KR0184235B1

KR0184235B1 - 거핵구 형성 인자

Info

Publication number: KR0184235B1
Application number: KR1019920700282A
Authority: KR
Inventors: 지. 게스너 토마스; 시. 클락 스티븐; 터너 케더린; 엠. 헤위크 로드니
Original assignee: 브루스 엠. 에이젠; 제네틱스 인스티튜트 인코포레이티드
Priority date: 1989-08-08
Filing date: 1990-08-07
Publication date: 1999-04-01
Also published as: US5326558A; JPH05500211A; KR927002375A

Abstract

본 발명의 한 측면에 따르면 본 발명은 실질적으로 사람의 다른 단백질과는 유리된 신규의 인간 거핵구 형성 인자(meg-CSF)를 제공한다. 이 단백질은 재조합 유전 공학 기술에 의해 제조될 수 있다. 또한 자연적으로 또는 다른 인자 유도하에 이 인자를 생산하는 세포 원료로부터 정제될 수도 있다. 또한 meg-CSF는 화학적 기술 또는 상기한 기술들의 조합에 의해 합성될 수 있다.

본 발명의 meg-CSF는 쥐의 골수 표적세포를 사용한 검정에서 중간 및 큰 크기의 거핵구로 구성된 콜로니의 성장 및 발달을 자극하는 것으로 밝혀졌다. meg-CSF는 상기 검정에서 단백질 1밀리그램당 5×10⁷희석 단위 이상인 생물학적 활성을 나타낸다. meg-CSF는 하기의 실시예 8에 기술한 바와 같이 인체 세포를 사용한 검정에서도 활성을 나타낸다.

활성 meg-CSF는 비환원 조건하에서 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 겉보기 분자량이 약 28∼38kd이다. meg-CSF는 환원 조건하에서 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 겉보기 분자량이 20∼27kd이다.

약 28∼38kd의 활성 meg-CSF는 하기의 표 1∼4의 서열을 모두 또는 일부를 함유함을 특징으로 한다. 또한, 하기의 (a)∼(d)에 언급한 동일하거나 대체적으로 동일한 4개의 아미노산 서열 또는 그의 단편 중 하나 이상을 함유함을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 측면은 인간 meg-CSF 단백질의 발현을 코딩하는 DNA 서열이다. 이 DNA 서열은 상기한 바와 같이 인간 meg-CSF 단백질 발현을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함할 수도 있다. meg-CSF 단백질 모두 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열은 동일하거나 대체적으로 동일한 표 1, 5 또는 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 함유함을 특징으로 한다. 이 DNA 서열은 추가의 코딩 서열을 함유할 수 있다. 또한 DNA 서열은 meg-CSF 코딩 서열의 측면에 위치하는 5' 및 3' 인간 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 이 DNA 서열은 또한 아미노 말단 시그날 펩타이드를 코딩할 수 있다. 표 1은 게놈 클론의 5' 최가장자리에서 시작하고 Exon Ⅱ와 Ⅲ 사이에 나타나는 인트론(intron)내의 Bg Ⅲ 부위에서 끝나는 것으로 추정되는 부분 게놈 서열을 나타낸다. 표 1은 Exon Ⅰ 및 Exon Ⅱ의 오픈 리딩 프레임을 코드하는 서열을 함유한다. 이는 N-말단 Exon 및 Meg cDNA 전 길이 내에 존재하는 ExonⅠ의 5' 게놈 서열에 함유되는 다른 추가의 Exon을 함유할 수도 있다. 표 5는 사람의 뇨로부터 분리되고 COS-1 세포에서 발현되는 인간 meg-CSF의 부분 게놈 코딩 서열을 형성하는 다른 공지된 Exon Ⅲ을 나타낸다. 표 6은 게놈 서열로부터 유래된 Exon Ⅰ∼Ⅲ을 함유하는 추정되는 부분 cDNA 코딩서열을 나타낸다.

본 발명의 DNA 서열은 사람의 생물학적 활성 인간 meg-CSF 단백질을 코딩할 수 있으며, 적당한 조건하에서 또는 유전 코드가 퇴화됨이 없다면 적당한 조건하에서 표 1, 5 또는 6의 단리된 DNA 서열에 하이브리다이징될 수 있는 DNA 서열을 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 DNA 서열은 대립형질성변이, 종 변이 또는 의도적 변이에 근거한 비코딩 서열, 시그날 서열 또는 코딩 서열에 있어서의 변형을 포함하거나 함유할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 사람의 뇨로부터 본 발명의 meg-CSF 조성 또는 그의 단편을 분리 및 정제하는 방법이다. 본 발명에 의해 제공된 정제 방법은 뇨를 농축시키고 ; 이를 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행하고 ; 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행한 후 ; 생성된 물질을 렉틴 친화성 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 우수성능(fine performance) 액체 크로마토그래피(FPLC)를 행하고 각 HPLC 작동에 대하여 다른 용매 용액을 사용하여 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통하여 3회 용출을 행한다.

본 발명의 또다른 측면은 쥐의 피브린 혈병 검정에서 5×10⁷희석 단위/mg 이상의 비활성에 의해 특징지어지는, 뇨로부터 정제되거나 재조합 또는 합성 기술에 의해 생성되는 동종의 meg-CSF이다.

또한 본 발명에 의해 제공되는 것은 벡터 DNA와 인간 meg-CSF를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 재조합 DNA 분자이다. DNA 분자는 선택된 숙주 세포에서 meg-CSF의 복제와 발현을 지시할 수 있는 조절 서열과 연관하여 작용하는 meg-CSF DNA를 제공한다. 재조합 meg-CSF 단백질의 발현에 사용되는 상기 DNA 분자로 형질 전환된 숙주 세포가 또한 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명의 DNA 분자 및 형질 전환 세포는 또다른 측면, 즉, 재조합 인간 meg-CSF 단백질, 또는 그의 펩타이드 단편을 생산하는 신규의 방법에 사용된다. 이 방법에서는 단백질 발현을 조절할 수 있는 적합한 조절 또는 발현 조절 서열과 함께 연관되어 작용되는 meg-CSF 단백질 또는 그의 단편의 발현을 코딩하는 DNA 서열(또는 상기한 바와 같은 재조합 DNA 분자)로 형질전환된 세포주를 재조합 DNA 발현시킬 수 있는 적절한 조건하에서 배양한다. 이어서 발현된 meg-CSF 단백질을 적당한 통상적인 방법에 의해 숙주세포, 세포 분해물 또는 배양 배지로부터 수거한다. 뇨로부터 meg-CSF를 분리하는데 이용한 것과 동일한 정제 단계 또는 그의 변형법을 통해 조정 배지는 가공될 수 있다. 청구하고 있는 이 방법은 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 다수의 공지된 세포를 사용할 수 있다. 현재 meg-CSF의 생산에 바람직한 세포주는 포유류 세포주와 박테리아 세포이다.

본 발명의 또다른 측면으로서, 재조합 meg-CSF 단백질을 제공한다. 이 단백질은 대체적으로 사람의 다른 단백질성 물질과 유리되어 있으며 하나 이상의 펩타이드 단편을 코딩하는 DNA 서열 또는 여기서 기재하고 있는 서열을 함유하고 있다. 본 발명의 meg-CSF 단백질은 또한 하나 이상의 물리적, 생화학적, 약리학적 또는 생물학적 활성을 함유함을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 측면으로는 치료학적 유효량의 동종 또는 재조합 meg-CSF, 또는 유효량의 하나 이상인 그의 활성 펩타이드 단편을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 약제학적 조성물은 혈소판 부족에 의한 질병 상태 또는 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 meg-CSF 조성물 또는 그의 약제학적 유효 단편은 화학치료 또는 혈소판 감소증으로부터 기인된 재생불량성 빈혈의 치료에 사용될 수 있다. meg-CSF는 골수 이식 환자의 보조적 치료로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또다른 측면은, 적당한 약제학적 담체 중의 치료학적 유효량의 meg-CSF 또는 그의 하나 이상의 펩타이드 단편을 환자에게 투여함으로써 혈소판 부족에 기인한 상기의 또는 그외의 병리학적 상태를 치료하는 방법이다. 이러한 치료 방법은 meg-CSF 또는 그의 하나 이상의 펩타이드 단편과 함께 하나 이상의 그외의 TPO-유사 인자, 사이토킨, 조혈소, 인터류킨, 성장 인자 또는 항체 유효량을 동시에 또는 차례로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 사람의 meg-CSF 또는 그의 단편에 대하여 유도되는 항체이다. 따라서, 이러한 측면의 일부로서 본 발명은 이러한 항체를 분비할 수 있는 세포주 및 그의 생산 방법 및 진단 또는 치료 방법에의 용도를 청구하고 있다.

본 발명의 또다른 측면 및 잇점은 하기의 바람직한 구현예에 대한 상세한 기술을 참고로 하여 명백해질 것이다.

Description

[발명의 명칭]

거핵구 형성 인자

[도면의 간단한 설명]

제1도는 meg-CSF를 함유하는 18.2kb 게놈 클론의 제한 엔도뉴 클레아제 효소의 위치를 나타내는 제한 지도이다. 도면의 아랫부분은 Exons Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ이 위치하는 게놈 영역을 나타내며, 제한 제도에서의 상대적 위치를 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 사람의 조혈 시스템을 조절하는데 중요한 신규의 단백질 인자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 거핵구(megakaryocyte) 콜로니 형성과 거핵구 원종의 분화 또는 성숙을 자극하는 신규의 단백질 인자에 대하여 기재하고 있다. 또한 재조합 유전 공학 기술에 의하여 이 인자를 동종의 형태로 수득하고 이를 생산하는 방법을 제공한다.

[본 발명의 배경]

거핵구는 골수에서 뿐 아니라, 말초 혈액 및 그외의 조직에서도 널리 발견되며, 혈소판(혈전구라고도 알려진)을 생산하여 이를 방출하여 순환시키는 조혈 세포이다. 사람의 조혈 시스템의 모든 조혈 세포와 같이, 거핵구는 많은 세포 분열과 상당한 분화 및 성숙을 포함하는 복잡한 경로를 거친 후에 궁극적으로는 원시 간세포로부터 유래된다.

이들 거핵구 세포로부터 유래된 혈소판은 상처 부위에서 혈병(blood clot) 형성을 시작하는데 중요하다. 혈소판은 또한 혈병 형성 부위에서 상처가 아무는 속도를 증진시키고 다른 기능을 도울 수 있는 성장 인자를 방출한다. 그러나, 혈소판 부족 상태(혈소판감소증)의 환자에서는 혈병을 형성할 수 없음이 가장 직접적이고 심각한 결과로서많은 암치료에 있어 잠재적으로 치명적인 문제이다. 이러한 암 환자는 일반적으로 혈소판 주입으로써 이러한 문제를 처리한다. 혈소판 주입을 자주 필요로 하는 환자는 골수 이식을 행한 환자이거나 재생 불량성 빈혈을 가진 환자이다.

