KR0121322B1 - 백혈병 억제 인자 제조를 위한 재조합 dna 분자 및 숙주 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백혈병 억제 인자(LIF), 거의 순수한 형태로 LIF를 제조하는 방법 및 재조합 LIF를 클로닝하여 발현하는 방법, 그리고 LIF 제조를 위한 재조합 DNA 분자 및 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

백혈병 억제 인자 제조를 위한 재조합 DNA 분자 및 숙주 세포

[도면의 간단한 설명]

도 1은 DEAE-세파로즈 CL-6B 상의 LIF 정제의 단계 2에 관한 것이다.

도 2는 렌틸 렉틴 세파로즈 4B 상의 LIF 정제의 단계 3에 관한 것이다.

도 3은 CM-세파로즈 CL-6B 상의 LIF 정제의 단계 4에 관한 것이다.

도 4는 지방산 분석 HPLC 컬럼상의 LIF 정제의 단계 5에 관한 것이다.

도 5는 정제된 LIF의 분자량과 순도를 나타낸 것이다.

도 6은 실시예 3을 나타낸다.

도 7은 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 1에 관한 것이다.

도 8은 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 3에 관한 것이다.

도 9는 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 4에 관한 것이다.

도 10은 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 5에 관한 것이다.

도 11은 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 1에 관한 것이다.

도 12은 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 2에 관한 것이다.

도 13은 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 4에 관한 것이다.

도 14는 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 5에 관한 것이다.

도 15는 실시예 6의 방법의 단계 1에 관한 것이다.

도 16는 실시예 7의 방법의 단계 1에 관한 것이다.

도 17은 실시예 8의 단계 1에 관한 것이다.

도 18은 단계 2에 관한 것이다.

도 19는 단계 2에 관한 것이다.

도 20은 단계 3에 관한 것이다.

도 21은 실시예 9의 단계 2에 결과를 나타낸다.

도 22는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 1에 관한 것이다.

도 23은 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 1에 관한 것이다.

도 24는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 2에 관한 것이다.

도 25는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 3에 관한 것이다.

도 26은 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 3에 관한 것이다.

도 27는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 4에 관한 것이다.

도 28은 실시예 11의 단계 1에 관한 것이다.

도 29는 실시예 11의 단계 1에 관한 것이다.

도 30은 실시예 11의 단계 3에 관한 것이다.

도 31은 실시예 11의 단계 4에 관한 것이다.

도 32는 추정 인체 LIF를 확인하는 단계 2에 관한 것이다.

도 33는 추정 인체 LIF를 확인하는 단계 3에 관한 것이다.

도 34는 추정 인체 LIF를 확인하는 단계 3에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 백혈병 억제 인자(LIF), 거의 순수한 형태로 LIF를 제조하는 방법 및 재조합 LIF를 클로닝하여 발현하는 방법, 그리고 LIF 제조를 위한 재조합 DNA 분자 및 숙주 세포에 관한 것이다.

[배경기술]

미숙한 전구 세포(precursor cell)의 클론성 증식 및 동시 분화에 의해 성숙한 혈액 세포를 얻는다:(Metcalf, D. (1984) The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier, Amsterdam). 정상의 조혈 세포에 있어서, 증식과 분화의 두가지 과정은 짧은 수명의 성숙 세포가 계속 보충되도록 밀착 연결되어 있다. 최소한 4개의 생화학적으로 구별되는 성장 인자, 콜로니-자극 인자(CSF)는 실험관내에서 과립구 및 대식세포의 전구 세포의 증식 및 분화를 자극하는 것으로 밝혀졌다: G-CSF, M-CSF, GM-CSF 및 멀티-CSF(IL-3)(Metcalf, D.(1987), Proc. R. Soc. B. 230, 389-423 참조).

정상 세포와는 달리, 백혈병 골수양 세포는 증식과 분화가 연결되지 않아서 미숙한 선조 세포(progenitorcell)가 축적되어, 그들의 증식 능력은 보존되지만 분화가 일어나지 않는 것이 특색이다. 실험관내에서 골수양 백혈병 세포의 분화를 유도할 수 있는 생물학적 인자의 특성과, 어떤 인자가 증식없이 분화될 수 있는지에 대하여 상당한 논란이 있어왔다. 실제로, 증식과 분화는 반드시 다른 인자들에 의하여 매개된다는 것이 제안되어 왔다(Sachs, L.(1982), J. Cell, Physiol. Suppl., 1, 151-164). 한편, 두개 그룹이 쥐의 골수양 백혈병 세포주 M1의 분화를 유도할 수 있는 활성(MGI-2 또는 D-인자)을 설명하고 정제하였는데, 이것은 정상적인 선조 세포의 증식은 자극시키지 않는다(Lipton, J. H. and Sachs, L. (1981), Biochem. Biophys. Acta. 673, 552-569:Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., and Hozumi, M. (1984) J. Biol. Chem. 259, 10978-10982). 한편, 본 발명자들은 CSFs, G-CSF중 하나가 쥐의 골수양 백혈병 세포주, WEHI-3B D⁺에 대하여 강력한 분화-유도 자극제이며, 그뿐아니라 정상 세포에 대해서도 증식 및 분화자극제라는 것을 이미 밝혀냈다(Nicola, N.A., Metcalf, D., Matsumoto, M. and Johnson, G.R. (1983), J. Biol. Chem. 258, 9017-9023). 또한 Tomida 등(Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M., Okabe, T. and Takaka, F. (1986), FEBS Lett., 207, 271-275)은 재조합 G-CSF가 또한 M1 세포의 대식세포 분화를 유도할 수 있음을 입증하였다. 이 인자들 사이의 관계는 논제가 되어오고 있다. 이러한 상황은 또한 종양 괴사 인자 α(TNF α)가 인체 골수아구 세포주 ML-1의 분화를 자극할 수 있음이 알려지면서 더욱 복잡해졌다(Takeda, K., Iwamoto, S., Sugimoto, H., Takuma, T., Kawatani, N., Noda, M., Masaki, A., Morise, H., Arimura, H. and Konno, K. (1986) Nature 323, 338-340)

이 그룹의 데이타 사이의 모순을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 많은 종래 연구들에 사용된 크렙스 Ⅱ복수 종양 세포에 의해 조건화된 배지를 생화학적으로 분별하고 이것이 정상의 선조 세포와 WEHI-3B D⁺세포에 활성인 진정한 G-CSF 및 GM-CSF를 함유할뿐 아니라 M1 세포의 분화를 유도할 수 있는, 두개의 생화학적으로 다르지만 기능적으로는 유사한 인자들을 함유한다는 것을 밝혀냈다. 이 후자의 인자들은 실험관내에서 M1 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있는 능력으로 인해 백혈병 억제 인자(LIF)-A 및 LIF-B로 명명되었고, 그들은 WEHI-3B D⁺세포의 분화를 유도하지 않으며, 정상의 과립구/대식세포 선조 세포의 증식을 자극하지 않는다는 것이 밝혀졌다.

[발명의 요약]

본 발명에 의한 LIF는 다음 두가지 특성을 가지는 분자로서 정의된다:(1) 백혈병 세포의 관련된 분화와 함께 M1 세포와 같은 골수양 백혈병 세포의 증식을 억제하는 능력을 가진다;및 (2) M1 세포 또는 쥐 또는 인체 대식세포상의 특이 세포성 수용체에 결합하기 위한, 쥐 LIF 또는 인체 LIF의 한정 서열을 갖는 분자와 경쟁한다. LIF는 골수양 백혈병의 일부 형태를 억제하는 치료적 비증식제로서뿐 아니라 대식세포기능 및, 감염에 대한 다른 반응 변형 및 이와 관련된 임상 시험과 조사 연구를 위한 시약으로서 사용될 수 있는 잠재성을 가지고 있다.

용어 LIF 활성을 가지는 폴리펩티드는 상술한 LIF의 특성을 가진 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드를 의미하며, 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 쥐 또는 인체 LIF의 아미노산 서열과 완전히 또는 부분적으로 상동인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 이 용어는 또한 쥐 또는 인체 LIF의 아미노산 서열의 단지 일부분과 완전히 또는 부분적으로 상동인 폴리펩티드로서 상술한 LIF 특성을 가지는 것을 포함한다. 이 용어는 또한, 숙주 세포에서 발현에 의해 산출된 것으로 발현시에는 불활성적이지만 숙주 세포에 의해 프로세싱되어 활성 분자를 산출하는 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드 뿐 아니라 발현시에는 불활성적이지만 생체외 또는 생체내에서 선택적으로 절단가능하여 활성 분자를 산출할 수 있는 폴리펩티드 또는 글리코펩티드를 포함한다.

쥐의 LIF는 다음의 생물학적 특성을 가지는 분자이다:(a)는 증식 능력이 상실된 쥐의 골수양 백혈병 세포주 M1 세포에서의 대식세포 분화 및 G-CSF에 의해 상승작용되는 클론원성(clonogenic) 백혈병 세포의 사멸 유도; (b) 복강, 비장 및 골수로부터의 M1 세포 및 정상적인 쥐 단일구 및 대식세포상의 고 친화성 수용체에는 선택적으로 결합(그 수용체 수는 대식세포 성숙 또는 기능적 활성화에 따라 증가함)하지만 상기 조직으로부터의 과립구, 적혈구 또는 임파구 세포에는 결합하지 않음; (c) 고 친화성 수용체에 대한¹²⁵I-LIF의 특이성 결합은 G-CSF, GM-CSF, 멀티-CSF(인터류킨-3), M-CSF, 인터류킨 1,2,4 또는 6, 엔도록신 또는 여러 가지 다른 성장 인자들에 의해 경쟁받지 않지만 비라벨된 LIF에 의해서는 경쟁받음; (d) 정상 또는 무흉선증 마우스의 혈청에서는 박테리아 엔도톡신에 의해 상승하지만 엔도톡신-내성 C3H/HeJ마우스에서는 상승하지 않음; (e) 폐, 타액선, 복막 세포 및 골간을 비롯한 여러 조직에 의해 생산됨; (f) CSF없이 성장할때 정상적인 과립구-대식세포 선조 세포의 시험관내 생존 시간의 감소; (g) 쥐의 백혈병 세포주 WEHI265와 WR19인 GM-CSF 또는 멀티-CSF를 발현하는 레트로비루스로 감염됨으로써 백혈병 원성으로 형질전환된 쥐의 골수양 세포인 WEHI-3B D⁺쥐 골수양 백혈병 세포의 증식 억제 또는 분화 유도의 불능; (h) 과립구, 대식세포, 호산구, 거핵구, 적혈구 및 마스트 셀 계통의 정상적인 선조 세포의 증식을 자극할 수 없으며 정상의 과립구, 대식세포, 거핵구, 호산구 또는 천연 세포독성 세포 선조체의 시험관내 CSF에 의한 자극에 대한 정량적 반응을 변경시키거나 그 선조체의 클론성 증식 또는 연속 세포주 32CD1.13과 FDCP-1 의 세포 증식을 억제할 수 없음; (i) M1과 WEHI-3B D⁺쥐의 골수양 백혈병 세포에서 분화를 유도하며 M1 세포에 대한 LIF의 작용을 상승 협력하는 G-CSF의 능력에도 불구하고 특이 세포성 수용체에 대해 결합하기 위해 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)의 요오드화 유도체와 결합할 수 없음; (j) LIF의 작용이 종양괴사 인자(TNF)에 대하여 특이적으로 산출된 항혈청에 의해 억제될 수 없음; (k) 쥐 LIF에 대한 전사체가 LB3과 E9.D4 T 세포의 세포질에서 계속 존재하고 이 세포들에서 렉틴 콘카나발린 A에 의해 유도되지 않으며 많은 다른 형태의 세포에서 존재함.

쥐의 LIF는 또한 다음 특성들을 가지는 것으로 결정되었다; (1) 환원제(2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨) 존재 또는 부재하에 소듐 도데실 설페이트를 함유한 8-25% 구배의 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 의해 측정시 분자량이 58,000±5,000이고 엔도글리코시다제, N-글리카나제로 처리된후 분자량이 23,000±5,000인 단일 소단위(subunit) 당단백질;(m) 8.6 내지 9.3의 등전점; (n) 도 10, 도 11 및 도 15에 상세히 나타낸 일차 아미노산 서열; (o) 도 10, 도 11 및 도 15에 상세히 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호됨; (p) 1-2×10⁸유니트/mg의 특이 활성(50 유니트는 1밀리리터에서, 쥐의 M1 골수양 백혈병 세포에 의해 클론 형성시 50%가 감소되는 LIF의 양을 나타냄); (q)도 19에 나타낸 바와 같은 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 결합된 쥐의 염색체 11(마우스/차이니즈 햄스터 난소 체세포 하이브리드의 판넬 분석으로 측정됨)상의 독특한 유전자에 의해 암호됨; (r) 도 27에 나타내는 바와 같은 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 염색체성 DNA에서 결합된 인체 유전자 서열과 상동임.

인체 LIF는 하기의 천연 및/또는 효모 유도된 재조합 생성물의 생물학적 특성을 가지는 분자이다:(a) 증식 능력이 없는 쥐의 골수양 백혈병 세포주 M1의 세포내 대식세포 분화 및 클론원성 백혈병 세포의 사멸 유도; (b) 과립구, 대식세포, 호산구 및 적혈구 계통의 정상적인 인체 신조 세포의 증식을 자극시키는 능력이 없음; (c) G-CSF와 함께 인체 백혈병 세포주 U937의 세포 증식을 부분적으로 억제하며, GM-CSF와 함께 인체 백혈병 세포주 U937과 HL60의 증식을 부분적으로 억제하는 능력을 가짐; (d) M1 세포와 쥐의 대식세포상의 쥐의 LIF 수용체에 특이적으로 결합하며 상기 세포들 쥐의¹²⁵I-LIF이 결합하는 것에 대해 완전하게 경쟁; (e) 인체 간암 세포주 Hep-2G상의 특이적 세포성 수용체에 결합.

인체 LIF는 또한 다음 특성들을 갖는 것으로 밝혀졌다:(f) 성숙 단백질에서 아미노산 잔기의 약 80%가 쥐의 LIF와 동일; (g) 도 25, 도 26 및 도 29에 나타낸 일차 아미노산 서열; (h) 도 27에 나타낸 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 염색체 DNA에 결합된 독특한 유전자에 의해 암호됨;(i) 이것의 유전자 서열의 일부분으로서, 도 25에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가짐.

본 발명의 일차적 관점에서, 백혈병-억제 인자(LIF)가 거의 순수한 형태로 제공된다. 본 발명은 또한 거의 순수한 LIF의 생산 방법, 특히, 크렙스 Ⅱ 복수 종양 세포로부터 정제함으로써 거의 순수한 쥐의 LIF를 생산하는 방법 및, 인체 방광암 세포주 5637(ATCC 제 HTB 9)로부터 정제함으로써 거의 순수한 인체 LIF를 생산하는 방법을 제공한다. 거의 순수한 LIF는 LIF의 아미노산 서열 또는 그 일부분을 암호하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 효모 세포, 포유동물 세포 및 이 콜리와 같은 숙주 세포에 의해 또한 생산될 수 있다.

거의 순수한 형태'란 적어도 90% 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드가 적합한 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동될때 하나의 밴드로서 나타나는 (그 밴드는 LIF 활성과 일치함) 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드의 형태를 의미한다.

또 다른 관점에서는 LIF 단백질을 완전히 또는 부분적으로 암호하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 클론의 분리 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 LIF의 특징인 것으로 결정된 독특한 아미노산 서열을 암호하며 또한 LIF의 완전한 아미노산 서열을 추론할 수 있도록 하는 능력을 가지는 뉴클레오티드서열에 관한 것이다.

또다른 관점에서, 본 발명은 LIF(또는 그것과 거의 유사한 유사체)를 완전하게 또는 부분적으로 암호하는 진술한 뉴클레오티드 서열이 완전하게 또는 부분적으로 LIF의 합성 및 생산을 유도할 수 있는 형태로 함유된 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 관점은 또한 재조합 DNA 분자가 삽입되어 있는 클로닝 벡터(플라스미드 등)와 숙주 세포까지도 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 DNA 분자의 발현 또는 펩티드 합성으로 생산된 합성 LIF, 완전히 또는 부분적으로, 또는 그것과 거의 유사한 유사체에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

LIF의 현재의 연구, 특히 임상 및 기타 분야에 사용할 수 있는 쥐 및 인체 기원의 이 당단백질의 다른 출처를 제공하는 데에 주력하는 연구에 있어서, 쥐의 LIF는 효율적인 정제 방법에 의해 크렙스 Ⅱ 복수종양 세포로부터 정제하여 이 인자의 화학적 또는 생합성적 생산을 위한 일차 단계로서, 부분적 아미노산 서열 분석을 하였다.

