、成長因子 またはトロンボボイエチン様因子を含む、請求環２２記載の組成物。 （２４）サイトカインがＧ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、１Ｌ−１、Ｉ Ｌ−３、ＩＬ−４、エリスロポイエチン、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＴＰＯ、Ｍ− ＣＳＦおよびＩＬ−７からなる群から選ばれる、請求項２３記載の組成物。 （２５）患者に、有効量のｍｅｇ−ＣＳＦまたはそのフラグメントを投与するこ とを含む、出血性疾患または血小板欠乏症の処置法。 （２６）さらに、ｍｅｇ−ＣＳＦと同時または逐次に、有効量のヘマトポイエチ ン、サイトカイン、成長因子、トロンボポイエチン様因子または抗体の少なくと も１種を投与することを含む、請求項２５記載の方法。 （２７）ヘマトポイエチンがＧ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ 、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１、エリスロポイエチンＩＬ−６、ＩＬ−７ま たはＴＰＯである、請求項２６記載の方法。