JPH04506342A - 非グリコシル化ヒトインターロイキン―３類似蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非グリコジル化ヒトインターロイキン−３Ｍ似蛋白質光盟Φ背量 本発明は一般的にはリンホカインに関し、特に大腸菌で産生されるｈｕｌＬ−３ 蛋白質と比較した場合有益な臨床的および毒性学的性質を示す選択され、切断さ れた非グリコジル化インターロイキン−３（ＩＬ−３）ＩＩ（［、ｌ蛋白質を含 む医薬組成物に関する。

造血細胞の分化および増殖はコロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）として集合的に知られ ている分泌糖蛋白質によりｆ［？Ｂされている。マウスおよびヒトの糸において は、正常骨髄からの顆粒球およびマクロファージ産生を促進し、また成熟し分化 した顆粒球およびマクロファージの活性を制限すると思われる顆粒球−マクロフ ァージコロニー刺激因子（ＣＭ−Ｃ５Ｆ）もこれらの蛋白質に含まれる。別のＣ ３Ｆとしてはマクロファージの選択的増殖を誘発するマクロファージＣ３Ｆ　（ Ｍ−Ｃ３ＦまたはＣ３Ｆ−１）および骨髄前駆体からの顆粒球前駆体の分化を誘 発する顆粒球Ｃ３Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆ）が挙げられる。最初にマウスの系で後にヒ ト細胞源から単離された別のＣ３ＦはＩ　Ｌ−３またはマルチ−ＣＳＦと称され ている。

マウスＩＬ−３は始めはＩｈ１ｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、　１ ユ」５２１８４　（１９８１）によりＴ細胞付随酵素、２０α−ヒドロキシステ ロイドデヒドロゲナーゼの発現を誘導する因子として同定された。この因子は均 質に精製され初期造血およびリンパ前駆細胞の多数の亜類の増殖および分化を制 御することが示された。マウスＩ　Ｌ−３に対応するｃＤＮＡクローンはＦｕｎ ｇ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ　３０７．　；　２３３（１９８４）、および Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、Ｕ　 ＳΔ　旦ユニ１０７０　（１９８４）により最初に単離された。マウスＩ　Ｌ− ３配列のテナガザルおよびヒトゲノムＤＮＡ相同体はＹａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　 Ｃｅ旦　４’７：３　（１９８６）により記載されている。　Ｙａｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、により報告されたヒト配列は成熟蛋白質配列の８位にセリン残基を含んで いた。この発見に続いて３つのグループがＰｒｏ”ｈｕｌｌ−３ｃＤＮＡの単離 を報告している、Ｄｏｒｓｓｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　５５　：　１１ ５　（１９８７）　；　０ｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、　 」−／［Ａと１２８８　（１９８８）　；およびＧ１１ｌｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、 Ｂｅｈｒ！ｎＩｎ５ｔ、門ｉｔｔ、　８３　：　ｌ　（１９８８）。

Ｐｒｏ”対立遺伝子の頻度を決定するための個体の調査がＧ１１ｌｉｓ　ｅｔ　 ａｌ、＋　（前記文献〕により報告されている。この仕事においては８位の側の ＤＮＡ配列を増幅するためポリメラーゼ連鎖反応が使用された。　Ｓｅｒ”およ びＰｒｏ”形に相補的な放射性標識オリゴヌクレオチドプローブが１３の遺伝的 に相関しない個体から単離された増殖ＤＮＡの証明に使用された。増殖されたＤ ＮＡはニトロセルロース上へ固定され高くしたストリンジエンシー条件下ハイプ リダイゼーシ町ンにより分析された。結果は試験された１３人の各々がｈｕｌＬ 　３のＰｒｏ”バージタンをコードしているＤＮＡに対して陽性であったことを 示した。この座位でＳｅｔ”　ｈｕルー３に対しても陽性であったことは（すな わち、ヘテロ接合体）、この試験集団中のヒトＩＬ−３遺伝子の多量が中程度で あることを示している。

色々な製造元で製造されたヒトＩ　Ｌ−３蛋白質の前臨床および臨床研究は臨床 有用性および毒性においての驚くべき相違を示した０組換え体ヒトＩ　Ｌ−３は 生体内での顆粒球形成、赤血球形成および最も重要な血小Ｗ薪生を刺激できる最 初のサイトカインであるようなので治療のｆめのヒトＩＬ−３の無毒で寛容でき る形の開発が重要である。

重度のｒｌＬ−３毒性がＶｅｌｅｎｔ　ｅｔ　ａｌ、により１９８９年６月１４ −１７日にドイツ共和国連邦のハノーバーで開かれた“造血、腫瘍学およびＡｌ ［Ｓにおけるサイトカイン”に関する第１回国際シンポジウムで報告された。大 １ＩＩｒＩｉにより産生されたｈｕｌＬ−３（Ｓｅｒ”）　’ＩＩ成物をアカゲ ザル（ｕ−１０）に毎日３回異なった用量で（０，１１，３３および１００　ｔ ｓ／ｋｇ／日、Ｓ、Ｃ，）１４日間投与し、続いて継続してＣＭ−Ｃ３Ｆ投与（ １４−２８日、５尾／ｋｇ毎日３回）を実施することにより生体内評価を行った 。すべてのサルが好酸球および好塩基球の増加により１４日目まで２−３倍白血 球（ＷＢＣ）が増加する応答をｒｈｕｌＬ−３に対し示した。ＷＢＣの細胞内に ヒスタミン（ＩＨ）はＩＬ−３処置後８−１０日目まで連続的に増加しているの が観察された。このｒＨの過剰は血しょうヒスタミン値の増加およびじんま疹様 発疹を伴い、皮膚生検標本で観察される真皮へのマスト細胞およびリンパ球の浸 潤を示している。このｒｈｕｌＬ−３組成物の臨床副作用はこのサイトカインの 好塩基球／マス）ＩＩ胞活性化およびヒスタミン産生効果によっている。

特表千４−５０６３４２　（２） 対照的に、本発明の蛋白質組成物はカニクイザルまたはヒト患者に投与された場 合、検出可能なしんま疹を示さず、真皮へのマスト細胞またはリンパ球の浸潤を 刺激しない、これらの毒性学的および臨床的研究の結果は実施例に報告されてい る。

質転換された酵母宿主により発現された１つまたはそれ以上の精製組換え体ヒト Ｉ　Ｌ　３　’（Ｐｒｏ”　Ａｓｐ”　Ａｓｐ”）類似体蛋白質を活性成分とし て含む医薬組成物を提供し、前記蛋白質は （ａ）　Ｎｅｔ’　ｒｈｕＩＬ３　（Ｐｒｏ’　ＡｓｐｌＳＡｓｐ”）　；、’ 　（ｂ）丁ｈｒ’　ｒｈｕルー３　（Ｐｒｏ”　Ａｓｐ”　Ａｓｐ”）　；およ び（Ｃ）、τｈｒ’　ｒｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ”　Ａｓｐ”　Ａｓｐ”）から成 る群より選択される。そのような組成分は、霊長類に注入された場合、検出可能 なしんま疹または真皮へのマスト細胞およびリンパ球の浸潤を起こさない。