I¹²⁵로 방사능 유도된 LIF는 LIF를 합성하며 생산하는 쥐 및 인체 기원의 세포와 조직을 확인하는 수용체 경쟁 분석에서 사용되었다. 이 조사 결과로서, 이 출처들중 하나로부터의 mRNA의 DNA 카피의 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝하고 쥐의 LIF-암호 클론을 기 결정된 쥐의 LIF 아미노산 서열의 일부분을 암호하는 방사능 라벨된 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화에 의해 확인하였으며, 이 쥐의 LIF cDNA 클론을 뉴클레오티드 서열 분석하였다. 또한, 클론된 쥐의 LIF 암호 서열은 쥐의 LIF의 상동체를 암호하는 인체 유전자를 확인하기 위한 하이브리드화 프로오브로서 사용하였으며 상기 교잡-종 하이브리드화가 효과적으로 일어날 수 있는 하이브리드화 조건을 설정하였다. 결과적으로, 쥐 LIF의 인체 상동체를 암호하는 DNA 서열이 함유된 재조합 DNA 클론이 확인되었다.

LIF-암호 서열의 구성 결과, 재조합 DNA 분자가 구성되어, 클론적으로 순수한 LIF를 완전하게 또는 부분적으로, 예컨대 배양된 포유동물 세포, 효모 또는 박테리아에서 합성하도록 유도하는 클론된 쥐 또는 인체 LIF-암호 DNA 서열을 사용할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 이러한 방법으로 생산된 거의 순수한 LIF를 포함한다.

하나의 특별한 실례에서, 본 발명은 효모 세포, 섬유아세포 및 이. 콜리에서의 클론된 인체 및 쥐 LIF유전자의 발현 및 발현될 수 있도록 한 클론된 유전자의 변형뿐 아니라 재조합 인체 및 쥐 LIF의 생물학적 및 생화학적 특성의 정립에 관한 것이다.

또한 이러한 실례에서, 본 발명은 인체 또는 쥐의 LIF(또는 그것과 거의 유사한 유사체)를 완전하게 또는 부분적으로 암호하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자에 관한 것인데, 그 뉴클레오티드 서열의 형태는 효모 세포, 섬유아세포 또는 이. 콜리에서, 완전하게 또는 부분적으로 인체 또는 쥐 LIF의 합성 및 생산을 유도할 수 있는 것이다. 본 발명은 또한 이러한 재조합 DNA 분자가 삽입되어 있는 클로닝 벡터(플라스미드 등)와 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 효모 세포에서 이러한 재조합 DNA분자를 발현시켜 생산된 합성 인체 또는 쥐의 LIF, 그것과 완전히 또는 부분적으로 유사한 또는 거의 유사한 동족체에 관한 것이다. LIF에 관한 이 작업의 하나의 실례에 있어서, 인체 및 쥐의 LIF 유전자 서열은 효모 발현 벡터, YEpsec1에서 변형되며 정착되었다. 효모 세포는 생선된 재조합체로 형질전환되며, 그 형질전환된 효모 세포에 의해 조건화된 배지는 천연의 인체 및 쥐 LIF의 것과 유사한 생물학적 특성의 인자를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

일부 형태의 골수양 백혈병의 환자 및 특정 감염의 환자의 치료시 사용하기 위한 LIF의 잠재성의 관점에서, 본 발명은 또한, 예컨대 클론된 LIF-암호 DNA 서열을 사용하거나 화학적 합성에 의해 완전하게 또는 부분적으로 생산된 LIF, 특히 인체 LIF를 함유하는 약학 조성물 및 예컨대 전술한 클론된 LIF-암호 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유도되거나, 화학적 합성에 의해 생산된 LIF 유사체의 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 또한 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 혈액 세포의 적어도 하나의 다른 생물학적 조절인자를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명은 백혈병 및 감염에 걸리기 쉬운 선천적 질병을 포함하여, 혈액 세포 형성 질병에서 인체 LIF 유전자와 관련된 유전적 재배열, 변형 또는 병소를 검사하는데 사용하는 진단 시약에 관한 것이다.

[실시예]

[실시예 1]

첨부되는 도 1 내지 도 5는 각 분별 단계에서 LIF가 모이는 분획을 보이며 이것의 순도를 나타내는 전술한 정제 방법의 여러 단계에 관한 것이다.

도 1은 DEAE-세파로즈 CL-6B 상의 LIF 정제의 단계 2에 관한 것이다. 그 바아는 단계 3을 위해 모든 분획들을 나타낸다.

도 2는 렌틸 렉틴 세파로즈 4B 상의 LIF 정제의 단계 3에 관한 것이다. 그 바아는 단계 4를 위해 모은 분획들을 나타낸다.

도 3은 CM-세파로즈 CL-6B 상의 LIF 정제의 단계 4에 관한 것이다. 그 바아는 단계 5를 위해 모든 분획들을 나타낸다.

도 4는 지방산 분석 HPLC 컬럼상의 LIF 정제의 단계 5에 관한 것이다. 39.6 내지 41.3% 아세토니트릴로부터의 분획들을 모은다.

도 5는 정제된 LIF의 분자량과 순도를 나타낸 것이다. 상부 패널은 8-25% 폴리아크릴아미드 SDS 겔상에서의 단백질 표준(93,000; 67,000; 43,000; 30,000; 20,000과 14,000 분자량)과 정제된 LIF(두개 제조물)의 이동을 나타낸다. 그 단백질 및 생물학적 활성은 모두 분자량 58,000의 단백질과 관계된다.

[단계1]

크렙스 Ⅱ 종양 세포(1×10⁶개)를 C57B16/6fj/WEHI 마우스에 복강내 주사하여 7일후 그 쥐를 죽이고 복막액을 취한다. 그 세포를 원심분리하고 이. 콜리 리포폴리사카라이드(200ng/ml)가 함유된 둘벡코스 변형이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's Meaium)중에 5×10⁶세포/ml로 재현탁시켜 24시간동안 37℃로 공기중에 10% CO₂가 함유된 흡윤화 인큐베이터에서 배양한다. 그 세포를 다시 원심분리하며, 조건화된 배지를 제거하고 0.02%(w/v) 소듐 아지드가 되게하여 4℃에서 보관한다. 36리터의 조건화된 배지를 아미콘(Amicon) DC2A 농축기에서 HIP10-8 동공 파이버 카트리지를 사용하여 100ml로 농축시키고 1mM의 페닐메틸 설포닐 플푸오라이드(PMSF), 소듐 아지드(0.02% w/v)와 트윈 20(0.02% v/v)가 함유된 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)으로 교체하여 아미콘 교반된 셀에서 YM-10 멤브레인 상에 20ml로 재농축시킨다.

[단계 2]

똑같은 완충제에서 평형화된 DEAE-세파로즈 CL-6B(Pharmacia)의 칼럼(2.5×30cm)에 상기 농축물을 적용시키고 200ml의 평형 완충제 및 이후 똑같은 완충제중의 0.3M의 NaCl로의 400ml 선상 구배물로 용출시킨다. 유속은 25ml/hr이며 5.8ml 분획물을 수거하여 분석한다(도 1 참조).

[단계 3]

예 - 구배 단계중 겔에 결합되지 않으며 쥐 M1 세포에 대한 활성을 가지는 단백질 분획을 모으고, YM-10 멤브레인상에 농축시키며 1mM MgCl₂, 1mM PMSF, 0.2% 소듐 아지드와 0.02% 트윈 20이 함유된 100mM의 소듐 아세테이트 완충제(pH 6.0)로 교체하여 똑같은 완충제에서 평형화된 렌틸 렉틴-세파로즈 4B(Pharmacia) 칼럼(1×4cm)에 적용시킨다. 이 칼럼을 25ml의 평형 완충제 그리고 이후, 동일 완충액중의 0.5M α-메틸-D-만노피라노시드로의 100ml 선상 구배물로 10ml/hr의 유속으로 용출시킨다. 3ml의 분획물을 수거하여 분석한다(도 2 참조).

[단계 4]

겔에 결합되며 당에 의해 용출되고, M1 세포에 대한 활성을 가지는 단백질 분획을 모으고 농축시킨후, 1mM PMSF, 0.02% 소듐 아지드와 0.02% 트윈 20이 함유된 100mM의 소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0)로 교체하여 똑같은 완충제에서 평형화된 CM-세파로즈 CL-6B(Pharmacia) 칼럼(1.0×4.0cm)에 적용시킨다. 이 칼럼을 25ml의 평형 완충제 그리고 이후, 똑같은 완충제중의 1.0M NaCl로의 100ml 선상 구배물 그리고 이후, NaOH로 pH가 10으로 조절된 1.0M의 NaCl 25ml로 용출시킨다. 유속은 2.0ml/hr이며 3.0ml 분획물을 수거한다(도 3 참조).

[단계 5]

겔에 결합되며 NaCl 구배물로 용출되며, M1 세포에 대한 활성을 가지는 단백질 분획을 모으고 YM-10 멤브레인상에서 2ml로 농축시키며 0.02% 트윈 20이 함유된 20mM의 암모늄 아세테이트 완충제(pH 5.0)로 교체시킨후, 0.45μm 밀리포어의 필터로 여과시킨다. 푸울을 워터스(Waters) 지방산 분석 칼럼과 구배 프로그래머가 달린 이중 펌프가 장치된 고 성능 액체 크로마토그래피 시스템(Beckman)의 주입기에 적재시킨다. 그 칼럼을 0.1%(v/v) 트리플루오아세트산(TFA)이 함유된 물중에서 평형화시키고, 샘플을 주입한후, 그 칼럼을 물 및 0.1% TFA 중의 34.8%(v/v) 아세토니트릴로의 5min 선상 구배물로 용출시킨뒤 물 및 0.1% TFA 중의 49.8%(v/v) 아세토니트릴로의 50min 선상 구배물로 용출시킨다. 유속은 1ml/min이며 1ml의 분획물을 50μl의 100mM 중탄산 암모늄 및 0.4% 트윈 20이 함유된 폴리프로필렌 튜브에 수거한다(도 4 참조).

단계 5로부터의 M1 세포에 대한 활성을 갖는 분획물은 두개의 중북 자외선 흡광 피크를 이룬다. 각 피크는 M1 세포에 대한 활성에 관련되며 각 피크는 실버 염색을 사용하는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔상에서 Mr 58,000의 단일 단백질 밴드에 해당한다. 각 경우에 있어 Mr 58,000의 단백질 밴드는 1mm 스트립으로 겔상의 평형 트팩(LIF가 적재된 것)을 절단하고 그 겔 스트립으로부터 단백질을 추출하여 반-고체 아가 배지에서 M1 세포의 증식을 억제하고 분화를 유도할 수 있는 능력에 대하여 추출된 단백질을 분석함으로써 평가된 바와 같이 M1 세포에 대한 생물학적 활성을 포함한다(도 5 참조).

[실시예 2]

다음 실시예는 트립신 또는 스태필로코쿠스 V8 프로테아제로 단백질 절단하여 만들어진 여러가지 펩티드의 N-말단 아미노산 서열 및 아미노산 서열들을 얻는데에 사용되는 단계들을 설명한다.

실시예 1의 방법으로 정제된 LIF(15μg)를 Brownlee RP300 비드(C8)로 채워진 마이크로보어(2mm) 칼럼에 적용시킨후 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 0-60% 아세토니트릴로부터 선상 구배로 HPLC 시스템상에서 용출시킨다. 그 단백질은 100μl의 부피로 단일 피크로서 용출된다. 이것을 유리 파이버 디스크에 적용시켜 건조시킨 후, 어플라이드 바이오시스템(모델 470A) 가스상 단백질 서열기의 서열화 챔버에 놓는다. 그 단백질을 에드만 화학(Edman Chemistry)에 의해 서열화하고 각 아미노산의 페놀티오히단토인 유도체를 어플라이드 바이오시스템 120A PTH 분석기상에서 HPLC에 의해 확인한다.

전술한 방법으로 정제된 LIF의 분리된 분취량(20μg)을 6m의 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.2M 트리스-염산 완충제(pH 8.5), 2mM 디티오트레이톨 중에서 2ml로 회석하여 37℃에서 2시간동안 항온처리한다. 30배 몰 과량의 요오도아세트산을 가한후, 그 용액을 다시 15분간 37℃에서 항온처리한다. 그 용액을 동일한 마이크로보어 HPLC 칼럼에 적용시켜 상기와 같이 용출시킨다. 무처리한 LIF와 RCM-LIF보다 칼럼으로부터 3분 뒤에 용출된 LIF의 환원 및 카르복시 메틸화 유도체(RCM-LIF)(200μl)를 0.02% 트윈 20, 1mM CaCl₂및 2μg의 TPCK-처리된 트립신이 함유딘 0.1M 트리스-염산 완충제(pH 8.0)을 사용하여 1ml로 희석한다. 이것을 18시간동안 37℃에서 항온처리하고 그 혼합물을 다시 마이크로보어 칼럼에 작용시킨후, 전술한 바와 같이 용출시킨다. 각 펩티드는 UV 흡광 피크로 나타나는데, 이것을 개별적으로 수거한다. 이 펩티드들중 일부는 전술한 바와 같이 직접 서열화하며 그외는 서열화 전에 0.9% NaCl(pH 6.0)중의 0-60% 아세토니트릴 구배를 사용하는 것을 제외하고는 똑같은 칼럼상에서 재정제한다.

RCM-LIF의 제2분취량(200μl=10μg)을 0.002M EDTA와 0.02% 트윈 20이 함유된 0.05M의 소듐 포스페이트 완충제(pH 7.8)를 사용하여 1ml로 희석하며 2μg의 스태필로코쿠스, 아우레우스 V8 프로테아제로 18시간동안 37℃에서 분해시킨다. 그 반응 혼합물을 똑같은 마이크로보어 칼럼에 적용시키며 전술한 바와 같이 용출시킨다.

서열중 아미노 말단으로부터 LIF를 규정짓는 26 아미노산은 다음과 같은 것으로 나타났다: 몇가지 트립틱 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같은 것으로 나타났다: V8 프로테아제로 LIF를 분해하여 산출한 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다.

[실시예 3]

하기 실시예에서는 방사능-유도체화된 LIF를 얻으며, 수용체 경쟁 분석에 의해 LIF의 출처를 확인하기 위해 사용되는 단계들을 설명한다.

첨부되는 도 6은 실시예 3에 관한 것이다:0℃에서의 M1 골수양 백혈병 세포에 대한 방사능요오드화된 순수 LIF(약 2×10⁵cpm/ng)의 결합, M1 세포(5×10⁶)을 2시간동안 경쟁 인자의 조재 또는 부재하에서¹²⁵I-LIF(4×10⁵cpm)과 함께 항온처리한 후, 소 태자 혈청을 거친 원심분리에 의해 미결합된 방사능으로부터 결합 방사능을 분리해 낸다. A. 지정 희석률(최종 80μl의 부피에 부가된 10μl의 각 희석물)에서 경쟁인자로서 비라벨된 순수 LIF와 순서 멀티-CSF, GM-CSF, G-CSF 또는 M-CSF의 적정, 각각의 최고 농도는 10⁴단위/ml; 3.5×10⁴단위/ml; 3×10⁴단위/ml; 5×10⁴단위/ml; 4×10⁴단위/ml. B. 상기와 같이 M1 세포에 대한¹²⁵I-LIF의 결합을 경쟁할 수 있는 순수 LIF 또는 리포폴리사카라이드(LPS), 또는 여러 세포나엔도톡신-주사된 마우스 혈청에 의해 조건화된 농축된(4-8배) 배지의 능력.

