JPH0259599A - 改良エリスロポイエチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、エリスロポイエチン型活性を有する新規物
質に関するものである。特にこの発明は、組換え体ＤＮ
Ａ技術を使用したエリスロポイエチン型物質の製造、お
よび貧血状態の処置のためのこれらの物質の治療用途に
関するものである。

［従来の技術］ エリスロポイエチン（以降ここではＥＰＯと称する）が
、血液中に循環する赤血球の総数を、体の組織に対して
最適な酸素の放出に必要なレベルに保持する糖蛋白ホル
モンであることはよく知られている。従ってこのホルモ
ンは、低いかまたはその他の欠点のある赤面法細胞産生
によって特徴づけられた血液疾病の診断および処置のた
めに重要である。例えば、ＥＰＯは種々の形態の貧血、
特に疾患組織がＥＰＯの産生を推持できない慢性腎不全
を有効に処置し得ることが示されている。

口発明の記載］ ＥＰＯは＋６５のアミノ酸配列として現されることで特
徴づけられ、知られている。ＥＰＯのアミノ酸配列はジ
ェネティック・インスティテユートのＰＣＴ公報ＷＯ３
６１０３５２０号で、第２表の実施例として明らかにさ
れている。また、ヤコブスら著、ネイチ＋　　（ＮａＬ
ｕｒｅ）３１３巻、第６００５号、８０６〜８１０頁（
１９８５年）参照。

組換え体Ｄ　Ｎ　Ａ技術を使用したＥ　Ｉ）　Ｏの製造
は、ヤコブスら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１３
巻、第６００５号、８０６〜８１０頁（１９８５年）、
ジェネティック・インスティテユートのＰＣＴ公報ＷＯ
８６１０３５２０号（その記載をここに引用して本明細
書に包含させる）およびキリンーアムゲンのＰＣＴ公報
ＷＯ３５１０２６１０号に記載されている。ひとＥＰＯ
遺伝子のクローニングおよびＥＰＯのｃＤＮＡクローニ
ングの発現は、生物学的に有効なＥＰＯの主要な産生源
を提供する。

この発明の改良ＥＰＯ組成物は、天然型Ｅ　Ｉ）　０に
おけろと同様に、同様の位置で、少なくと６１６２の同
一アミノ酸を存するアミノ酸配列によって特徴づけられ
ている。この発明の１つの組成物は、５４位にあるメチ
オニン残基を、異なった天然アミノ酸と置き換えた、天
然型ＥＰＯと実質的に同様のアミノ酸配列から成る。ｉ
！Ｔ−ましい実施態様として、前述の位置５４はメチオ
ニンの代わりにロイシンを含有する。別の好ましい実血
態ｆ、’９として、イソロイシン、バリン、またはアラ
ニンを含む脂肪族炭化水素基を有Ｖる他の天然アミノ酸
でメチオニンを置き換え得る。

この発明の別の好ましい実施態様は、３８位にあるアス
パラギン残基が、異なった天然アミノ酸と置き代わった
、天然型ＥＰＯと実質的に同様なアミノ酸配列によって
↑ν徴づけられｆこＥ　Ｐ　Ｏ組成物から成る。好まし
い実施態様として、＋ｉｉｒ述の３８位はアスパラギン
の代わりにクルクミンを含ａセる。好ましい実施態様と
して、アスパラギンは、セリン、スレオニン、およびチ
ロシンのような非荷電極性基を有する他の天然アミノ酸
と置き代え得る。

別の実施態様として、ＥＰＯ組成物は、５４位でのメチ
オニンの置換に加えて、アスパラギン残ＪＫ３８での置
換も包含するアミノ酸配列によりさらに特徴づけられる
。好ましい実施態様として、５４位はロイシンを含有し
、３８位はグルタミンを含有する。この発明はこの蛋白
をコード化ずろ１）　Ｎ　Ａおよび治療用組成物・１ｆ
２びにそれらの投与方法ら含む。