이러한 방법을 위한 혈소판은 정상의 수여자로부터의 혈소판 영동에 의해 수득된다. 대부분의 인체의 혈액 생성물과 같이, 주입용 혈소판은 비교적 저장 수명이 짧으며, 인간 면역결핍 비루스(HIV)와 같은 위험한 비루스에 환자를 노출시킬 위험이 크다.

혈소판감소증 환자에게 있어서 혈소판 주입에 대한 의존성을 감소시키는 동시에 내생적 혈소판 형성을 자극하는 능력은 분명히 매우 유리한 것이 될 것이다. 또한 암 치료를 위해 방사선 치료 또는 화학 치료를 행하는 환자에게 있어서 혈소판감소증을 치료하거나 예방할 수 있는 능력은 상기 치료를 더욱 안전하게 하고 치료의 강도를 증가시켜 더욱 큰 항암 효과를 얻게 한다.

이러한 이유로 거핵구 및 혈소판 생성은 조절에 관련된 인자의 확인 및 정제에 대한 상당한 연구가 행하여지고 있다. 상당한 논란이 있었으나, 조혈세포의 성숙한 거핵구로서의 성장 및 분화, 이어서 이러한 세포에 의한 혈소판 생성을 조절하는 인자는 하기의 2가지 종류인 것으로 여겨진다 :

(1) 배양시 거핵구 원종의 증식 및 분화를 도와주는 거핵구 콜로니-자극 인자(meg-CSF_S) 및 (2) 거핵구를 분화 및 성숙시켜 혈소판의 생산 및 방출을 도와주는 혈소판 형성(TPO) 인자[참고문헌 : E. Mazur, Exp. Hematol., 15 : 340 350 (1987)].

어느 한 종류의 인자가 생물학적 검정에 의해 정의된다. 동물에 투여한 경우 meg-CSF 활성을 가진 인자가 거핵구 콜로니 형성을 도와주는 반면, TPO 활성을 가진 인자는 순환하는 혈소판 수의 증가를 유도한다. 이러한 활성 중 어느 하나 또는 둘 모두를 갖는 인자가 몇 종류나 존재하는지에 대하여는 명확하지 않다. 예를 들면, 인간 IL-3은 사람의 거핵구 콜로니 형성을 도와주며, 원숭이 이상에서, 주로 혈소판 수의 증가를 유도한다. 그러나, IL-3는 모두 조혈 계통에서 조혈 세포 발달에 영향을 미치며 거핵구 계통 세포와 선택적으로 상호 작용하는 거핵구 형성 및 혈소판 형성의 특정 조절제와 구별될 수 있다.

지금까지 보고된 연구에 의하면, meg-CSF로서 확인된 활성이 TPO 활성을 가지고 있는가 또는 그 반대의 경우인가에 대하여는 명확하지 않다. 문헌 중에 나타나 있는 여러 가지 다른 보고에서는 거핵구 계통의 세포와 상호작용하는 인자에 대하여 기재하고 있다. 몇가지 추정되는 meg-CSF 조성물은 혈청으로부터 유도된다[참고문헌 : 예를 들면, R. Hoffman 등, J. Clin. Invest., 75 : 1174 1182 (1985) ; J. E. Stravena 등, Exp. Hematol., 15 : 657 663 (1987) ; E. Mazur 등, Exp. Hematol., 13 : 1164 1172 (1985)]. 본 분야에서는 TPO 인자에 대한 보고가 더욱 많다[참고문헌 : 예를 들면, T. P. McDonald, Exp. Hematol., 16 : 210 205 (1988) ; T. P. McDonald 등, Biochem. Med. Metab. Biol., 37 : 335 343 (1987) ; T. Tayrien 등, J. Biol. Chem., 262 : 3262 3268 (1987) 및 기타].

이러한 조절 인자를 잠정적으로 확인하는 추가의 여러 가지 보고가 있지만 이러한 인자의 생화학적 및 생물학적 확인과 특징은 혈액 및 뇨와 같은 천연 원료로부터 입수가능한 소량의 자연발생 인자에 의해 방해를 받는다. 현재 혈청-유래 생성물 또는 혈소판을 대체하는 약제학적 용도로 사용되는 meg-CSF 또는 TPO로서 유용한 단독으로 정제된 인자에 대하여는 확인된 바 없다.

현재 사용되는 혈소판의 주입을 대체하기 위해 생체내에서 혈소판 생성을 자극하거나 향상시킬 수 있는 천연 원료로부터 정제되거나 동종의 형태로 생성되는 또다른 단백질이 본 분야에 필요하다.

[상세한 설명]

본 발명에 의해 제공되는 신규의 인간 거핵구 콜로니 자극인자 meg-CSF는 인체의 다른 단백질성 물질과 실질적으로 유리된 동종 단백질 또는 단백질성 조성물이다. 이 단백질은 치료 용도에 유용한 순수 활성 meg-CSF를 다량으로 제조할 수 있는 재조합 기술에 의해 제조된다. 대안적으로, 이 단백질은 인체 뇨 또는 이것을 분비하거나 발현하는 포유류 세포주로부터 정제된 동종 단백질로서 수득될 수 있다. 또한, meg-CSF 또는 그의 활성 단편은 화학적으로 합성될 수도 있다.

본 발명의 meg-CSF는 하나 이상의 하기 생화학적 및 생물학적 특성을 특징으로 한다 :

(1) 비환원 조건하의 12% 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE) 및 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 생물학적 검정에 의해 측정된 바와 같이 본 발명에 따른 조성물의 겉보기 분자량은 약 28∼38kd이며 ;

(2) 다양한 환원제, 예를 들어 β-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨을 사용한 환원 조건하에서 12% SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이 본 발명에 따른 조성물의 겉보기 분자량은 대략 20∼27kd이고 ;

(3) 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 검정에 있어서, 본 발명에 따른 조성물의 비활성도는 대략 단백질 1mg당 5×10⁷희석 단위 이상이며 ;

(4) 본 발명에 따른 meg-CSF 조성물은 동일하거나 대체적으로 동일한 하나 이상의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 함유한다 :

(a) Ser Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Are

(b) Arg Val Cys Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly (Arg)

(c) Lys Ala Pro Pro Pro (X) Gly Ala Ser Gln Thr Ile Lys

(d) Lys Tyr Asp Lys Cys Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro

(e) 하기 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 나타낸 아미노산 서열.

상기 아미노산 서열 또는 이들의 단편의 생물학적 또는 생리학적 활성은 완전한 meg-CSF 단백질의 활성과 유사할 수도 있다. 서열에서, (X)는 아직 확실히 확인되지 않은 잔기를 나타내지만, Ser 또는 Thr일 수도 있으며 ; ( )는 잔기의 잠정적인 확인을 나타낸다. 상기 (a)∼(d)에서와 같이 확인된 서열은 본래 단계7을 생략한 단계8, 즉 정제단계 중 제3HPLC 정제 단계에서 정제된 물질로부터 결정되었다. 또한 8가지 단계 모두를 통해 정제된 물질로부터도 동일한 서열이 수득되었다. 표 1∼6의 DNA 및 아미노산 서열을 하기에서 상세히 설명하겠다.

(5) 본 발명의 meg-CSF 조성물은 pH 4.5의 산성 조건하에서 SP-Zeta Prep에 결합할 수 있다.

(6) 본 발명의 meg-CSF 조성물은 맥아(Wheat Germ)-세파로오스 및 콘카나발린-A 세파로오스에 결합할 수 있다.

(7) 본 발명의 meg-CSF 조성물은 트리플루오로아세트산(TFA) 및 아세토니트릴 용매계를 사용한 역상 C4 HPLC 컬럼 상에서 23∼33% 아세토니트릴에 용출된다.

(8) 본 발명의 meg-CSF 조성물은 피리딘, 아세트산 및 n-프로판올 용매계를 사용한 역상 C18 HPLC 컬럼상에서 6∼15% n-프로판올에 용출된다.

(9) 본 발명의 meg-CSF 조성물은 헵타플루오로부티르산(HFBA) 및 아세토니트릴 용매계를 사용한 역상 C4 HPLC 컬럼상에서 27∼37% 아세토니트릴 사이에 용출된다.

본 발명에 따른 meg-CSF 조성물의 생물학적 활성은, 조성물이 배양시에 중간 및 큰 크기의 거핵구로 구성된 콜로니의 성장 및 발달을 자극시킬 수 있는 능력에 의해 증명된다. 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 검정에 있어서, 본 발명에 따른 meg-CSF 조성물은 평균 3∼6의 거핵구 콜로니를 자극한다. 쥐의 한천 meg-CSF 검정에 있어서, 본 발명에 따른 meg-CSF 조성물은 거핵구의 콜로니를 자극한다. 본 발명의 meg-CSF 조성물은 인체 혈장 혈병 거핵구 콜로니 형성 검정에 있어서 일치하지 않는 활성을 나타낸다.

meg-CSF는 본래 골수 이식조직을 갖는 환자의 뇨에서 검출되었다. 이 환자는 향상된 meg-CSF 활성을 나타낸다. 인간 meg-CSF는 처음에는 하기 실시예 1에 구체적으로 설명된 정제 단계와 기술 순서에 의해 상기 인체 뇨로부터 정제되었다. 그러나, 이 인자는 또한 기타 원료, 예를 들어 인체 세포주로부터 정제될 수도 있거나, 재조합 방법을 거쳐 인체 세포주로부터 제조될 수도 있다.

인체뇨에서 meg-CSF를 수득함에 있어서 사용되는 정제 기술은 하기단계로 구성된다. 정제 단계는 아미콘(Amicon) YM-10 필터를 통해 모아진 골수 이식조직환자 뇨를 농축시킴을 포함한다. 농축된 뇨를 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과시키고, 유출물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합시킨다. 이어서, 뇨의 단백질 용출물을 모으고, 투석하고, 가열시킨 후 이것을 렉틴 친화성 크로마토그래피 컬럼에 가한다. 이어서 이 용출물을 투석하고 양이온 교환 FPLC 컬럼에 가한다. 마지막으로, 이용출물을 서로 상이한 용매계를 이용하는 역상 HPLC로 3회 반복처리한다.

하기 기술된 쥐의 피브린 혈병 검정에 있어서 회수와 수율을 최대화하기 위한 반제조 단계(30∼100리터 뇨 당량)에서의 추가의 정제를 위해 가장 높은 수준의 meg-CSF를 선택한다.

즉, 동종 meg-CSF는, 인체 뇨 또는 인체 meg-CSF의 기타 원료, 예를 들어 활성화된 말초 백혈구 및 인체 태반을 실시예 1에서 상세히 설명된 상기 정제 절차로 처리함으로써 수득될 수도 있다. 기타 조직 원료 및 C10-MJ2(HTLVI-형질변환 T 세포주) 및 HEK(초기 인체 태아 신장 세포)과 같은 세포주도 또한 단백질 원료가 될 수 있다. meg-CSF 생산을 위해 밝혀진 세포 원료 배양 절차는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

meg-CSF 또는 그의 하나 이상의 펩타이드 단편은 또한 재조합 기술에 의해 제조될 수도 있다. meg-CSF 또는 그의 하나 이상의 단편을 위한 게놈 DNA 및 cDNA 서열을 수득하기 위하여, 통상적인 기술에 의해, 정제되고 서열화된 폴리펩타이드의 트립신 소화물, 즉, 상기의 (a)∼(d)로서 확인된 트립신 소화물을 제조한다.