실시예 1에서와 같이 크렙스 Ⅱ 복수 세포 조건화된 배지로부터 정제된 LIF를 전술한 바와 같이 티로신잔기 상에서¹²⁵I로 방사능 라벨시켜(Nicola, N. A. and Metcalf, D., J. Cell. Physiol. 128:180-188, 1986), 약 2×10⁵cpm/ng의 특이 방사능을 갖는¹²⁵I-LIF를 생산한다.¹²⁵I-LIF는 쥐의 성체 골수, 비장, 흉선 및 복강 삼출 세포 뿐아니라 M1 골수양 백혈병 세포에 대하여 특이적으로 결합한다. 세포 자동방사능그래프 분석에 따르면,¹²⁵I-LIF는 대식세포 및 그들의 전구 세포에만 특이적으로 결합하며(수용체수는 세포 성숙과 함께 증가됨), 다른 조혈 세포 형태에의 결합은 탐지되지 않았다. 이것은 다양한 질환 상태에서 대식세포 기능을 조절하는데 LIF를 임상적으로 유용하게 사용할 수 있다는 것을 나타낸다. M1 골수양 백혈병 세포 또는 복강 대식세포군에 대한¹²⁵I-LIF의 특이적 결합은 비라벨된 LIF에 의해서는 억제되지만, G-CSF, GM-CSF, M-CSF(CSF-1), 멀티-CSF(인터류킨 3), 인터류킨 1,2,4,6, 엔도톡신 또는 다른 성장 인자들을 비롯한 광범위한 다른 조혈 성장 인자들에 의해서는 억제되지 않는다(도 6 참조). 따라서, 상기 세포군에 대한¹²⁵I-LIF의 결합을 억제할 수 있는 세포 조건화된 배지 또는 세포 추출물의 능력(LIF에 대한 방사능 수용체 분석)(도 6B)은 여러가지 세포 및 조직에 의한 LIF 생산이나 저장의 존재를 특이적으로 분석할 수 있도록 한다. 예컨대, 렉틴-활성화된 LB3 T 세포에 의해 조건화된 배지는 M1 세포에 대한¹²⁵I-LIF의 특이적 결합을 강하게 억제하며, 따라서 LB3 세포가 LIF를 생산함을 나타낸다.

[실시예 4]

하기 실시예에서는 쥐의 LIF를 암호하는 mRNA의 클론된 상보적 DNA 카피를 얻기 위해 사용되는 단계들을 설명한다.

첨부된 도면 도 7 내지 도 10는 후술되는 방법의 여러 단계들에 관한 것이다:도 7은 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 1에 관한 것이다: 렉틴 콘카나발린 A에 의한 자극후 LB3 세포의 세포질에서 조혈 성장 조절인자에 대한 mRNA의 축적. T세포 클론 LB3 세포, WEHI-3B D^-세포(트랙 1)로부터의 세포질의 폴리아데닐화 RNA(5μg)을 5시간동안 5μg/ml의 콘카나발린 A와 함께 10⁶세포/ml로 배양하고(트랙 2), 무자극된 LB3 세포(트랙 3)을 포름알데히드 아가로즈 겔상에서 전기영동시킨후 니트로셀룰로즈에 전이시켜³²P-GM-CSF 프로오브(판넬 a), 또는³²P-멀티-CSF 프로오브(판넬 b)로 하이브리드화한다(상세한 것은 Kelso. A., Metcalf, D. and Gough, N.M. J. Immunol. 136:1718-1725, 1986 참조).

도 8은 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 3에 관한 것이다:LIF 클론을 확인하기 위해 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드. N-말단 근처의 쥐 LIF의 아미노산 서열의 일부분(잔기 15-26, 실시예 2 참조)이 최상부 라인에, 이 펩티드를 암호할 수 있는 mRNA 서열의 가능한 조합은 중간에 및 이 mRNA 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로오브는 하단에 제시되어 있다. Cys 17과 His 18을 제외한 모든 아미노산 잔기에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 포유동물 암호 부분에서 가장 자주 사용되는 코돈에 대해서만 상보적이다(Grantham 등의 Nucleic Acids Res. 9:43-77, 1981), Cys 17에 있어서, 그 서열은 두 코돈 모두에 대하여 상보적이다. His 18에 대하여 그 올리고뉴클레오티드는 보다 적은 빈도의 CAU 코돈에 대하여 상보적이다. CAC 코돈이 인접 Gly 코돈과 함께 희귀 CpG 디뉴클레오티드를 만드는데 사용되는 것으로는 보이지 않는다(Swartz 등의 J. Biol. Chem. 228:1961-1967, 1962).

도 9는 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 4에 관한 것이다: 도 8에 나타낸 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화에 의한 LIF cDNA 클론의 확인.

도 10은 LIF cDNA 클론의 클로닝 단계 5에 관한 것이다:cDNA 클론 pLIF7.2b와 LIF 아미노산 서열의 뉴클레오티드 서열. cDNA의 mRNA-유사 가닥의 사열은 상술한 LIF의 예견된 아미노산 서열로서 5'에서 3'로 배열된다; 라인 말단에 붙여진 숫자는 그 라인에서 최종잔기(아미노산 또는 뉴클레오티드)의 위치를 표시하는 것이다. 그 아미노산 서열은 이 클론에서 암호된 제1잔기로부터 연속적으로 번호가 붙여졌다. 단백질 분석으로 측정된 아미노산 서열 부분의 위에는 선을 그어놓았는데; 그 둘간에는 어떠한 불일치도 볼 수 없다. Pro 9는 직접적인 아미노산 서열 분석(실시예 2)에 의해 측정된 N-말단 잔기이다. 7개의 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위(Neuberger, A. et al in Glycoproteins, Gottschalk, A, ed., Elsevier, Amsterdam, pp 450-490, 1972)가 별표로 표시되어 있고 4개 잠재적인 O-결합된 글리코실화 부위(Takahashi, N. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2021-2025, 1984)는 교차 평행선으로 표시되어 있다.

단계 1:LIF mRNA가 함유된 RNA의 제조

클론된 쥐의 T 세포주 LB3의 세포(Kelso, A. and Metcalf, D. Exptl. Hematol. 13:7-15, 1985)를 6시간동안 렉틴 콘카나발린 A로 자극하여, 조혈 세포의 성장 및 분화를 조절하는 여러 인자를 암호하는 mRNA이 세포질에 축적되는 것을 향상시킨다(Kelso, A., Metcalf, D. and Gough, N.M. J. Immunol. 136:1718-1725, 1986)(예컨대, 도 7은 조혈 성장 인자 GM-CSF와 멀티-CSF를 암호하는 mRNA의 자극된 세포에서의 생산증가를 나타낸다). 세포질 RNA를 전술한 방법(Gough, N.M. J. Mol. Biol. 165:683-699. 1983)으로 5×10⁸콘카나발린 A-자극된 LB3 세포주로부터 제조한다. 폴리아데닐화된 mRNA 분자를 리보소옴 RNA로부터, 표준 방법(Maniatis, T. et. al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 사용하여 올리고 -dT 셀룰로즈상에서 크로마토그래프를 2회 실시하여 분할한다.

노던 블롯 분석에 의해, GM-CSF와 멀티-CSF에 대한 mRNA와는 달리, LIF mRNA는 LB3 세포에서 계속 존재하며 이것의 풍부함은 콘카나발린 A 자극에 의해 향상된 것이 아니라는 것이 연속해서 밝혀졌다(Gearing D. P. et al, EMBO J. 6:3995-4002, 1987).

단계 2: LB3 cDNA 분자 라이브러리의 합성 및 클로닝.

전술한 바와 같이 제조한 LB3 mRNA의 이중-가닥 DNA 카피를 표준 방법(Maniatis, T. et. al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982 and Gough, N. M. et. al. Nature 309:763-767, 1984)에 의해 합성한다. 간략하게 10μg의 세포질 폴리아데닐화 LB3 mRNA를 조류 골수아세포종증 비루스 역 전사 효소에 의해 촉매된 반응에서 단일-가닥의 상보적 DNA(cDNA)의 합성에 대한 주형으로서 사용하여, 올리고-dT-로 프라이밍한다. 이 반응 완결후, mRNA를 0.3M의 NaOH, 1mM의 EDTA중에서 1시간동안 65℃로 항온처리하여 분해시킨다. 염기로 중화시키고 에탄올 침전에 의해 cDNA를 회수한후, 단일-가닥의 cDNA를 이. 콜리 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 클레노우(Klenow) 단편에 의해 촉매화된 반응에서 이중선 형태로 전환시킨다. cDNA의 헤어핀 루프 구조를 단일-가닥의 특이성 뉴클레아제 S1으로 처리하여 분해시킨후, 데옥시시티딘 잔기(약 20-30 잔기 길이)의 테일을 전술한 바(Michelson, A. M. and Orkin, S. J. biol. Chem. 257:14773-14782, 1982)의 효소 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제를 사용하여 이중-가닥의 cDNA의 각 말단에 부착시킨다. dC-테일된 cDNA를 1.5% 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 분별화하고 500bp 길이 이상의 분자를 회수한후, 제한 엔도뉴클레아제 Sac I로 절단하고, 여기에 데옥시구아노신 잔기의 테일을 부착시킴으로써(Michelson, A.M. and Orkin, J., J. Biol. Chem. 257:14773-14782, 1982) 플라스미드 DNA 분자(pjL3, Gough, N.M. et. al., EMBO J. 4:645-653;1984)에 아닐링시킨다. 테일된 cDNA와 플라스미드 분자를 전술한 바와 같이 (Gough, N.M. et. al., Biochemistry 19:2702-2710, 1980) 아닐링하며 이. 콜리 MC1061(Casadaban, M. and Cohen, S., J. Mol. Biol. 138:179-207, 1980)을 아닐링된 cDNA/플라스미드 혼합물로 형질전환시키고 약 50,000의 별개의 형질전환된 박테리아 콜로니를 10μg/ml의 암피실린이 함유된 아가 평판 상에서 성장시켜 선발한다. 형질전환된 박테리아 콜로니는 50μg/ml의 암피실린이 함유된 액상 성장 배지로 세척함으로써 아가 평판에서 제거해내어 10% 글리세롤중에 10개의 별개의 푸울로서 -70℃로 저장한다.

단계 3: 올리고뉴클레오티드 프로오브의 고안

LIF의 아미노 말단에서의 26개 아미노산의 서열과, 트립신과 V8 프로테아제로 LIF를 분해하여 유도된 11개의 상이한 펩티드로부터의 잔기를 결정한다(실시예 2 참조). 이 아미노산 서열은 LIF mRNA에 대응하는 cDNA 클론을 확인하기 위한 하이브리드화 프로오브로서 사용되는 LIF를 암호하는 mRNA의 특정 한정 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 디자인에 대한 기초를 제공한다.

각 천연 발생 아미노산은 3개의 리보뉴클레오시드 트리포스페이트(코돈)의 특이적 조합에 의해 이것의 대응 mRNA에서 암호된다(참고예, Watson. J. Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1976). 어떤 아미노산은 오직 하나의 코돈에 의해 지정되지만, 다른 것은 6개 정도의 많은 다른 코돈에 의해 지정된다(참고예, Watson, J. Molecular biology of the Gene, supra). 실제로 뉴클레오티드 서열의 많은 다른 조합들이 어떤 특정한 아미노산 서열을 암호할 수 있으므로, 펩티드를 잠재적으로 암호하는 모든 가능한 서열을 제공하기 위해서는 다수의 다른 축퇴성 올리고뉴클레오티드가 구성될 필요가 있다. 그러나, 하이브리드화 프로오브로서 고 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하는데 있어서는 일부 기술적 제한이 있다. 그러나, 소정의 아미노산에 있어서 모든 코돈은 똑같은 빈도로 사용되는 것이 아니며 (Grantham R. et al., Nucleic Acids Res. 9:43-73, 1981), 포유동물 게놈에서 CpG 디뉴클레오티드는 염기조성물로부터 기대되는 빈도의 20-25% 정도로 적게 나타나므로, (Swartz, M.N. et al., J. biol. Chem. 238:1961-1967, 1962), 대개는 소정의 펩티드를 암호하는 가능한 뉴클레오티드 서열을 예측하고 소정의 올리고뉴클레오티드 프로오브의 복잡성을 감소히키는 것이 가능하다. 전술한 것을 고려하여, 상이한 LIF 펩티드에 대응하는 많은 올리고뉴클레오티드가 고안되어 표준 방법에 의해 합성된다.

단계 4:LIF-암호 클론에 대한 LB3 cDNA 라이브러리의 스크리닝.

올리고뉴클레오티드 프로오브와 하이브리드화시켜 박테리아의 콜로니를 스크리닝하기 위하여, 상기 LB3 cDNA 라이브러리의 각 푸울로부터 10,000-15,000 박테리아 콜로니를 아가 평판(50μg/ml 암피실린 함유)상에서 성장시키고 니트로셀룰로즈 필터 디스크에 전이시킨후, 200μg/ml의 클로르암페니콜이 함유된 아가 평판상에서 그 필터를 항온처리시킴으로써 플라스미드 DNA를 증폭시킨다(Hanahan, D. and Meselson, M. Gene 10:63-67, 1980). 원래의 평판상에서 콜로니를 재성장시킨 후, 제2의 니트로셀룰로즈 필터를 상기와 같이 제조한다. 주요 평판을 2차 재성장시킨후, 4℃에서 보관한다. 플라스미드 DNA를 박테리아 콜로니로부터 방출시키고 전술한 바와 같이 니트로셀룰로즈 필터에 고정시킨다(Maniatis, T. et al., Molecular cloning, cold Spring Harbor, New York, 1981), 하이브리드화전에, 필터를 0.9M NaC1, 0.09M 소듐 시트레이트, 0.2% 피콜, 0.2% 폴리비닐-피롤리돈, 0.2% 소 혈청 알부민, 50μg/ml의 열 변성된 연어 정자 DNA, 50μg/ml의 이. 콜리 tRNA, 0.1M ATP 및 2mM의 소듐 피로포스페이트 중에서 37℃로 수시간동안 항온처리한다. 0.1% NP40을 추가로 함유하는 똑같은 용액중에서 37℃로 18시간동안 하이브리드화를 실시한다. 도 8에 나타낸 합성 올리고뉴클레오티드 500ng을 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 촉매되고 500μCi의 [γ-³²P]ATP를 함유하는 반응물에서 방사능 라벨한다(특이 활성도 2,000-3,000Ci/mmol). 미혼입된 [γ-³²P]ATP를 제조사의 지시에 따라 NACS-PREPAC 칼럼(Bethesda Research Laboratories) 상에서 이온교환 크로마토그래피하여 방사능 라벨된 올리고뉴클레오티드로부터 분리한다. 방사능 라벨된 올리고뉴클레오티드는 약 20ng/ml의 농도로 하이브리드화 반응에 포함된다. 하이브리드화후, 필터를 0.9M NaC1, 0.09M의 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트중에서 여러 온도하에서(후술됨) 철저히 세척한후, 오토래디오그래프화한다.

연속적인 세척 실시의 원리는, 저온에서는 올리고뉴클레오티드와 상동성이 적은(약 15 뉴클레오티드 정도) 모든 클론이 이중 필터상에 오토래디오그래프 스포트로서 나타난다는 것이다. 온도가 상승될수록, 올리고뉴클레오티드 프로오브는 가장 낮은 수준의 상동성을 갖는 클론으로부터 용해되어 대응 오토래디오그래프 시그널이 손실된다. 상동성이 큰 클론(및 즉 LIF cDNA 서열의 최상의 후보를 나타내는 클론)은 고온에서도 하이브리드화를 유지한다. 이 방법에 의해 가장 강력히 추천되는 클론에 직접적으로 촛점을 모을 수 있다. 도 9는 세척온도를 46℃에서 66℃로 상승시키면, 15,000 LB3 cDNA 클론이 함유된 두벌의 필터상에서의 한 셋트의 클론의 성능을 나타낸다. 몇개의 클론은 저온에서만 올리고뉴클레오티드에 대한 하이브리드화를 보유하지만 몇몇은 66℃에서도 하이브리드화를 유지한다(예컨대, 클론 1과 2). 다른 분석을 위해 후자의 클론을 선별하고 대응 박테리아 콜로니를 주평판으로부터 분리해내어, 정제하고 표준 방법(Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982)에 의해 각 박테리아 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조한다. 이 클론의 예비 구조 분석(삽입된 cDNA의 크기 측정, 여러 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 부위의 지도상에서의 위치 결정 및 다른 LIF 펩티드에 대응하는 여러가지 올리고튜클레오티드와의 하이브리드화에 대한 시험)에 따르면, 이들 클론들 각각은 실제로 동일하며; 즉, 그들은 동일한 원래 클로닝의 상이한 분리물들을 나타낸다. 따라서, 더욱 상세한 분석이 단지 하나의 클론, pLIF7.2b에 대하여 실시된다.

단계 5:pLIF7.2b의 뉴클레오티드 서열의 결정.