現在、Ｎ結合またはアスパラギン結合グリコル−ノヨン
認識部位は、適当な細胞ブリコンレーンラン酵素によっ
て特異的に認識されるトリペプチド配列から成ると考え
られている１、これらのトリペブヂド配列は、一般にＸ
が任ぎのアミノ酸である、アスパラギン−Ｘ−スレオニ
ンよｆこはアスパラギン−Ｘ−セリンのい４嘗１かであ
る。、：３つのグリコンレーアジン認識即位の内１っ丈
たはそれ以」二での種々のアミノ酸置換、挿入または消
去が、修飾ペプチド配列での非グリコンレー゛ンヨンを
もたらす。従って、ひとＥ　Ｉ）　Ｏのアミノ酸配列の
Ａｓｎ−３８を別のアミノ酸に１置き換えろことは、Ａ
ｓｎ−３８部位にグリコシレージョンを生じない結果を
もたらす。例えば、Ａｓｎ−３８をグルタミンに置き換
えることにより、３つのＮ結合炭水化物部分を有する天
然型ＥＰＯまたは組換えによって生成されたＥＰＯと異
なって、生じろ糖蛋白は、２つのＮ結合炭水化物部分を
含有する。

この発明のＥＰＯ組成物は、驚くべきことに天然型ＥＰ
Ｏの望ましい生物学的活性を残存させている。さらに、
この発明によって製造されたＥＰＯ物質は、天然のひと
ＥＰＯの正確なアミノ酸配列を有するＥＰＯ物質に比較
して改良された性質を有すると考えられる。この組成物
は天然型ＥＰＯに比べて安定性か増加していると考えら
れる。

他の変化では発現物の亀の減少があったか、そのような
減少はみられない。この組成物は、天然型Ｅ　Ｐ　Ｏに
比べてインビホにおける生物学的活性か改良されている
と考えられる。ＥＰＯは変化に対して極めて敏感である
ことが千１［１］されるので、これらおよび他の望まし
い特性は特に驚くべきことである。例えば、ＥＰＯのア
ミノ酸配列は、進化の間高度に保存されることが示され
ている。シューメイカーおよびミゾツクは、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（ＭＯｌ、　Ｃｅ
１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）６巻、８４９〜８５８頁（１９８
６年）で、マウス由来のアミノ酸配列と比較した場合、
ひと由来の成熟ＥＰＯか８０％保存されることを発見し
た。アスパラギンおよびメチオニン残基は、２種の間で
１００％保存された２０個のアミノ酸の広がりの範囲内
にある。したがって、ＥＰＯ分子は、微亀のアミノ酸変
化にさえ感受性があることが予期される。特に、その１
００％保存域に位置を付与されたアスパラギンまたはメ
チオニンでの変化は、分子およびその活性に有害に作用
することが予期される。硫黄を含有するシスティンから
セリンへの変換が顕著にＥＰＯの分泌の減少および特異
的活性の減少を起こすことも判明している。

しかしながら、この発明のＥＰＯ組成物は天然型ひとＥ
ＰＯの反応性を保持している。

この発明のＥＰＯ組我物は、より徹底的に修飾しｒ、類
似体に比較してなんら有害な免疫原性特性を行さないこ
とら予期される。このことは、貧血の処置におけるＥＰ
Ｏの長期投与を仮定すると、極めて望ましい乙のである
。

さらに、硫黄を含有するメチオニンのロイシンによる置
換は、酸化にあまり影響されやすくないＥＰＯ物質を呈
することが予期される。これらの酸化条件は、治療剤と
して投与するまでの組換え体蛋白の精製、製剤化または
保存の間に起こり得る。従って、酸化に対する感受性の
削減は、まったく重要であり、強く望まれる。この発明
のＥＰＯ物質は、天然に発生するひとＥＰＯの望ましい
生物学的および免疫学的特性を犠牲にすることなく酸化
による影響されやすさを少なくした乙のでｊ５る。