！五Ω脛裡庄脱朋 本発明のｈｕＩＬ−３蛋白質組成物は天然の蛋白質とはＮ−末端がわずかに異な っている選択され、切断されたｈ−ルー３葭似蛋白質を含んでいる。そのような 切断された蛋白質は、多分酵母発現宿主による蛋白質分解の結果、互、立と旦１ ；（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の成熟ｈｕｒＬ−３蛋白質をコードしているｃＤ ＮＡの発現により得られる蛋白質の混合物の成分として観察された。これらの混 合物は以下のアミノ酸配列のＮｅｔ”、丁ｂｒ’または↑ｈｒ−にＮ末端を持つ １つまたはそれ以上のヒトＩＬ−’３　（Ｐｒｏ’、　Ａｓｐ”　Ａａｐ’・＞ ａｍ蛋白質を含むことができる（代わりのＮ−末端は下線が引かれている）： Ａｉｓ　Ｐｒｏ　ム璽−ＪＬｎ　冨１τｂｘ　Ｐｒｏ　ｕｕ　！＋ｙｓ　Ｔｈｒ 　ｈ＊　ｔｑ　Ｖａ工ｍｐＣＹＩＩ　＄＠ｊ”　ＪＩＪｆｌ　舅−ｔ　Ｚ工＠　 Ａｊｐ　Ｇｌａ　Ｘユ＠！Ｌ＠　テｂｚＲ五ｓ　ｔａｕ　Ｌｙｓ　（ｉｎｎ　ν ｒ。

ｔｗｏ　ｕｕ　Ｐｒｏ　Ｘ、＠ｕ　Ｌｕ１ｌ　Ｌａｐ　Ｐａｌ＠　Ａａｎ　Ａｓ ｈ　ｔａｘ　Ａａａ　ＧＬｙ　Ｇ工ｕ　ＪＬｓｐ　ＧＬｕＡｌｐ　Ｚ）＠Ｌ４％ Ｉ　１４＠ｔ　ＧＬｕ　ＡＪＩＩ　Ｊｉｓｎ　Ｌｊｕ　Ａｒｇ＾Ｒｑ　Ｐｔｏ　 ３１４＋！　ＧＬｕ　ＧＬ＋ａ’　Ｉ浮■ ｔｈｅＡａｎＡｔｑＡｌ＆ＷａＬＬｙｓＭａｔ：！４ｕＧ工ｉ＾１ｐ＾ニーＳｕ ｅ＾ｌ―Ｉ工噛ＧλすＭａｒＸｌ＊ｔａｕＬｙｓＡｓＩ′ＩｋｕＴａｕＰｔｏＣ ｙｍｋｕＰｒｏ１ｍｕＡＸ―τｈｚ＾ユａＪｕｎ　Ｐｒｏ　Ｔｂ＋＋轟；９に工 ｓ　Ｐｒｏ　ＸＬ＊　）ＩＩｓ　Ｘ工・　Ｌｙｓ　Ｍｐ　Ｇｌｙ　入ｓｐ　τｒ ｐ　入１ｎＧＬｕ　Ｗｂ＠　Ａｚｇ　ｈｔｑ　！＋７１　Ｌａｕ　ＴｈＸ　９ｈ ＠　Ｑｒ　ＧＬｕ　ＬｙａＴｈｅ　−ｕ　Ｇｌｕ　ＪＬｓｎＪｕａ　Ｇｌａ　ｕ ａ　Ｇｉｎ　Ｇ−艶【τｈｘシ＋ｕ　Ｓａｇシ＋ｕＡ工ａ　Ｘ１喝ｔｈｅ術語ｒ ｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ”＾５ｐＩｓ　ＡｓｐＷｅ）は８位にプロリン残基および １５および７０位にアスパラギン残基を持つ（ここで、残基１は成熟天然または 野生型ヒトインターロイキン−３の最初のアミノ酸を示している）組換え体ヒト インターロイキンー３ポリペプチドを意味している。そのようなポリペプチドの アミノ酸配列は上に示しである０種々のＮ−末端種は術語“ｒｈｕｌＬ　３”の 前にＮ−末端残基を示すことにより表わされる、例えば、Ｍｅｔ’　ｒｈｕＴＬ −３（Ｐｒｏ’　Ａｓｐ”　Ａｓｐマ・）。

本発明の類像蛋白質はアスパラギン部位での酵母宿主によるＮ−グリコジル化を 排除するための天然ヒ）ＩＬ−３配列中に存在するＮ−グリコジル化部位中の各 々のアスパラギンがアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換されている。

ヒトＩＬ〜３をコードしているＤＮＡセグメントは以下の実験の部に記載されて いるごときｃＤＮＡライブラリーから単離された０部位特異的オリゴヌクレオチ ド突然変ｌｌ誘発が続いて実施され、ヒトＩ　Ｌ−３（Ｐｒｏ”　Ａｓｐ”　Ａ ｓｐ”）をコードしているｃＤＮＡを得る。得られる変化したｃＤＮＡは適当な 酵母発現株の形質転換に使用された酵母発現ベクターの構築に使用され、それは 酵母プロモーターの抑制を促進する条件下培養して増殖させた。得られる蛋白質 は次に逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびイオン交換ク ロマトグラフィーを組合わせることにより精製され純粋な生成物を与えた。ヒト 骨髄増殖アッセイおよびヒトＩ　Ｌ−３受容体結合アッセイを用いるこの生成物 のアッセイによりヒト医薬使用に適したＩＩ（以生成物の発現が確認された。生 成物のＮ−末端配列決定はロフトによりＭｆｇｌ蛋白質の混合物がわずかに異な ることを示した。実質的に単一種、Ｍｅｔ３ｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ”　Ａｓｐ’ ″４ｓｐ？６）から成る組成物を得るために成熟蛋白質の最初の２つのアミノ酸 を特定するコドンを欠くコンストラクトのよみわく内に直接融合された酵母分泌 リーダーをコードしている配列を持つ第２の発現ベクターが構築された。

好適には、本発明の組成物は事実上Ｎｅｔ”　ｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ＠Ａｓｐ１ ＳＡｓｐ”）から構成されている。しかしながら、もし完全長成熟蛋白質をコー ドしている発現ベクターが用いられたならば、Ａｌａ’　ｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ ＠Ａｓｐ”　Ａｓｐ〒０）と１つまたはそれ以上の前記の群から選択される蛋白 質との混合物を含む混合物が得られるであろう、典型的には： （ａ）約３０から約４０パーセントのＡｌａ’　ｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ”　Ａｓ ｐＩｓＡｓｐ’・）；（ｂ）約１０から約３０パーセントのＭｅｔ″ｈｕｌＬ　 ３　（Ｐｒｏ”　ＡｓｐｌｓＡｓｐ”）　；および（ｃ）残りの分画は本質的に はＴｈｒ’およびＴｈｒ’　ｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ”　Ａｓｐ”　Ａｓｐ”）の 混合物から構成されている。

好適には、本発明の組成物は、ヒト骨髄アッセイにおいて約１，８から約７．０ ×１０’Ｕ／■（および好適には４．０から約７．０Ｘ１０’Ｕ／■）のおよび 阻害定数として表現されたヒト単球ＩＬ−３受容体の結合親和力では約２．０か ら約８．ＯＸ　１０　ｒ＠Ｍ−凰（好適には約４．０から約８．ＯＸ　１０１ｌ Ｍ−’）　（７）特異的生物活性を示した。別のＮ−末端を持つｒｈｕＩＬ−３ 蛋白質の小さな分画（１モル％未満）もまた本発明の混合物中に存在することも 理解されたい。

１　ｈｕＩＬ−３：　のアーセイ ｈｕルー３生物活性の測定に使用されたアッセイが以下に説明される。

Ａ　ヒト　ア・セイ 新しく分離されたヒト骨髄細胞を、前もって暖め、ガス処理され〜５０単位／− のペニシリン、５０１１ｇ／ｄのストレプトマイシンおよび３００　ｐｇ／ｄｌ の新鮮なＬ−グルタミンを含む無血清ＲＰＭ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｃｈ ａｇｒｉｎ　Ｆａｌｌｓ＋　ＯＲ。

