JPH06508148A - 肝細胞成長因子及びγ−インターフェロンによる肝細胞成長刺激 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 肝細胞成長因子及びγ−インターフェロンによる肝細胞成長刺激発明の分野 本発明は肝細胞再生における肝細胞成長因子（ＨＧＦ−）誘発刺激に関する。

より詳細には、本発明はこの刺激におけるＨＧＦ及びγ−インターフェロン（Ｉ ＦＮ−γ）の相乗的な相互作用に関する。

従来技術 肝障害は、劇症肝不全、肝炎、部分的肝切除、硬変、肝細胞移植、人工肝臓の移 植など、多くの急性及び慢性的な臨床症状に起こる。多くの場合、肝臓の再生は 患者の延命にとって大切である。

肝細胞は良好な再生能を有している。部分的肝切除術の後では肝臓のサイズは約 ６日以内に元の大きさに正確に復元するのが通常であることが知られている。

肝（肝細胞）の再生は自己分泌又は傍分泌起源の種々の成長刺激と成長阻害サイ トカインによって制御されていると考えられるが、これらの因子の正確な役割及 び作用機序は完全には理解されていない。

単離された肝細胞におけるインビトロＤＮＡ合成は、インスリン様成長因子−Ｉ 　（ＩＧＦ、）　、表皮性成長因子（ＥＧＦ）　、α型トランスフォーミング成 長因子（ＴＧＦ−（ＩＺ）などの成長因子によって刺激され、β型トランスフォ ーミング成長因子（ＴＧＦ−β）族の要素及びトランスフェリン（アクチビン） によって阻害されることが見いだされている。最近になって肝細胞成長因子（Ｈ ＧＦ）と呼ばれるさらなるタンパク質が一次肝細胞の完全なマイトジェン（分裂 促進因子）であることが示された。肝臓に実験的損傷を与えた後及び劇症肝不全 の患者ではＨＧＦの血清レベルが急速に上昇するという観察結果は、そのＨＧＦ がインビボにおいて肝再生の重要なメディエータ−であることを示している。

ＨＧＦは部分的に肝切除されたラットの血清からナカムラらによって精製された ［Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１２２：　１４５０ −１４５９　（１９８４）］　ｏ次いで、ＨＧＦはラットの血小板から精製され 、そのサブユニット構造が決定された［ナカムラら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８３．６４８９− ６４９３　（１９８６）：及びナカムラら、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２ ４．３１１−３１６（１９８７）コ。ヒト血漿からのヒトＨＧＦ　（ｈＨＧＦ） の精製はゴーダ（Ｇｏｈｄａ）らによって初めて記載されたｒＪ、ｃｌｉｎ、Ｉ ｎｖｅｓｔ、　８１．４１４−４！９　（１９８８）］。ゴーダらに報告された 結果によれば、ｈＨＧＦはヒト表皮性成長因子（ｈＥＧＦ）又はインスリンより も培養肝細胞増殖の刺激が効果的であり、ｈＨＧＦの効果とｈＥＧＦ及びインス リンの最大効果とは「相加的又は相乗的」である。

同様に、Ｚａｒｎｅｇｅｒら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４９．３３ １４−３３２０　（１９８９）は、初期の文献にて特徴付けされた、ｈＨＧＦと 非常に類似した性質を有するヒトへバトポイエチンＡ　（ＨＰＴＡ）と呼ばれる ポリペプチド成長因子の精製を開示している。この著者らはこれら精製タンパク 質のアミノ酸配列を明らかにしていないので、上記２つの因子間の構造類似性の 程度は知ることができない。

ヒト血漿から精製されたｈＨＧＦから得られる部分アミノ酸配列を使用し、ｈＨ ＧＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びｈＨＧＦタンパク質の推定アミノ酸配列な どの分子クローニング及びｈＨＧＦの発現がミャザヮら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ ｙｏｐｈｙｓ、Ｃ。

ａｍ、　１６３．９６７−９７３　（１９８９）及びナカムラら、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３４２．４４０−４４３　（１９８９）に報告されている。この報告された 配列は幾つかの部位が相違している。ナカムラら（前掲）はｈＨＧＦ及びｈＥＧ Ｆの効果を相加的なものとして記載している。

ラットＨＰＴＡのＮ−末端アミノ酸配列がＺａｒｎｅｇｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｙｏｐｈｙｓ、　Ｃｏｌ１＋ｍ。

塵、　１３７０−１３７６　（１９８９）に記載されている。

ｈＨＧＦ　ｃＤＮＡは、分子質量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ、　Ｍ）約８ ２，０００であり異種二量体であり、４４０アミノ酸（Ｍ、６９，０００）の大 きなα−サブユニットと２３４アミノ酸（Ｍ、３４，０００）の小さなβ−サブ ユニットから構成される７２８アミノ酸ポリペプチド（プレープロｈＨＧＦ）を コードしている。このα−及びβ−鎖は共にプレープロ前駆タンパク質をコード する１本鎖オープン解読枠に含まれていることが、ｈＥＧＦ　ｃＤＮＡのヌクレ オチド配列から判明した。成熟ｈ　ＨＧ　Ｆの推定−次構造では、α−鎖のＣｙ ｓ４８７とβ−鎖のＣｙｓ６０４との間に輪間Ｓ−８架橋が形成されている［ナ カムラら、　Ｎａｔｕｒｅ、前掲〕。α−鎖のＮ−末端は５４アミノ酸に後続し 、メチオニン基から開始する。このセグメントにはシグナル配列及びプレ配列が 包含される。α−鎖はアミノ酸（ａ　ａ）５５から始まり、４つのクリングルド メインを含有する。クリングル１ドメインはα−鎖の約１２８アミノ酸から約２ ０６アミノ酸まで伸長し、クリングル２ドメインは約２１１７二ノ酔から２８８ アミノ酸間にあり、クリングル３ドメインは約３０３アミ７ノ酸から約３８３ア ミノ酸にまで伸長するものとして規定され、クリングル４ドメインはａ−鎖の約 ３９１アミノ酸から約４６４７ミノ駿にまで伸長する。これら種々のクリングル ドメインの規定は他のタンパク質（プロトロンビン、プラスミノーゲン）のクリ ングル様ドメインとの相同性に基づくものであり、従ってこれらの限定は大体の ものに過ぎない。ＨＧＦβ−鎖にはセリン−プロテアーゼ様ドメインが包含され る。ヒト白血球から単離されたｃＤＮＡ部分では、１５塩基対の枠内（ｉｎ　ｆ ｒａｍｅ）欠失が観察された。ＣＯ３−１細胞におけるこのｃＤＮＡ配列の一時 的発現によって、クリングル１ドメイン内にて５アミノ酸が欠けたコード化ＨＧ Ｆ分子は完全に機能的であることが判明した［５ｅｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｔ　ａ ｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ１ｕｎ、　１７２．３２１−３２７ 　（１９９０）］　ｏこの変異体は「デルタ５　ＨＧＦＪと命名されている。Ｈ ＧＦは４つの推定グリコジル化部位を含有し、それはα−鎖の２９４位及び４０ ２位に、並びにβ−鎖の５６６位及び６５３位に位置している。