실시예 5에 자세히 나타낸 바와 같이, 하기의 올리고뉴클레오타이드 탐침은 트립신 단편의 아미노산 서열 또는 상기한 meg-CSF의 아미노산 말단 서열을 코딩하는 모든 가능한 서열을 예견하는 유전 코드를 사용하여 합성된다. 탐침은 인간 태반 람다 파아지 DNA 라이브러리(인간 게놈 라이브러리)를 스크린하는데 사용한다. 18.2kb 게놈 DNA에 하이브리다이징된 탐침 중 하나를 삽입한다. 이 삽입부의 제한 지도를 제1도의 최상부에 나타내었다. 하부는 3개의 추정 Exon Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ을 코딩하는 게놈 서열을 함유하는 5kb 영역의 제한 지도를 나타낸다. 게놈 서열은 3영역 ; Not Ⅰ~EcoRⅠ, EcoRⅠ∼BglⅡ 및 BglⅡ∼BglⅢ에서 수득된다. 표 1에 보고된 하나의 긴 연속된 게놈 서열을 이루기 위해 서열은 상기 위치에서 서로 연결된다. 그러나 이를 연결점에서 표 1에 존재하지 않는 작은 결실이 있을 수도 있다.

표 1의 서열은(제1도의 5' NotⅠ부위에 인접한) 클론의 5' 최가장자리에서 시작하는 게놈 meg-CSF 클론의 부분 서열이다. -1∼-64로 나타낸 뉴클레오타이드는 폴리링커 뉴클레오타이드이다. 게놈 서열의 제1뉴클레오타이드는 서열 중에 n1로서 나타낸다. Exon Ⅱ와 Exon Ⅲ 사이의 인트론 서열에서 표 1 서열은 제2 Bgl Ⅱ 부위에서 끝난다. 이 서열은 약 7505 뉴클레오타이드를 함유한다. 4개의 효소, Kpn Ⅰ, Pvu Ⅱ, EcoRⅠ 및 SnaBⅠ은 이 서열은 절단할 수 있는 능력이 있으며 게놈 서열의 5' 가장자리에 인접한 클로닝 부위의 폴리링커에 존재하는 Not Ⅰ도 또한 이 서열을 절단할 수 있다. 예상되는 절단 부위는 대략 별표로 표시된 부위로서 표 1에 나타나 있다. 이 서열은 2개 이상의 Exon을 함유하는 것으로 추측되나 Exon Ⅰ의 5' 가장자리의 위치와 또다른 Exon의 존재를 확실하게 결정되지 않았다. Exon Ⅰ의 아미노산 서열은 확실하게 결정되지 않았다. 또한 이 서열에 포함되는 추가의 Exon의 적당한 리딩 프레임(reading frame)의 아미노산 서열도 확실하게 결정되지 않았다. 적당한 리딩 프레임의 정확한 확인이 없는 상태하에 표 2, 3 및 4는 각각 게놈 클론 표 1의 제1게놈 뉴클레오타이드(리딩 프레임 A), 표 1의 제2뉴클레오타이드(리딩 프레임 B), 및 표 1의 제3뉴클레오타이드(리딩 프레임 C)에서 시작하는 리딩 프레임으로서의 추정되는 아미노산 서열을 포함한다. 3개의 모든 리딩 프레임은 컴퓨터에 의해 분비성 리더(secretory leader) 서열을 함유하는 유사한 Exon 후보자로서 인식된 잠재적 N-말단 Met-함유 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 이러한 서열 중 하나는 표 2의 뉴클레오타이드 #4897∼#5073에 걸쳐 있다. 표 1의 뉴클레오타이드 #5742∼#5961(리딩 프레임 A 중)로부터의 아미노산 서열은 Exon Ⅰ의 코딩 영역에 대응하여 결정되었다.

따라서, 표 2는(밑줄 그은) Exon Ⅰ을 포함하며, 서열 중에서 어떠한 뉴클레오타이드도 결실되거나 잘못 반복되지 않은 것으로 가정하여 정확한 리딩 프레임 서열일 수 있다. 뉴클레오타이드 #5742∼#5961에 대응하는 표 3 및 4의 아미노산은 결실되었다.

Exon Ⅱ는 리딩 프레임 B내의 뉴클레오타이드 #7340∼#7459에 걸쳐 있다. 또다른 잠재적 오픈 리딩 프레임 서열로서, 뉴클레오타이드 #4202∼#4465에 걸쳐 있는 서열 및 뉴클레오타이드 #4466∼#4915에 걸쳐 있는 서열은 리딩 프레임 B에 포함된다. 리딩 프레임 C에서 하나의 이러한 잠재적 서열은 뉴클레오타이드 #2559∼#2732에 걸쳐 있다.

표 1∼6의 서열은 인간 meg-CSF 부분 게놈 클론으로부터 수득되며 하기한 바와 같이 수득된 Exon Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ을 함유한다. 탐침에 하이브리다이징된 영역은 제1도에 Ⅱ로 표시된 막대 그래프 바로 위에 나타나는 Bgl Ⅱ 단편 상에서 발견되는 Exon Ⅱ로 표식된 오픈 리딩 프레임과 함께, 서브클론되고, 서열화되며 표 1에 나타난다.

18.2kb 게놈 DNA 단편도 두개의 또다른 탐침에 하이브리다이징된다. 하이브리다이징 영역은 각각 서브클론, 서열화되어 각각 오픈 리딩 프레임 내의 Exon Ⅰ및 Ⅱ로서 표 1과 5에 나타내어지는 서열을 함유함을 보여 준다. 4개의 모든 트립신 서열은 세개의 Exon에 존재한다.

두개의 트립신 서열은 인트론/Exon 연결부를 오버랩하고 Exon Ⅱ의 가장자리를 한정시킨다. meg-CSF 부분 cDNA 서열을 함유하는 단일 리딩 프레임 중에서의 3개의 Exon (Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)의 예상 아미노산 서열(3 문자 코드) 및 추정되는 cDNA 서열이 하기의 표 6에 보고되었다. 상기의 4개의 모든 트립신 서열을 함유하는 부분 서열은 182 아미노산과 546 뉴클레오타이드를 함유한다. 이 cDNA의 5' 및 3' 가장자리는 정확하게 확인되지 않으며 가능한 여분의 Exon 3' 내지 Exon Ⅲ 뿐만 아니라 N-말단 Met-함유 Exon도 현재 확인되지 않았음을 나타내는 것이다. Exon Ⅰ의 5' 가장자리로서 가능한 부위(즉, N-말단 Met-함유 Exon 또는 5'-인접 Exon은 이어질 수 있다)는 현재 (Exon Ⅰ및 Ⅱ의 밑줄친 서열 이외에) 상기의 표 2, 3 또는 4 밑줄친 서열에 나타나는 것으로 추정되고 있다.

뉴클레오타이드 # 5742 # 5961 (Exon I)에 대한 리딩 프레임은 리딩 프레임A로서 결정되었다.

Exon I에 대한 코딩 서열은 뉴클레오타이드 # 5742 #5961로부터 나타난다.

상기 확인된 meg-CSF 서열을 함유하는 2개의 게놈 클론은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 요건에 따라 1990년 8월 3일에 미합중국 20852 메릴랜드 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 미합중국 기탁기관(American Type Culture Collection : ATCC)에 기탁되었다. 이. 콜리(E. Coli) 플라스미드 내에서 5' KpnⅠ위치에서 3' SnaBⅠ 위치(제1도 참조)까지 걸쳐 있는 대략 12kb 게놈 단편(Meg KpnⅠ-SnaBⅠ라 한다)은 수탁 번호 ATCC 40857로 기탁되어 있다. 박테리오파아지 람다 DNA에 삽입된 제1도의 전체 18.2kb NotⅠ서열 (18-5665라 한다)은 수탁 번호 ATCC 40856로 기탁되어 있다.

예비 실험은 KpnⅠ/SnaBⅠ 단편이 COS 세포내에서 활성 단백질을 생산함을 보여 준다.

이 meg-CSF의 뉴클레오타이드 서열, 상세하게는 Exon Ⅰ 및 Exon Ⅱ를 단백질 및 DNA 데이타 뱅크에 저장된 뉴클레오타이드 서열과 비교하였다. 혈청 점착 분자인 비트로넥틴(vitronectin)의 아미노 말단이 가장 높은 서열 유사성이 있음을 관찰하였다. 아미노 말단부는 순환에서 발견되는 펩티드인 소마토메딘 B(Somatomedin B)로 칭하기도 한다. 기타 중요한 서열 유사성은 내피세포 및 거핵구에서 만들어진 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자의 B 영역에 대한 단백질 및 DNA 수준, 및 IgG 분비 혈장 세포에서 발견되는 막 당단백질 다이머인 쥐의 PC-1 세포외 영역의 단백질 수준에서 발견된다. 이들 펩타이드는 기능이 알려지지 않은 PC-1 및 소마토메딘 B와 기능적으로 관련이 없다.

전체 게놈 및 cDNA 서열을 수득하기 위해서, meg-CSF의 아미노 및 카르복시 말단을 각종의 절차로 결정할 수 있다. 하나의 절차는 탐침으로서 3개의 공지의 Exon을 사용하여, 인체의 활성화 말초혈관 백혈구 또는 다른 meg-CSF RNA 원료로부터 cDNA 라이브러리 제조 및 하이브리다이징에 의한 전 길이의 cDNA 추출과 관련있다. 2번째 방법은 COS 세포 중에서의 발현 클로닝이다. 예를 들면 18.2kb 게놈 삽입부의 다른 절단부를 COS 세포내로 서브클론하여 다른 활성을 확인한다. 단백질이 있으면, 상기 클론의 RNA를 분리하고 거기서 cDNA를 제조하고 발현시켜 단백질을 수득한다. 예컨대, 상기 방법은 완전한 길이의 인체 게놈 클론(18-5665라 한다)인, KpnⅠ/SnaBⅠ 클론 또는 18.2kb 게놈 삽입부의 다른 절단부 중 어느 하나를 발현 벡터에 서브클로닝하고, COS 세포내로 감염시키고, meg-CSF 감염 COS 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고 meg-CSF cDNA를 위한 하이브리다이징에 의해 스크리닝하는 것으로 구성되어 있다. 이와는 달리. N-말단 Met를 포함하는 전체 서열은 쥐의 meg-CSF 동종(homolog)와 비교함으로써 확인될 수 있다. 또한, meg-CSF의 세포 원료로부터의 mRNA를 사용하여 meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 확인하기 위한 탐침으로 스크린될 수 있는 cDNA 라이브러리를 제조한다. cDNA 원료를 스크린하는 기술은 ExonⅠ∼Ⅲ로부터 프라이머(primer)를 제조하고, PCR 기술을 사용하여 cDNA 전사체(transcripts)를 분리하고 확대하는 것을 포함한다.