ＵＳＡ）（以後“アッセイ培地”）ｄ当り２Ｘ１０−細胞を含む組織培養フラス コ中、３７°Ｃ１５％ＣＯ２で２時間前もってインキユベートする。インキュベ ーション後、付着していない細胞をフラスコの表面で穏やかに培地をピペッティ ングすることにより除去する。付着しなかった細胞を集め４℃で１０分間１００ ０ｒｐ１７１で遠心分離して集め、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む検定培 地の少量に再懸濁させ、生存率をトリパンブルーを用いて、白血球の回収をチュ ルク染色を用いて計数した。細胞はアッセイブレートに加えられるまでは１０％ ＦＢＳを含むアッセイ培地巾約４℃に保たれる。

５０８１のアッセイ培地を９６ウ工ル平底組織培養プレートの各々のウェルに加 える、アッセイ培地で希釈した５０ｄの試料を各々の列の最初のウェルに加え、 通常の方法で各々の列について連続的に希釈する０次に１００ｄの容量の１．２ ５×１０４骨髄細胞を各々のウェルに加える。プレートは乾燥を防ぐため無菌蒸 留ＨｘＯを含むプラスチック箱中、５％Ｃ０ｆｆで３７℃にて４日間インキュベ ートする。

４日間に５％ＦＢＳおよび８０１１ｃＩ／Ｉ１１の〔３Ｈ〕−チミン７（８０Ｃ ３／ミ１７モル）を含む２５ｄのアッセイ培地を各々のウェルに加え、プラスチ ック箱中３７℃、５％ＣＯＩにて５時間プレートをインキユベートする。インキ ュベージタン後、細胞をガラスファイバーフィルター上に集め、洗浄後シンチレ ーシッンカウンターを用いて取り込まれた放射活性を試験する。ｈｕｌＬ−３活 性の単位は最高のチミジン取り込みの５０％を誘導するｈｕｌＬ　３の量を参照 して計賞される０例えば、１００Ｉｌの試料が１１０ｆ）ｊｌｙ釈で層高チミジ ン取り込みの２分の１を示したら、１単位は１００．７の１／２０（または５０ Ｉ）に含まれている活性として定義される。それ故その試料はミリリットル当り １０００割る５、または２００単位（Ｕ／ｄ）のｈｕｌＬ　３活性を含んでいる であろう。

Ｂ　ヒトＩ　Ｌ−３轡　ムア・セイ ９６ウエル丸底マイクロタイタープレートに、０．０７５　、／ｌで始めたＲＰ Ｍ１１６４０培地で調製された１０の各々試料の２倍希釈液を入れる（各々５０ ｐＺ）。

各々のアンセイプレートにｒｈｕｌＬ３標準液（１，５，７ｄ）および陰性対照 液（結合培地）の５０ａｌを３通り加える。このアッセイの目的のための”結合 培地”とは２．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％（ｗ／ ｖ）アジ化ナトリウムおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，２を含むＲＰＭ１ １６４０を意味している。ＰＣＴ出願米国８９１０２５９９号に記載されている ごとくして調製された、５０８１の１”Ｉ　ｒｈｕｌＬ　３保存液（ＩＸＩＯ− ’Ｍ結合培地、比活性４８Ｘ１０”ｃｐｓ／ミリモル）を各々のウェルに加え、 続いて５０ｔｒｌのヒト単球を加える（遠心分離し、ＲＰＭ１１６４０で２度洗 浄し、結合培地に４ＸＩＯ’細胞／ｄで再懸濁したもの）、各々のプレートはロ ータリーシェーカー上激しくかき混ぜなから３７°Ｃにて１時間インキュベート する。インキュベージタン後、シラン混合物から６５４を２度採り、各々を２０ ０４の冷フタレートオイル混合１５（１，５部ジブチル　フタレート、１部ビス （２−エチルヘキシル）フタレート（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、＋　 Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）　）上に４００ｄのポリエチレン遠心チューブ中 で層積し、微量遠心分離機中８℃にて１分間遠心分離する。細ｌｌ！および結合 …ＩｒｈｕｌＬ−３沈渣はフタレートオイル混合物を通過するが、密度の小さい 非結合’　”　Ｉ　ｒｈｕｌＬ　−３を含む結合培地はその表面上に残る。細胞 に結合した’　”　Ｉ　ｒｈｕｌＬ　−３はチェープを半分に切断し、上端およ び先端部分の１１８■を計測することにより測定される。ＩＬ−３受容体結合ア ンセイは以下の式ｌに従って計算される阻害（％）として表わされる：式中、Ｍ ａｗは培地のみが存在する時の”’ＩＩＬ−３の結合のレベルであり、Ｍｉｎは １．５ａ／ｄの非標識物が存在する時の結合レベルおよびＴｅ５ｔは試料希釈液 が存在する時の結合レベルである。結果は以下の式２の非線形最小自乗法フィッ ティングにより分析される： １で与えられた形で表現されるデータに対し、Ｍ（％）は阻害の最高レベルであ り、Ｋ（Ｍ−１）は’　”　Ｉ　ｒｈｕｌＬ　−３の結合定数であり、Ｃ（Ｍ） は’　”　Ｉ　ｒｈｕＩＬ−３の濃度であり、！　（Ｍ）は試験試料の濃度であ り、Ｋｌ　（Ｍ−’）は試験試料の阻害（結合）定数である。試験試料のに、値 をｒｈｕｌＬ−３標準品のそれで割って見積ると、（Ｋｌ　／Ｋｓ　）（式中に ３は標準品の阻害定数）、相対的結合活性が得られる。

・　に・番　の 組換えｉヱ左…亙皇ス　セレビシェ（釦匹触区肛匹ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 宿主細胞が本発明の組換え蛋白質の発現に使用される。好適な発現ベクターは大 腸菌での選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｐ　’遺伝 子および複製起Ｂ）およびグルコース−抑制可能アルコールデヒドロゲナーゼ２ 　（ＡＤＨ２）プロモーターを含む酵母ＤＮＡ配列を含んでいるｐＢｃ１０２・ Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７２５５）から誘導できる。ＡＤＨ２プロモーターは　Ｒｕ ５ｓｅｌｌ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、、　１足置：　２６７４　（１９８２）およびＲｅｆｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｎａｔｕｒｅ　％７２４　（１９８２）により記載されて いる。プラスミドｐＢｃ１０２・Ｋ２２はまた選択可能マーカーとしてのＴｒｐ ’遺伝子および酵母２μ複製起源も含んでいる。プロモーターに隣接しているの は酵母宿主から異種蛋白質の分泌を可能にすに酵母α−因子リーダー配列である 。α−因子リーダー配列の外来遺伝子への融合を容易にするために、その３′末 端近くにＡｓｐ７１　Ｂ　（ＫｐｎｌおよびＡｓｐ７１８はアイソシゾマー）を 含むようにこの配列は改変されている。Ｂｒａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、〜ａｔ１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ　ＵＳＡ　ｊＪ−土：　４６４２　（１ ，９８４）により記載されているごとく、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａアミ ノ酸をコードしている配列は分泌蛋白質の効率のよい処理を可能にするため除去 されている。

別の発現ベクターは、α−因子プロモーターを含む酵母ベクターであり〔例えば 、ｐＹαＨｕＧＭ（ＡＴＣＣ５３］５７））それは野生型ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを運 んでいる。別のものも当業者には知られている。ＰＹαＨｕＧＭの構築は公開さ れた欧州特許出願第１８３，３５０　（８５３０６８２，７）号に記載されてお り、その開示内容はここに文献として含まれている。