免疫インターフェロンとも呼ばれるγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）は、イ ンターフェロン−α及び−βの抗ウィルス及び抗増殖特性を示すが、これらのイ ンターフェロンとは対照的にｐＨ２にて不安定である。ＩＦＮ−γはリンパ球の マイトジェン誘導の際に元々は産生された。ＩＦＮ−γの組換え生産はＧｒａｙ ％Ｇｏｅｄｄｅｌ及びその共同研究者によって最初に報告され［Ｇｒａｙら、　 Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５０３−５０８　（１９８２）］　、それは米国特許第 ４，７６２．７９１号、第４．　９２９．　５４４号、第４，７２７．１３８号 及び第４．９２５，７９３号に記載されている。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）にて産生されるＧｒａｙ及びＧｏｅｄｄｅｌの組換えＩ ＦＮ−７は１４６アミノ酸から構成され、その分子のＮ−末端部分はＣｙｓＴｙ ｒＣｙｓ配列から開始されている。その後、天然のＩＦＮ−γ（即ち、ヒト末梢 血リンパ球のマイトジェン誘導によって惹起され、次いで精製されたもの）はＧ ｒａｙら［前掲］が帰属したＣｙｓＴｙｒＣｙｓ　Ｎ−末端を欠くポリペプチド であることが見いだされた。

ＩＦＮ−γは細胞生育阻害のための検定においてＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βと［ ＥＰ１０７．４９８、Ｃｚａｒｎｉｅｓｋｉｒａ、　ＪＪｉｒｏｌｏｇｙ　４９ 　（１９８４）］　、及びリンホトキシンと［ＥＰ１２８，００９］　、及びＩ Ｌ−２［米国特許第５．　０８２．　６５８号］と相乗効果を示すことが示唆さ れた。ヒトインターフェロン及びＴＮＦを含有する相乗的な細胞毒性組成物が米 国特許第４，６５０，６７４号に記載されている。

発明の概要 本発明者らは、劇症肝不全などの肝障害をもたらす特定の臨床状態では患者の血 清中に高濃度のＨＧＦが検出されるが、多くの場合、肝再生は起こらず、又は満 足いくほどのものでないことを見いだした。本発明者らはさらに組換えＨＧＦ（ ｒＨＧＦ）の活性に及ぼす種々のタンパク質の効果を調べ、ＩＦＮ−γカＨＧＦ と相乗作用し、−次ラット肝細胞の増殖性を増大させることを見いだした。

本発明は、特に肝細胞増殖の増大と共同的なＨＧＦ及びＴＦＮ−γの意外な相乗 作用という認識を基礎としている。

本発明は１つの局面として、生物学的に有効な量のＨＧＦ及び相乗的に有効な量 （相乗作用を示す有効量）のＩＦＮ−γを、必要としている患者に投与すること によってＨＧＦの生物学的活性を増大させる方法に関する。

別の局面では、本発明は肝細胞の増殖を増大させる方法であって、このような処 置を必要とし、内生の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の血清レベルを上昇させること が必要な哺乳動物患者に、肝細胞増殖の加速を誘発するに有効な量のγ−インタ ーフェロン（ガンマインターフェロン、ＩＦＮ−γ）を投与することを特徴とす る方法に関する。

また、本発明は別の局面では、肝細胞の成長刺激及び内生ＨＧＦの血清レベルの 上昇を必要としている哺乳動物患者に相乗的に有効な量のＩＦＮ−γを投与する ことを特徴とする、肝細胞に対するＨＧＦの分裂促進活性を増大させる方法に関 する。

さらに、本発明は肝細胞増殖を増大させる方法であって、このような処置を必要 としてい哺乳動物患者に、肝細胞増殖を誘導するに有効な量のＨＧＦ及び相乗的 に活性な量のＩＦＮ−γを投与することを特徴とする方法に関する。

また、別の局面として本発明は、必要としている哺乳動物患者の肝細胞の成長を 刺激するための方法であって、 （ａ）　該患者の血清中ＨＧＦ濃度を測定し、（ｂ）　該ＨＧＦ濃度と同じ哺乳 動物種の血清中の正常なＨＧＦ濃度とを比較し、そして、 （Ｃ）　該ＨＧＦ濃度が該正常ＨＧＦ濃度よりも高い場合に該患者に相乗的な量 のＩＦＮ−γを投与し、又は （ｅ）　該ＨＧＦ濃度が該正常ＨＧＦ濃度と同じか、又はそれよりも低い場合に 該患者に治療学的に有効な量のＨＧＦ及び相乗的な量のＩＦＮ−γを投与するこ とを特徴とする方法に関する。

本発明はまた、治療学的に有効な量のＨＧＦ及び相乗的な量（相乗作用を示す量 ）のＩＦＮ−γを含有する、肝細胞再生の刺激に使用される組成物に関する。

本発明はさらに、ＨＧＦ誘発性の肝細胞増殖に対する成長インヒビターの効果を 補償するための方法であって、肝細胞成長の刺激を必要としている哺乳動物患者 にＨＧＦと相乗作用を示す量のＩＦＮ−γを投与することを特徴とする方法に関 する。

図面の簡単な説明 第１図は、−次ラット肝細胞培養物の肝細胞増殖を増大させるＩＦＮ−７及びＨ ＧＦの相乗的効果を示している。

第２図は、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αとＨＧＦとによって得られる第１図と同様 の条件下での結果である。

第３図は、肝細胞のＨＧＦ誘発性増殖に対するＴＧＦ−βの阻害効果を示してい る。

第４図は、ＨＧＦ活性のＴＧＦ−β阻害に対するＩＦＮ−７の効果を示している 。

第５図は、アクチビンによるＨＧＦ活性の阻害に対するＩＦＮ−γの効果を示し ている。

第６図は、所望のポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子を簡便に挿入できる 一般的な発現ベクターｐｓＶ１６Ｂ５の構築を示している。

第７図−第１０図は、ｒｈＨＧＦによる処置が肝実質組織モデルにおける壊死損 傷は予防するが、門脈周囲の炎症、浮腫及び管変化は予防しないことを示してい る組織病理学写真である。

第１１図−第１４図は、肝毒であるα−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ ）で処置した雄性フィッンヤーラットの肝臓における肝酵素及びビリルビンレベ ルに対するＨＧＦ処置の効果を示している。

本発明の詳細な説明 肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は肝臓、肺、腎、脳、胸腺などの種々の多くの組織に て検出されている。ＨＧＦは主として肝細胞の強力なマイトジェンとして知られ ているが、その生物学的活性は肝臓細胞に限定されない。インビトロ試験では、 ＨＧＦはマウス肉腫１８０細胞及びヒドロ表皮性癌腫（ＫＢ）細胞に対して細胞 毒性であり［ＩＩｉｇａｓｈｉｕら、　ＢＢＲＣ１７０（１）、　３９７−４０ ４１　、種々の表皮、内皮及びメラニン形成細胞セルラインに対して分裂促進を 示すことが見いだされている。本明細書にて使用している「肝細胞成長因子」又 はｒＨＧＦＪなる用語は、生物学的活性を示す肝細胞成長因子のすべての型を表 すために用いている。この用語は詳細には、例えばＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、　８０．７２２９　（１９８３）など に記載されている標準的な検定にて肝細胞成長の促進活性を示す肝細胞成長因子 が含まれる。