전체-길이 인체 게놈 클론 또는 그의 단편을 탐침으로 하여 교차-하이브리다이징하므로써 meg-CSF의 쥐의 게놈 클론 또는 단련을 분리할 수 있다. meg-CSF의 쥐의 게놈 클론 또는 그의 단편은 쥐의 cDNA 라이브러리의 제조에 사용할 수 있는 meg-CFS용 mRNA 원료의 확인에 사용할 수 있다. 쥐의 cDNA는 인체 meg-CSF 유전자 중의 대응하는 Exon 확인에 사용될 수 있으며 Exon 을 함께 연결하여 완전한 길이의 인체 cDNA를 만들 수 있다.

일단 완전한 cDNA가 확인되면, meg-CFS의 활성 단편을 코딩하는 cDNA 또는 그의 일부를 각종의 발현 벡터 중의 어느 하나에 도입하여 meg-CSF 또는 하나 이상의 그의 단편을 위한 발현 시스템을 만들 수 있다.

재조합 기술을 사용하여, 하나 이상의 트립신 단편을 코딩하는 DNA 서열 및 상기 확인된 일부의 서열을 함유하는 meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 수득한다. 본 발명은 또한 기타 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 연관되지 않으며 meg-CSF 폴리펩타이드를 위한 발현에 코딩되는 상기 DNA 서열을 포함한다. 상기 DNA 서열은 상기 확인된 펩타이드 서열의 전체 또는 단편 또는 일부의 클론서열을 코딩하는 서열들 및 강제적 하이브리다이징 조건하에서 DNA 서열에 하이브리다이징하는 서열을 포함한다[참조, T, Maniatis 등, Molecular cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), p 387 389 면].

강제적 하이브리다이징 조건의 예는 4×SSC로 65℃에서 하이브리다이징 시킨 후, 0.1×SSC로 65℃에서 1시간 세척한다. 선택적으로, 좋은 예가 되는 강제적 하이브리다이징 조건은 50% 포름아미드 중에서 42℃에서의 4×SSC이다.

완화된 하이브리다이징 조건하에서 meg-CSF 서열에 하이브리다이징되고 meg-CSF 생물학적 성질을 갖는 meg-CSF 펩타이드 발현시에 코딩되는 DNA 서열도 신규한 meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩한다. 비-강제적 하이브리다이징 조건예에는 50℃에서의 4×SSC 또는 42℃에서 30∼40% 포름아미드를 사용한 하이브리다이징이다. 예컨대, 글리코실화(glycosylation) 또는 디술파이드 결합 부위 등과 같이 meg-CSF 서열과 현저한 상동성을 공유하고 하나 이상의 meg-CSF 생물학적 성질을 지닌 단백질을 코딩하는 DNA 서열은, DNA 서열이 강제적으로 meg-CSF서열에 하이브리다이징하지 않았을지라도, meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 것은 명백하다.

meg-CSF 펩타이드 서열을 코딩하는 DNA 서열의 대립 유전자의 변이(아미노산을 변화시키거나 변화시키지 않을 수도 있는 종집단 내에서의 염기의 자연 변화) 뿐만 아니라 동족체 또는 그의 유도체도 본 발명에 포함된다. 유사하게, meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩하지만 유전자 코드의 퇴화 또는 점 돌연변이(point mutation) 또는 유도 변형시켜 코딩된 펩타이드의 활성, 반감기 또는 생산을 향상시키는 meg-CSF의 DNA 서열중의 변이로 인해 코돈 서열이 다른 DNA 서열도 또한 본 발명에 포함된다.

meg-CSF 폴리펩타이드는 또한 공지의 통상적인 화학적 합성법으로 제조될 수 있다. 합성 수단에 의한 본 발명의 폴리펩타이드를 구성하는 방법은 본 기술분야의 숙련자에게는 공지되어 있다. meg-CSF와 1차, 2차, 3차 구조 및 입체 구조 특성을 공유하는 합성적 구성 meg-CSF 폴리펩타이드 서열은 meg-CSF와 공통적인 생물학적 성질을 지닐 수 있다. 따라서, 이들은 치료 및 면역학적 방법에서 천연, 정제 meg-CSF 폴리펩타이드에 대한 생물학적 활성 또는 면역학적 대체물로 이용할 수 있다.

폴리펩타이드 또는 meg-CSF를 코딩하는 DNA 서열의 변형은 공지의 기술을 사용하여 본 분야의 숙련자에 의해 행해질 수 있다. meg-CSF 서열에서 의도하는 변형은 코딩서열내의 선택된 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 치환, 삽입 또는 결실을 위한 돌연변이 유발 기술은 당 기술분야의 숙련자들에게는 널리 공지되어 있다[참조, 예. 미합중국 특허 제4,518,584호].

meg-CSF 폴리펩타이드 서열의 특정 돌연변이는 글리코실화 부위의 변형을 포함할 수 있다. 어떤 아스파라긴-연결 글리코실화 인식 부위 또는 0-연결 탄수화물의 첨가로 변형된 분자의 어떤 위치에서 아미노산의 치환 또는 결핍이 일어남으로써 글리코실화가 일어나지 않거나 부분적 글리코실화만이 생기게 된다. 아스파라긴-연결 글리코실화 인식 위치는 적당한 세포의 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩타이드로 이루어진다. 이 트리펩타이드 서열은 Asp-X-Thr 또는 Asp-X-Ser(여기서, X는 어떤 아미노산도 무방하다.) 중 어느 하나이다. 글리코실화 인식 부위의 1번째 또는 3번째 아미노산 위치 중 하나 또는 모두에서의 각종 아미노산의 치환 또는 결실(및/또는 2번째 위치에서의 아미노산의 결실)로서 변형된 트리펩타이드 서열에서는 비-글리코실화가 된다.

상기 변화된 뉴클레오타이드 서열의 발현은 전기의 부위에서 글리코실화되지 않은 변이체를 생산한다.

전체적 또는 부분적으로 meg-CSF 활성을 지니는 것으로 예견되는 meg-CSF 서열의 동족체 또는 유도체도 또한 기술한 바와 같이 본 분야의 숙련자에 의해 쉽게 만들어질 수 있다. 이러한 변형의 하나는 meg-CSF 서열내에 존재하는 리신 잔기상에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 부착시키거나, 또는 리신 잔기 또는 PEG 또는 PEG 유도체와 반응할 수 있는 하나 이상의 기타 아미노산 잔기를 통상적인 방법으로 서열에 삽입함으로써 PEG 부분을 부착시킬 수 있는 것이다. 이러한 변형도 본 발명에 포함되는 것으로 생각된다.

본 발명은 또한, meg-CSF 폴리펩타이드 또는 그의 활성 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한가지 방법은 meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 cDNA를 발현 벡터에 도입하여 meg-CSF용 발현시스템을 만드는 것이다. 선택된 숙주세포는 상기 벡터로 형질전환하여 배양한다. 따라서 본 발명의 방법은 공지 조절서열의 조절하에서 meg-CSF 폴리펩타이드의 발현을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 적당한 세포 또는 세포주를 배양하는 것으로 구성된다. 조절서열은 프로모터 단편, 터미네이터 단편 및 적당한 숙주세포에서 단백질의 발현을 유도하는 기타 적당한 서열을 포함한다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 적당한 수단을 사용해서 발현 인자를 배양배지로부터(또는 세포내에서 발현되었다면 세포로부터) 회수한 다음, 분리하고 정제한다.

적당한 세포 또는 세포주는 중국산 헴스터 난소 세포(CHO) 또는 3T3 세포 등과 같은 포유류 세포이다. 적당한 포유류 숙주세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝과 생산물 생산 및 정제방법도 본 분야에 공지되어 있다[참조, 예, Gething 및 Sambrook, Nature, 293 : 620 625(1981), 또는 선택적으로 Kaufman 등, Mol. Cell. Biol., 5(7) : 1750 1759(1985) 또는 Hawley 등, 미합중국 특허 제4,419,446호]. 기타 적당한 포유류 세포주는 원숭이 COS-1 세포주 및 CV-1 세포주이다. 또한, 대표적인 포유류 숙주 세포는 특히, 형질전환된 세포주를 포함하여 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 1차 이식체 뿐만 아니라 1차 조직의 시험관 배양으로 유도된 세포균주(strain)인, 정상의 2배체 세포도 적합하다. 설정된 세포는 선택 유전자 중에서 유전자형이 결핍될 수 있고, 또는 우성으로 작용하는 선택 유전자를 함유할 수도 있다. 기타 적당한 포유류 세포주로 헬라(HeLa), 마우스-L929 세포, 스위스 유래의 3T3 세포계통, Balb-c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 적당한 숙주세포로 유사하게 유용한 것은 세균세포이다. 예컨대, 각종의 이. 콜리(E. Coli) 균주(예, HB101, MC1061 및 하기 실시예에 사용된 균주)가 생명공학 분야에서 널리 알려진 숙주 세포이다. 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas), 기타 바실러스 등의 각종 균주가 또한 상기 방법에 이용될 수 있다.

본 분야의 숙련자에게 공지된 많은 효모 세포 균주를 본 발명의 폴리펩타이드 발현을 위한 숙주세포로 이용할 수 있다. 또한, 원한다면, 곤충의 세포를 본 발명 방법의 숙주세포로 이용할 수 있다[참조, 예, Miller 등, Genetic Engineering, 8 : 277 298(Plenum Press 1986) 및 이 문헌에 언급된 참조문헌].

본 발명은 또한 산규의 meg-CSF 폴리펩타이드를 발현시키는 방법에 사용하는 재조합 분자 또는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 여기에 재언급된 신규 meg-CSF DNA 서열을 포함하여 이는 단독으로 또는 다른 서열과 조합하여 본 발명의 meg-CSF 폴리펩타이드 또는 그의 활성 단편을 코드한다. 이와는 달리, 상기한 변형서열을 포함하는 벡터도 또한 본 발명의 구현예이며 meg-CSF 폴리펩타이드의 제조에 유용하다. 이 방법에 이용된 벡터는 또한 본 발명의 DNA 코딩 서열과 연관하여 작용하며 선택된 조절 서열을 함유하고 선택된 숙주세포에서 복제 및 그의 발현을 유도할 수 있다.

하나의 바람직한 벡터는 pXM[참조, Y. C. Yang 등 Cell, 47 : 310(1986)]이다. 여기에 기술된 포유류 세포 발현 벡터는 본 분야의 숙련자에게 공지된 기술로 합성될 수 있다. 예컨대, 레플리콘(replicon), 선별 유전자(selection genes), 인헨서(enhencer), 프로모터 등과 같은 벡터 성분들은 천연원으로부터 수득되거나 또는 공지 방법에 의해 합성될 수 있다[참조, Kaufman 등, J. Mol. Biol., 159 : 511 521(1982); 및 Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82 : 689 693(1985)]. 이와는 달리, 이 벡터 DNA는 소 유두종 바이러스 게놈[Lusky 등, Cell, 36 : 391 401(1984)]의 전체 또는 일부를 포함할 수 있고, 안정한 에피솜 성분(episomal element)으로써 C127 마우스 세포와 같은 세포주내에 수반될 수 있다. 이들 벡터를 적당한 숙주세포로 형질전환시키면, meg-CSF 폴리펩타이드가 발현될 수 있다.