形質転換のための適当な酵母株の選択は選択可能マーカーの性質およびベクター の他の特質により決定されるであろう。ｐＢｃ１０２．に２２またはｐｙαＨｕ ＧＭから誘導される発現ベクターによる形質転換に適した互、セレビシェ（ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ）株には、Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｂｅ ｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ、　ＵＳ　Ａ　（下記参照）から入手可能で遺伝子型（ｒ Ｌｒｐｌ　ｇａｌｌ　ａｄｅｌ　ｈｉｓ２　；　Ｊ　１７を持つＸ２１８１１Ｂ 　（ＡＴＣＣ５２６８３；ａ　ｈｉｓ２　ａｄｅｌ　ｔｒｔｌ　ｍｅｔ１４　ｕ ｒａ３）　；およびＩＬ１６６−５８　（ＡＴＣＣ４６１８３；αｈｉｓｌ　ｔ 、、１）が含まれる。ｐＢＣ１０２−に２２、ＸＶ２１８１で使用するのに特に 好適な発現株は２つの１倍体株の交配により形成される２倍体のＸ　２１８１− 　Ｉ　Ｂ　（’ｆｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐ ａｒｔｍｅｎｔ、ｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｈ ｙｓｉｃｓ、ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ@ｏｆ　Ｃａ１− ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ９４７０２．　ＵＳＡから入手可能 ）；およびＸＶ６１７］、　３　Ｂ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、５ｅａｔｔｌ ｅAＷ Ａ９８１０５．ＵＳＡ、またはＩｍａｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＋　５ １　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ。

５ｅａｔｔｌｅ、ＷＡ９８１０１．　ＵＳＡから入手可能）である、適切な形質 転換プロトコールはＨｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃ４．　ＩＪｓΔ　７５：１９２９（１９７８Ｌにより記述されており 、０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、Ｌｏｇ／ｄ アデニンおよび２０Ｒ／ａｆウラシルを含む選択培地中でＴｒｐ”形質転換体を 選択する。

ＡＤＨ２またはα−因子プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主 株は１％酵母抽出物、２％ペプトンおよび１％グルコースから構成さね、８０ｇ ／ｄアデニンおよび８０Ｒ／ａｌウラシルを補給したリッチ培地中で発現のため に増殖させる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制は培地グルコースの消耗により生じ る。粗酵母上澄液を濾過して集め、更に精製するまでは凍結させるかまたは４℃ に保つ。

ｌ−土旦ニュ９糧製 酵母株の醗酵により得られる紐換えｈｕｌＬ−３は、Ｕｒｄａｌ　ｅｔ　ａｌ、 、ム堕収懸旦Ｌ２９６：１７１　（１９８４）およびＧｒａｂｓｔｅｉｎ　ｅｔ 　ａｌ、、ムｈム抛ム　ｌ旦ｌ：１４０５　（１９８６）に記載されている方法 と類似の方法により一回または連続的な分取用ＨＰＬＣカラムによる逆相ＨＰＬ Ｃ工程により精製できる。好適な精製プロトコールは下記実施例２に記載されて いる。

−皇一一一駁− ＡｈｕｌＬ−３コー゛しているｃＤＮＡの末梢血リンパ球はフィコールハイパツ ク密度遠心法により全血（Ｐｏｒｔｌａｎｄ　ＲｅｄＣｒｏｓｓ、　Ｐｏｒｔｌ ａｎｄ、　Ｏｒｅｇｏｎ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）から調整された白血球層から分離さ れた。Ｔａｌ！胞は２−アミノエチルチオウロニウム　プロミド−処理ヒツジ赤 血球細胞でロゼツト形成させて分離された。細胞は１０１００ｄＲＰ　（１０％ ウシ胎児血清、５０ＩＭ　β−メルカプトエタノール、１％フィトヘマグルチニ ン（ＰＨＡ）および１０ｎｇ／ａｔホルボール１２−ミリステート　１３−アセ テート（ＰＭＡ）Ｅ中１７５ｃｊのフラスコで５Ｘ１０”細胞／１１ｉにて１８ 時間培養した。ＲＮＡはグアニジニウムＣｓＣ１法により抽出され、ポリＡ″Ｒ ＮＡはオリゴ−ｄＴセルロース　クロマトグラフィーにより調製された（Ｍａｎ ｉａｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、モレキュラークローニング：実験手引、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｉ　９８２　）。ｃＤＮＡはポリＡ゛ＲＮＡから 本質的にＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎにより記載されているようにして（ Ｇｅｎｅ　７五：２６３　２６９　（１９８３））調製された。ｃＤＮＡはＤＮ Ａポリメラーゼ■を用いて二本鎖となし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑端化し 、ｃＤＮＡ内のＥｃｏＲＩ切断部位を保護するためにＥｃｏＲＩメチラーゼでメ チル化し、ＥｃｏＲｒリンカ−を連結させた。これらのコンストラクトをＥｃｏ ＲＩで消化してｃＤＮＡの各々の末端のリンカ−のすべてしかし１つのコピーを 除去し、バクテリオファージλｇｔｌＯのＥｃｏＲＩ−切断および脱リン酸化ア ーム（Ｈｕｙｎｈ　ｅｔａｌ、、ＤＮＡクローニング：実際的方法、　Ｇｌｏｖ ｅｒ、　ｅｄ、、Ｉ　ＲＬ　’Ｐｒｅｓｓ＋　ρ９．４９−７８）に結合させ、 製造元の指導に従ってλファージ抽出物内ヘバッケージングした（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｏｇｏ、ＣＡ、　（ＪＳＡ）　＊　５００＋ＯＯＯ組 換え体を大腸菌株Ｃ６００Ｍ１−上に置き、下記のプローブを使用して標準ブラ ークハイブリダイゼーシッン技術によりスクリーニングした。　′ｈｕｌｌ、− ３遺伝子の選択された５′および′３′配列と相補的な配列を持つ２つのオリゴ ヌクレオチドが合成された。ｈｕｒｔ−３リーダーの部分をコードしている配列 と相補的な５′プローブは５’−ＧＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡ−ＧＧＡ Ｃ−３’の配列を持っていた。成熟蛋白質のアミノ酸１２３−１３０をコードし ている領域に対応する３′プローブは配列５’−ＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＣＴＣＡ ＡＡＧＴＣＧＴ−３’を持っていた０合成方法は５ｏｏｄａｔａ＋、、Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、４；２５５７　（１９７７）およびＨ４ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａ ｔ、。

Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、２８　；２４４９　（１９７８）により記述されている方 法と実質的にａｍの標準自動化トリエステル法であった０合成に続いてオリゴヌ クレオチドを脱保護し、分取用ゲル電気泳動により精製した。スクリーニング　 プローブとして使用するために、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、により記載さ れている技術と類似の技術を用いて”Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド　 キナーゼでオリゴヌクレオチドの末端を放射標識した。ライブラリースクリーニ ングに使用された大腸菌株はＣ６００ｈｆｌ　−（Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８５．上記文献）であった。

１３の陽性プラーグが精製され、２つのハイブリダイゼーシタンブローブで別々 に再プローブ化された。１１のコロニーが両方のオリゴヌクレオチドにハイブリ ダイズした。いくつかの陽性組換え体ファージからのｃＤＮＡ挿入物が特異的Ｅ ｃｏＲ１部位、Ｂａ５Ｈ１部位および多数の独特の制限部位を持ち、ポリリンカ ー特表平４−５０６３４２　（４） を含むｍ準りローニング　ベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−切断誘導体（ｐ ＧＥＭＢＬｌ　Ｂ）内へサブクローン化された。この型のベクターの例、ｐＥＭ ＢＬはＤｅｎｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｇ　Ｒｅｓ、１上：１ ６４５　（１９８３）により記述されており、ＳＦ３のためのプロモーターおよ びＴ７ボリメラーゼが多クローニング部位のそばにある。Ｒ択されたクローンの ヌクレオチド配列は頷終止法により決定された。特に、ＩＣＴｌ０　：　ＩＬ− ３クローン２．　３．　４および５の部分Ｅｃ。