異なったアミノ酸によるメチオニン−５４の置換は、ノ
ルロイノンの誤った組込みを最小限に−するという別の
トリ点を生じる。ノルロイノンは、通常メチオニンが占
める位置で蛋白に組込まれることが知られている、合成
アミノ酸類似化合物である。またノルロイノンは、集積
し、その結果メチオニン位置に誤まって組込まれる可能
性を有し得る細胞代謝産物として産生されろことか推定
される。

アスパラギン−３８の置換は、炭水化物部分の１つを排
除し、それによって炭水化物の総量の減少によるＥＰＯ
生成物の品質制御特性を単純化する。さらに、炭水化物
の付加部位の少なさおよび付随する炭水化物の不均質性
の結果として、生成物は不均質さが減少する。

この発明のＥＰＯ蛋白物質は、これらの蛋白をコード化
するＤＮＡ配列を用いて形質転換された咄乳類細胞を培
養することによって製造される。

ＤＮＡ類は、ひとＥＰＯをコード化するＤＮＡの部位特
異的変異生成により製造される。上記で述へたように、
ひとＥＰＯをコード化するＤＮＡ配列は当業界で公知で
あり、クローン化され確認されている。常套の部位指向
変異生成によって、ひとＥＰＯアミノ酸配列配列中５４
位るメチオニン残基のコドンを変えて、ロイシン・コド
ンを作り出ず。変異生成の上記方法は、当業界でよく知
られており、例えば単鎖ＤＮＡを使用するシラーおよび
スミスのＭＩ　３系［ヌクレイツク・アシツズ・リザー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）１
０巻、６４８７〜６５００頁（１９８２年）、メソッズ
・エンザイマット（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍａｔ
）１００巻、４６８〜５００頁（１９８３年）およびデ
ィーエヌエイ（ＤＮＡ）３巻、４７９〜４８８頁（１９
８４年）］および異種二重螺旋ＤＮＡを使用するモリナ
ガ等のバイオ／テクノロジー（Ｂ　ｉｏ／　ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）６３６〜６３９頁（１９８４年７月）の方
法を包含する。置き換えられたコード化ＤＮＡは、選択
された宿主系中で常套手段によって発現され、目的とす
るＥＰＯを発現し、これはその後に回収されて精製され
る。

この発明による発現ベクターは当業界で熟知された技術
としてよく知られている技術によって合成Ｌ　？ｌる。

細菌レプリコン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロモー
ターなどのようなベクターの成分は、自然源から人手し
得るか、または公知方法によって合成され得る。カウフ
マンら晋、ンヤーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（ＪＭｏｌ、　Ｂ　ｉｏｌ、　）　Ｉ　５９巻、５
１〜５２１頁（１９８２年）、カウフマン著、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　）８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年）参照。

形質転換セルラインを含む樹立セルラインは宿主として
適している。正常の二倍体細胞、−次組縁のインビトロ
培養から得られた細胞株および一次外植片（造血幹細胞
のような比較的未分化細胞を含む）も適している。候補
となる細胞は、選択遺伝子が優位に作用するならば選択
遺伝子で遺伝子型的に不完全であることは必要でない。

樹立咄乳類セルラインは一般に好ましい宿主細胞である
。

特に、現在、ＣＨＯ（中国ハムスターの卵巣）細胞が、
染色体ＤＮＡへのベクターＤ　Ｎ　Ａの安定した組込み
のために、および続く組込ベクターＤ　Ｎ　Ａの増幅の
ために（いずれら常套の方法による）推奨される。別法
として、ベクターＤＮＡは、全てのまたは一部のうし乳
頭腫ウィルスゲノム［ルスキーら著、セル（Ｃｅｌｌ）
、３６巻、３９１〜４０１頁（１９８４年）］を含み、
Ｃｌ２７マウス細胞のようなセルライン中に安定な遺伝
子副体（エピゾーム）要素として導入され得ろ。他の有
用な哺乳類セルラインはＥ−１ｅＬａＳＣＯＳ−１モン
キー細胞、マウスＩ、　−９２９細胞、スイスから得ら
れた３Ｔ３ライン、Ｂａ１ｂ−ｃまたはＮ　Ｉ　Ｈマウ
ス、Ｂ　ＨＫまたは）−（ａＫハムスター・セルライン
などを包含するが、それらに限定されるものではない。