포유류, 곤충, 효모, 곰팡이 및 세균 발현을 위해 본 분야에 공지된 각종 유형의 적당한 기타 발현 벡터도 상기 목적으로 사용할 수 있다.

따라서, 세포원에서 균질하게 정제되거나 또는 재조합 또는 합성하여 제조된 meg-CSF 또는 그의 활성 단편은 약제학적 제제 또는 제형에 사용되므로써, 화학요법 또는 골수이식에 따른 혈소판 회복을 촉진하여, 혈소판 감소증, 재생불량성 빈혈 및 기타 혈소판 관련 질병을 치료할 수 있다. 이 meg-CSF 폴리펩타이드 조성물을 사용한 혈소판 관련 질병 및 결핍증의 치료적 처리는 현재 이용하고 있는 혈청-유래된 인자에 의한 치료 또는 인체 혈소판의 주입으로 인한 바람직하지 않은 부작용을 피할 수 있다. 상기 확인된 펩타이드와 같은 meg-CSF의 하나 이상의 펩티드 단편을 또한 약제학적 제제에 이용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 상기 정의한 상태의 치료에서 단독으로 또는 기타 사이토킨, 조혈소, 인터류킨, 성장 인자 또는 항체와 함께 이용될 수도 있다.

따라서, 본 발명의 기타 다른 측면으로는 상기에 언급한 상태를 치료하는 치료학적 조성물이 있다. 이와 같은 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 부가 혼합된 치료학적 유효량의 meg-CSF 단백질 또는 그의 치료학적 유효 단편을 함유한다. 상기 조성물은 체계적으로 비경구적 투여될 수 있다. 이와는 달리, 이 조성물을 정맥내 투여할 수도 있다. 원한다면, 조성물은 피하내 투여될 수도 있다. 체계적으로 투여되는 경우, 본 발명에 사용하는 치료 조성물은 세균성 발열 물질이 없는, 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태이다. 적절한 pH, 등장성, 안정성 등을 갖는 약제학적으로 허용가능한 단백질 용액의 조제는 본 분야의 기술 범위내이다.

상기에 기술한 상태들을 치료하는 방법과 연관된 약물투여법은 예컨대, 환자의 상태, 체중, 성별 및 음식, 감염의 심각성, 투여시간 및 기타 임상적 요인 등과 같이 약물의 작용에 변화를 주는 각종 요인을 고려한 의사의 진료로 결정될 수 있다. 통상, 일일 투여량은 체중 1Kg 당 meg-CSF 단백질 또는 그의 단편 1∼1000mg 또는 단백질 50∼5000 단위 범위(즉, 1단위는 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 검정에서 가장 많은 콜로니 수를 산출하는 meg-CSF 단백질의 최저 농도이다.)이어야 한다.

본 발명의 치료방법, 조성물 및 폴리펩타이드는 또한 혈소판 결핍 뿐만 아니라 기타 증후로 특징지어서는 질병 상태의 치료에서, 단독으로 또는 기타 사이토킨, 조혈소, 인터류킨, 성장인자 또는 항체와 함께 사용될 수 있다. 상기 분자는 그 자체가 TPO 활성이 없다면, IL-3, IL-6 또는 GM-CSF 등과 같은 일반적인 조혈 촉진제 또는 거핵구 자극인자 또는 TPO-유사 활성이 있는 분자와 조합하여 혈소판 감소증 몇몇 형태의 치료에 유용한 것으로 증명될 수 있음이 예견된다. 이러한 함께 투여하는 부가적인 전형적 사이토킨 또는 조혈소로서 TPO, G-CSF, CSF-1, GM-CSF, IL-1, IL-11(공동출원되고 본 명세서에서 참고로 편입된 미합중국 특허 출원 SN 07/441,100호에는 IL-10이라 기재됨), IL-3, IL-4, M-CSF, IL-7 또는 적혈구조혈소가 있다. 상기에 재언급한 투여량은 치료학적 조성물에 부가적 성분을 보충하여 조절될 것이다. 치료 환자의 호전은 통상적인 방법으로 모니터 될 수 있다.

이 신규 폴리펩타이드의 기타 용도는 생체내 또는 시험관내의 진단 또는 치료적 용도의 표준방법으로 생겨난 항체의 개발에 있다. 이러한 항체는 공지기술로 만들어지는 복합항체 또는 재조합항체 뿐만 아니라 모노클론성 및 폴리클론성 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에 의해 제공하는 것은 공지의 기술에 의해 항원으로서 meg-CSF 또는 그의 단편을 선택된 포유동물에 제공하고 이어서 동물세포를 특정 암세포와 융합시켜 나타나는 영구적인 세포주를 만드는 것에 의해 생겨난 세포주이다. 상기 세포주 및 본 발명의 인체 meg-CSF 폴리펩타이드의 전체 또는 일부에 대해 유도되는 항체를 만드는데 이용하는 방법 또한 본 발명에 속한다.

본 발명의 항체는 항체를 검출할 수 있는 라벨 또는 라벨 시스템과 연결하는 등과 같이 생체내 및 시험관 내에서의 진단목적을 이용할 수 있따. 이와는 달리, 이 항체는 독성물질 또는 치료 화합물 또는 당분야의 숙련자에게 공지된 성분과 연관됨에 의한 것과 같이 생체내 및 인체내의 치료목적으로 이용될 수 있다. 이 항체는 또한 연구용 시약으로도 유용성이 있다.

하기의 실시예는 동종의 인체 meg-CSF의 정제 및 특성, 본 발명의 기타 방법 및 본 발명의 생성물을 예시적으로 기술하는 것이다. 이들 실시예는 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1-뇨로부터 meg-CSF의 정제]

하기의 절차는 인체 골수 이식 환자의 뇨로부터 동종의 meg-CSF 단백질을 수득하기 위해 현재 이용되고 있다. 다른 질병 상태를 수반하는 재생불량성 빈혈 또는 혈소판 감소증이 있는 환자로부터 얻은 뇨는 정제에 사용하는 인자의 원료로서 사용할 수도 있다.

단계 1 : 이식후 5-18일 사이에 골수이식 환자로부터 뇨를 수집한다. 100 1의 수집된 뇨를 프로테아제 억제인자, 페닐메틸-술포닐플루오라이드(PMSF) 및 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)으로 처리한다. 상기의 수집한 뇨를 아미콘 YM-10 필터(10,000 분자량 절단) 상에서 농축하여 과잉의 색소를 제거하고 부피를 감소시킨다. 프로테아제 저해인자(류펩틴, 아프로티닌, 에틸렌 글리콜-비스-테트라아세트산(EGTA) 및 N-에틸말레이미드(NEM)의 혼합물을 이 단계 및 하기 3단계에서 뇨에 첨가하여 단백질 분해를 최소화한다. 뇨 농축액의 pH를 8.0으로 조절하고 전도성이 7ms/cm가 되도록 희석한다.

단계 2 : 상기 정제의 첫번째 단계에서의 체류액을 pH 8.0에서 QAE 제트라프레프(Zetaprep)[Cuno]으로 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 한다. QAE 통과 유출액의 pH를 1M 아세트산을 사용하여 4.5로 조절한다.

단계 3 : 2번째 정제 단계로부터의 유출액을 pH 4.5에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(SP-제트라프레프 컬럼[Cuno])에 결합시킨다. meg-CSF를 함유하는 결합된 단백질을 pH 4.5의 1M NaCl로 용출시킨다. 용출액을 수집하고, 프로테아제 저해 인자를 상기와 같이 첨가하고, 상기 물질을 추가로 크로마토그래피 할 때까지 -80℃에서 저장한다. 다음, 이 용출액을 단계1에서 기술한 프로테아제 저해인자를 첨가하여 트리스-완충 식염수에 대하여 투석시킨다. 이 투석물을 56℃에서 30분간 가열한다. 단백질 회수의 필수요건은 아니지만, 프로테아제 저해인자의 첨가는 이 시스템에서 프로테아제에 의해 분해되지 않는 본 단계에서 회수되는 단밸질의 양을 더욱 증가시킨다. 본 단계에서의 수집물은 거핵구-특이성 성장 인자의 존재를 확인하기 위해 분석의 대상이 된다. 이 수집물은 meg-CSF 활성을 지닌 것으로 확인되었다.

단계 4 : 생성된 물질을 렉틴 친화성 크로마토그래피 컬럼인 맥아 세파로오스컬럼 [Pharmacia] 에 가하고, TBS 중의 0.25M N-아세틸 글루코스아민(N-acglcNH₂)으로 용리시킨다. 결합된 단백질을 단계3에서 기재한 이유로 첨가한 단계1의 프로테아제 저해인자 존재하의 pH 4.5에서 20mM 아세트산 나트륨에 의해 상기 컬럼에서 용리시킨다.

단계 5 : 이 투석물을 10ml S-도요펄(Toyopearl) FPLC 양이온 이온교환 컬럼에 가하고 pH 4.5의 20mM 아세트산 나트륨 중의 0∼1M NaCl의 선형 농도구배를 사용하여 용리시킨다. 이 단계에서 용리된 단백질은 하기의 피브린 혈병 검정에서 meg-CSF 활성의 시험에 사용된다. meg-CSF 활성은 2개의 분리된 피크로 용리되어 관찰된다. 주요활성은 0.1M∼0.25M NaCl 사이에서 용리된다. 미세하지만 재현가능한 활성이 0.3M∼0.5M NaCl 사이에서 용리된다. 2개의 활성은 단일 단백질의 단밸질 또는 탄수화물의 변형에 기인된 것이며, 그러나 여기에 추가로 나타낸 데이타는 주요 단백질에 관한 것이다.

단계 6 : 상기 5번째 정제 단계에서의 용출물은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 중의 23∼33% 아세토니트릴 사이의 선형 농도 구배로 용리되는 역상 HPLC(C4) 컬럼 [Vydac; 1cm×25cm]로 정제한다. 이 단계는 수많은 30Kd 단백질 오염물을 제거한다.

단계 7 : 단계6의 용출물을 2부의 아세트산 및 피리딘으로 희석한 후, 다른 용매계로 HPLC 단계를 반복한다. 정제물은 C18 역상 HPLC 컬럼(0.46×25cm) 상에서 피리딘 및 아세트산 중의 6∼15% n-프로판올에서 용리된다. 이 단계후에 제조된 물질을 분석하면, 주의 검정에서 보고된 비활성은 5×10⁷희석 단위보다 크다. 이 임의적 단계는 제조 단계에서 뇨의 리보뉴클레아제 덩어리, 주요 오염물을 제거한다.