Ｒ１消化は８５０ｂｐから１０００ｂｐの大きさの範囲の断片を生じさせ、それ らは別々にｐＧＥＭＢＬｌ８のＥｃｏＲＴ部位内へサブクローン化された。ｐＧ ＥＭＢＬ　：　ｒｈｕＩＬ−３サブクローンの挿入物はｐ　Ｃ，ＥＭＢ　Ｌ　１ ’８の多クローニング部位に隣接して結合するユニバーサルプライマーおよびｈ ｔｃｒＬ−３配列から誘導される合成オリゴヌクレオチドブライマーを用いて配 列決定された。

実施例１：ｈｕｌＬ−３ｃＤＮＡによりコードされているＮ−グリコジル化部位 の改変およびｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ＠Ａｓｐ”　Ａｓｐ”）のための　ベタ　 −の　で 天然量白賀中に存在する２つのアスパラギン−結合グリコジル化部位（Ａｓｎ” およびＡｓｎ”）がこれらの位置のコドンをアスパラギン酸をコードするコドン に変化させることにより変えられた。このことで酵母細胞による分泌された蛋白 質のＮ−結合グリコシル化（しばしば過グリコジル化）が防止され、より均質な 生成物が得られる。これらの変化はｈｕＩＬ−３ｃ　ＤＮＡを酵母発現ベクター ｐｌＸＹ１２０内へサブクローニングで以下に記述するようにしてなされた。

酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０はｐＢｃ１０２・Ｋ２２　（ＥＰＡ２４３．１ ５３に記載されている）と本質的には同一であるが、ただし多クローニング部位 を含む下記の合成オリゴヌクレオチドが２ｕ配列に含まれる５ｐｅ１部位のα− 因子シグナルベブチドの３′末端近くのＡｓｐ７１８部位（アミノ１ｉ７９）に 挿入さていた： さらに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列のＮｒｕ１部位に複製起点および遺伝子開領域 を含む一本護バクテリオファージｆ１から誘導された５　１４ｂｐＤＮＡ！７ｒ 片が挿入されていた。複製のｆ１１配の存在は大腸菌の適当な（オス）棟内へ形 質転換され、バクテリオファージｆ１で重感染させた場合にベクターの一本鎖コ ピーの発生を可能にする。この能力はベクターのＤＮＡ配列決定を容易にし、イ ンビトロでの突然変異誘発を可能にする。

酵母発現ベクターＰＩＸＹ１２０をα−因子リーダーペプチドの３′末端（ヌク レオチド２３７）の近くを切断するＡｓｐＴ　Ｌ　８およびポリリンカーを切断 するＢａ５Ｈ１の制限酵素で消化した。大きなベクター断片を精製し以下のＤＮ Ａ断片に結合させた：（１）プラスミドＧＥＭＢＬ１Ｂ　：ｈｕｌＬ−３のＣｌ ａｌ部位（成熟ｈｕｌＬ−３ヌクレオチド５８）からＢａ５Ｈ１部位（ポリリン カー中ｂｕｌＬ−３ｃＤＮＡに対して３′）から誘導されたｈｕｌＬ−３ｃ　Ｄ ＮＡ断片；および（２）下記の合成オリゴヌクレオチド　リンカ−Ａ： ＣＴＡ　ＧＣＴ　？？１３　αへτＡＡＡ　ＡＧＡ　ｃａｅ　ＴＡｃｋＡａ　Ｇ ＡＣＧＡＣＧＡＴ　Ｃ４Ｍ：　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＣＣｃＡτf α＾　ＡＡＣＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ 　ＣＴＡ　ＣＴＧ　？！’ｌ：　ＣＧＡ　ＧＧＧ　？ＡＣＡＣＣＣＡＧ　Ｎ＄　 ＡＣＧ　ＣＣＣＴＴＣＡＡＧ　ＡＣ（：　ＡＧＣＴＧＧ　Ｇ？？　ＧＡｊ：　Ｔ Ｇｅ　ＴＣＴ　ＡＡＣＡＴＧ　ＡＴ’ｒａａａτＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧ　ＡＡＣ ＴＴＣＴＧＣＴＣＧ　ＡｃｃＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＴＴＣで＾Ｃτ ＾ａｃオリゴヌクレオチドＡはα−因子リーダーペプチドのＣ−末端をコードし ている配列を再生し、それをオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫの読みわく内へ融 合させそれは順に成熟ｒｈｕｌＬ−３のＮ−末端へ融合された。このｒｈｕｌＬ −３蛋白質への融合はオクタペプチドに対して特異的な抗体での検出を可能にし 、初めにｒｈｕ　ＩＬ−３の発現および精製のモニタリングに使用された。この オリゴヌクレオチドはまた１５位のアミノ酸変化（ＡＳｎ″からＡｓｐ′Ｓ）も コードしておりこのＮ−結合グリコシル化部位を変化させた。オリゴヌクレオチ ドＡ中の下線を引いたヌクレオチドは野生型ｃＤＮＡ配列から変更を示している 。ヌクレオチド４３および４５、　（成熟ｈｕＩＬ−３分子のＮ−末端アラニン に対応するコドンから数えて）での各々ＡからＧおよびＣからＴだけの変更でア ミノ酸変化（Ａｓｐ”）を生じる。他の塩基変化はアミノ酸配列を変化させるこ となく都合の良い制限部位（ＡｈａｌｌおよびＰｖｕｌｌ）を導入する。得られ たプラスミドはｐｌＸＹ１３９と称ぎ顛　１つの残余Ｎ一連結グリコシル化コン センサス配列（Ａｓｎ？６）を持つｒｈｕｌＬ　−３ＣＤ　Ｎ　Ａを含んでいる 。

Ａｓｎ”をＡｓｐ？ｌ′に変化させることにより第２のＮ一連結グリコシル化コ ンセンサス配列を除去するためのオリゴヌクレオチド−指令突然変異発生にプラ スミドρＩＸＹＩ３９が使用された。インビボ突然変異発生は−ａｌｄｅｒおよ び−ａｌｄｅｒ、　Ｇｅｎｅ土又：１３３　（１９８６）により記述されている 方法と類似の方法により実施された。一本領バクテリオファージ【１のための複 製起点を含む酵母ベクターｐｌＸＹ１３９は、大腸菌の適した（オス）株の存在 下へルバーファージで重感染させた場合、−末鎖ＤＮＡを発生させることが可能 である。

−末鎖ＤＮＡは形質転換大腸菌株ＪＭ１０７およびヘルパーファージＩＲＩでの 重感染により発生された。一本：１［ＤＮＡを単離し、下記の突然変異発生オリ ゴヌクレオチドＢ ＧＴＣＡＡＧ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　（ｉＡＣＧＣＡ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　Ａ ＡＴ　Ｇとアニール化すると成’、ｌ’ｊｈ　ｕ　Ｉ　Ｌ　−３の７０位のＡｓ ｎをＡｓｐに変化させるコドン転換を与える。アニーリングおよび酵母形質転換 条件ばＷａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｄｅｒ　（前記文献）により記載されてい るように行われた。酵母形質転換体はトリプトファンを欠く培地で増殖させるこ とにより選択され、プールされ、Ｈｏ１ｅ　ａｔ　ａｌ、＋Ｇｅ匹　婬：１６９ 　（１９８６）に記載されていることくしてＤＮＡが抽出された。野生型および 突然変異体プラスミドＤＮＡの混合物を含むこのＤＮＡが大腸菌ＲＰＩをアンピ シリン耐性にするために形質転換に使用された。生しるコロニーは常法を用いて 放射標識オリゴヌクレオチドＢへのハイブリダイゼーションによりスクリーニン グされた。ｈｕｌＬ　−３Ａｓｐ”を含むプラスミドはストリンジェント条件下 放射標識オリゴヌクレオチドＢへのパイプリダイゼーシテンにより固定嬢−ヌク レオチド配列決定により確認された。