디데옥시 사슬 말단화 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977)에 의하여, 주형으로서 알카린 또는 열 변성된 이중-가닥의 플라스미드 DNA와, cDNA에 인접하는 벡터(pJL3)의 부분 및 프라이머로서 cDNA 삽입체내의 서열에 모두 상보적인 여러가지 올리고뉴클레오티드를 사용하며, 서열화 반응에서 폴리머라제로서 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편과 조류 골수아세포종증 비루스 역 전사효소를 사용하여 클론 pLIF7.2b의 cDNA 부분의 뉴클레오티드 서열 분석을 실시한다. 클론 pLIF7.2b의 cDNA 부분에 대하여 측정된 바의 서열을 도 10에 나타내었다. 상기 분석에 의하여 이 클론은 실제로 LIF 분자를 암호하는 능력을 가진 mRNA의 DNA 카피를 함유하는 것으로 확인되었는데, 이는 중지 코돈에 의해 중단되지 않는 전체 cDNA에 걸쳐 있는 해독 판독 프레임내에서, LIF 분자의 여러 펩티드에 대하여 기 결정된 모든 아미노산 서열이 밝혀질 수 있기 때문이다. 그러나, 이 클론은 (a) 5'말단에서 메티오닌 코돈에 의해 개시된 추정 소수성 리더 서열을 암호하는 부분을 통해 연장되지 않으며 (b) 3' 말단에서 인-프레임 해독 중지 코돈을 함유하지 않으므로, LIF 암호 부분의 완전한 카피를 포함하지 않는다. 그러나 기 결정된 아미노-말단 아미노산 서열과 비교함으로써 결정된, 성숙한 단백질을 암호하는 부분의 개시부를 지난 5' 말단에서 연장된다(도 10의 잔기 Pro 9).

[실시예 5]

하기 실시예는 쥐의 LIF 암호 부분의 완전 길이의 카피를 구성하고 효모 발현 벡터에서 이 암호 부분을 위치시키며, 쥐의 LIF를 생산하는 단계들을 설명한다.

첨부되는 도면들은 후술되는 방법의 여러 단계들에 관한 것이다.

도 11은 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 1에 관한 것이다: LIF의 C-말단 아미노산 서열, pLIF7.2b 판독 프레임의 C-말단에서의 아미노산 서열은 크렙스 복수 종양 세포로부터 정제된 LIF에서 유래된 스태필로코쿠스 V8 프로테아제와 트립틱 펩티드의 서열상에 나타나 있다. 후자 펩티드는 pLIF7.2b LIF 서열에서 9 아미노산 연장되어 똑같은 잔기에서 종결된다. 클론 pLIFNK1의 대응 부분에서의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하단에 나타내는데, 이에 따라 직접적인 아미노산 서열화에 의해 부여된 C-말단이 확인된다. 번호 체계는 도 10에 나타나 있다.

도 12는 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 2에 관한 것이다:효모 발현 벡터, YEpescl로 삽입하기 위한 pLIF7.2b cDNA의 재구성. pLIF7.2b cDNA의 뉴클레오티드 서열 일부와 이것의 암호된 아미노산 서열이 상단에 표시되어 있다. 번호는 도 10 및 도 11에 따라 붙여졌다. 제2 및 제3라인은 각각 pLIFmut1과 pLIFmut2의 서열을 나타낸다. 별표는 중지 코돈을 나타낸다. YEpsec1(Baldari. C. et al., EMBO J. 6:229-234, 1987) 및 pGEX-2T(Smith, D.B. and Johnson, K.G., Gene, in Press, 1988)내로 클로닝하기 위해 사용되는 제한 부위(Bam HI. Hind Ⅲ과 Eco RⅠ)이 표시되어 있다. 하단은 YEpsecl내의 K. lactis 킬러 록신 시그널 서열의 부분 서열을 나타낸다. Bam HI 제한 부위에서 암호된 서열 Gly-Ser은 시그널 펩티다제에 의해 효율적으로 인식된다(Baldari, C. et al., EMBO J. 6:229-234, 1987).

도 13은 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 4에 관한 것이다: M1 백혈병 세포의 배양액중 효모-유래된 재조합체 LIF의 생물학적 활성, 정제된 천연 LIF-A(-o-)에 대한 효모-유래된 재조합 LIF(-o-)의 M1 배양액에서의 적정은 M1 콜로니(판넬 A)의 분화 및 콜로니 형성(판넬 B)의 억제에 있어 유사한 농도 의존성 유도를 나타낸다. 각 포인트는 두 배양액으로부터의 평균치를 나타낸다.

도 14는 효모 세포에서의 쥐 LIF 발현의 단계 5에 관한 것이다: 쥐 복막 세포상의 세포성 수용체에 천연¹²⁵I-LIF-A가 결합하는 것과 경쟁할 수 있는 원래의 천연 쥐 LIF-A의 상이한 희석액(-o-), 갈락토즈로 유도된 LIFmutl/YEpsecl 재조합체를 함유한 효모 세포로부터 조건화된 배지(-o-)와 갈락토즈로 유도되지 않은 것을 제외하고는 똑같은 효모 세포로부터 조건화된 배지(-+-)의 능력.

단계 1: 쥐 LIF의 C-말단에서의 아미노산 서열의 측정

실시예 4의 cDNA 클론 pLIF7.2b는 쥐 LIF mRNA의 불완전 카피를 포함한다. 5' 말단에서, cDNA는 N-말단 아미노산 서열 분석에 의해 결정된 제1잔기(도 10에 Pro 9)까지 N-말단에 잔기 8개를 암호한다. 그러나, 3' 말단에서, pLIF7.2b는 이것이 인-프레임 해독 중지 코돈을 함유하지 않으므로 완성되지 않는다. 직접적인 아미노산 서열화(실시예 2)에 의해 측정된 두개의 LIF 펩티드의 아미노산 서열 조사에 따르면 pLIF7.2b에는 3' 말단에서의 암호 부분의 27개 뉴클레오티드만이 결여되어 있다. 도 11에 나타내는 바와 같이, V8-유래 펩티드는 cDNA 서열의 잔기 Ala 162에서 개시되며 cDNA 클론으로부터 추론된 아미노산 서열에서 9개 잔기까지 연장된다. V8 펩티드내에 포함된 트립틱 펩티드는 똑같은 잔기에서 종결되는데 이것은 Phe 187이 그 단백질의 C-말단 잔기임을 암시하는 것이다. 이 결론을 확인하기 위하여, pLIF7.2b와 중복되며 3'-방향으로 신장된 LIF cDNA 클론을 분리하여 뉴클레오티드 서열 분석한다.

상기 클론을 분리하기 위한 적합한 cDNA 라이브러리를 구성하고 스크리닝하기 위해, 일련의 상이한 mRNA 샘플을 노던 블롯 하이브리드화에 의해 스크리닝하여 최고 농도의 LIF mRNA 분자를 가진 RNA 샘플을 확인한다. 전술한 바와 같이(Gough, N.M. J. Mol. Biol. 165:683-699, 1983), 제조한 세포질의 폴리아데닐화된 RNA를 20mM의 모르폴리노프로판 설폰산(MOPS), 5mM의 소듐 아세테이트, 1mM의 EDTA(pH 7.0과 6% v/v의 포름알데히드가 함유된 1%의 아가로즈 겔상에서 분별화되고, RNA를 포함하는 필터를 0.2% 피콜, 0.2%의 폴리비닐-피롤리돈, 0.2% 소 혈청 알부민, 2mM의 소듐 피로포스페이트, 1mM의 ATP, 50μg/ml의 변성된 연어 정자 DNA와 50μg/ml의 이.콜리 tRNA가 함유된 2×SSC중에 67℃에서 몇시간동안 담가 놓는다. 동일 완충액과 0.1% SDS중에서 67℃로 하이브리드화했다. LIF 전사체를 검출하기 위해 사용되는 프로오브는 pSP65에서 서브클론된 pLIF7.2b의 cDNA 삽입체를 포함하는 약 750bp Eco RI-Hind Ⅲ 단편으로 이루어져 있다. 이 단편은 cDNA 서열뿐아니라 G-C 테일과 약 150bp의 pJl3 벡터 서열을 포함한다. 약 2×10⁹cpm/μg의 리보프로오브는 BRESA(Adelaide)에 의해 공급된 시약을 사용하여 이 SP6 서브클론을 전사함으로써 유도된다. 그 프로오브는 약 2×10⁷cpm/ml로 하이브리드화 과정에 포함된다. 필터를 67℃로 2×SSC, 2mM EDTA, 0.1% SDS 및 최종적으로 67℃로 0.2×SSC중에서 철저히 세척하고 오토래디오그래프화한다.

상기 분석에 의해 LIF 전사체가 광범위한 조혈 세포주에서 소량 존재한다는 것과 크렙스 RNA의 여러 상이한 베취내 LIF mRNA의 양에는 상당한 차이가 있음이 나타났다. 크렙스 복수 종양 세포 RNA의 두개 배취가 두개의 cDNA 라이브러리의 합성을 위해 선택된다. cDNA 라이브러리는 아머삼에 의해 공급되는 시약(생성물 번호 RPN, 1256과 RPN. 1257) 및 제조사의 지시에 따라 구성된다; 그 클로닝 벡터는 λGT10이다. 약 4×10⁵재조합 클론을 얻고 pLIF7.2b 서열의 3' 말단의 36개 잔기 서열(도 10의 뉴클레오티드 500-535(포함))에 대응하는 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화시켜 스크리닝한다.

크렙스 cDNA 라이브러리를 나타내는 파아지 플라크를 10cm 페트리 다쉬당 약 50,000 플라크의 밀도로 성장시키고 니트로셀룰로즈에 두번 옮긴후, 표준 방법(Maniatis, T. et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982)을 사용하여 처리한다. 하이브리드화 전에, 필터를 몇시간동안 37℃하에 6×SSC(SSC=0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트), 0.2% 피콜, 0.2% 폴리비닐-피롤리돈, 0.2% 소 혈청 알부민, 2mM 소듐 피로포스페이트, 1mM ATP, 50mg/ml의 변성된 연어 정자 DNA와 50μ/ml의 이. 콜리 tRNA 중에서 항온 처리시킨다. 0.1% NP40을 함유하는 동일 용액중에서 37℃로 16-18시간동안 하이브리드화시킨다. 약 10⁹cpm/μg의 특이 활성으로, [γ-³²P]ATP와 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 방사능 라벨되고 NACS 칼럼(Bethesda Research Laboratories)상에서 이온 교환 크로마토그래프화시킴으로써 미혼입된 라벨로부터 분리해낸 전술한 올리고뉴클레오티드 프로오브가 약 20ng/ml의 농도로 하이브리드화과정에 포함된다. 하이브리드화후, 필터를 60℃에서 6×SSC, 0.1% 소듐 도데실 설페이트중에서 철저히 세척한다. 이중 필터상에서 양성인, 클론 λLIFNK1을 나타내는 하나의 플라크를 채취하여 전술한 바와 같이 저밀도로 재스크리닝한다.

전술한 올리고뉴클레오티드와 하이브리드된, λLIFNK1내의 약 950bp의 cDNA 삽입체를 플라스미드 벡터(pEMBL8⁺, Dente, L, et al., Nucl. Acids Res. 11:1645-1655, 1983)로 서브클론하여 클론 pLIFNK1을 얻는다. pLIFNK1내의 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열 분식은 디데옥시 사슬 말단화 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977)에 의해 주형으로서 알카린 변성된 이중-가닥의 플라스미드 DNA(Chen, E. Y. and Seeburg, P.H., DNA 4:165-170, 1985), 프라이머로서 그 cDNA에 인접한 벡터 부분과 cDNA 삽입체내의 서열에 모두 상보적인 많은 올리고뉴클레오티드를 사용하며, 서열화 반응에서 폴리머라제로서 이. 콜리 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편과 AMV 역 전사효소를 사용하여 실시한다. pLIFNK1내 cDNA 삽입체 일부분의 뉴클레오티드 서열은 도 11에 수록되었다. pLIFNK1에 의해 명시된 아미노산 서열은 LIF의 C-말단을 구성하는 것으로 직접적인 아미노산 서열화에 의해 예측된 C-말단의 9개 아미노산과 동일하며, Phe 187은 pLIFNK1 cDNA 서열에서 이 잔기에 대한 코돈의 바로다움이 인-프레임 해독 중지 코돈이기 때문에 LIF의 C-말단 잔기인 것으로 확인된다.

단계 2: 효모 발현 벡터내에서의 LIF 코돈 부분의 구성

LIF cDNA 클론에 의해 암호된 단백질의 최초 생산은, 그 발현 생성물이 글리코실화되고, 분비되며 정확히 접히도록 진핵생물 시스템(효모)에서 이루어졌다. 사용된 발현 벡터, YEpsec1(Baldari, C. et al. EMBO J. 6:229-234, 1987)은 인터류킨 1의 효율적인 분비를 유도하는 것으로 이미 증명되었으며 (Baldari. C. et al., EMBO J. 6:229-234, 1987) 갈락토즈-유동성 하이브리드 GAL-CYC 프로모터로부터 전사된, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 킬러 톡신 유전자로부터 유래된 N-말단 리더 서열을 제공한다.

이 벡터에서 pLIF7.2b에 의해 암호된 단백질을 발현하기 위해서는, 몇가지 방법으로 cDNA를 변형시킬 필요가 있다(도 12 참조). 5' 말단에서, 부분적인 포유동물 리더 서열을 명시하는 몇개의 뉴클레오티드는 제거하고 K. lactis 리더와 함께 프레임내에 삽입되도록 적합한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(Bam HI)는 포함시키며 적합한 시그널 펩티다제 절단 부위(Gly-Ser)는 보유되도록 할 필요가 있다. 3' 말단에서는, LIF에 대한 암호 부분의 두개 이형체를 구성한다. 하나의 정지 코돈이 pLIF7.2b의 마지막 코돈(Gln 178) 바로 뒤에 위치하도록 하나의 이형체(LIFmut1)를 구성한다. 다른 이형체(LIFmut2)는 pLIF7.2b로부터 소실된 것으로 알려진 9개의 아미노산 잔기를 암호하는 서열(상기 참조)과 그 다음에 인-프레임 해독 중지 코돈을 부착시켜 구성한다.

적합한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(Hind Ⅲ)은 두개 조립체 모두를 완성시킨다. 이 모든 변형은 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발에 의해 이루어진다:G-C 테일과 pJL3 벡터의 일부분에 의해 결합된 pLIF7.2b의 535bp cDNA에 삽입체를 지니는 약 750bp의 Eco RI-Hind Ⅲ 단편을 플라스미드 pEMBL8⁺(Dente. L. et al. Nucl. Acids Res. 11:1645-1655, 1983)내로 서브클론시키고 단일-가닥의 DNA를 전술한 바와 같이 제조한다(Cesarini. G. and Murray. J.A.H. in Setlow. J.K. and Hollaender, A.(eds), Genetic Engineering:Principles and Methods. Plenum Press, New York, Vol. 8, 1987(in Press)). 설험관내 돌연변이를 전술한 바와 같이(Nisbet. I.T. and Beilharz. M.W. Gene Anal. Techn. 2:23-29, 1985) 각각 35, 51과 61개 염기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시함으로써 상술한 바와 같이 cDAN의 5' 말단과 3' 말단을 변형시킨다. 변형된 LIF cDNA 서열이 포함된 Bam HI-Hind Ⅲ 단편을 플라스미드 YEpsec1로 결찰시키고 생성된 재조합체내 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.

단계 3: 효모 세포로의 YEpsec1/LIF 재조합체의 도입

에스. 세레비시애(S. cerevisiae)주 GY41(Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley로부터의 leu2 ura3 adel his 4 met2 trp5 gall cir +; x 4003-5b)를 폴리에틸렌글리콜 방법(Klebe, R.J. et al. Gene 25:333-341, 1983)에 의해 형질전환시킨다. 형질전환체를 선별하고 우라실 부재하에 합성 최소 배지(50μg/ml의 필요한 아미노산이 보충된 2%의 탄소원, 0.67% 효모 질소 염기(Difco))상에서 유지시킨다. 플라스미드 YEpsec1에서 삽입체 서열은 각각 2%의 갈락토오즈를 함유하는 비-선택성 완전 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤) 또는 합성 최소 배지에서 형질전환체를 성장시킴으로써 발현된다.