その後、標準免疫学的または酵素分析によって生成物の
発現について形質転換体をスクリーンする。変異体蛋白
をコード化するＤＮＡの存在は、ザウザン・プロッティ
ングのような標準法によって検出され得る。ＣＯ５−１
モンキー細胞のような適当な宿主細胞に発現ベクターＤ
ＮＡを導入した後、変異体をコード化ずろＤ　Ｎ　Ａの
数日間にわたる短期発現が培養培地中の蛋白の活性また
は免疫学的分析によって選択することなしに測定される
。

その後、宿主細胞で発現した化合物類は、全て公知方法
によって、採取され、精製され、および／または物理化
学的、生化学的および／または医療的パラメーターにつ
いて確認され得る。この発明のＥＰＯ物質は、ひとＥＰ
Ｏに対する抗体を使用するイムノアフィニティークロマ
トグラフィーによって採取および／または精製し得る。

適当なベクター類、宿主細胞類および技術の詳細な記載
に関してはジェネッテソク・インスティテユートのＩ）
　ＣＴ公報ＷＯ３６１０３５２０を引用する。

［実施例コ この発明は、以下に示す限定をしない実施例からさらに
理解されるが、実施例は限定をき図するものではない。

実施例１ シラーおよびスミス（上記文献）の方法（従って詳細な
方法の詳説はここで操り返さない。）に従って、ひとＥ
ＰＯをコード化するＤＮＡの常会の部位指向変異生成を
使用して、ロイシンでメチオニン−５４を置換すること
により、この発明のＥＰＯ組成物をコード化するｃＤＮ
Ａの製造を行った。

ひとＥＰＯをコード化するｃＤＮＡをＭ１３ベクターに
挿入した。メチオニン・コドンをロイシン・コドンに変
換するために以下のオリゴヌクレオチド： ５°ＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＧ３′を
使用してＭｅｔ−５４での変異生成を行った。当業者は
熟知しているように、オリゴヌクレオチド中の、目的と
する交替アミノ酸のコドンを置換することによって、目
的部位のアミノ酸を異なったアミノ酸に置き換えるのに
使用するために、上記オリゴヌクレオチドを直ぐに作成
し得た。その後、Ｍ１３ベクターを使用して、エシェリ
ヒア・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　Ｉ　０１細胞
を形質転換させた。以下に示す変異生成オリゴヌクレオ
チド。

５°ＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＧ３ をシラーおよびスミスの方法によるプローブとして使用
するフィルター・ノ＼イブリダイゼインヨンによって変
異体についてプラークをスクリーンしｊ二、。

変異ｃＤＮＡをＭｌ　３ベクターから摘出し、ロックヒ
ル、メリーランドにあるアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　ＴｙｐｅＣｕ
ｌｔｕｒｅ　　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、受託
番号ＡＴＣＣ３９９４０として人手可能な発現ベクター
ｐＲＫｌ−４に結さつした。

実施例２ シラーおよびスミスの方法（上述文献）によってひとＥ
ＰＯをコード化するＤＮＡの常套の部位指向変異を使用
してロイシンでアスパラギン−３８を置換した。ＭＩ３
ベクターにひとＥＰＯをコード化するｃＤＮＡを挿入し
、その後アスパラギン−３８コドンをグルタミン・コド
ン に変換するために以下のオリゴヌクレオチド５°ＧＣＴ
ＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣ３“ を使用して、ＡＳＰ−３８での変異生成を行った。

当業考は熟知しているように、オリゴヌクレオチド中の
目的とする交替アミノ酸のコ下ンを置換することによっ
て目的部位のアミノ酸を冑なったアミノ酸に置き換える
のに用いる上記オリゴヌクレオチドを作成し得た。その
後、ＭＩ３ベクターをｌして、エシェリヒア・コリ（Ｅ
　、　ｃｏｌ　ｉ）　Ｊ　Ｍ１０１細胞を形質転換させ
た。以下に示す変異生成オリゴヌクレオチド： ５°ＴＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＣ３’ をシラーおよびスミスの方法によるプローブとして使用
するフィルター・ハイブリタイゼイノヨンによって変異
体についてプラークをスクリーンしノこ。