단계 8 : 아세토니트릴 중의 0.15% HFBA를 사용하여 C4컬럼(Vydac : 0.46×25cm) 상에서 HPLC 단계를 한번 더 반복한다. 이 물질은 27∼37% 아세토니트릴에서 용리된다. 최종 HPLC 단계는 단계7후에 존재하는 모든 잔류 리보뉴클레아제 및 단백질성 오염원을 대체적으로 모두 제거한다.

상기 정제된 meg-CSF 물질은 SDS-PAGE로 분석하고, 생물학적 검정을 행한 후¹²⁵I로 라벨한다. 단계 7을 생략한 이 절차에서 하기 기술한 쥐의 거핵구 콜로니 검정에서의 비활성이 단밸질 1mg당 약 5×10⁷∼약 2-5×10⁸희석 단위인 동종의 단백질을 수득한다.

[실시예 2-소듐도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동]

정제한 단백질을 12% 아크릴아미드 슬라브 겔(두께 0.75mm)상에서 Laemmli 방법[Laemmli, U. K., Nature, 227 : 680 685(1970)]에 따라 수행하는 SDE-PAGE로 분석한다. 전기영동시킨 후, 겔에 방사선 자기법을 수행하여¹²⁵I-라벨 meg-CSF를 시각화하거나, 은 염색하거나, 0.5~1cm 조각을 절단하고 0.3% 탈이온화 BSA를 사용하여 0.5ml TBS 중에 4℃에서 하룻밤 용리시켜 meg-CSF 활성을 검정한다. 겉보기 분자량을 단백질 표준으로 측정한다 : BRL 예비 염색 분자량 마커, 14C 분자량 표준 [NEN], 또는 저분자량 SDS-PAGE 표준 [Biorad].

활성 meg-CSF를 함유하는 실시예1의 단계 6, 7 및 8에서의 소량 단백질을 요오드화하고 SDE-PAGE를 행한다. meg-CSF 활성전에 용리되는 몇몇 분획으로 시작하여, 활성 분획에서 오른쪽으로 계속되어 meg-CSF 활성 피이크 후에 용리되는 분획으로 끝나는 단계8로부터 정제된 역상 meg-CSF의 SDS-PAGE 분석(비환원 조건)은 28 및 38kd 사이의 크기 범위의 이종의 단백질 밴드가 존재함을 보여준다. 수평 겔레인에서의 단백질의 용출은 쥐의 거핵구 콜로니 형성 검정에서의 생물학적 활성이 겔의 요오드화 meg-CSF 밴드의 존재와 상화 관련 있음을 나타낸다.

환원시에, 단백질의 대부분은 대락 20∼27kd의 분자량을 갖는다. 상기 정보를 기초로 meg-CSF는 다이머가 될 수 있다. 표준 조건하에서 단백질은 N-글리카나아제로 되지 않는다.

[실시예 3- 단백질의 회수]

50 1의 요소로 시작한 HPLC 컬럼에서의 최종 수집 분획은 정제한 meg-CSF의 아미노산 조성으로 평가하여 대략 25㎍의 단백질을 포함한다. 28∼38kd meg-CSF 단백질의 비활성은 하기의 쥐의 피브린 혈병 검정에서 대략 5×10⁷희석 단위/mg 보다 더욱 큰 것으로 측정되었다.

활성의 한 단위는 최대 콜로니 형성을 촉진하는 최대 희석의 역수로서 정의된다. 하나의 거핵구 콜로니는 3이상의 세포로 정의된다.

[실시예 4-meg-CSF 단백질 조성]

단계 7을 생략한 실시예1의 정제의 단계 8에서 수득한 meg-CSF를 이용하여 서열분석용 트립신 단편을 수득한다. 정제한 meg-CSF 제제의 25㎍을 역상 컬럼을 통해 탈염시킨다. 다음, 다량의 시스테인이 그 속에 존재하기 때문에 주 피크는 완전히 감소하고 알킬화된다. 이 물질을 다시 역상 컬럼을 통해 용리시키고, 단백질 피크를 SDS-PAGE에 행한다. 마커로서 I²⁵²-라벨 물질을 사용하여, 대략 20∼27kd로 연결된 단백질을 겔에서 절단하고 메탄올 : 아세트산 : 물로 고정하고 물로 세척한다. 겔 조각을 부드럽게 한다. 0.1M NH₄HCO₃용액(200㎕)로 중화시킨 다음, 겔 매트릭스 내에 포함된 단백질을 트립신(2% w/w)으로 소화시킨다.

서열 결정으로 4개의 펩타이드 서열을 제공한다 :

(a) Ser Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu ARg

(b) Arg Val Cys Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly(Arg)

(c) Lys Ala Pro Pro Pro (X) Gly Ala Ser Gln Thr Ile Lys

(d) Lys Tyr Asp Lys Cys Cys Pro Asp Thr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro

X는 불명확하게 확인된 아미노산을 나타내며, S 또는 T이다. ( )는 잠정적으로 확인된 아미노산을 나타낸다.

이들 4개의 트립신 펩타이드 모두는 meg-CSF의 추정의 cDNA 서열 및 Exon내에서 발견된다.

[실시예 5-뇨 meg-CSF의 게놈 클로닝]

다수의 올리고뉴클레오타이드 또는 독특한 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탐침을 문헌 [R. Lathe, J. Mol. Biol., 183(1) : 1 12(1985)]의 방법에 따라서 상기 트립신 서열로부터 디자인 한다. 하기 올리고뉴클레오타이드 탐침은 자동 DNA 합성기상에서 합성되며, N은 임의의 4개의 뉴클레오타이드 A, T, C 또는 G를 나타내며; R은 뉴클레오타이드 A 또는 G를 나타내며; Y는 뉴클레오타이드 C 또는 T를 나타내며; H는 뉴클레오타이드 A, T 또는 C를 나타낸다;'

유전자 코딩은 변이성을 갖기 때문에(하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있다), 선택된 트립신 단편 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 코딩하고 있는 가능한 모든 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 합성한다. 어떤 코돈은 진핵 유전자에서 드물게 사용되고, 진핵 코딩 서열내에서 디뉴클레오타이드 CpG가 비교적 드물기 때문에 어떤 경우에 있어서는 코돈 이용을 기준으로 하여 탐침 혼합물내의 올리고뉴클레오타이드의 수를 감소시킬 수가 있다 [참조 J. J. Toole 등, Nature, 312 : 342∼347(1984)]. 탐침 디자인에 사용되는 아미노산 서열의 범위는 가능한 한 고 변이성 코돈은 피하면서 선택한다. 올리고뉴클레오타이드는 자동 DNA 합성기상에서 합성되고 탐침은 폴리튜클레오타이드 키나아제 및³²P-ATP로 방사성 라벨링 된다.

변이성 올리고뉴클레오타이드 탐침을 태반으로부터 제조한 사람의 게놈 라이브러리 [Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA]를 확립된 기술 [참조 : K. Jacobs 등, Nature, 313 : 806∼810(1985)]을 이용하여 스크린하는데 사용한다. 이 라이브러리로부터의 제조합체는 플레이트화하고 이중 니트로셀룰로오스 및/또는 나이론 복제물은 플레이트로 만들어진다.

전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는³²P 감마 ATP로 카나제화하고 48℃의 3M TMAC 용액내에서 48∼96시간 동안 여과지에 하이브리다이징된다. 여과지를 50℃ 50mM 트리스 중의 3M TMAC 중에서 1시간 동안 세척한 후에 실온에서 30분간 각각 2×SSC로 2회 세척한다 [참조 : K. Jacobs 등, Nucleic Acids Res., 16 : 4637∼4650(1988)]. 중복 포지티브(positive)는 정제된 플라크이다.

18.2Kb는 단편(제1도)는 4개의 모든 트립신 서열에 하이브리다이징 된 것으로 나타난다. 단리되고 서열화될 18.2Kb 삽입부 내에 함유된 첫번째의 부분 게놈 서브클론은 단일 엑손(엑손 Ⅱ)내에 하나의 트립신 서열(a)과 Exon Ⅱ에 함유된 두개의 부분 트립신 서열(b 및 d)을 함유하며 인접한 코딩서열과 겹치는 것으로 나타난다. Exon Ⅲ는 트립신(c)로부터 만들어진 탐침으로 확인된다. Exon Ⅰ은 트립신의 (b)의 5' 말단으로부터 만들어진 탐침으로 확인되었다.

meg-CSF 단백질을 코딩하는 조합된 부분 게놈 클론의 예상되는 cDNA 및 아미노산 서열을 상기 표 6에 기록하였다. 이 부분 서열에 의해 코딩되는 펩타이드가 활성 meg-CSF 단편을 제조할 수 있는 반면에, 서열에는 임의의 정의된 3' 말단 뿐만 아니라 아미노 말단 Met도 없다.

meg-CSF 게놈 서열의 나머지를 수득하기 위해서, 전체 길이의 게놈 DNA 서열은 COS 세포 및 COS 세포 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리에 발현시킬 수 있으며, cDNA 서열은 상기 원료로부터 클로닝한다. 대안적으로, 나머지 서열은 쥐의 교차-하이브리다이징 게놈 meg-CSF 서열과 서열을 비교함으로써 추론할 수 있다. 서열은 또한 두개의ㅡ mRNA 잠재적 공급원, 말초 혈관 림프구 또는 태반으로부터 수득할 수 있다.

[실시예 6-재조합 인체 meg-CSF의 발현]

meg-CSF 또는 그의 활성 단편을 제조하기 위하여 그를 코딩하는 cDNA를 사람, 곤충, 효모, 곰팡이 및 세균 발현을 위해 본 분야에 공지되어 있는 여러 가지 형태의 적당한 발현 벡터내로, 표준 분자 생물학 기술에 의해서 전이시킨다. 포유류 세포에 대한 상기 벡터 중 하나는 pXM이다[Y. C. Yang 등, Cell, 47 : 3∼10(1986)]. 이 벡터는 포유류 세포내에서 목적하는 cDNA를 발현시킬 수 있는 적절한 관게로, 복제 및 인핸서(enhancer)의 SV 40 오리진, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promotor), 아데노바이러스 삼분절계 리더 서열의 cDNA 카피, 소 잡종세포 개재서열(small hybrid intervening sequence), SV 40 폴리아데닐화 시그날(SV 40 polyadenylation signal) 및 아데노바이러스 VA I 유전자를 함유한다 [참조, Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 689∼693(1985)]. pXM 벡터는 엔도뉴클레아제 효소 XhoI로 선형화된 다음 XhoI 상보적 말단을 발생시키는 합성 올리고뉴클레오타이드[Collaborative Research, Lexington, MA]를 첨가함으로써 변성된 meg-CSF를 코딩하는 cDNA 내에 개별적으로 동몰량으로 연결되어서 meg-CSF의 발현을 위한 구조물이 제조된다.

