JP5628544B2 - クロストリジウム・サーモセラム由来のタンパク質複合体を構築するためのタンパク質及びその利用 - Google Patents
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Description
(a)内在性のN型糖鎖修飾予測部位を有しない
(b)内在性のN型糖鎖修飾予測部位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている
のいずれかを充足する少なくとも一つのドッケリン特異的配列を含むドッケリンを有するタンパク質が提供される。
本明細書に開示されるタンパク質は、C. thermocellum由来のタイプIコヘシンを有する骨格タンパク質を利用したタンパク質複合体の構築に特に適したタンパク質である。本タンパク質は、C. thermocellum由来のタイプIドッケリン中のコヘシン結合能に関連した配列であって、(a)内在性のN型糖鎖修飾予測部位を有しない、(b)内在性のN型糖鎖修飾予測部位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている、のいずれかを充足する少なくとも一つのドッケリン特異的配列を含むドッケリンを有することができる。
こうしたドッケリン特異的配列において、N型糖鎖修飾予測部位に相当する部位のアミノ酸がアスパラギン酸であることが好ましい。こうしたドッケリン特異的配列を1又は2つ有するドッケリンが好ましい。
本タンパク質は、C. thermocellum由来のタイプIコヘシンを有する骨格タンパク質との複合体の構築のためのタンパク質として好適である。C. thermocellum由来のタイプIコヘシンを有する骨格タンパク質は、C. thermocellum由来の1又は2以上のタイプIコヘシンをを備えることができる。コヘシンは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプI等の骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている(粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10(1999)、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等)。本タンパク質を結合するためのC. thermocellum由来の骨格タンパク質としては、タイプI骨格タンパク質上のタイプIコヘシンドメインを少なくとも有している。そのほか、タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインを備えていてもよい。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びDNA配列は、NCBIのHP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
本明細書の開示によれば、C. thermocellum由来のタイプIコヘシンを有する骨格タンパク質と、この骨格タンパク質に結合された本タンパク質と、を備えるタンパク質複合体も提供される。このタンパク質複合体は、本タンパク質の集積量及び/又は集積密度が高くなっているため、本タンパク質の活性が増強されたものとなっている。
本明細書に開示される真核微生物は、本明細書に開示されるタンパク質複合体を細胞表層に備えている。本真核微生物は、タンパク質複合体を構成する骨格タンパク質と本タンパク質とを細胞外から供給して自己集合的に細胞表層にて構築されたものであってもよいが、好ましくは、これらのタンパク質を自己生産する。本タンパク質は、真核微生物において生産してもその糖鎖修飾系による糖鎖修飾を解除又は抑制して、対コヘシン結合性が向上しているからである。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、本明細書に開示される真核微生物であって、本タンパク質がセルロース分解促進活性を有する真核微生物を用いて、セルロース含有材料を炭素源として発酵する工程、を用いて、セルロース含有材料を糖化し、発酵する工程、
を備えることができる。この方法によれば、この真核微生物を用いてセルロース含有材料を直接分解糖化し、グルコース等として利用できることになる。前記発酵工程の実施により、用いた真核微生物が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。
Claims (10)
- C. thermocellum由来のタイプIコヘシンを有する骨格を利用して真核細胞で生産するためのタンパク質複合体であって、
以下の表A及び表Bから選択されるアミノ酸配列におけるN型糖鎖修飾予測部位N−X(プロリン以外の任意のアミノ酸)−T/Sのアスパラギン(N)がアスパラギン酸(D)に置換されてなるD−X(プロリン以外の任意のアミノ酸)−T/Sを有するアミノ酸配列から選択される1又は2以上のドッケリン特異的アミノ酸配列を有するドッケリンを有するタンパク質と、
前記1又は2以上のドッケリン特異的アミノ酸配列と結合するC. thermocellum由来のタイプIコヘシンと、
を備える、タンパク質複合体。
- 前記ドッケリンは、以下の表BのC. thermocellum由来の同一遺伝子座の1st欄の第1のアミノ酸配列と2nd欄の第2のアミノ酸配列とに基づく2つの第1のドッケリン特異的アミノ酸配列と第2のドッケリン特異的アミノ酸配列とをそれぞれ備え、第1のドッケリン特異的アミノ酸配列をN末端側に含み、前記第2のドッケリン特異的アミノ酸配列をC末端側に含む、請求項1に記載のタンパク質複合体。
- 前記ドッケリンは、以下の表Cに表されるアミノ酸配列において、N型糖鎖修飾予測部位N−X(プロリン以外の任意のアミノ酸)−T/Sのアスパラギン(N)がアスパラギン酸に置換されたD−X(プロリン以外の任意のアミノ酸)−T/Sを有すアミノ酸配列である、請求項1に記載のタンパク質複合体。
- 前記タンパク質は、セルロース分解活性タンパク質を備え、セルロース分解促進活性を有する、請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質複合体。
- 前記セルロース分解促進活性はセルラーゼ活性である、請求項4に記載のタンパク質複合体。
- 前記セルロース分解活性タンパク質は、クロストリジウム・サーモセラム由来である、請求項4又は5に記載のタンパク質複合体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のタンパク質複合体を細胞表層に備える真核微生物。
- 前記タンパク質複合体を前記真核微生物が自己生産する、請求項7に記載の真核微生物。
- 前記真核微生物は酵母である、請求項7又は8に記載の真核微生物。
- 有用物質の生産方法であって、
請求項7〜9のいずれかに記載の真核微生物であって、前記タンパク質がセルロース分解促進活性を有する真核微生物を用いて、セルロース含有材料を炭素源として発酵する工程、を用いて、セルロース含有材料を糖化し、発酵する工程、
を備える、方法。
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