＆％　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　’ｉ：　Ｍ　Ｉ　３ベクターか
ら摘出し、発現ベクターｐｌλＫｉ、４に結さつした。

プラスミドｐＲＫＩ−，４〜ＩＡは、エノエリヒ７・：
ｌ：Ｉす（Ｅ、ｃｏｌｉ）・プラスミドｐＢＲ３２２の
テトラサイクリン耐性エレメントから得たベクターの領
域がアンピノリン耐性エレメントおよびＦ￥ｉ鎖ファー
ンＭ　ｌ　３のｉ夏製の起点ら含有するｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡと交換された以外はＲＫ１４と同しである。

実施例Ｉおよび２の発現ＥＰＯの特５ｖ的活性を測定し
、野性型ＥＰＯの特異的活性と比較した。

ソムベイラクおよびダナ著、プロシーディング・オブ・
ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニス
エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵ
ＳＡ）７８巻、７５７５〜７５７８頁に記載されている
ようなりＥＡＥ−デキストラン法によって、変異ｃＤＮ
Ａを含有する精製発現ベクターＤＮＡをＣ０９−１細胞
に形質導入した。２日後培地を交換し、ＥＰＯを含有す
る調整培地を２４時間後に採取した。野性型ＥＰＯのｃ
ＤＮＡを含有する精製発現ベクターＤＮＡを用いて２回
目の形質導入を行い、同じ方法によって試験した。クリ
スタル法［エックスベリメンタル・ヘマトロジー（Ｅｘ
ｐ、　Ｉ−１ｅｍｌ−１ｅ、）　ｌ　１巻、６４９ＥＩ
（１９８３年）］によって、ＥＰＯ組成物のインビトロ
での活性を分析した。この分析は、赤血球１７Ｉ駆体を
高めた弔離牌臓細胞集団内での増殖の刺激を測定する３
、拌臓中のエリスロイド前駆細胞の蓄積を生じる薬物起
因の貧血を形成ケるマウスに、注射によってフェニルヒ
ドラジンを投与した。牌臓を取り出し、エリスロイド前
駆体を高めた細胞集団を単離してから培養した。これら
の細胞はＥＰＯの添加による増殖に特に応答する。従っ
てこれらの細胞への３１］−チミジン組込みは、ＥＰＯ
存在下での培養によって基礎値より充分高く増加される
。ＥＰＯ標品を利用することで、直線用型／応答範囲が
確認される。３８組込みが標準曲線の直線応答の範囲内
であるように試料を希釈した場合、ＥＰＯに関して正確
に未知試料を分析し得る。

組換え体ＥＰＯ蛋白濃度の決定法としては、池の抗原に
ついて広く使用されている方法と同様な設計でＥＰＯに
関するラジオイムノアッセイを行った。そのアッセイは
、ＥＰＯに対して特異的である抗血清に結合することに
関して放射性標識ＥＰＯと競合する試料の能力を測定す
るしのである。

競合する能力は試料中のＥＰＯの壜に関連する。

この関係は、ＥＰＯの一定範囲で直線である。計算標準
を使用して、この直線の範囲を確認する。

その後、未知試料を希釈して、放射性標準ＥＰＯに対す
る競合が分析の直線範囲内にあるような程度にする。こ
の値に基づいて、ＥＰＯ蛋白濃度を計算し得る。

２つの別々のアッセイで測定した場合、Ｃ０８ｌ細胞に
よって生成された変異体（メチオニン５４をａイシンに
）ＥＰＯの特異的活性は、Ｃ０９−１細胞由来の野性型
ＥＰＯの活性が９３９ｕ／ｕｇおよび１１５５　ｕ／ｕ
ｇであるのに対して、８５３ｕ／ｕｇおよび９１４ｕ／
ｕｇてあった。