단계 4:효모-유래된 LIF의 생물학적 특성의 결정

효모 조건화된 배지의 백혈병 억제 활성 및 분화-유도 활성의 분석을 최종 농도시 20%의 소 태자 혈청과 0.3% 아가를 함유하는 둘벡코스 변형 이글스 배지에서 300개의 M1 세포(제공처:Dr. M. Hozumi, Satitama Cancer Research Centre. Japan)를 포함하는 1ml 배양액중에서 실시한다.분석 물질을 계열 희석된 0.1ml 부피로 그 배양 디쉬에 부가한 후 아가 배지중의 세포 현탁액을 부가한다. 7일간 10% CO₂로 충분히 습윤된 대기에서 배양액을 배양한다. x35 확대 배율로 해부 현미경을 사용하여 그 배양액을 계수하는데, 이는 분산된 세포의 코로나를 가지거나 전체 분산된 세포로 이루어진 임의의 콜로니를 미분하여 계수한다. 콜로니의 형태학적 검사는 전체 배양액을 1ml의 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고 아세틸콜린스테아라제/룩솔 페스트 블루(Luxol Fast Blue)/헤마톡실린을 사용하여 현미경 슬라이드상에서 건조된 배양액을 염색함으로써 실시한다.

콜로니 자극 활성의 분석은 전술한 바와 같이(Metcalf, D. The Hemopoietic Colony Stimulating Factors Elsevier, Amsterdam, 1984) 75,000 C57BL 골수 세포를 사용해서 실시한다. WEHI-3B D⁺세포에 대한 활성을 유도하는 분화의 분석은 전술한 바와 같이(Nicola, N. et al, J. Biol. Chem. 258:9017-9023, 1983)시행한다.

비-형질전환된 효모, 벡터 YEpsec1만을 함유하는 효모, 또는 불완전한 암호 부분을 함유하는 효모 배양체(LIFmut1)로부터가 아닌 전체-길이의 암호 부분을 함유하는 효모의 배양체(LIFmut1)로부터의 배지는 M1 콜로니의 배양액에서 전형적인 대식세포 분화를 유도할 수 있다(도 13A). 정제된 천연 LIF에서와 같이, 증가되는 농도에 있어서, 효모-유래 물질은 또한 M1 콜로니 발생의 수와 크기가 점차적으로 감소된다(도 13B). 정제된 천연 LIF-A와 마찬가지로, 효모-유래된 LIF는 정상의 과립구-대식세포 선조세포에 의한 콜로니 형성을 자극하거나 또는 WEHI-3B D⁺백혈병 콜로니의 분화를 유도하거나 그 증식을 억제하지 못하였다. 세파크릴(Sephacryl) S-200 칼럼상의 크기 분별화에 의해, 외관 분자량 67,000 내지 150,000달톤의 단백질과 공동 용출된 효모-유래의 LIF가 크렙스 세포로부터 유래된 LIF 경우의 58,000달톤과 비교되었다.

불완전한 암호 부분을 함유하는 효모에 의해 조건화된 배지(LIFmut1)에서 LIF 활성이 부재한 것은 이 구성체에서 소실된 9개의 소수성 C-말단 잔기가 LIF 기능에 필요할 수 있는 것임을 암시하는 것이다. 이 잔기들이 그 수용체들과 상호 작용하는 사이에, 그들은 또한 그 단백질 내에서 소수성 코어의 구성부분을 구성할 수 있으며, 따라서 그들의 부재는 적절한 접힘 현상을 방해할 수 있다. 또 다르게는 그들은 몇가지 방법에서 LIF의 효율적인 분비에 필요할 수 있다.

단계 5:효모-유래된 쥐 LIF와 크렙스 Ⅱ 복수 세포 조건화된 배지로부터의 정제된 천연 LIF-A의 수용체 결합 특이성.

정제된 쥐의 LIF-A(실시예 1)을 전술한 바와 같이 요오드화한다(실시예 3). 티오글리콜레이트에 의해 복막강에서 다량의 대식세포가 유도된, 쥐를 위장 세척하여 복막 세포를 수거한다. 이 세포들을 세척하고 10% 소 태자 혈청이 함유된 헤페스(Hepes)-완충된 RPMI 배지에 2.5×10⁶/50μl로 재현탁시킨다. 50μl 분취량의 세포를¹²⁵I-LIF-A(똑같은 배지중의 10μl) 200,000cpm과 10μl의 대조 배지, 또는 비라벨된 순수한 쥐 LIF-A 또는 효모-유래된 쥐 LIF의 두배 계열 희석액과 함께 배양한다. 적합한 농도에서, LIFmut2 구성체(도 12)가 함유된 갈락토즈-유래된 효모로부터의 상청액은 복막 세포상의 수용체에¹²⁵I-LIF-A이 결합하는 것과 경쟁하지만, 비유도된 효모 상청액은 경쟁하지 않는다(도 14). 경쟁 정도는 원래의 천연 LIF-A의 것과 동일하며, 이것은 효모-유래된 LIF-A에 LIF-A 세포성 수용체에 대한 결합에 요구되는 모든 정보가 포함되어 있음을 나타내는 것이다.

[실시예 6]

하기 실시예에서는 포유동물 세포에서 재조합 쥐의 LIF를 발현하기 위해 사용된 단계들을 설명한다. 도15는 후술되는 방법의 단계 1에 관한 것이다:클론 pLIFNK3의 cDNA 부분의 뉴클레오티드 서열. mRNA-유사 가닥의 뉴클레오티드 서열은 상기에서 주어진 LIF의 추론 아미노산 서열과 5'에서 3' 방향으로 존재한다. 기 측정된 N-말단 아미노산 잔기는 +1로서 표시된다. cDNA의 5'말단의 Eco RI 부위와 그 중지 코돈에 걸친 Xba I 부위(단계 2에서 pMP-Zen으로 LIF 암호 부분을 삽입시키는데에 사용됨)가 표시되어 있다.

단계 1:쥐 LIF의 N-말단 리더 서열의 아미노산 서열의 결정.

cDNA 클론 pLIF7.2b와 pLIFNK1(상기 참조)는 LIF mRNA의 불완전 카피를 함유한다. 그들은 LIF 단백질의 성숙 부분에 대한 완전 암호 부분을 함께 함유하지만, 포유동물 세포로부터의 LIF의 분비에 필요한 완전한 소수성 리더 서열은 함유하지 않는다.

소수성 리더를 암호하는 부분이 함유된 cDNA 클론을 분리하기 위하여, 주형으로서 크렙스 mRNA의 똑같은 배치를 사용하여 상기와 같이(실시예 5) 추가 구성된 10⁶cDNA 쿨론을 pLIF7.2b 서열의 5' 말단에서 35개 잔기의 서열과 3' 말단에서 36개 잔기의 서열(도 10에 포함된 뉴클레오티드 67-102와 500-535)에 대응하는 두개의 올리고뉴클레오티드를 프로오브로 사용하여(상기와 같이) 스크리닝한다.

이중의 필터상에서 양성인 클론 λLIFNK2와 λLIFNK3를 나타내는 두 플라크를 채취하여 상기와 같이 저밀도로 재스크리닝한다. λLIFNK3은 사용된 두 올리고뉴클레오티드 각각과 하이브리드화하는 것으로 나타났으므로, 추가 분석을 위해 이를 선별하였다.

λLIFNK3내 약 1400bp의 cDNA 삽입체를 플라스미드 벡터 pEMBL8⁺(Dente, L., et al., Nucleic Acids Res. 11:1645-1655, 1983)내로 서브클론하여 클론 pLIFNK3을 얻는다. pLIFNK3의 cDNA 삽입체에 대한 뉴클레오티드 서열 분석은 pLIF7.2b와 pLIFNK1(상기)에 대한 것과 같이 실시된다.

pLIFNK3내 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 도 15에 나타내었는데, 이것은 pLIFNK3이 완전한 LIF 암호 부분을 함유함을 나타낸다:pLIFNK3 서열내 위치 23-25에 개시 코돈(AUG)이 있는데, 이것은 24개 아미노산 잔기의 전형적인 소수성 리더 서열을 암호하는 서열에 선행된다. 그 암호 부분은 pLIFNK1(상기)에 의해 이미 정의된 것과 똑같은 해독 중지 코돈까지 연장된다.

단계 2:포유동물 발현 벡터내로의 LIF 암호 부분의 도입.

최초에 선택된 포유동물 발현 벡터는 레트로비루스의 발현 벡터 pMP-Zen이다. 그 벡터는 몰로니(Moloney) 쥐 백혈병 비루스-계 벡터 pZIPNeo SV(X)(Cepko, C.L. et al., Cell 37:1053-1062, 1984)에서, 가까운 SV40 및 플라스미드 서열과 함께 neo^R유전자는 결실되고 Xho I 발현 부위는 남겨짐으로써 이것으로부터 유래된 것이다. 그 벡터의 3' 부분은 또한 골수증식성 육종 비루스(MPSV)(Bowtel, D.D.L. et al., Mol. Biol. Med. 4:229-250, 1987)의 긴 말단 반복부(LTR)로부터 인헨서가 도입되도록 변형된다. 이 벡터를 선택한 것은 첫째 LIF/PMP-Zen 재조합체가 ψ2세포(Mann, R., et al., Cell, 33:153-159, 1983)로 통과함으로써 헬퍼가 없는 감염성 레트로비루스 입자내로 패키징될 수 있기 때문이다. 그후, 그 비루스 입자는 광범위한 쥐의 세포 형태내로 LIF/pMP-Zen 재조합체를 효율적으로 도입(감염에 의해)시키는데 사용될 수 있다(Mann, R. et al., Cell 33:153-159, 1983). 둘째, 외래 암호 부분의 발현을 위해 MPSV LTR을 사용하는 이 특정 벡터는 GM-CSF를 비롯한 인자들의 분화와 다른 조혈 성장의 효율적인 발현을 유도할 수 있는 것으로 나타났기 때문이다.

pMP-Zen으로 삽입되도록 선택된 pLIFNK3의 단편은 위치 1(Eco RI 부위)로부터 위치 630(중지 코돈에 걸친 Xba I 부위)으로 연장되어 있다-도 15 참조. 이 단편이 선택되는데, 그 이유는 이것이 LIF 전구체의 암호 부분보다 약간 적은 것을 포함하며 mRNA 불안정성을 주는 서열을 포함할 수 있는 모든 3' 비번역된 부분을 배제하기 때문이다(참조예. Shaw, G. and Kamen, R. Cell 46:659-667, 1986; Verma, I. M. and Sassone-Corsi, P., Cell 51:513-514, 1987). 이 단편을 pMP-Zen으로 삽입시키기 위해, 이것을 먼저 표준 방법(Maniatis et al., 1982, supra)에 의해 pIC20H(Marsh, J.L. et al., Gene 32:481-485, 1984)의 Eco RI과 Xba I 부위 사이로 삽입시킨다. cDNA 삽입체를 Sal I과 Xho I 분해에 의해 pIC20H 플라스미드의 폴리링커로부터 회수하여 pMP-Zen의 Xho I 클로닝 부위로 삽입되기에 적합한 점착 말단을 가진 LIF cDNA 단편을 산출한다.

pMP-Zen내로 LIF cDNA 단편을 삽입하는 것은 표준 방법(Maniatis et al., 1982, supra)에 의해 실행되었다.

단계 3: 쥐 섬유아세포로의 pMP-Zen/LIF 재조합체의 도입.

pMP-Zen/LIF DNA를 전기영동(Potter et al., PNAS 81:7161-7165, 1984)에 의해 ψ2 섬유아세포내로 도입시킨다. 30μg의 pMP-Zen/LIF DNA와 3μg의 pSV2Neo DNA(Southern, P.J. and Berg, P. J. Mol. App. Genet. 1:327-341, 1982)를 1ml의 DME/10% FCS(10% 소 태자 혈청이 함유된 둘벡코스 변형 이글스 배지)중에서 1×10⁶ψ2 섬유아세포와 혼합하고 25μF의 성능에서 500v의 펄스로 적용시킨다(BioRadGene-Pulser 모델 No. 1652078 사용). pSV2Neo DNA에 부여된 항생제 G418에 대한 내성에 근거하여 처음에 형질감염체를 선택한다. G418-내성 ψ2 세포를 표준 방법(Mann, R. et al., Cell 33:153-159, 1983)에 의해 40μg/ml의 G418에서 선택한다. 시험된 19개의 G418-내성 클론중, 2개가 또한 ψ2 조건화된 배지중 검출될 수 있는 LIF 활성에 의해 측정된 바와 같은 pMP-Zen/LIF 구성체를 함유한다.

단계 4:ψ2-유래된 LIF의 생물학적 특성의 결정.

ψ2세포가 함유된 pMP-Zen/LIF로부터의 조건화된 배지의 백혈병 억제 활성과 분화-유도 활성이 분석을 전술한 바와 같이 실시한다. 3ml의 DME/10% FCS 중에서 10⁶ψ2 세포의 배양액으로부터의 배지를 분화-유도 활성에 대하여 분석한다. 두개의 양성 배양액으로부터의 결과가 하기 표에 수득되어 있다.

따라서, 생물학적으로 활성인 재조합 쥐의 LIF가 이 발현 시스템에서 대량 생산될 수 있다.

단계 5:ψ2 세포로부터 pMP-Zen/LIF 레트로비루스의 조혈 세포로의 전이.

감염성 pMP-Zen/LIF 레트로비루스는 ψ2 모 세포주로부터 FDC-P1(Dexter, T.M. et al., J. Exp. Med. 152:1036-1047, 1980) 주의 조혈 세포로 공동배양에 의해 전이될 수 있다. 10⁶개의 ψ2 세포를 FDC-P1 세포의 성장을 위한 WEHI-3BD^-조건화된 배지가 최적 농도로 함유된 10ml의 DME/10% FCS에서 10⁶개의 FDC-PI 세포와 함께 혼합한다. 2일간 배양한 후, 비-고착 FDC-P1 세포를 모든 고착 ψ2 세포로부터 제거 및 세척해내고 16시간동안 3ml의 똑같은 배지에서 성장시킨다. 조건화된 배지를 수거하여 전술한 바와 같이 분화-유도 및 백혈병 억제 활성에 대하여 분석한다. 그 결과는 하기 표와 같다:

따라서, ψ2 클론, ψ2-11a와 ψ2-11d는 생물학적으로 활성인 pMP-Zen/LIF 레트로비루스를 조혈 세포로 전이시킬 수 있다. 그러므로, 이 클론은 Zen/GM-CSF 비루스 감염에 대하여 사용된 것과 유사한 방법으로, 정상의 쥐 조혈에 대한 천연 LIF 고 수준 발현의 효과를 연구하기 위하여 광 조사된 마우스의 조혈계를 재구성하는데 사용될 수 있는 정상의 쥐 조혈성 선조 세포의 감염에 적용가능해야 한다.

[실시예 7]

하기는 이. 콜리 세포에서 재조합 쥐의 LIF를 발현하는데 사용되는 단계를 설명한다.

도 16은 후술하는 방법의 단계 1에 관한 것이다: 플라스미드 pGEX-2T/LIF에서 글루타티온 S-트랜스퍼라제/트롬빈 절단 부위/LIF 결합부에 있는 뉴클레오티드 서열과, 암호된 융합 단백질의 결합부에 있는 서열. 삼등분체 융합 단백질의 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 C-말단, 트롬빈 절단 부위 및 쥐 LIF 부분의 N-말단이 이 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열과 함께 표시되어 있다. 트롬빈에 의한 절단의 예상 부위가 화살표로 표시되어 있다.

단계 1:이. 콜리 발현 벡터내로 LIF 암호 부분의 도입.

이. 콜리에서 LIF를 발현하는데 사용되는 발현 벡터는 pGEX-2T(Smith, D. B. and Johnson, K.S., Gene(in Press), 1988)로, 이것은 기생충 쉬스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum)에 의해 암호된 27kD 글루타티온 S-트랜스퍼라제(E.C.2.5.1.18)인 Sj26의 C-말단과 융합될때 이종 폴리펩티드 합성을 유도한다. 대부분의 경우에, 융합 단백질은 수용액에서 용해되며, 글루타티온이 고정된 친화성 크로마토그래프화에 의해 비-변성 조건하에서 조 박테리아 용균물로부터 정제될 수 있는 것으로 나타난다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제 캐리어가 부위-특이성 프로테아제 트롬빈으로 분해시킴으로써 융합 단백질로부터 절단될 수 있도록 특정 벡터 pGEX-2T를 조작한다.

플라스미드 pLIFmut2(실시예 5와 도면 도 12 참조)로부터 유래된, 쥐 LIF의 완전 암호 부분을 Bam HI-Eco RI 단편으로서 pGEX-2T(상기, D.B. and Johnson, K.S., supra)의 다수 클로닝 부위내로 도입시켜, 글루타티온 S-트랜스퍼라제와 트롬빈 절단 부위의 것과 똑같은 해독 판독 프레임의 3'에 LIF 암호 부분을 위치시킨다. 따라서, LIF 단백질은 삼등분체 글루타티온 S-트랜스퍼라제/트롬빈 절단 부위/LIF 융합단백질내 이들 요소에 대한 C-말단에 위치된다(도 16 참조). 트롬빈 절단 부위는 두개의 아미노산 잔기(Gly-Ser)가 트롬빈 절단후 LIF 단백질의 N-말단에 부착되도록 위치한다. 전술한 플라스미드, pGEX-2T/LIF의 구성은 표준 기술에 의해 달성되며 이 플라스미드는 이.콜리 NM522(Gough, J. A. and Murray, N. M., J. Mol. Biol. 166:1-19, 1983)내로 표준 방법에 의해 도입된다.