具体的には、この用語は、天然起源から精製され、化学的に合成され又は組換え 的に製造された成熟、プレ、ブレープロ又はプロ形態のラットＨＧＦなどの非ヒ ト及びヒトを包含している。

「ヒト肝細胞成長因子」又はｒｈＨＧＦＪなる用語は、ミャザワら（前掲）又は ナカムラら、　Ｎａｔｕｒｅ　（前掲）に開示されたｃＤＮＡ配列によってコー ドされている、天然起源から精製され、化学的に合成され又は組換え的に製造さ れた成熟、ブレ、プレープロ又はプロ形態のポリペプチドを意味する（配列番号 ２も参照）。

ミャザワら及びナカムラらに報告されている配列は１４アミノ酸が相違している 。

この相違の理由は充分に解明されていないが、冬型又はクローニング人工産物が 可能性の１つにある。具体的には、本発明の目的では、定義したｒｈＨＧＦＪに これら両配列がともに包含される。この用語は具体的には、天然のヒトｈＨＧＦ の第１クリングルドメイン内における５アミノ酸が欠如し、最初に同定された５ ｅｉｋｉら（前掲）に記載されている変異体である「デルタ５ｈＨＧＦＪが包含 される。両用語（ＨＧＦ及びｈＨＧＦ）ともに、天然に存在する（）ＴＧＦ　Ｄ ＮＡを操作する必要のない）アレル又は、アレルもしくは天然では見いだされな い変異体を導＜ＤＮＡの突然変異によって作成される前もって規定された突然変 異型であってもよい、上記ＨＧＦポリペプチドの種々のアミノ酸配列変異体が包 含されるが、ただしこのような変異体は天然のヒトＨＧＦ種の生物学的活性を維 持しているものである。このような突然変異には通常、天然のアミノ酸配列の１ つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入が含まれる。このアミノ 酸の改変は、組換え宿主での発現の際にＨＧＦのさらなる修飾、例えばグリコジ ル化型位の導入又は移動も起こす場合かある。

本明細書にて使用している「γ−インターフェロン」又はｒｌＦＮ−γ」には、 例えば適当なセルラインでのウィルス複製の阻害（ヒト肺癌腫セルラインＡ３４ ９での編心筋炎ウィルスの複製の、ヒトＩＦＮ−γの阻害）、クラス■抗原の誘 導、熱不安定性、他の抗ウィルス、抗腫瘍又は免疫調節検定、又はγ−インター フェロンとの免疫反応性を有するがα−又はβ−インターフェロンとの免疫反応 性は有していない抗体による中和など、認められたγ−インターフェロン検定に て生物学的に活性であることが知られているすべての形態の（ヒト及び非ヒト動 物）のγ−インターフェロンが種々包含され、これは、天然起源から入手される か、化学的に合成されるか、又は組換えＤＮＡ手法によって製造されるかの別に 関係なく、成熟、プロ、メト又はデス（１−３）（デスＣｙｓＴｙｒＣｙｓ　Ｉ ＦＮ−７）型を包含する意味を有している。組換えγ−インターフェロン（ｈ　 Ｉ　ＦＮ−γ）及びそのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を製造するための完全な説明 は上記の米国特許（例えば、米国特許第４．７６２，７９１号）に示されている 。ＣｙｓＴｙｒＣｙｓを欠如した組換えヒトγ−インターフェロン及び種々の断 頭誘導体は例えば、欧州公開第１４６．３５４号に記載されている。ＩＦＮ−γ などの非ヒト動物インターフェロンは例えば、欧州特許第８８，６２２号に記載 されている。この用語は種々のグリコジル化型及び他の変異体及び、当業者に知 られており又は将来知られるであろうそのようなインターフェロンの誘導体を包 含している。このような変異体としては例えば、アレル、及び残基が欠失、挿入 及び／又は置換された部位特異的突然変異の産物（例えば、上記の欧州特許第１ ４６．３５４号）が挙げられる。

ＩＦＮ−γは宿主範囲が狭いことで知られ°Ｃいるので、処置する動物と同種の ＩＦＮ−γを使用すべきである。ヒトの治療では、例えば米国特許第４．７１７ ゜１３８号及びその対応特許ＥＰ７７．６７０に示されている配列のデスＣｙｓ ＴｙｒＣｙｓ変異体を使用するのが好ましく、要すれば最後の４残基を翻訳前プ ロセッシングで欠如させたＣ−末端変異体を使用する。

本明細書における「相乗作用」、「相乗的」、「相乗的に有効」なる用語は、認 められた定義［ＧｏｏｄＩｌａｎら、　”Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”。

ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ＋ｎｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、、 　ニューヨーク、　１９８０］に従って規定される。これは、２成分それぞれの 特定の同一の生物学的応答に必要な用量レベルをＸ及び）軸に沿、〕でププロト するイソボログラムを作成することで最も容易に認められる。単純な相加作用て あれば、１成分が減少し他の成分が増加するｉｉｒ線が描かれるが、相乗作用は 凹状曲線が描か第１るーとｉ：１オー＋て認めることができ、その結果１成分の 若干−の増加が他の成分真の劇的な減少を補償することになる１、本明細書で使 用するＨ　Ｇ　Ｆの［−治療りｒ的に有効な］」とは、薬理学的な観点から、相 乗的量のｌ　ＦＮＩ−γの存在Ｆ１．肝細胞ＤＮＡの八代を刺激するの（−有効 な量を意味す乙。

［肝細胞成１イ、、・１−ヒター１なる用語（ｊ、肝細胞ＤＮＡの合、蝮、Ｓｚ は肝臓の重量をモニターすダニとに基づくｔ、１′１１（Ｔ）極度的な検定？− おいでイン１、ボ叉はイレビＩ・１１て肝細胞の成腰を阻害する因子を表すため （二使甲Ｌ２ている。「肝細胞成長因子Ｈ，２”３アー−１なｚｌ用語には具体 的１−は、ＴＧＦ−，９超１４（ｓｕｐｅｒｆａｉｉ、］ｙ’ｊの膜、例え。

ばＴＧＦ−β及びＴクチピン（インｌ−ビンβえ又はβ３鎖のダイマー）なａ− が包含される。

本明細書及び請求の範囲にで使用しているｒ　Ｔ　ＧＦ−β］なる用語はＴ　Ｇ 　Ｆ’　−β、例、考、ば肝細胞成長の阻害作用を有するＴＧＦ−６つ、−β、 及び−β、の種′？のサブタイプを包へしている。