CHO 세포내에서 meg-CSF 를 발현하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 벡터는 pEMC2B1이다. 이 벡터는 ATCC(American Type Culture Collection, 록크빌, MD, USA)에 수탁번호 ATCC 40348로 기탁되어 있는 pMT2pc로부터 유도될 수 있다. 이 DNA는 PstI로 플라스미드를 소화시킴으로써 선형화된다. 이어서 DNA를 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트 시킨다. 올리고뉴클레오타이드 5' TGCAGGCGAGCCTGAA TTCCTCGA 3'를 DNA내로 연결시키고, 5' 말단에서 PstI 부분을 다시 만들고 DHFR cDNA의 ATG 앞에 EcoRI 부분 및 XhoI 부분을 첨가한다. 이 플라스미드를 pMT21이라 한다. pMT21을 두개의 인접한 클로닝 부위에서 플라스미드를 절단하는 XhoI 및 EcoR I으로 절단한다. 508개 염기쌍의 EMCV 단편을 제한 효소 Ecol 및 TaqαI를 사용하여 pMT₂ECAT1 [S. K. Jong 등, J. Virol., 63 : 1651∼1660(1989)] 로부터 절단한다. 68개 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드 한쌍을 합성하여 EMCV 서열을 ATG까지 복제한다. ATG를 ATT로 교환하고 C를 첨가하여, 3' 말단에서 XhoI 부분을 만든다. TaqαI 부분은 5' 말단에 위치하고 있다. 올리고뉴클레오타이드 서열은 5'CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAA AAACACGATTGC3' 및 그의 상보적 서열이다.

pMT21 EcoRI-내지-XhoI 단편을 EMCV EcoRI -내지-TaqαI 단편 및 TaqαI/XhoI 올리고뉴클레오타이드로 연결시키면 벡터 pEMC2B1이 제조된다. 이 벡터는 포유동물 세포내에서목적 cDNA를 높은 수준으로 발현시킬 수 있는 적절한 관계로, 복제 및 인핸서의 SV 40 오리진, 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터, 아데노바이러스 삼분절계 리더 서열의 cDNA 카피, 소 잡종세포 개재 서열, SV 40 폴리아데닐화 시그날, 아데노바이러스 VA I 유전자, DHFR 및 β-락탐에이즈 마커 및 EMC 서열을 함유한다. EMC2B1 벡터를 엔도뉴클레아제 효소 EcdRI 로 선형화 한 다음 EcoRI 상보적 말단을 발생시키는 합성 올리고뉴클레오타이드를 첨가함으로써 미리 변성된 meg-CSF 를 코딩하는 cDNA내에 개별적으로 동몰량으로 연결시켜 발현을 위한 구조물을 제조한다.

meg-CSF를 함유하는 목적으로 벡터를 통상적인 유전 공학 기술에 의해서 적당한 숙주 세포내로 도입한다. 형질전환된 세포를 배양하고 발현된 meg-CSF를 표준 기술을 사용하여 배양 배지로부터 회수하고 정제한다.

[A. 포유류 세포 발현]

포유류 숙주세포내에서 meg-CSF 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여, meg-CSF DNA 서열을 함유하는 pXM 벡터를 COS 세포상으로 감염시킨다. 감연된 COS 세포로부터 콘디셔닝된 배지는 쥐의 검정에서 측정시 meg-CSF 생물학적 활성을 함유한다. 유사하게 meg-CSF 에 대한 cDNA를 함유하는 pEMC2B1 구조물을 CHO 세포내로 감염시킨다.

여기에 기술된 포유류 세포 발현 벡터는 당분야 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 당분야 숙련자는 또한 예를 들변 적절한 효소와 함께 플라스미드로부터의 meg-CSF의 DNA 서열을 삽입하고 공지된 재조합 유전자 공학 기술 및 다른 공지된 벡터, 예컨대 pJL 3 및 pJL 4 [Gough 등, EMBO J., 4 : 645∼653(1985)] 및 pT2(pMT2-VWF로 출발, ATCC #67122; 참조 PCT 출원 PCT/US 87/00033)를 사용함으로써 pXM 벡터에 상응하는 다른 포유류 발현 벡터를 만들 수 있다.

COS 세포 이외의 포유류 숙주세포도 meg-CSF 발현에 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 바람직하게는 통상적인 방법에 의한 벡터 DNA의 안정한 인테그레이션 및 그 후의 증식을 위해서는 CHO 세포가 가장 바람직하게 포유동물 숙주세포로서 사용될 수 있다.

벡터 및 숙주세포가 선택되고 형질전환되면, 안정한 형질전환체를 표준 면역학적, 생물학적 또는 효소 분석, 예컨대 하기 실시예8에 기술된 방법에 의하여 생성물의 발현을 스크린한다. MEG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 m-RNA의 존재는 써던(Southern) 및 노던(Northern) 블로팅(blotting)과 같은 표준방법에 의해 검출 할 수 있다. 적절한 숙주세포내로 발현 벡터 DNA를 도입한 후 수일 동안 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA의 일시적인 발현을, 선택 없이 배양 배지내의 단백질의 활성 또는 면역학적 검정, 예를 들면 쥐의 피브린 혈병 검정에 의해 측정한다.

[B. 세균류 발현 시스템]

유사하게, 당분야 숙련인은 코딩서열에 접하고 있는 임의의 사람의 조절 서열을 제거하고 세균의 조절 서열을 삽입함으로써 meg-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 조작하여 세균 세포에 의한 본 발명의 meg-CSF 폴리펩타이드의 세포내 또는 세포의 발현을 위한 세균 벡터를 만들 수 있다. 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA는 당분야에 공지된 바와 같이 다른 코돈을 함유하도록 더 변성되어 세균 발현을 최적으로 한다. 바람직하게 숙성 meg-CSF를 코딩하는 서열은 또한 당분야 공지 기술에 의하여 세균 발현, 숙성 meg-CSF 폴리펩타이드의 분비 및 가공을 허용하는 분비 리더 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 효과적으로 연결된다. 상기 분비 시스템을 사용하는 이. 콜리(E. Coli)내에서의 meg-CSF 발현으로 활성 폴리펩타이드를 분리할 것이 기대된다. 이러한 접근은 활성 키메릭(chimeric) 항체 단편을 산출한다 [참조, 예를 들면, Bitter 등 Science, 240 : 1041 ∼1043(1983)]. 대안적으로, meg-CSF는 이. 콜리 내에서 세포질 단밸질로서 발현될 수도 있다. 이 경우에 있어서, 분자는 대부분 구아니딘 히드로클로라이드를 사용한 완전한 변성 후에 재생될 것이며, 방법은 당분야에 공지되어 있다. 세포내에서 발현된 단백질의 분리 및 재생에 대하여는, 예를 들면 미합중국 특허 제4,512,922호를 참조한다. 세균 숙주 세포내에서 어느 하나의 경로를 통하여 발현된 화합물을 공지방법에 따라서 회수하고 정제하며 및/또는 물리화학적, 생화학적 및/ 또는 임상적 변수로 특징 지어진다.

[C. 곤충 또는 효모류 세포 발현]

곤충 세포내에서의 meg-CSF 폴리펩타이드의 발현을 위한 곤충 벡터를 만들기 위해 유사한 조작을 실행 할 수 있다 [참조, 공고된 유럽 특허 출원 제155,476호에 기술된 방법].

유사하게 전구체를 코딩하는 cDNA를 발현하는 효모 조절 서열을 사용하여 효모세포내에 효모 벡터를 만들어서, 분비된 세포외 활성 meg-CSF를 수득한다. 대안적으로 폴리펩타이드는 효모내에서 세포내 발현될 수 있으며, 폴리펩타이드를 단리하고 재생하여 활성 meg-CSF를 생산 할 수 있다 [참조, PCT 출원 제WO 86/00639호 및 유럽 특허 출원 제EP 123,289호에 기재되어 있는 방법]

[실시예 7-meg-CSF를 고 발현시키는 CHO 세포주의 제조]

포유류 세포주로부터 본 발명의 meg-CSF 단백질을 고도로 제조하기 위한 방법은 meg-CSF를 코딩하는 cDNA의 다중 카피를 함유하는 세포를 구성하는 것을 포함한다.

cDNA는 문헌(상기 Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol., (1982))의 방법에 따라서 증식가능한 마커, 예를 들면 그의 세포가 증가된 농도의 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 DHFR 유전자와 동시에 감염된다. 이러한 접근은 다수의 다른 세포 형태에 사용될 수 있다. 대안적으로, meg-CSF cDNA 및 약품 내성 선택 유전자(예를 들면, DHFR)는 동일한 벡터내로 도입될 수 있다. 이 접근에 바람직한 벡터는 pEMC2B1이다.

예를 들면, meg-CSF 유전자의 발현을 가능하게 하는 다른 플라스미드 서열과 연결되어 작용하는 emg-CSF 유전자를 함유하는 pXM 벡터를 pAd D26SVpA3 [Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 689∼693(1985)]과 같은 DHFR 발현 프라스미드와 함께 칼슘 포스페이트 공침전 및 감염에 의해 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII내로 도입한다.

대안적으로, meg-CSF 유전자의 발현을 가능하게 하는 다른 플라스미드 서열과 연결되어 작용하는 meg-CSF 유전자를 함유하는 pEMC2B1 벡터를 원형질 융합 및 감염에 의해 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII 내로 도입한다. meg-CSF 유전자 및 DHFR 마커 유전자는 모두 meg-CSF가 PEMC2B1내로 도입될 때 효율적으로 발현된다. meg-CSF 유전자는 전술한 바와 같이 pMT2 내로 도입될 수 있으며 생성된 벡터는 pXM/meg-CSF 및 pAdA26SV(A)3 대신에 사용된다.

DHFR 발현 형질전환체는 투석된 태아 소 혈청과 함께 알파 배지내에서의 성장을 위해 선택된다. 생물학적 정량, 면역분석 또는 RNA 블로팅에 의해 meg-CSF의 발현을 위한 형질전환체를 조사하고 이어서 포지티브 풀은 문헌 [Kaufman 등, Mol. Cell Biol., 5 : 1750(1983)]에 기술되어 있는 바와 같이 MTX 농도의 증가(0.02, 0.2, 1.0 및 5 uM MTV의 연속단계)시의 성장에 의한 증식을 위해 선택한다. 증식된 라인을 클로닝하고, meg-CSF 단백질 발현을 피브린 혈병 검정에 의해 모니터한다. meg-CSF의 발현은 MTV 내성 수준의 증가와 함께 증가할 것으로 기대된다.

상기 임의의 발현 시스템에 있어서, 생성된 세포주는 적절한 약품 선택에 의해 더 증식될 수 있으므로 세포주를 재클론하고 상기 쥐의 피브린 혈병 검정을 사용하여 발현 수준을 평가한다.

meg-CSF 발현 세포주는 혈청이 없는 배지내에서의 성장에 적합할 수 있다. 동종의 meg-CSF는 당분야 통상적인 기술, 예를 들면 렉틴-친화성 크로마토그래피, 역상 HPLC, EPLC 등을 사용하여 콘디셔닝 배지의 세포주로부터 단리될 수 있다.

[실시예 8-사람의 meg-CSF의 생물학적 활성]

하기 검정을 실시예1에 기재된 정제된 meg-CSF를 사용하여 수행한다. 분자의 재조합 변형으로 이들 동일한 검정 또는 다른 검정에서 meg-CSF 생물학적 특성이 나타날 것으로 기대된다.