단계 2: 글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 융합 단백질의 발현 및 정제.

글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 융합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 pGEX-2T/LIF가 함유된 이. 콜리 NM522 세포의 10ml 배양액을 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드가 0.1mM의 농도로 부가된 루리아 육즙에서 대수상으로 배양시킨다. 4시간 다시 성장시킨 후(이동안 글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 유전자가 발현됨), 그 세포를 원심분리에 의해 수거하고 1ml의 마우스 강장 포스페이트-완충 식염수(MTPBS:150mM NaCl, 16mM Na₂HPO₄, 4mM NaH₂PO₄, pH 7.3)중에 재현탁시킨다. 세포를 얼음위에서 완만한 초음파 처리에 의해 용균시키고 트리톤 X-100을 1%로 가한후, 세포 잔편을 원심분리(10,000g, 5분, 4℃에 의거 제거한다. 맑은 상청액을 실온으로 50ml의 폴리프로필렌 튜브중에 200μl의 50% 글루타티온-아가로즈 비드(황 결합, 시그마)와 함께 회전식 플레트폼상에서 혼합한다(사용전, 비드를 MTPBS 중에서 예-팽윤시키며, 똑같은 완충제에서 2회 세척하며 4℃에서 50% 용액 v/v로 MTPBS 중에 저장한다). 흡수후(5분), 비드를 원심분리(500g, 1분)에 의해 수거하며 3회 MTPBS/트리톤 X-100에서 세척한다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 융합 단백질을 유리 글루타티온과 경쟁시킴으로써 용출시킨다:비드를 100μl의 500mM 트리스. 염산, 5mM 환원된 글루타티온(pH 7.5)와 실온에서 2분간 항온처리한후, 그 비드를 원심분리로 제거한다. 용출 단계를 두번 실시하고 두 100μl 분취량의 용출물을 모은다.

100μl의 글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 융합 단백질은 전술한 바와 같이(Smith, D.B. and Johnson, K.S., supra) 트롬빈으로 처리한다.

1μl 분취액의 미절단 및 트롬빈-절단된 글루타티온 S-트랜스퍼라제 LIF 융합 단백질을 Pharmacia Phast Gel(8-15% 폴리아크릴아미드 구배 겔)상에서 전기영동시킨다. 코마시 블루(Coomassie Blue)로 염색시킨후, 상대적인 분자량이 ∼46kDa인 하나의 주 단백질종이 미절단된 제조물에서 나타나며, 트롬빈-절단된 제조물에서는 두개의 주요 밴드 ∼26kDa와∼20kDa(융합 단백질(46kDa), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(26kDa)와 LIF 단백질(20kDa) 각각의 예상 크기에 해당함)가 나타난다. 이 겔상에서 코마시-염색된 밴드의 질량을 측정함으로써, 원래 10ml의 이. 콜리 배양액으로부터의 글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 단백질의 산출량은 ∼1.5μg으로 추정된다.

글루타티온 S-트랜스퍼라제/LIF 융합 단백질 및 트롬빈 절단된 LIF 제조물의 분화-유도 활성 및 백혈병-억제 활성의 분석은 쥐의 M1 세포를 사용하여 전술한 바와 같이 실시된다. LIF의 두 제조물 모두 특이 활성도가 7×10⁶단위/mg 이상으로 생물학적으로 활성인 것으로 측정되었다.

[실시예 8]

하기는 쥐의 게놈이 클론 pLIF7.2b(실시예4)에 존재하는 서열을 암호하는 유전자와 밀접한 관련이 있는 다른 유전자를 포함하는지의 여부와 LIF 유전자 주위의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 위치를 나타내는 지도의 변형을 측정하기 위해 사용되는 단계들을 설명한다.

첨부 도면들은 후술하는 방법들의 여러 단계들에 관한 것이다:

도 17은 단계 1에 관한 것이다:고 및 저정밀 조건하에서 pLIF7.2b-유래된 프로오브와 마우스 DNA의 하이브리드화. 표시된 제한 효소로 분해된 BALB/c 간 DNA는 실시예 8, 단계 1에서 설명되는 바와 같이 LIF 유전자 서열에 대하여 탐지된다. 왼쪽 판넬에서 하이브리드화는 65℃로 2×SSC 중에서 일어나며 최종 세척은 65℃로 0.2×SSC 중에서 실시된다. 오른쪽 판넬에서, 하이브리드 및 세척은 둘다 65℃로 6×SSC에서 실시된다. 왼쪽 판넬에서, 3×10⁹bp의 단배체 마우스 게놈에 대한 분자량을 가정하면 선형 pLIF7.2b 플라스미드 DNA(5.6kb)는 단배체(haploid) 마우스 게놈(각각, 400pg와 40pg)당 10과 1 카피에 해당하는 양으로 포함된다(Laird, C.D. Chromosoma, 32:378-406,1971). 이것은 하이브리드화 게놈 단편의 크기가 표시되어 있다.

도 18은 단계 2에 관한 것이다: 여러 제한 엔도뉴클레아제로 절단된 마우스 DNA를 단일 및 짝지은 조합으로 마우스 LIF 프로오브와 하이브리드화시킴. 분해된 DNA를 0.8% 아가로즈 겔상에서 전기영동하며 실시예 8, 단계 1에서와 같이, 고정밀도 조건하에 pLIF7.2b cDNA 단편과 하이브리드화시킨다.

도 19는 단계 2에 관한 것이다:쥐 LIF 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도. cDNA 클론 pLIF7.2b에 대응하는 서열을 포함하는 염색체 DNA의 부분이 박스로 표시되어 있다. 중앙선의 위(Eco R5)와 밑(Xba I, Bam HI, Pst I과 Stu I)에 나타낸 제한 부위는 중앙선에 대하여 배향되지 않았다. 복합체내 부위의 상대적 위치는 그 선 밑에 표시되었다.

도 20는 단계 3에 관한 것이다:쥐 LIF 유전자의 염색체 지정. 레인 1에서 BALB/c 마우스 엠브리오 DNA를 전기영동하며, 레인 2에서는 차이니즈 햄스터 난소 세포로부터의 DNA를, 레인 3-8에서는 하이브리드 클론 I-18A HAT, I-18A-2a-8AG;EBS 58; EBS 11; EBS 4; 및 I-13A-1a-8AG(Cory, S. et al. EMBO J. 2:213-216, 1983)으로부터의 DNA를 전기영동한다. 이 하이브리드의 쥐의 염색체 함량은 문헌(Cory, S. 등 EMBO J. 2:213-216, 1983)에 제시되어 있다. 모든 DNA는 Bam HI으로 분해되었다. 쥐의 LIF 유전자가 포함된 3kbp Bam HI 단편의 위치가 표시되어 있다.

단계 1:쥐의 게놈에서 LIF-관련 유전자 수의 측정.

크렙스 Ⅱ 세포에 의해 조건화된 배지가 M1 세포의 분화를 유도할 수 있는 두개의 생화학적으로는 분리되지만 기능적으로 유사한 인자(LIF-A와 LIF-B)를 포함한다는 데이타(실시예 1)에 견주어, 본 발명자들은 정제 및 클론한 종류에 관련된 쥐의 게놈에 얼마나 많은 유전자가 존재하는가를 측정하고자 하였다. 그러므로, 여러 제한 엔도뉴클레아제로 분해된 쥐의 게놈성 DNA의 서던 블롯을 고 및 저정밀도 조건 둘다에서 pLIF7.2b로부터 유래된 프로오브와 하이브리드화시켰다.

BALB/c 마우스 간으로부터의 고 분자량 게놈성 DNA 20μg 분취액을 여러 제한 엔도뉴클레아제로 완전 분해하며 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분별화한후, 니트로셀룰로즈로 전이시킨다. 하이브리드화 이전에, 필터를 몇시간동안 65℃로 6×SSC(저정밀도) 또는 2×SSC(고정밀도) (SSC=0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트) 0.2% 피콜, 0.2% 폴리비닐-피롤리돈, 0.2% 소 혈청 알부민, 2mM 소듐 피로포스페이트, 1mM ATP. 50μg/ml 변성 연어 정자 DNA와 50μg/ml의 이.콜리 tRNA에서 항온처리한다. 0.1%SDS를 포함하는 동일 용액중에서 65℃로 16-18시간 동안 하이브리드화한다. 필터를 6×SSC, 0.1% SDS 중에서 65℃(저정밀도) 또는 2×SSC, 0.1% SDS 중에서 65℃, 이후 0.2×SSC 중에서 65℃로(고정밀도) 도 17에 설명된 바와 같이 세척한다. 사용된 하이브리드화 프로오브는 니크-해독에 의해 약 4×10⁸cpm/μg의 특이 활성으로 방사능 라벨된 pLIF7.2b의 cDNA 삽입체에 걸친 전술한 바의 약 750bp Eco RI-Hind Ⅲ 단편이며 약 2×10⁷cpm/ml의 농도로 하이브리드화에 포함한다.

크렙스 Ⅱ 세포, LB3 T세포와 WEHI265 단핵구 세포(표시안함)으로부터의 DNA 뿐아니라 쥐 간의 DNA(도 17)에서, LIF 프로오브는 약 11.3 및 13kbp에 각각 해당하는 독특한 Eco RI, Bam HI 및 Hind Ⅲ 단편을 검춤해내었다. 똑같은 형태의 하이브리드화가 고정밀도(0.2×SSC, 65℃)와 저정밀도(6×SSC, 65℃)(도 17)에서 증명되며: 저정밀도 하이브리드화 및 세척 조건하에, 어떠한 추가 밴드도 나타나지 않는다. 마찬가지로, 독특한 하이브리드 단편이 Pst I. Stu I. Sac I, Eco R5와 Bgl Ⅱ-분해된 게놈성 DNA(도17)에서 검출되었다. 또한, 도 16에서 설명되는 실험에 있어, pLIF7.2b 플라스미드 DNA는 단배체 마우스 게놈상 10과 1 카피에 해당하는 농도로 포함되며(트랙 1과 2); 게놈성 LIF 서열의 하이브리드화 강도는 고유한 유전자 표준(트랙 2)의 강도와 거의 다르지 않다.

전술한 데이타들은, LIF 유전자가 아무런 유사한 관련체없이 쥐의 게놈에서 유일한 것임을 암시한다. 따라서 두개 종류의 LIF는 상이한 유전자들의 생성물이기 보다는, 똑같은 유전자 생성물의 전사후 또는 해독후 변이체를 나타내는 것으로 보는 것이 타당하다.

단계 2:쥐 LIF 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도 작성

쥐 LIF 유전자 내 및 주위의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 위치를 결정하여 이 유전자의 분자량 지문을 제공하기 위하여, 마우스 간 또는 크렙스 복수 종양 세포로부터의 DNA를 여러 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨후, 단계 1에서와 같이(고정밀도 하이브리드화 및 세척 조건하) 서던 블롯으로 분석한다. 상기 실험들의 예는 도 18에 표시되어 있다. 분해 생성물 크기의 분석에 의해 LIF 유전자 주위의 각 절단 부위의 위치를 나타내는 지도를 만들 수 있다(도 19).

단계 3:쥐 LIF 유전자의 염색체 지정

마우스의 LIF 유전자가 소재하는 염색체를 결정하기 위하여 여러 마우스 염색체를 보유하는 여섯마리의 마우스-차이니즈 햄스터 난소체 세포 하이브리드 세포주로부터 DNA를 검사한다(Cory, S. et al, EMBO J.2:213-216, 1983;Francke, U. et al, Cytogenet. Cell, Genet. 19:57-84, 1977). 서던 블롯 분석은 단계1에서와 같이 실시하며(고정밀도 하이브리드화 및 세척 조건 사용). 이 분석은 쥐의 LIF 유전자가 포함된 3kbp Bam HI 단편에는 모든 하이브리드가 존재하지 않음을 보여준다(도 20). 염색체 11은 이들 세포주(Cory, S. et al, EMBO J. 2:213-216, 1983)의 그러한 것에도, 마우스-차이니즈 햄스퍼 하이브리드(Francke, U. et al., Cytogenet. Cell. Genet. 19:57-84, 1977)의 특성을 보유하지 않는 유일한 마우스 염색체이므로, ILIF 유전자는 이 염색체상에 존재하는 것 같다. 똑같은 근거로, 쥐의 GM-CSF 유전자(Barlow, D. P. et al, EMBO J. 6:617-623, 1987)와 멀티-CSF 유전자(Ihle, J. N. and Kozak, C. A., National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility, Annual Report, 1984)는 또한 염색체 11에 지정되는데, 그 배열은 유전적 결합 연구(Barlow, D.P. et al. EMBO J. 6:617-623, 1987)에 의해 확인되었다.

[실시예 9]

하기는 하이브리드화에 의해 인체 LIF-암호 서열이 포함된 인체 유전자 또는 mRNA 또는 재조합 DNA 클론을 확인하는데 클론된 쥐의 LIF cDNA를 사용할 수 있는 조건을 설정하기 위해 사용되는 단계들을 설명한다.

첨부 도면(도 21)은 후술되는 방법의 단계 2에 관한 것이다:여러 조건하에 클론 pLIF7.2b로부터의 cDNA의 32p-라벨된 단편을 마우스 및 인체 기원의 게놈성 DNA에 하이브리드화시키는 방법. 각 경우에, 트랙 1은 15μg의 쥐(LB3) DNA를 포함하며, 트랙 2와 3은 15μg의 인체 DNA(각각, 세포주 Raji 또는 Ramos로부터)를 포함한다. 각 필터에 적용된 하이브리드화 및 세척 조건이 단계 2에서 설명된다. 쥐의 LIF 유전자가 포함된 약 10kbp의 Eco RI 단편 및 인체의 상동체가 포함된 약 9kbp의 Eco RI 단편이 화살표시되었다. 표준 분자량이 왼쪽에 주어졌다. 두개의 다른 오토래디오그래프성 노출(16시간 및 62시간)이 표시된다.

단계:pLIF7.2b로부터의 cDNA 단편의 제조 및 방사능 라벨링.

pLIF7.2b 플라스미드 DNA를 이. 콜리 MC1061(Casadaban, M. and Cohen, S., J. Mol. Biol. 138:179-207, 1980)에서 성장시켜 증폭시키고 표준 방법(Maniatis, J. et al, Molecular Cloning, cold Spring Harbor. New York, 1982)에 의해 이.콜리 세포로부터 추출하여 CsCl-구배 원심분리에 의해 정제한다. 정제된 pLIF7.2b 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Eco RI와 Hind Ⅲ로 절단하고, 1.5% 아가로즈 겔을 통한 전기영동에 의해 벡터 서열로부터 분리시켜 벡터(pJL3)로부터 ∼770bp의 cDNA-함유 단편을 방출시킨다.

이렇게 정제된 200ng의 pLIF7.2b cDNA 단편을 100μCi[α³²P]-dATP가 함유된 반응물에서 니크-해독(Rigby, P.W.J., Deickmann, M., Rhodes, C. and Berg, P., J. Mol. Biol. 113:237-251, 1977)에 의해 약 3×10⁸cpm/μg의 특이 활성으로 방사능 라벨시킨다. 방사능 라벨된 cDNA 단편을 1M의 소듐 퍼클로레이트와 33% 이소프로판올의 존재하에 침전시킴으로써 미혼입된 라벨로부터 정제한다.