肝細胞増殖及び成長促ボの効果及び成長阻害因子は肝細胞の一次培養物にて簡便 に試験される。細胞培養物中の種々の細胞型に対するタンパク質の分裂促進作用 を試験するための文献は膨大にある。−次培養物の成熟ラット肝細胞はインビボ において種々の肝機能レベルを保持し、種々のホルモンに対して応答すること一 次培養物の成熟ラット肝細胞は、肝細胞増殖を調節する因子、及びこのような多 くの因子の分裂促進作用を調査するために膨大に使用されており、例えば表皮性 成長因子（ＥＧＦ）　、インスリン及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）がこの ようなインビトロ検定にて証明された［Ｒｉｃｈｍａｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａンター・フニロンーβ７、バ イブリド・−？形豫細胞腫成長因：Ｆ、ＢＳＦ−２尺び２６−ｋＤタンパク質吉 様々に呼は４する因子の肝細胞刺激活性はラット肝細胞の一次培養物において証 明されている［１９９０年１１月２７Ｆ１発ｉ〒の米国特許第４９７３．４７８ 号］１、 ヒト肝細胞は例オば、移植に不適と琴な、′−幡また器′α・＼Ｃ）全肝潅流、 −ｆ：ｉｌｌ、での１？植に使用さ第１た成人肝臓のパレーグＴ５・ン（ｐａｒ ｅ−ｄｏｗｒ＋ｓ）、、別の症状のために丁未によ１で切除された胎ＩＱＦ汐− 及び肝臓残、存組織から入手す！Ｎ１乙番−がで・≠（る１、ヒ１１１（細胞は 、第７常う・・ト肝細胞の一次培養物を調製す？）際の確立されノ一方法（二鵠 似した方法により一ξ＋８夏することがτ゛きる。

例えば、肝細胞Ｄト晶名成１ツ、Ｌ″ＨＩＨＩヂニジ／ＮＡ＾、の導入を２゜適 当なヒドロキシ尿素対照を再勺合成とＩで用いて測定する、Ｅとにより、検定ず ろことができる。アフィディフ＋１゛、・（ａｐｈｉｄｊｃｏｌｉｒ＋）を加え 又は加えない肝細胞の一一次培養物における肝細胞ＤＮＡ合成を測定する方法は 、Ｎａｋａｒｕｒａら（：よって、Ｂ角ｃｈｅ＊、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ ｎｍｍ、　１：’、２（３）、１４０−１４５９（＋９８４）、及び、？、Ｂｉ ｎｃｈ損、９４．１０２９|１０３５（１ ９８３）に記載されている。この手法の変法を実施例１で説明する。

ＨＧＦ及びＩＦＮ−γの肝細胞成長に対する効果は、例えば部分肝切除術後又は 四塩化炭素誘発性肝損傷のラットなどの肝不全及び再生の動物モデル、又はＤ− ガラクトサミン誘発性の急性肝不全モデルなどにおいても試験することができる 。

肝臓成長刺激に対するＨＧＦのインビボ効能を証明するための動物モデルは実施 例２にて説明している。

ＩＦＮ−γ及びＨＧ　Ｆは通常、製薬的に許容される適当なビヒクル及び要すれ ば他の製薬的に許容される添加剤とともに、その活性成分の有効量を含有する医 薬組成物の形態で投与する。

「医薬組成物」なる用語は、該組成物が投与される被験者にとって毒性である追 加的成分をまったく含まない、活性成分の生物学的活性を疑いなく有効にできる 形態にある調製物を意味する。

「製薬的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、使用する活性成分の 有効量を与えるために被検哺乳動物に適切に投与できるものである。

ＨＧＦ及びＩＦＮ−γはこのような活性を示す物質を投与するために許容されて いるあらゆる方法によって被検哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができ る。この方法には、皮下、及び好ましくは腸管外投与が包含される。腸管外投与 経路の例としては、静脈内、肺内、動脈内、筋肉内、及び腹腔内投与が上げられ 、静脈内経路が好ましい投与方法である。投与は治療学的に有効な／相乗的なレ ベルを維持するに充分な量となるよう連続して、又はポーラス用量で行えばよい 。ＨＧＦ及びＩＦＮ−γは投与する前にインビトロで合剤とすることができ、又 は同時にもしくはいずれかを先に別個に平行投与することができる。

これらの化合物は通常、医薬組成物として投与され、普通は当業者に既知の方法 によって投与剤形に製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａ ｒ＋＊ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、マッグ・パブリッシング・カン パニー、イーストン、ペンシルバニア、１５版１９７５を参照のこと。腸管外投 与の際には、ＨＧＦ及びＩＦＮ−γは通常、適当な製薬的に許容されるビヒクル 及び要すれば製薬的に許容される添加剤と共に注射用溶液剤、懸濁剤、乳化剤の 形態に製剤化する。典型的なビヒクルには食塩水、デキストロース溶液、リンゲ ル溶液などがあるが、非水性ビヒクルも使用することができる。

ＩＦＮ−γの製剤は液体が好ましく、普通は通常の安定化剤及び／又は賦形剤を 含有する生理食塩溶液又はデキストロース溶液である。ＩＦＮ−γ組成物は凍結 乾燥粉末とすることもできる。通常、製剤は１．０　０．２ｍｇｈｌでＩＦＮ− γ（２０Ｘ１０’Ｕ）、０．２７ｍｇ／扉ｌコハク酸、及びコハク酸二ナトリウ ム・６水和物０．７３＋ｌ／注射（ｐＨ５，０）を含有することができる。好ま しい■ＦＮ−γ製剤は１９８９年５月１８日発行の公開番号ＷＯ３９／４１７７ に記載されている。

相乗的に有効な量及び肝細胞の増殖促進を誘発するに有効な量の決定は、臨床医 の技術的範囲内に属される事項である。ＨＧＦ及びＩＦＮ−γの実際の用量は処 置すべき医療症状、病態の状況、及び患者の臨床的寛容性、使用するＩＦＮ−γ 及びＨＧＦ調製物の性質、例えばそれらの活性及び生物学的半減期などによって 変動する。実施者は臨床経験に沿ってその用量を調節できることは理解されよう 。

以下の実施例を単純化するため、特定の用語の定義を下記に説明する。

「トランスフェクション」とは、宿主細胞による発現ベクターの取り込みであっ て、コード化配列が実際に発現されるか否かは問わないものである。多くのトラ ンスフェクション方法は当業者に既知であり、例えばＣａＰＯ，法及びエレクト ロポレーションがある。トランスフェクションが成功したか否かは一般に、この ベクターの作動が宿主細胞内に現れた場合に認められる。

「形質転換」とは、染色体外成分として、又は染色体成分によってＤＮＡが複製 できるように生物にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じ て、その細胞に適切な標準的手法により形質転換を行う。Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　 Ｎ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、 ６９．　２１１０（１９７２）　：　Ｍａｎｄｅｌら、Ｊｊｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、 ５３．@１５４（１９７０）　； 及びさらに最近のＬｉ　ｊｉｅｓｔｒｏｍら、　Ｇｅｎｅ　４０．２４１−２４ ６（１９８５）に記載されている塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は一 般に、原核生物細胞又は実質的な細胞壁障壁を含有する他の細胞に使用される。

このような細胞壁を欠く哺乳動物細胞では、リン酸カルシウム沈降法が好ましい ［Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ａ、、　Ｖｉｒ。

１ｏｇｙ婬、　４５６−４５７（１９７ｇ）コ。哺乳動物宿主細胞系形質転換の 全体像は１９８３年８月１６日発行の米国特許第４．３９９．２１６号にＡｘｅ ｌによって記載されている。酵母における形質転換は通常、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎ ｇｅｎ、　ｐ、　、ら、　Ｊ、Ｂａｃｔ、　１３０．９４６（１９７７）、及び Ｈｓｉａｏ、　Ｃ，Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　 Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７６、３８２９（１９７９jの方法に 従って通常行われる。しかし、核注入又はプロトプラスト融合など、細胞にＤＮ Ａを導入する他の方法も使用することができる。