Ｃ０５Ｉ細胞によって生成された変異体（アスパラギン
３８をグルタミンに）ＥＰＯの特異的活性は、Ｃ０Ｓｉ
細胞由来の野性型ＥＰＯの活性が９３９ｕ／ｕｇおよび
ｌ　Ｉ　５５　ｕ／ｕｇであるのに対して、７７２ｕ／
ｕｇおよび１２３７　ｕ／ｕｇであった。

この発明は、慢性腎不全のような貧血症状の処置のため
の治療用組成物を包含する。この組成物は、医薬上許容
し得る担体、希釈剤、または補薬と共に混合した治療的
に有効ｍのこの発明のＥＰＯ蛋白から成る。組成物は、
ひとＥＰＯに関して報告されているのと同じ方法の製剤
、投与方法および用量で使用し得る。この発明は、何効
量のＥ１〕０物質を投与することから成る貧血症状の処
置方法ら包含する。実際の田虫および投与方法は、ＥＰ
Ｏの有効性および薬物動力学的性質により、および体重
、性別、食事、投与回数、反応感受性および各症例の重
さのような薬剤の反応を修飾する種々のファクターに応
じて、参加する医師によって決定される。

この発明のＥＰＯ物質の別の有用な利点が確認された。

例えば、ひとＥＰＯのアミノ酸配列中の唯一のメチオニ
ン残基を別のアミノ酸に置き換えることによって、生成
ＥＰＯ分子は、Ｃ末端メチオニンを切断することが知ら
れている臭化シアンに影響されなくなる。従って、この
発明のＥＰＯは、遺伝子操作によってＥＰＯ分子に隣接
するメチオニン含何融合配列を加えた融合生成物として
生成され得ろ。ＥＰＯ分子は、Ｅ　Ｉ）　０分子または
その活性を損なうことなく、臭化ノアンのａ在下で融合
配列から切断し得る。この特性は、特に研究および臨未
治療法の両方のためのＥＰＯの精製および単離について
数々の利点を有する。

この発明のＥＰＯ組成物は、貧血症状の有効処置のため
にＥＰＯの重要な供給源および研究１１１用上の重要な
供給源を特徴する 特許出願人　ジエネテイソクス・インスティテユート・
インコーホレイテッド

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然型ひとエリスロポイエチンの配列と実質的に
   同様で、５４位がメチオニン以外のアミノ酸であること
   によって特徴づけられたアミノ酸配列を有する貧血を処
   置するのに有用な蛋白。
2. （２）上記５４位アミノ酸がロイシンである、請求項１
   記載の蛋白。
3. （３）天然型ひとエリスロポイエチンの配列と実質的に
   同様で、３８位がアスパラギン以外のアミノ酸配列であ
   ることによって特徴づけられたアミノ酸配列を有する貧
   血を処置するのに有用な蛋白。
4. （４）上記３８位アミノ酸がグルタミンである、請求項
   ３記載の蛋白。
5. （５）請求項１または３の蛋白をコード化するｃＤＮＡ
   。
6. （６）ｃＤＮＡを発現し得る、請求項５記載のｃＤＮＡ
   を含有する宿主細胞。
7. （７）上記細胞が哺乳類である請求項６記載の宿主細胞
   。
8. （８）医薬上許容し得る担体といっしょに混合した、請
   求項１または３記載の有効量の蛋白を含有する貧血を処
   置するための治療用組成物。
9. （９）請求項８記載の有効量の組成物を投与することか
   ら成る、貧血症状の処置方法。
10. （１０）３８位がアスパラギン以外である天然アミノ酸
    によってさらに特徴づけられる請求項１記載の蛋白。
11. （１１）上記３８位アミノ酸がグルタミンである、請求
    項１０記載の蛋白。
12. （１２）上記５４位アミノ酸がロイシンであり、上記３
    ８位アミノ酸がグルタミンである、請求項１１記載の蛋
    白。