得られた酵母発現プラスミドはｐｌＸＹ１３Ｂと称され、ＡＳＰ”Ａｓｐ？Ｏア ミノ酸変化およびＮ−末端のオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫをコードしている ｈｕｌＬ−３遺伝子を含んでいた。最終酵母発現プラスミドはｐｌＸＹ１３Ｂと 同一であるが、ただし、オクタペプチドをコードしているヌクレオチド配列を欠 くため、成熟ｒｈｕｌＬ　３を生成物として発生させる。

最終酵母発現プラスミドは下記のごとく構成されていた。酵母発現ベクターｐｔ ＸＹ１２０が前記のごとく制限酵素Ａｓｐ７１８およびＢａｍＨｌで切断された 。大きなベクター断片を＜　１　）　Ａｂａ１１部位（成熟ｈｕｌＬ−３のヌク レオチド１９を切断）からｃＤＮＡに対して３′のＢａｉ＋Ｈ１へのびたプラス ミドｐｌＸＹ１３８から誘導されたｈｕｌＬ−３ｃ　ＤＮＡ断片、および（２） 下記の合成オリゴヌクレオチドＣと一緒に連結された： オリゴヌクレオチドＣはＡｓｐ７１８部位からα−因子リすダーベブチドの３′ 末端（アミノ酸　Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａｒｇ）お よびＡｈａ１１部位に対してｂｕ　ＩＬ−３のＮ−末端の７つのアミノ酸を再生 させる。得られるプラスミドはｐｌＸＹ１５１と称された。このベクターが酵母 に存在する場合、ｒｈｕＪＬ　−３（Ｐ　ｒｏ“Ａｓｐ”Ａｓｐ”）のグルコー ス−制御発現および分泌を可能にする。はとんどＭｅｔ”ｒｈｕＩＬ３　（Ｐｒ ｏ”　Ａｓｐ”Ａｓｐ”）から構成される比較的均質な組成物を提供するため、 ｐ＋ＸＹ２９０と称される類似の発現ベクターが天然ヒ）ＩＬ−３蛋白質に存在 するＡｌａおよびＰｒｏを特定するコドンを欠くオリゴヌクレオチドＣと同一の 置換オリゴヌクレオチドを用いて構成された。適した宿主にトランスフェクトし 、適当な条件下増殖させると、このベクターは本質的に完全にＭｅｔ’　ｒｈｕ ｌＬ−３（Ｐｒｏ”Ａ　３ｐ’Ｓ　Ａ、、ｆｆ６）生成物から成るｒｈｕｌＬ− ３ｉｌ製物の発現を指令できた（下記実施例３参照）。

：　ｒｈｕｌＬ−Ｐｒｏ”　Ａｓ　”Ａｓ↑・・ムの宿主株ＸＶ２１８１（２倍 体旦、セレビジ’　ｓ　（ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　１ａｅ）株〕はＸＶ６１７−１− ３　Ｂ　（α、　ｌ」工Ｍ　ｋトＬ肛虹ムｓｔｅ　５　）　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙｏｆ　＆Ｉａｓｈｉｎｇｔａｎ＋　Ｄｅｐａｒｔｔｚｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ　Ｙｅａｓｔ　５ｔｒａｉｎ　ＢａｎＬ　５ｅａｔｔ撃■A　ＷＡ。

、ＵＳＡから入手）およびＸ２１８１−ＩＢ　（α、ｋＬｈ　組貝、観１．襄〕 （Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ＋　ｔｌｎｔｖｅｒ ｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ；　Ｂｅｒｋｅｌｅ凵A　ＣＡ。

ＵＳＡから入手）を交配させて形成させた。宿主株は５ｈｅｒ＊ａｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、（酵母遺伝学の方法のための実験過程マニュアル、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８６）の方法により発現プラ スミドで形質転換される。

発現プラスミドｐｌＸＹ１５１（前記実施例１参照）を含む酵母は４℃で貯蔵さ れたＹＮＢ−ｔｒｐ寒天プレート上に維持される。前培養は１す７）ルのＹＮＢ −ｔｒｐ培地（６，７ｇ／Ｌ酵母窒素塩基、５ｇ／Ｌカザミノ酸、４０［／Ｌア デニン、１６０■／Ｌウラシルおよび２００ｍｇ／Ｌチロシン）中へいくつかの 単離された組換え酵母コロニーを接種することにより開始され、２つの２リツト ルのフラスコ中３０°Ｃで激しく振とうしながら一夜増殖させる。ＪＭ朝培養液 は飽和されており（定常期）、ＯＤ＆。。は２から７である。前もって洗浄し殺 菌された発酵槽（１０リツトルの作業容量の器機３つ）にその作業能力の８０％ まで５Ｄ−２培地（４，０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、３．２ｇ／Ｌｌ１７酸２水 素カリウム、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出液、１．０ｇ／Ｌクエン酸、ｏ、ｔｇ／Ｌ塩 化ナトリウム、５ｄ／Ｌ２％塩化カルシウム、２．５ａｆ／Ｌビタミン１０１溶 液、０．５ａｆ／Ｌ微量元素溶液、０．５ｍ／Ｌ２０％硫酸マグネシウム、２． ０ｄ／Ｌグ／ｌｚ？−ス）を満たし、３０’Ｃにて５００−６００ｒｐｍのかき 混ぜおよび１０〜１６４！ｐｍの通気を行った。

接種物を加える。増殖２時間後、１０−１２時間かけて５０　ｇ／Ｌを加えるよ うな速度で５０％グルコースの栄養供給を始める０次に採取まで３０−４０ｍ／ 時間の速度での５０％エタノールの添加へと栄養供給を移行させる。

発酵の全経過時間は約２０時間であり、光学密度（６００ｎｍ）は３０から４５ の範囲である０発酵槽は次に２０℃まで冷却し、酵母ビールのＰＨを５Ｍ　Ｎａ ＯＨを添加することにより８．０に調整し、得られる物質は０．４５ｍフィルタ ーカセットを備えたミリポアペリコン　フィルターシステムを通して濾過し、無 菌の１０Ｌの箱入りガラスびんに集めた。

酵母ブロスに含まれているｒｈｕｌＬ−３は１５−２０ｐＣ−４逆相シリカ（Ｖ ｙｄａｃ＋５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ｐｅｒｒａ、ＣＡ、 ＵＳＡ）が詰められた５ＣＩＩＸ３０Ｃ１のカラム上へのせる（濾過酵母ブロス を直接ボンピングする）。カラムは酵母ブロスを加える前に０．１％トリフルオ ロ酢酸水溶液（溶媒Ａ）で平衡化し、ブロスを全部加えた後溶出液の光学吸光度 かヘースライン値に達するまでカラムをこの溶媒で溶出する。この時点で０．１ ％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）のグラジェント（分当り２ ％Ｂの変化速度で０％Ｂから１００％Ｂへ〕を確立し、その流速は１００Ｉ１１ ／分である。グラジェントが３０％Ｂに達した時に５分の間隔を置くことをグラ ジェントコントローラー内へプログラムする。グラジェント開始から２０分後、 １分間づつの分画を採取する０分画の一部をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標 準品として用いるフルオレスカミンアッセイにより蛋白質含量を分析する。ｒｈ ｕＩＬ−３は分画８，９および１０に溶出することが観察された。