「プラスミド」は、小文字のｐの後に大文字及び／又は数字を付して命名してい る。実施例に記載している発現プラスミドの構築に使用される出発プラスミドは 市販されているか、制限なく公に入手可能であるか、又は文献記載の手法に従っ てこのような入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、別の等 価なプラスミドが当業界にて知られており、それらは当業者に明らかなものであ る。

発現ベクター（プラスミド）は選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する ことができる。選択遺伝子は、ベクターによって形質転換された宿主細胞の生存 又は成長に必須である、第２タンパク質と呼ばれる場合のあるタンパク質をコー ドしている。哺乳動物細胞にとって適切な選択マーカーには例えば、ジヒドロ葉 酸還元酵素（ＤＨＦＲ）　、チミジンキナーゼ又はネオマイシンなどがある。選 択マーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に導入されれば、その形質転換された哺 乳動物宿主細胞は選択圧の下においても生存することができる。選択方法には大 きく２つの別個のカテゴリーのものがある。最初のカテゴリーは細胞の代謝及び 、添加培地とは無関係に発育できる能力を欠く突然変異セルラインの使用に基づ くものである。これには２つが例示される：　ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞及びマウス Ｉｔｋ−細胞。これらの細胞はチミジン又はヒボキサンチンなどの栄養素の添加 なしで発育できる能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経 路に必須の特定の遺伝子を欠如しているので、欠失したヌクレオチドが添加培地 に添加されなければ生存することができない。培地を添加する手法の代替法は、 無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、その発 育要求性を変化させることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子によって形質転換さ れていない個々の細胞は非添加培地中で生存することができないであろう。従っ て、これらの細胞の直接的な選択法は、添加栄養素の不存在下における細胞発育 を要求しない。

第２のカテゴリーは、あらゆる細胞タイプに使用される選択方法と呼ばれる、突 然変異セルラインの使用を必要としない主要な選択法である。この方法は通常、 宿生細胞の成長を阻止する薬物を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬物 耐性を担持するタンパク質を発現し、その選別性を存続させるであろう。このよ うな主要選択法は例えば、ネオマイシン薬物［５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｐ、及びＢｅ ｒｇ、　Ｐ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　！、　３２７（ １９８２）］　、ミコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，及びＢｅｒ ｇ、Ｐ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．１４２２（１９８０）］　、又はハイグ ０フィシン［Ｓｕｇｄｅｎ、　Ｂ、ら、　Ｍｏ１．Ｃｅｌ、、Ｂｉｏｌ、　”２ ．４１０−４１３（１９８５）］を使用するものである。以下の実施例では、Ｄ ＨＦＲ生産の直接選択法を使用している。

「増幅」とは、細胞の染色体ＤＮＡ内における挿入領域の増大又は複製を意味す る。増幅は、選択物質、例えばＤＨＦＲを不活化させるメトトレキサート（ＭＴ Ｘ）を使用して行う。ＤＨＦＲ遺伝子の連続コピーを増幅又は作成すると、ＭＴ Ｘが大量になるにも拘わらず、大量のＤＨＦＲが産生される。増幅圧は、内生Ｄ ＨＦＲの存在に関係無く、より多（のＭＴＸを培地に添加することによって適用 する。所望の遺伝子の増幅は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡとＤＨＦＲ 又は増幅遺伝子とを含有するプラスミドによって哺乳動物宿主細胞を同時トラン スフェクトすることにより行い、それによって同時組込みを引き起こすことがで きる。より多くのＭＴＸ濃度の連続ラウンドにて発育できる細胞のみについて選 択すれば、細胞が多（のＤＨＦＲを必要とするよう確実にすることができるが、 この要件は選択遺伝子の複製によって満たされる。所望の異種タンパク質をコー ドする遺伝子を増幅遺伝子と共に同時組込みを行う限り、この増幅遺伝子の複製 によって所望のタンパク質をコードする遺伝子が複製される。この結果は、所望 の異種タンパク質をコードする遺伝子、即ち増幅遺伝子の増大コピーがより多く の所望の異種タンパク質を発現することを示す。この操作は特に、以下の実施例 に示すようにｂＨＧＦ発現の際に行った。

ｈＨＧＦをコードするＤＮＡを発現する適当な宿主細胞には、ＳＶ４０によって 形質転換されたサル腎ＣＶＩライン［ＣＯ３−７ｍ　ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１ ］　；ヒト胚腎ライン（２９３、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ、ら、　Ｊ、Ｇｅｎ Ｊｉｒｏｌ、　３６．５９（１９７７））；幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、Ａ ＴＣＣＣＣＬ　１０）　、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ［ＬＩｒｌ ａｕｄ及びＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、 　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７V゜ ４２１６（１９８０）に記載〕などがある。

宿主細胞はｈＨＧＦ発現ベクターによって形質転換することができ、またプロモ ーターの導入、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅に適するよう改変した通常の 栄養培地中にて培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は発現のため に選択する宿主細胞について使用する上記のものであり、それは当業者に明らか であろう。

本発明をさらに詳細に説明するため、以下に実施例を記載するが、これらは本発 明を限定するものでない。

種々のポリペプチドの発現に広く適用される親ベクターであるプラスミドｐｓＶ １６Ｂ５を、第６図に示すようにしてプラスミドｐｓＶ１６Ｂ５−ｔ−ＰＡから 誘導した。ｐｓＶ１６Ｂ５　［形質転換大腸菌株ＡＴＣＣＮｏ、６８，１５１　 ；配列番号１］はｐ　ＳＶ　１６　Ｂ　５−ｔ−ＰＡのｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの代 わりにポリリンカー領域を担持している。このポリリンカー領域は、目的のポリ ペプチドをコードする配列の導入に使用できる便利かつ唯一の制限エンドヌクレ アーゼ認識部位を提供するものである。

第６図に示しているように、ｐｓＶ１６Ｂ５は４工程から創製した。最初の３工 程はそれぞれＢａｍＨＩ　、　ＨｉｎｄＩ［［及び５ａｌｌ制限部位をｐｓＶ１ ６Ｂ５−ｔ−ＰＡから除去する工程である。従って、その結果、ｔ−ＰＡ　ｃＤ ＮＡを最後の工程にてポリリンカーと置き換えると、これらの酵素のポリリンカ 一部位は得られた親発現プラスミドにおいて唯一のものとなった。

５ｅｋｉら（前掲）に記載されているようにしてヒト白血球ライブラリーから単 離されるｈＨＧＦ　ｃＤＮＡりｏ−７（ＨＬＣ３）を発現ベクター１）ＳＶ１６ Ｂ５にクローンした。ヒト白血球ＨＧＦの完全なアミノ酸は配列番号２に示して いる。

４２１６−４２２０（１９８０）］を、上記のｐｓＶ１６Ｂ５基礎ｈＨＧＦ発現 ベクター及びｄｈｆｒ選択ベクターｐ　Ｆ　Ｄ　ｌ　ｉ　［Ｓｉｍｏｎｓｅｎ及 びＬｅｖｉｎｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ A　Ｓ、　Ａ。