단계 2:pLIF7.2b cDNA 프로오브를 사용한 마우스 및 인체 게놈성 DNA의 서던 블롯의 하이브리드화. 제한 엔도뉴클레아제 Eco RI으로 절단선 쥐의 T 세포주 LB3(레인 1) 및 두개의 인체 B 세포주(Raji and Ramos; 레인 2와 3)으로부터의 고 분자량 게놈성 DNA(15μg)을 0.8% 아가로즈 겔을 통해 전기영동시키고 표준 방법(Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517, 1975)을 사용하여 니트로셀룰로즈로 전이시킨다. 5개의 동일한 서던 블롯을 각각 세개의 DNA가 포함되도록 하여 제조한다. 하이브리드화 전에, 필터를 55℃로 몇시간동안 0.9M NaCl, 0.09M 소듐 시트레이트, 0.2% 피콜, 0.2% 폴리비닐-피롤리돈, 0.2% 소혈청 알부민, 50μg/ml의 열 변성 연어 정자 DNA, 50μg/ml의 이.콜리 tRNA, 0.1mM ATP와 2mM 소듐 피로포스페이트중에서(필터 a,b,c,d) 또는 똑같은 첨가 성분들과 함께 0.3M NaCl, 0.03M 소듐 시트레이트증에서 (필터 e) 항온처리한다. 단계 1에서 제조된³²P-라벨된 pLIF7.2b cDNA와의 하이브리드화는 0.1% 소듐 도데실 설페이트가 또한 포함된, 예비 하이브리드화에서 사용된 것과 똑같은 용액에서 55℃로(필터 a,b,c) 또는 65℃로(필터 d,e) 16시간동안 실시한다.³²P-라벨된 cDNA는 하이브리드화전에 비등시켜 변성시키며, 이것은 ∼10⁷cpm/ml로 하이브리드화 반응에 포함된다.

하이브리드화후, 0.9M NaCl, 0.09M 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트에서 55℃(필터 a), 60℃(필터 b) 또는 65℃(필터 c,d)로 또는 0.3M NaCl, 0.03M 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트에서 65℃(필터 e)로 그 필터를 세척한다. 철저히 세척한 후, 코닥 XAP-5 필름과 두개의 증감 스크린을 사용하여 -70℃에서 그 필터를 오토래디오그래프화한다. 도 21는 이 실험 결과들을 보여주는데, 이때 전술한 하이브리드화/세척(필터 d와 e) 두 과정에 의해 쥐의 LIF 유전자(약 10kbp의 Eco RI 단편상에 존재)와 인체 LIF 유전자(약 9kbp의 Eco RI 단편상에 존재)가 상기 잔류하는 배경 비-특이성 하이브리드화함을 검출할 수 있다. 시험된 모든 다른 조건들은 허용될 수 없을 만큼 높은 수준의 배경 하이브리드화를 일으킨다(필터 a,b,c).

[실시예 10]

하기 실시예는 쥐의 LIF에 상동인 클론된 인체 유전자를 얻기 위해 사용되는 단계들을 설명한다.

첨부되는 도면들은 후술된 방법의 여러 단계들에 관한 것이다.

도 22는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 1에 관한 것이다:마우스 LIF cDNA 프로오브를 사용하는 서던 블롯 하이브리드화에 의한 LIF 유전자의 검출. 인체 ㅅ포주 RAMOS로부터의 게놈성 DNA를 표시된 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고 실시예 19, 단계 1에 설명된 조건하에서 pLIF7.2b로부터 유래된 마우스 cDNA 단편과 하이브리드화시킨다.

도 23은 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 1에 관한 것이다:여러가지 하이브리드화 조건하에 마우스 LIF cDNA 프로오브를 사용하는 서던 블롯 하이브리드화에 의한 LIF 유전자의 검출. 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI으로 분해된 인체 세포주 RAMOS(H) 또는 마우스 간 DNA(M)으로부터의 게놈성 DNA를 여러 하이브리드화 및 세척 조건하에서 쥐의 LIF cDNA 프로오브(pLIF7.2b)와 하이브리드화시킨다. 하이브리드화에 사용된 SSC의 농도와 온도가 최상단에 표시되며, 세척 조건은 두번째 단에 표시되어 있다(실시예 10, 단계 1).

도 24는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 2에 관한 것이다:세개의 추천 LIF 유전자 클론의 제한 엔도뉴클레아제 절단. 클론 λHGLIF1, λHGLIF2와 λHGLIF3의 λ파아지로부터의 DNA 1μg을 Sal I. Bam HI 또는 Pst I으로 분해하고, 0.8% 아가로즈 겔상에서 전기영동한후(좌측 판넬), 니트로셀룰로즈로 전이시키고 pLIF7.2b cDNA와(전술한 바와 같이) 하이브리드화한다. 하이브리드 단편의 적합한 크기가 표시되어 있다.

도 25는 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 3에 관한 것이다:인체 LIF 유전자(H)에 걸친 λHGLIF1의 1.3kbp 단편의 mRNA-유사 가닥의 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3'방향으로 제공된다. cDNA 클론 pLIF7.2b, pLIFNK1과 pLIFNK3으로부터 유래된 쥐 LIF mRNA(M)의 대응 뉴클레오티드 서열은 인체 유전자 밑으로 배열되어 있으며 소문자로 주어져 있다. 마우스와 인체 서열 사이의 동일 부분은 별표로 도시되어 있다. 마우스 LIF에서 유추한 성숙한 인체 LIF의 추정 N-말단 잔기가 +1 지정되어 있다.

도 26은 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 3에 관한 것이다: 인체 LIF의 아미노산 서열 및 마우스 LIF와의 비교. 직접적인 아미노산 서열화와 cDNA 클론 pLIF7.2b, pLIFNK1과 pLIFNK3의 분석으로 결정된바의 성숙한 쥐 LIF(M)의 아미노산 서열이 최상단에 표시되어 있고 λHGLIF1의 서열로부터 추론된 인체LIF(H)의 대응 서열은 하단에 표시되어 있다. 동일부분은 점선으로 표시되어 있다.

도 27은 인체 LIF 유전자 클로닝의 단계 4에 관한 것이다:인체 LIF 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도. pLIF7.2b(도 25)와 상동인 인체 유전자의 엑손이 박스로 지정되어 있다. 그 유전자의 전사 방향이 그 선밑에 화살표로 표시되어 있다.

단계 1:마우스 프로오브를 이용한 인체 LIF 유전자의 검출

인체 LIF 유전자를 검출하기 위한 하이브리드화 프로오브로서 마우스 LIF cDNA 클론 pLIF7.2b의 방사능 라벨된 단편을 사용하는 방법은 이미 설명되었다. 도 22는 이 방법에 의해 인체 LIF 유전자가 여러 제한 엔도뉴클레아제로 분해된 인체 게놈성 DNA에서 검출될 수 있음을 보이고 있다. 이와 같은 분석 및 제시되지 않은 다른 겔들에 의해 인체 LIF 유전자가 소재하는, 여러 제한 엔도뉴클레아제에 의해 산출되는 DNA 단편의 크기가 밝혀졌다. 상기 데이타들은 이 실시예의 연속 단계에 있어서, 마우스 프로오브가 인체를 검사하기 위해 하이브리드화 프로오브로서 사용될 수 있는 조건을 설정하는 것 뿐만 아니라 인체 게놈성 LIF 클론을 확인하는데에 있어 도움이 되는 진단성 제한 지도 데이타를 제공하는데에 중요한 것이 된다.

Bam HI로 분해된 마우스 및 인체 게놈성 DNA가 여러 하이브리드화 및 세척 건조하에 마우스의 LIF cDNA 프로오브와 하이브리드화 될때, 마우스 및 인체 LIF 서열 사이에는 높은 정도의 상동성이 나타난다(도 23). 하이브리드화 및 세척 조건이 까다로울수록 배경 반점이 감소되며, 마우스 프로오브와 하이브리드화하는 ∼3kbp의 유일단 단편이 나타난다. 인체 유전자는 65℃하에 0.2×SSC에서도 상당한 하이브리드화를 보유한다.

단계 2: 인체 게놈성 라이브러리의 스크리닝 및 LIF 유전자가 함유된 클론의 단리.

Sau 3A로 부분 분해되고 람다 파아지 클로닝 벡터 EMBL3A로 결찰된 인체 게놈성 DNA의 라이브러리를 프로오브로서 마우스 cDNA와 하이브리드화시킴으로써 LIF 유전자-함유 클론에 대해 스크리닝한다. LIF cDNA의 단편을 방사능 라벨하며 하이브리드화의 조건은 전술한 바와 같다(실시예 4). 간략하게, 게놈성 라이브러리를 나타내는 파아지 플라크를 10cm 페트리 디쉬당 ∼50,000 플라크의 밀도로 성장시키고 전술한 바와 같이 니트로셀룰로즈로 전이시킨다(Maniatis, T. et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). 하이브리드화전에, 필터를 몇시간동안 65℃로 6×SSC(SSC=0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트), 0.2% 피콜, 0.2% 폴리비닐-피롤리돈, 0.2% 소혈청 알부민, 2mM의 소듐 피로포스페이트, 1mM ATP 50μg/ml의 변성된 연어 정자 DNA와 50μg/ml의 이. 콜리 tRAN 중에서 항온처리한다. 0.1% SDS가 함유된 똑같은 용액에서 65℃로 16-18시간동안 하이브리드화를 실시한다. ∼2×10⁸cpm/μg의 특이 활성으로 [α³²P]dATP를 사용하는 니크-해독에 의해 방사능 라벨된 LIF cDNA 단편은 ∼2×10⁶cpm/ml의 농도로 하이브리드화에 포함된다. 하이브리드화후, 필터를 65℃로 6×SSC, 0.1% 소듐 도데실 설페이트중에서 철저히 세척한후, 오토래디오그래프화한다. 이중 필터상의 양성 플라크를 취하여 전술한 바와 같이 저밀도로 재스크리닝한다.

세개의 클론을 확인하고 정제하였다;λHGLIF1, 2 및 3. 이 클론들 사이의 관계를 조사하고 어떤 것이 인체 LIF 유전자를 포함하는가를 검사하기 위하여, 각 클론으로부터 DNA를 제조하여 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다:각각 ∼3kb와 1.8kbp와 0.6kbp(상기에서 측정된 바와 같음)의 특징적인 단편들을 만들기위한, 클론된 게놈성 DNA의 전체 단편들을 유리시키는 Sal I 과 LIF 유전자내와 그 주변을 분해시키는 Bam HI와 Pst I. 재조합 파아지 DNA의 분해 및 아가로즈 겔상에서의 전기영동에 의한 분할후(도 24, 왼쪽 판넬), 그 DNA를 니트로셀룰로즈에 전이시키고 마우스 LIF cDNA 프로오브와 하이브리드화시켜(상술된 조건하), LIF 유전자가 함유된 단편들을 밝혀낸다(도 24, 오른쪽 판넬). 이 분석은 하기(a)-(c)의 사실을 나타낸다:(a) 모든 세개 클론이 동일하게 나타난다; (b) 모두는 마우스 LIF 프로오브와의 상동부분을 함유하는 게놈성 DNA의 ∼kbp 단편을 포함한다;(c) 마우스 cDNA와의 상동 부분이 인체 LIF 유전자의 특성인(상기 참조), 3kb Bam HI 단편 및 1.8 및 0.6kbp Pst I 단편상에 존재한다.

따라서, 모든 세개의 클론은 인체 LIF 유전자를 포함하는 염색체 DNA의 분절을 포함하는 것으로 결론지어진다.

단계 3: 인체 LIF 유전자의 뉴클레오티트 서열의 결정

마우스 LIF cDNA 프로오브와 하이브리드되는 것으로 상기에서 나타난 λHGLIF1의 ∼3kbp Bam HI 단편들을 플라스미드 벡터 pEMBL8⁺내로 재클론하여, 클론 pHGLIFBam1을 만들고 이를 뉴클레오티드 서열 분석한다. 주형으로서 알카리 변성된 이중-가닥의 플라스미드 DNA와, 프라이머로서 그 유전자내의 서열과 상보적인 여러 올리고뉴클레오티드 및, 서열화 반응에서 폴리머라제로서 조류 골수아세포종증 비루스 역 전사효소와 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 람들의 마레노우 단편 둘다를 사용하여 디데옥시 사슬 종결 방법(Sanger. F et al, Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5463-5467, 1977)에 의해 뉴클레오티드 서열화를 실시한다.

LIF 유전자에 걸친 Bam HI 단편의 전체 뉴클레오티드 서열(2840bp)가 결정되는데, 그중 1297bp가 도 25에 표시되었다. 쥐의 LIF mRNA 서열을 포함하는 이 서열의 배열은 성숙 인체 LIF 단백질을 암호하는 서열이 693bp의 인트론에 의해 분리되는 두개의 엑손상에 존재함을 보여준다(도 25). 성숙한 단백질을 암호하는 부분에 있어서, 뉴클레오티드와 아미노산 서열 수준에서 두 종류 사이에는 상동성 정도가 높다. 엑손 1내에는 성숙 단백질을 암호하는 부분(위치 58-186)에 대해 88%(114/129 잔기) 핵산 서열 상동성과 91%(39/43) 아미노산 서열 상동성이 존재한다. 엑손 2는 어느정도는 덜 상동성을 나타내는데, 암호 부분내에서, 뉴클레오티드 수준에서는 77%(318/411) 및 아미노산 수준(101/136)에서는 74%를 나타낸다. 전체로서 성숙 단백질을 고려하면, 상기 결정된 마우스 및 인체 LIF 서열을 삽입이나 또는 삭제가 전혀 없이 179개중 40개 위치(78%)에서 동일하다(도 26). 또한, 차이나는 곳중 대부분은 높은 보존성 치환에 의한 것이다(Lys:Arg, Glu:Asp와 Leu:Val:Ala).

성숙 LIF의 N-말단 프롤린 잔기(도 25에서 위치 58)에 대한 코돈의 5'에서 인체 유전자는 소수성 리더의 대부분을 암호하는 부분을 거쳐 쥐 LIF의 mRNA 서열과 상동이다. 그러나, 전체 리더는 이 엑손상에서 암호되지 않는데, 이는 mRNA와 유전자 서열이 전형적인 RNA 접속 부위(TCCCCAG)(Mount, S.M., Nucleic Acids Res. 10:459-472, 1982)에서 분리되기 때문이다. 그 리더의 5' 비번역 부분과 첫번째 잔기를 특정화하는 엑손은 이 접속 부위의 1097bp 5'내에서 존재하지 않는다. 마우스 LIF 유전자에서, 소수성 리더의 처음 6개 아미노산 잔기를 특정화하는 엑손은 유사한 접속 부위의 ∼1.5kbp 5'에 위치한다.

단계 4:인체 LIF 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도의 작성

인체 LIF 유전자내 또는 그 주변의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 위치를 결정하여, 이 유전자의 분자량 지문을 제공하기 위하여, 인체 게놈성 DNA(RAMOS 세포주로부터 유래)를 여러 제한 엔도뉴클레아제로 단일 및 쌍-형태 조합으로 분해하고, 그 사용 프로오브가 상기 단계 3에서 설명된 pHGLIFBam1로부터 유래되고 니크-해독시 방사능 라벨된 3kbp Bam HI 단편인 것을 제외하고는 실시예 8에서 설명된 것과 같이 서던 블롯 분석한다. 도 22에 나타나며, λHGLIF1과 pHGLIFBam1의 분석으로부터 유래된 것뿐아니라 상기와 같이 유래된 데이타의 분석(표시안함)에 의해 도 27에 나타내는 제한 엔도뉴클레아제 절단지도가 작성되었다.

[실시예 11]

하기 실시예는 효모 세포에서 발현하기 위한 클론된 인체 LIF 유전자에 대하여 이루어진 변형과, 유래된 재조합 인체 LIF의 생물 및 생화학적 특성의 결정을 상세히 설명한다.

도 28은 단계 1에 관한 것이다:YEEpsec1으로의 혼입을 위해 인체 LIF 유전자를 변형시키는데 사용되는 올리고뉴클레오티드. 올리고뉴클레오티드(a)는 암호 부분의 5' 말단에 대응한다(도 25에서 잔기 31-69). 올리고뉴클레오티드(b)는 암호 부분의 중앙부에 대응한다(도 25에서 잔기 163-186과 880-903). 엑손 1에 상보적인 이 올리고뉴클레오티드의 일부분은 점선으로 밑줄쳐져 있으며 엑손 2에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 일부분은 점으로 표시되어 있다. 올리고뉴클레오티드(c)는 암호 부분의 3' 말단에 대응한다(도 25의 1279위치로부터). 올리고뉴클레오티드(a)와 (b) 는 표시된 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 도입한다.

도 29는 단계 1에 관한 것이다:클론된 인체 LIF 유전자의 돌연변이 유발에 의해 유래된 합성 인체 LIF cDNA에 의해 암호된 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열. 올리고뉴클레오티드(a)와 (c)(도 28)에 의해 도입된 Bam HI와 Hind Ⅲ 절단 부위가 표시되어 있다. 성숙 LIF의 추정된 N-말단 아미노산(쥐와 유사)이 +1로 표시된다.