最初の工程からのｒｈｕｌＬ　３含有分画は、約１グラムの総蛋白質が得られる までポリエチレンびん中で４°Ｃにて保存する。そのプールへ２容量の０．１％ トリフルオロ酢酸水溶液を添加する。この溶液は次に溶媒Ａ（０，１％ＴＦＡ水 溶液）で平衡化されている１　５−２０ｕＣ−１８シリカ（Ｖｙｄａｃ、　５ｅ ｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ＋Ｈｅ５ｐ−ｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が充填 された第２の５ｃｍＸ３０ｃｔ＋カラムへ加える。材料を加えた後、カラムは溶 媒Ａを十分に流し、分当り１％の溶媒Ｂへの変化速度および１００Ｉｔｌ／分の 流速で前記の同一のグラジェントを確立する。グラジェントにはいり２４分まで ０．４分毎の分画を集める０分画の一部を採り、ＢＳＡを標品として用いるフル オレスカミンアッセイにより蛋白質含量を分析する。

Ｃ−１８カラムからのピーク分画をプールし、１／１０容量の０．５Ｎβ−アラ ニン、ｐＨ３，６を添加する。試料をとりそのプールされたものは１０ａｅＳ− セファ０−スカラム（Ｉ　ＣＩ　Ｘ　１０　Ｃ１１，ｐｈａｒｍａｃｉａ）に５ ａｆ／分で注ぐ、試料を注いだ後、カラムを５０−のｌＯｍＭ）リス、ｐ　Ｈ７ ，４で洗浄し、１０ｍＭトリス、ｐＨ７，４から２００ｍＭ）リス、ｐＨ７，４ への直線のグラジェントでＩＬ−３を溶出する（２００ｄの総グラジェント容量 ）、ｒｈｕＪＬ−３のピーク分画は、プールし１００ｍＭトリス、ＰＨ７，４に 対して一夜４°Ｃにて透析し、除菌濾過する。

本質的に前記のごとく調製されたｒｈｕ［１３の３つの生産ロットの生物活性（ 単位／■）および結合親和性が決定された。結合親和性は精製された蛋白質を用 いて阻害定数（Ｋ１）の決定により評価された。結果は下記表１に示しである。

表１においては、２つの別のアッセイにおいての３回の試料実験の平均としてす べての値は表現されている。

これら３つのロフト（Ａ２２−０００１−０００３）のｒｈｕｌＬ　３はまたエ ドマン分解による蛋白質配列決定にかけられ、各々のＰＴＨアミノ酸残基の積算 値（ピコモル）が既知の蛋白質配列と比較された。直線回帰分析各々の同時実施 の配列の線が得られ、調製液中の各々の配列の優勢度（％）の推定に使用された 。

結果は下に示しである。

表１＝ ｒｈｕｌＬ　３　口１２トのＮ−１゛　および　へ親和性　モルＯ比活性　結合 ロット　ＩＩ！二　八に′鼠酊８工敗゛工庶６　（刈７Ｗ壓）（Ｘ迎”Ｍ−’） ＡＺＺ−０００１３４２３３１１２４，５５，５８ＡＺＺ−０００２３５１５１ １３９５，６７，１４ＡＺＺ−０００３３７１８１４３１５，０５，９５実施ｆ ３３　：　Ｍｅｔ３ｒｈｕｌＬ　−３Ｐ　ｒｏ″Ａｓｌ５Ａｓ７ｏ　の　および 本質的に実施例２でｐｌＸＹ１５１に対して記載したようにして発現ベクターｐ ｌＸＹ２９０（前記実施例１参照）が互、セレビジｓ　（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）生産株ＸＶ２１８１内へトランスフェクトされた。

接種物は０．５　ｍ　Ｌの生産株の凍結グリセロール保存液を（ａ）無ＩＩ　Ｈ ｔ　ｏリンドル当り；　２０．　Ｏｇ　（ＮＨａ）ｚｓＯａ　；　５、ＯｇＫＨ ｚＰＯａ　；　１．ＯｇＭｇｓＯ＊　・７）１ｚｏ；　ｏ、　１　ｇｃａモ戟B ・２８ｚＯ；　ｌ　Ｏ，Ｏｇカゼモノ消化物；２０．０ｇグルコースおよび２０ ．０ｇガラクトース；を含む５００ｄの酵母増殖培地；　（ｂ）無菌Ｈ，０リッ トル当り：５．０ｇホウ酸；２．Ｏｇｔ！酸銅；１０．０ｇ塩化第二鉄；１０． ０ｇ硫酸マグネシウム；０．５ｇモリブデン酸ナトリウム；１．０ｇ硫酸亜鉛； ０．５ｇ塩化コハル（・；および１００ｉｄ６Ｎ）ＩＣＩを含む０．５　ｍの微 量塩混合物；および（ｃ）無菌ＨｚＯリットル当り：１．０−の０．２％ビオチ ン溶液；１．０ｇパントテン酸カルシウム；２５．Ｏｇミオイノントール；　５ ．　Ｏｇナイアシン；０．４ｇピリドキシン−ＨＣｌｌＯ，１ｇ葉酸；および０ ．５ｇ塩化コリンを含む０．５ｄのビタミン溶液を含む６Ｌのフラスコに接種す ることにより調製された。この接種培養液は２５０ｒｐｍの回転フラスコ振とう 器中約２４時間３０℃にてインキュベートされた。

１０リツトルの発酵槽に５０ｇのリン酸２水素カリウム、２００ｇの硫酸アンモ ニウム、１０ｇのＮｇＳＯｎ−７１１１０，１，０ｇのＣａＣ１ｇ　・２ｕｘＯ および２ｊｌ１Ｍの消泡表面活性剤を含む７．５Ｌの脱イオンｌＩｇｏを満たす ことにより発酵の準備をした０発酵槽は攪拌しながら１２１℃に３０分間加熱す ることにより殺菌した。殺菌後、発酵槽に３５ｍ！の１％Ｃｗ／Ｖ’）チアミン −［ＩＣ１，５００−の１０％カゼイン加水分解物、１００−の５０％グルコー スおよび２５−づつの前記ビタミンおよび微量塩溶液を補給した。３０％龍４０ ８を添加することにより発酵槽ｐＨ＠ｐＨ＆５に制御し、溶解された０３は２９ ℃で１００パーセントに及んでいた０次に接種物の内容物を発酵槽に加え、（ａ ）３６００−の５０％グルコース；（ｂ）［ＩｔＯリットル当り？２５０ｇ硫酸 アンモニウム、１２５ｇのリン酸２水素カリウムおよび２５ｇのＭｇ５Ｏａ　・ ７Ｂ、０から成る６２５ｄの酵母給餌塩溶液；　（Ｃ）９００ｍの５０％ＥｔＯ Ｈ；　（ｄ）６０−の１％チアミン−〇ＣＩ　；　（ｅ）４５０ｍｌの２０％酵 母抽出物ｉ　（ｆ）４５０−の２０％ペプトン；　（ｇ）９００−の２０％カゼ イン加水分解物；および（ｈ）２５ｄづつの前記ビタミンおよび微量塩溶液から 成る給餌溶液の分当り約２．０−での供給を開始した。給餌速度をこのレベルに 約２０時間保った後、約２０時間分当り３．２５−に調整し、その後本質的に前 記実施例２に記載したようにして培養上澄み液を採取した。