８０、２４９５−２４９９（１９８３）］で同同時トランスフエフした。この後 者のプラスミドはＤＨＦＲをコードしており、従って形質転換細胞にメトトレキ サート耐性を付与し、ｈＨＧＦを発現する形質転換体の選別を可能にするもので ある。形質転換したｄｈｆｒ−細胞を、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン 欠損培地中での発育によって選択した。この選択培地にて現れるコロニーを綿棒 で単離し、その同じ培地中で数世代増殖させた。細胞発育の後、得られた細胞を 増幅させ、常法によりメトトレキセートの増大量によって選択した。選択培地中 で発育できるコロニー、従ってこれはトランスフェクトＤＨＦＲを含有するプラ スミドが導入されているが、このコロニーをＨＧＦの分泌に関してスクリーニン グした。このコロニーの培地中ＨＧＦ活性は、以下に記載する分裂促進検定によ って検定した。あるいは、培養培地中のＨＧＦ活性は、Ｎａｋａｍｕｒａら、　 Ｎａｔｕｒｅ　３４２．４４０−４４３（１９８９）に記載されているように、 −次培養物中のラット肝細胞に１２Ｊ−標識化デオキシウリジンを導入すること によっても測定することができる。ｈＨＧＦは実質的にＮａｋａｍｕｒａら（前 掲）に記載されているようにして精製した。

３）に記載されている方法に実質的に従って行った。

この検定培地は以下の組成を有している：ウィリアムス培地Ｅ（ｆｉｌｌｉａｍ ｓ　＋ｍｅｄｉａ　Ｅ）　［ギブコ］１　ｘ　Ｐｅｎ／　５ｔｒｅｐ　（１００ 単位／厘ｌペニシリンー１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン） １×グルタミン（２＋Ｍ） １×微量元素（１０，０ＯＯＸ７相由来の保存溶液）１０μｇ／Ｉｌトランスフ ェリン １μｇｋｌアプロチニン。

標準的な潅流コラゲナーゼの方法によって、ウィスターラット（各々体重］５０ −１８０ｇ）から肝細胞を単離し精製し［Ｓｅｇｌｅｎ、Ｐ、０．、　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ。

１ｎｇｙ　１３．２９−８３（１９７６）］　、検定培地３×によって洗浄し、 ｌＸｌ０’細胞／ｍｆｌ：：て検定培地中に再懸濁した。９６ウエル平底マイク ロタイター平板の各ウェルに、得られた細胞懸濁液１００μｌを加えた。その細 胞にＨＧＦ又は他の試験化合物の適当な希釈物を容量１００μｌで加えた。得ら れた平板を３７℃で４８時間インキュベートした。３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ ウエル）を１２時間用いるプラス−標識化培養細胞によって、ＤＮＡ合成速度を 測定した。次いで、自動細胞捕集装置［Ｐｈ　Ｄ捕集装置、ケンブリッジ・バイ オチック］を使用し、細胞をガラス繊維フィルターに捕集し、そのガラス繊維フ ィルターを係数バイアルに移し、次いで液体シンチレーション分光器によって３ Ｈ導入を測定し、ＣｐＨで表した。

Ｃ３結　果 １、本発明者らは、肝細胞増殖に対するＴＦＮ−γの効果を研究した。第１図に 示す結果は、ＩＦＮ−γ単独では分裂促進作用を表さないことを示している。

ＨＧＦ及びＩＦＮ−γの種々の組合わせ物が、上記の一次ラット肝細胞培養物に て肝細胞増殖を増大させるうえで相乗効果を示すことを見いだした。ＨＧＦ及び ＩＦＮ−γの平行投与の作用も調査した。第１図に示されるように、相乗効果は ＨＧＦ又はＩＦＮ−γの添加時間とは無関係であった。

２、第２図及び第３図に示している試験結果は、ＩＦＮ−βがＨＧＦとは相乗効 果を示さず、ＩＦＮ−α及びＨＧＦ間の相乗効果は多くても限界レベルであるこ とを示している。

３．１５０ｐｇ程に少ないＴＧＦ−βを培養の始めに添加すると、−次ラット肝 細胞のＨＧＦ誘導増殖が根底から抑制されることが見いだされた（第３図）。

４、第４図に示されるように、ＩＦＮ−７２５０Ｕ　（１００ｎｇ）はＴＧＦ− β１５０ｐｇによる抑制効果を完全に逆転させた。ＴＧＦ−βの濃度を高めた効 果に打ち勝つには、ＩＦＮ−γの濃度を高めることが必要であった。

５、第５図に示されるように、ＴＧＦ−β族の別の因子であるアクチビン（ａｃ ｔｉｖｉｎ）の抑制効果もＩＦＮ−γによって逆転された。この実験では、アク チビン濃度は１０ｎｇ／富ｌであり、ＩＦＮ−γ濃度は０−１０００単位／冨ｌ に変動させた。得られた結果は、ＩＦＮ−γは約１０単位／ｍｌを越える濃度で は、アクチビンの抑制効果を逆転させ、またＨＧＦの肝細胞成長刺激活性を増大 させることを示している。

プラスミドｐＳＶ１６Ｂ５で形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ　（大腸菌）２９４株 は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［米国、　ＭＤ、ロックビ ル、バークローン・ドライブ１２３０１］　（ＡＴＣＣ）に１９８９年１０月２ ５日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６８，１５１が付与されている。この寄託物 は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約及びその 規則の規定（ブタベスト条約）の下に寄託された。これによると、寄託日から３ ０年間にわたり生存培養物の維持が保証される。この微生物は、ブタベスト条約 の条項のもとで、及びジエネンテク、インコーポレイテッドとＡＴＣＣとの間の 契約の条件のもとてＡＴＣＣから入手可能となるであろう。即ち、関連の米国特 許が発行されたとき、又は米国もしくは外国特許出願のいずれかが公開されたと きのどちらか早いときに公衆への培養物子孫の永久的かつ非制限の入手可能性が 保証され、また、３５　ＵＳＣ＠１２２及びそれに則る長官の規則（ＯＧ６３８ への具体的な言及を有する３７　ＣＦＲ６１，１４を含む）に従って米国特許商 標局長室によって決定された者への該子孫の入手可能性が保証されている。

欧州特許をめる場合に上記表示では、寄託微生物の試料は欧州特許の登録決定の 発行まで、又はその出願が拒絶されもしくは放棄されもしくは取り下げと見なさ れる日まで、試料を要求する者が指定する専門家にこの試料が分譲される場合に のみ入手可能である（規則２８（４）ＲＰＣ）。

本出願の譲受人は、寄託微生物が適当な条件下で培養したときに死ぬか、失われ るか、又は破壊されたときには、通知俊速やかに同培養物の生存試料と交換する ことに同意している。寄託された株の入手可能性を、特許法に従っていずれかの 政府機関の権限のもとに認可された権利に反する本発明を実施するためのライセ ンスであると解すべきではない。

上述した記載は、当業者が本発明を実施することを可能ならしめるに充分である と考える。本発明における原料の寄託は、本明細書に含まれる記述が本発明のあ らゆる態様（最良の態様を含む）を実施するのに不十分であることを認めるもの でな（、またそれが本発明の範囲を限定するものでもない。