[A. 쥐의 피브린 혈벙 검정]

실시예 1의 정제 절차 단계 7로부터 수득한 meg-CSF를 대체로 문헌 [S. Kuriya 등, Exp. Hematol., 15 : 896∼901(1987)]에 기재되어 있는 바와 같이 실행되는 거핵구 콜로니 형성 검정에서의 활성에 대해 시험한다. 96-웰 플레이트에 2.5×10⁵개의 쥐 골수 세포를 함유하는 피브린 혈병이 형성된다. 희석 샘플을 혈병 주위에 적층하고 6일간 배양한다. 그 후에, 세포를 고정하고 거핵구를 쥐의 거핵구에 대한 특정 마커인 아세틸콜린스테라제에 대해 염색한다. 콜로니는 단위 면적당 세개 이상의 거핵구로 정의된다. 두가지 유형의 거핵구 콜로니 : 추가의 세포형태를 함유하지 않는 순수한 콜로니 및 추가의 비-거핵구 세포 형태를 함유하는 혼합 거핵구 콜로니가 흔히 관찰된다.

하기 대조용 샘플은 모든 검정에 포함된다. 포지티브 대조용은 WEHI 콘디셔닝 배지(쥐의 IL-3)이며, 이는 혈병당 7-25(평균 12)개의 거핵구 콜로니, 대략 50%의 순수 및 50%의 혼합 거핵구 콜로니를 제조한다. 다른 포지티브 대조용은 치사하도록 조사된 개로부터 혈소판 수의 최하점에서 취한 혈청 [참조, Mazur 등, Exp. Hematol., 13 : 1164∼1172]이며, 이는 혈병당 6∼22(평균 15)개의 거핵구 콜로니를 제조하며, 그의 70%는 순수한 것이고 30%는 혼합 거핵구 콜로니이다. 네가티브 대조용은 이스코브스(Iscoves) 배지이며, 이는 혈병당 2∼4개의 거핵구 콜로니를 제조한다.

검정에 있어서, meg-CSF는 대략 5×10⁷희석단위/단백질 mg 이상의 비활성을 갖는다. 활성의 단위는 실시예3에서 정의한 바와 같다.

실시예1의 정제에 있어서 S-도요펄 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로부터 용출된 골수 이식환자 뇨로부터 수득된 주요 meg-CSF를 이 검정만으로, 또는 다른 세포질분열과 함께 검정한다. 피브린 혈병 검정에 있어서, 이것은 50∼70%의 순수 거핵구 콜로니로 6∼16(평균 13)개의 거핵구 콜로니를 제조한다.

각각의 검정에 있어서 2회 및 3회 희석으로 시험한다.

[B. 사람의 혈장 혈병 meg-CSF 검정]

본 발명의 meg-CSF도 또한 사람의 활성에 대한 검정, 문헌 [E. Mazur 등, Blood, 57 : 277∼286(1981)]에 기재되어 있는 변형된 혈정 혈병 meg-CSF 검정으로 시험한다. 비-부착 말초 혈액 세포를 류코팩(Leukopac)으로부터 단리하고 부분 표본내에서 동결시킨다. 시험 샘플을 혈소판-부족 인간의 AB 혈장 및 24-웰 플레이트내의 1.25×10⁵세포와 혼합하고 칼슘을 첨가하여 혈병을 형성시킨다. 12일간 배양 후에, 거핵구를 혈소판 글리코프로테인 IIb/IIIa에 대한 단클론성 항체 및 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제/항-퍼옥시다제 크로모겐 검출 시스템을 사용하여 확인한다. 대략 60%의 순수 및 40%의 혼합 거핵구 콜로니로 혈병당 12∼30개의 거핵구 콜로니를 제조하는 제조합 인간 IL-3 [Genetics Institute, Inc.] 를 포지티브 대조용으로 사용한다. 쥐의 검정에 있어서, 개의 탈점성 혈청을 또한 포지티브 대조용으로 사용하는데 이는 혈병당 5∼10개의 거핵구 콜로니를 제조하며, 그의 대략 50%는 10개 이하의 세포에 함유된 순수한 거핵구 콜로니이며, 50%는 40개 이상의 거핵구를 함유하는 혼합 거핵구 콜로니이다. 네가티브 대조용은 알파 배지이며, 이는 혈병당 0∼1개의 거핵구 콜로니를 제조한다.

상기 정제의 단계8의 meg-CSF 생성물은 본 검정에서 활성이다.

[C. 쥐의 meg-CSF 검정]

정제 7 단계의 meg-CSF를 문헌 [P. J. Quensenbery 등, Blood, 65(1) : 214∼217(1985)]에 따라서 검정한다. 검정에서, meg-CSF는 콜로니당 평균 4∼15개의 세포를 함유하는 아세틸 콜린에스터라제 포지티브 거핵구 콜로니의 형성을 촉진한다. 거핵구의 크기는 작은 비성숙 세포로부터 형태학적으로 큰 성숙 세포까지 변화가능하다.

[D. 기타 검정]

쥐의 골수 세포를 사용하는 수개의 다른 거핵구 검정이 사용되며, 문헌 [Ishibashi 등, Blood, 69 : 1737∼1741(1987)] 의 액체 아세틸콜린 에스터라제 유도 검정 및 문헌 [Vanucchi 등, exp. Hematol., 16 : 916∼921(1988)] 의 액체 세로토닌 흡수 검정을 포함한다.

단편은 또한 일반적으로 수개 요인 dml존 세포주 내에서 검정하여 단독으로 또는 함께 병합하여 콜로니 형성을 촉진하는 성장 요인의 존재를 스크린 한다. 사용된 세포주는 인간의 적백혈병 세포계 TF-1, 쥐의 I1-6-의존 세포주 T1165 및 쥐의 IL-3-의존 세포주 DA-1a이다.

상기 기재는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 자세히 나타낸 것이다. 본 발명을 실시할 때의 다양한 변형 및 변화가 당분야 숙련자에게 일어날 것으로 기대된다. 상기 변형 및 변화는 하기 특허청구범위내에 포함한다.

Claims

표 6의 아미노산 #1~아미노산 #182의 아미노산과 동일한 서열 또는 그의 생물학적 활성 단편을 함유하는 단백질.
제1항에 있어서, (a) 표1에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (b) 표5에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (c) 표6에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (d) 서열 (a)∼(c)의 단편, (e) (a)∼(d)의 어느 것과도 하이브리다이징 할 수 있는 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질.
제1항에 있어서, 제1도의 제한 지도에 의해 특징 지어지는 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질.
제1항에 있어서, ATCC 40857 에 함유된 게놈 KpnI-SnaBI DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질.
제1항에 있어서, ATCC 40856 에 함유된 게놈 DNA 서열 18-5665에 의해 코딩되는 단백질.
제1항에 있어서, 중간 및 큰 크기의 거핵구 세포로 구성되어 있는 콜로니의 성장 및 발달을 자극할 수 있는 단백질.
제1항에 있어서, 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 검정에서의 생물학적 비활성에 약 5×10⁷희석단위/mg 단백질 이상인 단백질.
제1항에 있어서, 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 검정에서의 생물학적 비활성이 2×10⁸희석단위/mg인 단백질.
제1항에 있어서, 하나 이상의 하기의 특성을 갖는 단백질 : (1)비환원 조건하의 12% 수듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔 전기 영동 및 쥐의 피브린 혈병 거핵구 콜로니 형성 생물학적 검정에 의해 측정된 약 28∼38kd의 겉보기 분자량; (2)환원 조건하의 12% 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 결정된 약 20∼27kd의 겉보기 분자량; (3)pH 4.5의 산성 조건하에서 SP-Zeta Prep에 결합할 수 있는 능력; (4)맥아-세파로오스 및 콘카나발린-A 세파로오스에 결합할 수 있는 능력; (5)트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴 용매계를 사용한 역상 HPLC(C4) 컬럼 상에서 23∼33% 아세토니트릴에 용리되는 능력; (6)피리딘, 아세트산 및 n-프로판올 용매계를 사용한 역상 HPLC(C18)컬럼 상에서 6∼15% n-프로판올에 용리되는 능력; (7)아세토니트릴 및 헵타플루오로부티르산 용매계를 사용한 역상 HPLC(C4) 컬럼 상에서 27∼37% 아세토니트릴에 용리되는 능력,
제1항에 있어서, 사람의 골수 이식 환자의 뇨에 하기와 같은 단계로 구성되는 정제 단계를 행하여 생산되는 단백질 : (a) 뇨를 농축하고; (b) 생성된 체류액에 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행하고; (c) (b)단계로부터의 유출액에 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행하고; (d) 렉틴 친화성 컬럼 크로마토그래피를 통해 (c)단계로부터의 물질을 용리시키고; (e) (d)단계로부터의 용출액에 양이온 교환 우수 성능 액체 크로마토그래피를 행하고; (f) 2 부의 TFA를 사용하여 (e)단계로부터의 용출액을 희석하고 이를 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산 용매에서 역상 고압 액체 크로마토그래피를 행하며; (g) 2부의 피리딘 및 아세트산을 사용하여 (f)단계로부터의 용출액을 희석하고 이를 n-프로판올, 피리딘 및 아세트산 용매계에서 제2역상 고압 액체 크로마토그래피를 행하고; (h) 헵토플루오로부티르산 및 아세토니트릴 용매계에서 임의적으로 (g)단계로부터의 용출액에 제3역상 고압 액체 크로마토그래피를 행한다.
제1항에 있어서, 발현 조절 서열과 연관하여 작용하는 meg-CSF 발현을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 세포주를 배양함으로써 생산되는 단백질.
제1항에 있어서, DNA 서열이 : (a) 표1에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (b) 표5에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (c) 표6에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (d) 서열 (a)∼(c)의 단편, (e) (a)∼(d)의 어느 것과도 하이브리다이징할 수 있는 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질.
발현 조절 서열과 연관되어 작용하는 meg-CSF 발현을 코딩하는 cDNA 서열로 형질 전환된 세포주를 배양함을 특징으로 하는 meg-CSF의 제조방법.
(a) 표1에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (2)표5에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (c) 표6에 나타낸 바와 동일한 DNA 서열, (d) 서열 (a)∼(c)의 단편, (e) (a)∼(d)의 어느 것과도 하이브리다이징 할 수 있는 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 meg-CSF를 코딩하는 DNA 서열.
발현 조절 서열과 연관하여 작용하는 제14항의 DNA 서열로 형질전환된 세포.
제15항에 있어서, 포유류 또는 세균류 세포를 함유하는 세포.
(a) 표1의 뉴클레오타이드 #1∼#7505를 함유하는 DNA 서열, 그의 단편 또는 이와 유사한 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, (b) 배양 배지로부터 표6에 나타낸 아미노산 #1∼#182, 그의 단편 또는 이와 유사한 서열을 함유하며 거핵구 세포의 성장 및 발달을 자극할 수 있는 단밸질을 회수, 분리 및 정제하는 단계로 생산되는 거핵구 형성 단백질.