酵母ブロス中のｒｈｕｌＬ−３は最初に１％ベータメルカプトエタノールＰＨ７ ，４に調整し、重量で１時間インキュベートすることにより還元された。得られ た混合物は直接濾過酵母ブロスをカラム上ヘボンピングすることにより、１５− ２Ｏ−Ｃ−４逆相シリカ（Ｖｙｄａｃ、　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ、 　Ｈｅ５ｐｅｎｉａ＋ＣＡ、　ＵＳＡ）が充填された５ｃｍＸ３０ｃｍのカラム へ注ぐ、カラムは酵母ブロスを注ぐ前に０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（溶媒 Ａ）で平衡化されており、カラムへのブロスの注入が完了後溶出液の光学密度が ベースライン値へ達するまで、この溶媒を十分流す。

この時点で０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）のグラジェ ント（分当り２％Ｂの変化速度での０％Ｂから１００％Ｂへ）を確立し、その流 速は１００ｄ／分である。

Ｃ−４カラムからのピーク分画をプールし、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４， ７に調整した。この溶液は次に５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，７で平衡化さ れているＭｏｎｏ　Ｓイオン交換樹脂を含むカラムに直接注ぎ、ｒｈｕｌＬ−３ は２０力ラム容量以上のＩ　Ｍ　ＮａＣ１直線グラジェントで溶出された。得ら れたｒｈｕｌＬ−３は事実上１００％Ｍｅｔコ　ｒｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ’　Ａ ｓｐ”Ａｓｐ”）であって、前記実施例２に記載したｒｈｕルー３生産物ロフト と類似の生物活性であった。

実施例４：カニクイザルへのｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ’　Ａｓｐ”Ａｓｐ’・） の ３匹のオスおよび３匹のメスカニクイザル〔ヱ立左　Ｚｚ入之え立之ス（１ａｃ ａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｎｓ　）の３つの群に、ｌｘ／ｋｇ（群２．低用量）、 １０　ｒａｔ／ｋｇ　（群３、中用量）および１００　ｔｓ／ｋｇ　（群４、高 用量）の用量レベルで３０連続日の間−日一回静脈内投与により実施例２に記載 したごとくして調製されたｒｈｕｒＬ−３０ツトの１つからの物質を与えた。第 ４番目の群の３匹のオスおよび３匹のメスには０．９％塩化ナトリウム（生理食 塩水）を与え、対照群とした（群１、対照）。

群当り性別当って一匹の動物は１７日の回復期の間保持された。化合物の影響の 変化が含まれている。

すべての動物は計画された殺害時までは生きのびていた。処置関連臨床的徴候に は食欲欠乏が含まれている。じんま疹は観察されなかった０体重、身体的検査、 心電計的評価または検眼鏡的試験に処置関連効果はみられなかった。評価された 臨床病理学パラメーターには血液学および大腿塗抹から評価された骨髄球系−赤 芽球系（Ｍ／Ｅ）比が含まれていた。血清化学分析および尿分析もまた実施され た。中−および高用量動物において注目に値する血清化学パラメーターは、同時 に行った対照値またはそれぞれの処置前の値と比較して何ら注意を引くものはな かった。処置後の尿分析値も注意を引くものはなかった。

ｒｈｕｌＬ−３類似体の静脈内投与は中−および高用量オスおよびメスにおいて 白血球数を劇的に増加させた。平均リンパ球数もまた細胞−処置オスおよび高用 量メスで増加した。中−および高用量動物における分節核好中球、好酸球および 好塩基球の増加は一般に増加した白血球およびリンパ球数とへい平行関係であっ た。

高用量オスおよび処置の合間の化合物処置メスにおいて平均血小板数の増加もま た観察された。最も注目に値する用量相関増加は最初のおよび第２週の間に進行 的に起こり、回復期後は処置前のレベルへ一般的に減少した。

総体的病理学では最も高い用量を受けている個々の動物の肺臓、胸腺および副腎 にある種の異常が認められた。しかしながら、２匹の動物は一つの場合において 同じ影響を示したわけでなく、異常は前から存在しているものと診断された。

低−および中用量オスの最終殺害時および１匹の低用量および１匹の中用量メス の回復期後の殺害時に絶対的な平均相対胸腺重量の増加が注目された。投与終了 時に殺害した動物の顕微鏡的調査結果で注目されるものは数も少なく重大なもの は何もなかった。すべての組織病理学的調査結果はよくありがちなもので化合物 投与と関係ないものであった。

５：ＩＬ−３の 実施例２に記載したごとくして調製された１つまたはそれ以上の生産物ロットの ｒｈｕｌＬ−３が高度の進行性腫瘍または骨ａｉｉｉ害の患者に１５日間毎日皮 下注射により投与された０通常の常用血液学的および生化学的検査が行われ、処 置サイクル前および後に骨髄吸引液および生検試料が得られた。全部で１４人患 者が６０．１２５．２５０および５００ｘ／ｎｆで処置された。毒性のため治療 を中止した患者はいなかった。すべての９人の評価に値する患者においてＷＢＣ ２絶対分節核顆粒球、好酸球および単核球数ならびに網状赤血球および血小板数 の実質的増加がみられた。血液学的変化（特に血小板数の増加）が主としてｒｈ ｕｌＬ−３処置の第２週の間に起こり、治療終了後１−２週間続いた。血小板数 の平均増加は１７’９．５００　／ｌｔｌ　（６３，０００−４４８，０００） であった。各々３０００／μ！および２２，５００／ｐＺの持続性血小板減少症 の２人の患者において、処置後６０ｘ／ｒｒｆで期間を延長すると血小板数が１ ０４，０００／μｌおよび８８．０００／ａ７に上昇した。毒性としては３人の 患者の発熱（グレード２）、１人の患者の頭痛（グレード２）および１人の患者 においての注射部位の局所的紅５ｉ：（グレード１）が挙げられた。じんま疹ま たは真皮へのマスト細胞またはリンパ球の浸潤は観察されなかった。

国際調査報告 １”ｌｅｍｍｅ＠ａ＋　Ａ６＋　＃＃１．＋＋　１ｊ１１−　ＰＣ”７７１１ｇ 　ｑｎｚｒ＋ｔ１ａｃ国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．種サッカロミセス　セレビヅエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）の形質転換された酵母宿主により発現される１つまたはそれ以上の 精製された組換えヒトＩＬ−３（Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０）類似蛋白質を 活性成分として含む医薬組成物であって、前記蛋白質は （ａ）Ｍｅｔ３　ｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ６　Ａｓｐ１３　Ａｓｐ７０）；（ｂ ）Ｔｈｒ４　ｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ６　Ａｓｐ１３　Ａｓｐ７０）；および（ ｃ）Ｔｈｒ６　ｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ６　Ａｓｐ１３　Ａｓｐ７０）から成る 群より選択される、上記医薬組成物。
2. ２．前記群から選択される蛋白質とＡｌａ１ｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５ Ａｓｐ７０）の混合物をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
3. ３．活性成分が本質的にＭｅｔ３ｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７ ０）から成る請求項１に記載の医薬組成物。
4. ４．活性成分が本質的にＴｈｒ４ｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７ ０）から成る請求項１に記載の医薬組成物。
5. ５．活性成分が本質的にＴｈｒ６ｒｈｕＩＬ−３（Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７ ０）から成る請求項１に記載の医薬組成物。
6. ６．約１．８から約７．０×１０７Ｕ／ｍｇのヒト骨髄アッセイにおける比生物 活性を持つ請求項２に記載の医薬組成物。
7. ７．阻害定数で表わして、約２．０から約８．０×１０１０Ｍ−１のヒト単球Ｉ Ｌ−３受容体に対する結合親和性を持つ請求項７に記載の医薬組成物。
8. ８．請求項１から７のいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与することを含 む、それらを必要としている患者の好中球減少症、貧血または血小板減少症の処 置方法。
9. ９．好中球減少症、貧血または血小板減少症のための薬剤の処方における請求項 １から７のいずれかに記載の組成物の使用。