（ａ）　動物：　雄性フィッシャー・ラット（２５０ｇ）をカールス・リバー・ ブリーディング・ラボラトリーズ（ＭＡ、ウィルミントン）から入手した。これ らのラットは１２時間の光り一暗闇サイクルを施した中央動物施設（室温７２゜ Ｆ）内で飼育した。ヒマラヤスギ木チップ又はアルファ乾燥ベッドを入れた１ケ ージ当たりに４匹−５匹を収容し、市販のラット食餌［Ｒａ１ｓｔｏｎ　Ｐｕｒ ｉｎａ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ］及び精製水を自由に与えた。ラットはその施設内で少なく とも１週間馴化させた。すべての動物プロトコールは連邦ガイドラインに沿って おり、動物愛護及び使用委員会制度によって承認されてたものである。

（ｂ）　化学物質：　肝毒素、α−ナフチルイソチオンアネート（ＡＮＩＴ）を ノグマ・ケミカルズＣｏ、　［ＭＯ，セント・ルイス］から入手した。ＡＮＩＴ をビーナツツ油に溶解し、それを終濃度１２．７諺ｇ／＋ｆで腹腔内（ｉ、　ｐ 、　）投与した。０１％ウソ血清アルブミン［ングマ・ケミカルズＣｏ］を含有 するリン酸緩衝化食塩水の滅菌溶液中の組換えヒト肝細胞成長因子−ＨＧＦ［ジ エネンテク・インコーホレイテッド、ＣＡ］を側面尾静脈から静脈内（ｉ、ｖ、 ）注射した。

（Ｃ）　予備実験：　２つの別個の実験を行い、種々の用量のＡＮＩＴの毒性応 答性を評価した。

（ｄ）　処置プロトコール：　最初の実験では、ＡＮＩＴを実験の０時点にて注 射した。ＡＮＩＴの用量は５０ｍｇ／ｋｇであったが、この用量は血清中の酵素 ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ及び総ビリルビン値を再現性をもって有意に上昇させ、 プロトロンビン時間（ＰＴ）は変化させないことが予備実験にて見いだされた。

ＨＧＦ注射は一３０分、及びＡＬＰ注射の６．１２．２４．３ｏ及び３６時間後 に行った。動物を４８時間時点で殺した。第２の実験では、ＨＧＦをＡＮＩＴチ ャレンジの１２．２４．３０及び３６時間後に注射した。

（ｅ）　肝臓組織学：　肝、肺及び腎試料を１０％中性緩衝化ポルマリン中に固 定化し、パラフィンワックス中に浸漬し、断片化した。光学顕微鏡を行うため、 断片をヘマトキノリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。

（ｆ）　血清分析　Ｍｏｎａｒｃｈ　２０００　７６１型微小遠心ケミ力ル分析 器［Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＭＡ、レキシ ントンコを用いて試験を行った。試薬はその製造元から供給されている。

（ｇ）　統計法・　得られた結果は平均Ｓ、Ｅ、で表した。データの有意性はＤ ｕｎｃａｎ’ｓニュー°フルチプル°レインジ試験（Ｄｕｎｃａｎ’　ｓ　ｎｅ ｗ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ｔｅｓｔ）によって判定した。有意性はｐ ＜０．０５と確立された。

（ｈ）　肝の組織病理学：　ＡＮＩＴによる処置により、出血及び最小の好中球 浸潤、伝播性中度門脈周囲炎症及び浮腫を伴った実質細胞の液化壊死の最小又は 中程度の多病巣性の限界領域、及び胆管上皮の肥大、及び肝細胞グリコーゲン貯 蔵の枯渇を特徴とする肝損傷が認められた。これらの損傷は文献に報告されてい るものと類似していた。ｒｈＨＧＦによる処置により、肝実質細胞の壊死性損傷 は予防されたが、門脈周囲炎症、浮腫及び胆管変化は予防されなかった（第７図 −第１０図）。ｒｈＨＧＦで処置した動物の肝断片に有糸分裂数の増加が存在し ていた。

（ｉ）　肝酵素及びビリルビンレベル：　生化学所見を第１１図Ａ−Ｄ、第１２ 図Ａ−Ｄ、第１３図Ａ−Ｄ及び第１４図Ａ−Ｄに示す。ＡＮＩＴ処置は、肝酵素 ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＡＬＰを中等度に上昇させた。総ビリルビン値も有意に上昇 した。ｒｈＨＧＦによる処置によって、これらすべてのパラメーターが有意に改 善した。ｒｈＨＧＦ処置の用量−依存性が観察され（第１３図Ａ−Ｄ）、ＡＮＩ Ｔ注射の１２時間後のｒｈＨＧＦ処置によって酵素レベルが有意に改善された。

上記の記載は具体的な好ましい態様に関するものであるが、本発明がこれらに限 定されると解してはならない。開示の態様に対する種々の改変が、本発明の全体 的範囲を逸脱しない限り可能である。これらの改変はすべて、本発明の範囲に包 含されるものである。

配列表 （１）一般的情報 （ｉ）　特許出願人・　シェネンテク、インコーポレイテッド及びジャデユー、 ポーラ・エム （ｉｉ）　発明の名称：　肝細胞成長刺激（伍）配列の数＝　２ （ｉｖ）　連絡先。

（Ａ）　宛名　ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り・ポイント・ サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）　市：サウス・サン・フラッジス コ（Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国・アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０ （Ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型＋５．２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）　コン ピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・システム：　ＰＣ−Ｄ Ｏ３／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）　ソフトウェア：　ｐａｔｉｎ（ジエネンテク）（ｖ ｉ）　本出願のデータ： （Ａ）　出願番号 （Ｂ）　出願臼＋１９９２年５月１９日（Ｃ）　分類： （ｖｉ）　優先権主張出願のデータ： （Ａ）　出願番号＋０７／７１２．２８４（Ｂ）　出願口：１９９１年６月１０ 日（輯）弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名ニドレジャー、ジンジャ−・アール（Ｂ）　登録番号＋３３，０５ ５ （Ｃ）　参照／整理番号：　７０４Ｐ１（Ｌｘ）　電話連絡先情報 （Ａ）　電話番号：４１５／２２５−３２１６（Ｂ）　ファックス番号＋４１５ ／９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）配 列番号１の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ＋　４４５４塩基 ＣＢ）　型：核酸 （Ｃ）　ｔＪＩの数　１本鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１： ＧＴＣＭＣＡＡｅＣＡＴＡＧＴＣＣｅＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣｅＣＡＴＣ ＣＣＧ　ＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣ２５０ＣＧＣＣＣＡＣ７ＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣ Ｔ　ＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧ　ＧＣＴＧＡＣＴＭＴ　ｆｆｆｆｒＴＴＡＴ？　３０ ０ＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧ　ＣＡＧＣ＾ＣＡＴＣＣＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴ ＧＧＣＧＴ＾　八ＴＡＧＣＧＡＭ；Ａ　１４００ＧＴＧｋＡＡＧＴ八＾　入＾Ｇ ＡＴＯＣＴＧへ　＾ＯＡ？ＣＡＧＴＴＯＣ０Ｔ（ｉｃＡｃＯＡ（ｌ　ＴＧＧＧＴ ＴＡＣ八丁　２５５０へＣＡＡＣＴＧＧＡＴ　ＣＴＣｋＡＣＡＧＣＧ　ＧＴ八へ ＧＡＴＣＣＴ　ＴＣＡＣＡＣＴ丁’！’Ｔ　ＣＧＣＣＣＣＧｋＡＧ　２６００Ｃ Ａ丁ＡＣＣＴＣＯＣＴＣｒＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴ＾ＣＣＡＯＴＯＧＣ’ｒＧ Ｃ’ｒＧＣＣ＾ＧＴＧＯＩＪ八丁　３７Ｏ０（２）配列番号２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝８５８アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘＩ）　配列：配列番号２： 特表十６−５０８１４８　（９） Ｓａｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　にＧｌｎ　Ａｒｑ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｘａａ 　Ｓｅｒ　Ｌｙｅ　Ｘａａ　ＨＬｍ　Ｇｉｎ　Ｘ１ｔａ０　８５　９０ Ｘａａ　Ａｒｇ　Ｘａａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｘ１１＆　ＩＬｅ 　−ｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｅ＾ｓｎ　Ｖａｌ　Ｌ＊ｕ１１・Ａｍｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　ｃｌｙ　Ｘｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠ＨＬｍ　ｌｉ＠ｒし＋ｕ　Ａｌａ　Ａ ｒｇ　Ｌ＊ｕＬ＠ｕ　ｉｌｈ會り瞼ｕ　ＸＬｅＬｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ＾ｓｎ　 Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　５ｅｘ１２５　１３０　１ ３ｓ ｘ１＠＾Ｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｘａａ　Ｌｙｍ　Ｌｙｅ　Ａ ｓｎ　Ｌｅｕ＾１ｍ　Ｍｅｔ＾ｓｎ　！、ｅｕＴｈｒ　５＠ｒ　１４＠ｔ　ｔ、 ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｂｒ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　八ｌａ　Ｓ ｉｒ　Ｌｓｉｕ　ＶａｌＡｓｓ　１６０　１６５ ＬＹ＠　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　１ｔｃＪ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｌ ：　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａ１ｍ５＊ｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ 　５ｔａｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｔｙｒ　）ＩＬｓ　τ ｈ【　八ａｎ　τｈ【八１ａｉｌｌｓ　’　１９０　１９５ Ｐｈ＠　ｅＹｓ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　ｃｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｙ−丁 ｈｒ　ＴＹｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｅ　ｔｈｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｘ１ｔａ　Ｌ ａｕ　Ｇｌｕ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｍ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　ｇ＠ｔ　Ｇ１ｎ＾Ｌｍ　ＸＬｅＧｉｎ　八ｒｇ　Ｔｙｒ　ＡＬａ　丁ｈｒ 　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＶａＬ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｖａ１Ｇｉｎ　 Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ａ ｒｇ　ＶＪＩＬ　ＩＬｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ２４５　２Ｓ０　２５５ ｓｉｒ　Ｔｒｐ　ＩＬｅ　ＩＬｅ　ＧＬｎ　Ａｍｎ　Ｇｉｎ　八Ｌａ　Ａｒｇ　 Ｐｈ＠　ＶａＬ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅ１１ｅ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｈ ｌ−丁ｈｒ　Ｏｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｍｎ　Ｓａｔ　Ｃｙｉ　Ｌａｕ　ＬＹＩＩ　Ａ ＩＩＰ　ＸＬｍ　Ｐｒ。

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Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．肝細胞増殖性を増大させる方法であって、このような処置を必要としている 哺乳動物患者に肝細胞増殖を誘導するに有効な量の外因性肝細胞成長因子（ＨＧ Ｆ）、及びガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の相乗作用を示すに有効な量 を投与することを特徴とする方法。
2. ２．該外因性ＨＧＦをＩＦＮ−γ投与の前に行う請求項１に記載の方法。
3. ３．該外因性ＨＧＦをＩＦＮ−γ投与の後に行う請求項１に記載の方法。
4. ４．該外因性ＨＧＦ及びＩＦＮ−γを同時に投与する請求項１に記載の方法。
5. ５．少なくとも１つの製薬的に許容される賦形剤が混合されている単一医薬組成 物として該外因性ＨＧＦ及びＩＦＮ−γを投与する請求項５に記載の方法。
6. ６．該患者が急性又は慢性肝損傷に罹患している請求項１に記載の方法。
7. ７．該患者がヒトであり、該ＩＦＮ−γがヒトＩＦＮ−γである請求項６に記載 の方法。
8. ８．該ＩＦＮ−γがヒトデスＣｙｓＴｙｒＣｙｓＩＦＮ−γである請求項７に記 載の方法。
9. ９．該患者が部分的肝切除術にかかっている請求項７に記載の方法。
10. １０．該ヒトＩＦＮ−γを部分的肝切除術の約６日後以内に投与する請求項９に 記載の方法。
11. １１．該ヒトＩＦＮ−γを部分的肝切除術の約２４日後以内に投与する請求項１ ０に記載の方法。
12. １２．該ヒトＩＦＮ−γを液状医薬製剤として投与する請求項１０に記載の方法 。
13. １３．哺乳動物患者における肝細胞成長を刺激する方法であって、（ａ）該患者 の血清中ＨＧＦ濃度を測定し、（ｂ）該ＨＧＦ濃度を、同じ哺乳動物種の正常な 血清中ＨＧＦ濃度と比較し、次いで、 （ｃ）該ＨＧＦ濃度が該正常ＨＧＦ濃度よりも高い場合にＩＦＮ−γの相乗作用 を示すに有効な量を該患者に投与するか、又は（ｅ）該ＨＧＦ濃度が該正常ＨＧ Ｆ濃度と同じ又はそれよりも低い場合にＨＧＦの治療学的有効量とＩＦＮ−γの 相乗作用を示す有効量とを該患者に投与すること、 を特徴とする方法。
14. １４．治療学的有効量の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及び相乗作用を示す有効量の ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を含有する肝細胞再生を刺激するための 組成物。
15. １５．ＩＦＮ−γ約１００Ｕ−約１０００Ｕを含有する請求項１４に記載の組成 物。
16. １６．該ＨＧＦ及びＩＦＮ−γがヒト由来である請求項１５に記載の組成物。
17. １７．該ＩＦＮ−γがヒトデスＣｙｓＴｙｒＣｙｓＩＦＮ−γである請求項１６ に記載の組成物。
18. １８．少なくとも１つの製薬的に許容される賦形剤をさらに含有する請求項１６ に記載の組成物。
19. １９．ＨＧＦ誘導肝細胞増殖に対する成長インヒビターの作用を補償するための 方法であって、このような処置を必要としている哺乳動物患者にＨＧＦと相乗作 用を示す有効量のＩＦＮ−γとを投与することを特徴とする方法。
20. ２０．該成長インヒビターがＴＧＦ−β族又はアクチビンの一員である請求項１ ９に記載の方法。
21. ２１．生物学的に有効な量のＨＧＦ及び相乗作用を示す有効量のガンマインター フェロン（ＩＦＮ−γ）を哺乳動物患者に投与することを特徴とする、肝細胞成 長因子（ＨＧＦ）の生物学的活性を高めるための方法。