도 30은 단계 3에 관한 것이다:정제된 천연 쥐 LIF의 희석액(○-○) 및 갈락토즈로 유도된 YEpesc1/HLIF 재조합체가 함유된 효모 세포로부터의 조건화된 배지(●-●)에 대한 M1 백혈병 세포의 콜로니에서의 분화 유도. YEpsec1/HLIF 재조합체가 포함된 비유도된 효모 배양액으로부터의 조건화된 배지(○-○)는 비활성이다. 7일 배양 후 복제물로부터의 평균 데이타가 제시되었다.

도 31은 단계 4에 관한 것이다:쥐의 M1 세포상의 특이 수용체에 대한 결합에 있어서, 천연 쥐의¹²⁵I-LIF와 효모-유래된 HLIF의 경쟁. 원래의 천연 쥐 LIF-A(실시예 1)(○-○), 재조합 쥐의 LIF(●-●)와, 갈락토즈로 유도된 것과(□-□) 갈락토즈로 유도되지 않은 YEpsec1/HELF 구성체가 함유된 효모 세포로부터의 조건화된 배지(■-■)의 희석액들을 전술한 바와 같이, 37℃하에 쥐의 M1 세포상의 세포성 수용체에 대한 천연¹²⁵I-LIF-A의 결합에 있어서 경쟁하는 능력에 관하여 시험한다.

단계 1:효모에서 발현되기 위한 인체 LIF 유전자의 변형

인체 LIF 유전자 및 전술한 유전자의 뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 DNA 클론의 분리는 이미 설명되었다(실시예 10). 성숙 인체 LIF 단백질을 암호하는 2개의 엑손에 걸친 DNA의 1297bp의 뉴클레오티드 서열은 도 25에 제시되어 있다.

쥐의 재조합 LIF는 효모 발현 벡터, YEpsec1를 사용하여 효모 세포에서 이미 생산되었다(실시예 5). 이 벡터는 갈락토즈-유도성 하이브리드 GAL-CYC 프로모터로부터 전사된, 클루이베로마이세스 락티스의 킬러 톡신 유전자로부터 유래된 N-말단 리더 서열을 제공한다.

이 벡터에서 인체 LIF 유전자에 의해 암호된 단백질을 발현ㅎ기 위해서는 여러방법으로 그 유전자를 변형시킬 필요가 있다. 성숙 단백질을 암호하는 부분의 5' 말단에 케이. 락티스 리더와 함께 제한 엔도뉴클레아제 Bam HI에 대한 절단 부위를 도입하여 프레임내에 삽입시키고 적합한 시그널 펩티다제 절단 부위(Gly-Ser)이 보존되도록 한다. 마우스 cDNA(pLIF7.2b)에 이미 적용된 것과 똑같이 변형이 이루어진다. 중앙부에서, 693bp 방해 서열이 제거되며, 두개의 엑손이 똑같은 해독 판독 프레임에서 융합된다. 3' 말단에, 제2해독 중지 코돈을 천연 중지 코돈에 3'에 바로 도입하고, 그 뒤에는 YEpsec1로의 삽입을 위한 Hind Ⅲ부위가 수반된다. 모든 변형이 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이 유발에 의해 이루어진다:LIF 유전자에 걸친 ∼3kb Bam HI 단편을 플라스미드 pEMBL8⁺에 서브클론시키며(Dente, L. et al, Nucleic Acids Res. 11:1645-1655, 1983) 단일-가닥의 DNA를 F1 초감염에 의해 제조한다. 실험관내 돌연변이 유발은 상기 유전자(도 28 참조)의 5' 말단, 중앙부, 3' 말단을 변형시키도록 각각 39, 48과 39 염기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전술한 바와 같이 실시한다(Nisbet, I.T. and Beilharz, M.W. Gene Anal, Techn. 2:23-29, 1985). 변형된 인체 LIF 암호 부분의 뉴클레오티드 서열은 도 29에 표시되어 있다.

단계 2:효모 세포로의 YEpsec1/HLIF 재조합체의 도입

에스. 세레비시애 균주 GY1⁺(G. Cesareni, EMBL 하이델베르그로부터의 leu2 ura3 ade2 trpl cir+)를 폴리에틸렌 글리콜 방법(Klebe, R.J. et al, Gene 25:333-341, 1983)에 의해 형질전환시킨다. 형질전화체를 선택하고 우라실 부재하에 합성 최소 배지(50μg/ml의 필요한 아미노산이 보충된 2% 탄소원, 0.67% 효모 질소 염기(Difco))상에서 유지시킨다. 재조합 HLIF는 두가지 방법중 하나에 의해 제조된다. (1), Ura⁺형질 전환체를 2% 갈락토즈가 함유된 비-선택성 배지중에서 정지상까지 성장시켜 활성에 대하여 배지를 분석하거나 또는 (2), Ura⁺형질전환체를 2% 글루코즈가 함유된 선택성 최소 배지중에서 정지상까지 성장시킨다. 세포를 세척한 후, 2% 에탄올이 함유된 동일 부피의 선택성 최소 배지중에 재현탁시키고, 8시간 성장시켜 글루코즈 억제를 극복하도록 한다. 그 세포를 2% 갈락토즈가 함유된 합성 최소 배지로 회석(1:10)함으로써 HLIF 삽입체의 전사를 유도한다. 배양 상청액의 분취량을 유도후 수차에 걸쳐 제거하며 밀리포어필터(0.2μm)로 여과후 LIF 활성에 대하여 직접 분석한다.

단계 3: 효모-유래된 LIF의 생물학적 특성의 결정.

마우스 LIF와 인체 LIF 사이의 서열 유사성의 높은 정도에 비추어, 쥐의 M1 세포에 대한 효모 유래된 인체 LIF이 활성이 평가되었다. 분화-유도 활성 및 효모 조건화된 배지의 백혈병 억제 활성에 대한 분석을, 최종 농도가 20%의 소 태자 혈청과 0.3% 아가인 둘벡코스 변형 이글스 배지중에 300개의 쥐 M1 세포(Dr. M. Hozumi, Saitama Cancer Research Centre, Japan에서 제공됨)가 포함된 1ml 배양액에서 실시한다. 분석 물질은 아가 배지중의 세포 현탁액을 가하기 전에 배양 디쉬에 계열 희석된 0.1ml 부피로 첨가한다. 배양액을 7일간 충분히 습윤된 공기중 10%의 CO₂대기중에서 항온처리한다. 배양액을 x35 배율로 분석 현미경을 사용하여 계수하는데 분화시, 분산된 세포의 코로나를 갖는 콜로니 또는 거의 분산된 세포로 구성된 콜로니의 수를 기록한다. 콜로니의 형태학적 조사는 전체 배양액을 1ml의 2.5% 글루타르알데히드로 고정시킨후 그 건조된 배양물을 아세틸콜린스테라제/Loxol Fast Blue/헤마톡실린을 사용하여 현미경 슬라이드상에서 스테이닝하여 실시한다.

똑같은 효모 세포의 비유도된 배양액으로부터가 아닌 비-형질전환된 효모의 배양액으로부터의 YEpsec1에 인체 암호 부분이 함유된 효모 또는 벡터 YEpsec1만을 함유하는 효모의 갈락토즈-유도 배양액으로부터의 배지는 M1 콜로니의 배양액에서 전형적인 대식세포 분화를 유도할 수 있다(도 30). 쥐의 LIF에서와 같이, 농도가 증가될수록, 효모-유래된 인체 물질은 또한 M1 콜로니 발생의 수와 크기를 점차로 감소시킨다. 정제된 천연 쥐의 LIF와 비교함으로써, 효모 조건화된 배지가 인체 LIF를 50,000단위/ml까지 함유한다는 것이 밝혀졌다.

단계 4: 효모-유래된 인체 LIF의 수용체 결합 특이성.

정제된 쥐의 LIF-A(실시예 1)을 전술한 바와 같이 요오드화한다. M1 세포를 세척하고 10%의 소 태자혈청이 함유된 헤페스-완충된 RPMI 배지중에서 2.5×10⁶/50μl로 재현탁시킨다. 50μl 분취액중의 세포를 200,000cpm의¹²⁵I-LIF-A(똑같은 배주중의 10μl)와 10μl의 대조 배지 또는 비라벨된 순수 쥐 LIF-A의 두배 계열 희석액 또는 YEpsec1/HLIF 구성체가 포함된 효모 형질전환체의 갈락토즈-유도 또는 비유도 배양액으로부터이 조건화된 배지와 함께 배양한다.

YEpsec1/HLIF 재조합체가 포함된 갈락토즈-유도된 효모 세포에 의해 조건화된 배지는 37℃(도 31) 및 0℃(나타내지 않음)에서 천연 및 재조합 쥐 LIF-A와 똑같은 정도로 쥐 M1 세포상의 특이 세포성 수용체에 대한 천연 쥐¹²⁵I-LIF-A의 결합과 경쟁할 수 있다. 비유도된 효모 세포 및 벡터 YEpsec1만을 포함한 효모 세포로부터의 배지는 경쟁을 보이지 않는다. 따라서, 일차 아미노산 서열 유사성 정도가 높으면, 쥐 및 인체 LIF에서 수용체 결합 도메인이 강력히 보존되는 것으로 나타난다.

단계 5: 효모-유래된 인체 LIF의 정제, 서열화 및 요오드화

실시예 1의 단계 2와 4를 사용하여 YEpsec1/HLIF 재조합체가 포함된 갈락토즈-유도된 효모 세포에 의해 조건화된 배지에서 인체 LIF를 정제하는데, 단 DEAE-세파로즈 CL-6B 칼럼에 결합되고, 염 구배로, 용출되는 LIF 화성을 단계 2에서 모은다. 2M의 NaCl중의 1mCi의 Na¹²⁵I(2.7μl)와 5μl 의 0.2mM IC1과 함께 50μl의 0.2M 소듐 포스페이트 완충액, pH 7.2중에서 1μg의 인체 LIF을 60초간 항온처리시킴으로써 정제된 효모-유래된 인체 LIF를 방사능 요오드화한다. 0.02%의 트윈 20과 0.02%의 소듐 아지드가 함유된 포스페이트 완충(20mM, pH 7.4) 식염수(0.15M) 중에서 평형화된 세파덱스 G-25M(Pharmacia)의 칼럼을 통해 그 반응 혼합물을 통과시킴으로써 비혼입된¹²⁵I로부터¹²⁵I-LIF를 분리한다. 인체¹²⁵I-LIF는 8-25%구배의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔상에 외적 분자량 170,000의 하나의 넓은 밴드로서 전기 영동된다. 쥐의 M1 세포와 골수 세포에 특이적으로 결합한 인체 125I-LIF는 쥐의 LIF 수용체에 결합할 수 있는 인체 LIF의 능력을 가짐을 증명한다. 정제된 효모-유래된 인체 LIF(약 10μg)을 실시예 2에서와 같이 아미노-말단 아미노산 서열화시켜 Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala……의 한 서열을 얻는다. 이것은, Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala……인 쥐 서열(실시예 2)의 개시부에 비하면 네번째 아미노산에서 그 서열이 시작되는 것을 제외하고는 인체 LIF(제 26)의 예측 아미노산 서열과 동일하다. 이것은 정제된 효모-유래된 인체 LIF가 마우스 서열의 대응하는 처음 세개의 아미노산을 가지지 않지만 여전히 쥐의 LIF 수용체에 결합할 수 있으며 생물학적으로 활성임을 보여주는 것이다. 따라서, 처음 세 아미노산은 LIF의 생물학적 활성에 대하여 필수적인 것은 아니다.

[실시예 12]

하기 실시예는 추정 천연 인체 LIF 분자를 확인하며 부분적으로 정제하기 위하여 사용되는 단계들을 설명한다.

첨부된 도면들은 후술하는 방법의 여러 단계들에 관한 것이다.

도 32는 추정 인체 LIF를 확인하는 단계 2에 관한 것이다:인체 방광암 세포주 5637(ATCC. HTB9)에 의해 조건화된 배지(-□-) 조생성물 또는 (-+-) DEAE 비-결합 분획 또는 천연 쥐 LIF-A(-o-)의 다른 희석액의 쥐 복막 세포상의 세포성 수용체에 대한 쥐¹²⁵I-LIF-A의 결합의 경쟁 능력, 결합에 대해 경쟁하는 인체 G-CSF(-■-)의 불능이 또한 나타난다(비회석=5μg/ml).

도 33은 추정 인체 LIF을 확인하는 단계 3에 관한 것이다:DEAE-세파로즈 CL-6B의 칼럼상에서 인체 방광암 세포주 5637에 의해 조건화되고, 쥐 LIF-A의 전술한 분별(실시예 1)에서와 같이 정확하게 용출된 배지의 분별화와 쥐 M1 세포의 분화된 콜로니의 형성을 유도할 수 있는 이 분별화로부터의 각 분획의 능력. 판넬 A는 염 구배를 나타내며, 판넬 B는 5637 조건화된 배지의 분별화를 나타내고; 판넬 C는 비교용으로 크렙스 Ⅱ세포 조건화된 배지의 분별화를 나타낸다.

도 34는 추정 인체 LIF를 확인하는 단계 3에 관한 것이다:쥐의 LIF-A의 분별화에 대하여 전술한 바와 같이(실시예 1) 용출된 렌틸-렉틴 세파로즈 4B의 칼럼상에서 인체 방광암 세포주 5637에 의해 조건화된 배지의 분별화 및 쥐 M1 세포의 분화된 콜로니의 형성을 유도할 수 있는 상기 분별화로부터의 각 분획의 능력. 판넬 A는 α-메틸-D-만노피라노시드의 구배를 나타내며, 판넬 B는 5637 조건화된 배지의 분별화를 나타내고 판넬 C는 비교용으로 크렙스 Ⅱ 조건화된 배지의 분별화를 나타낸다.

단계 1:여러가지 인체 세포주에 의해 조건화된 배지를 반-고형 아가 배양액(본 명세서의 실시예 5, 단계 4에서 설명)중에서 M1 쥐 골수양 백혈병 세포의 분화를 유도하는 능력 및 증식을 억제하는 능력에 대하여 분석한다. 몇몇 세포주는 상기 활성을 보이며, 그중 방광암 세포주 5637은 최고 수준으로 활성을 보인다. 그러나, 5637 세포주는 이미 M1 세포의 분화를 유도하는데에 있어서 또한 활성인(Tomida, M. et al, FEBS Lett. 207:271-275, 1986:Neckers, L.M. and Pluznik, D.H. Exp. Hematol. 15;700-703, 1987)인체 G-CSF(Nicola, N.A. et al. Nature 314:625-628, 1985;Welte, K. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1526-1530, 1985)를 생산하는 것으로 이미 증명되어 있다. 5637 세포가 원래의 인체 LIF(G-CSF외에)를 생산함을 확인하기 위하여, 5637-조건화된 배지를 또한 하기 단계 2와 3으로 처리한다.

단계 2: 5637 세포로 조건화된 배지를 20배로 농축시키고 쥐의 복막

세포상의 특이 세포성 수용체에 대한 천연 쥐¹²⁵I-LIF-A의 결합에 대하여 경쟁하는 능력을 시험한다. 이 경쟁 결합 분석은 본 명세서내 실시예 5의 단계 5에서 설명된 바와 같다. 세포성 수용체에 대한 쥐¹²⁵I-LIF-A의 결합에 대하여 경쟁할 수 있는 활성이 함유된 5637 세포-조건화된 배지와 이 활성을 5637CM(LIF-A)의 DEAE 비-결합 분획(도 32)에서 농축시킨다. 매우 높은 농도에서도 인체 및 쥐의 G-CSF 는¹²⁵I-LIF-A 결합 부위에 대하여 경쟁하지 않으므로, 이것은 쥐 LIF의 수용체를 특이적으로 인식할 수 있는 상동 인체 LIF 활성의 5637-조건화된 배지에서의 존재를 설정한다. 이것은 높은 정도의 일차 아미노산 서열 상동성과 함께, 수용성 결합 도메인으로서의 쥐와 인체 LIF의 강력한 보존성을 시사하는 것이다.

단계 3: 인체 방광암 5637 세포에 의해 조건화된 배지(10% v/v 소 태자 혈청중 21)를 40ml로 농축시키고 크렙스 Ⅱ 복수 세포-조건화된 배지로부터의 쥐의 LIF에 대하여 전술된 바와 같이 DEAE-세파로즈 CL-6B와 렌틸-렉틴-세파로즈 4B 상에서 연속적으로 크로마토그래프화한다. 5637 세포(추정의 인체 LIF)로부터의 M1 분화-유도 활성을 DEAE-세파로즈 상에서 쥐의 LIF에 대한 것과 매우 유사한 방식으로 크로마토그래프화하는데, 일부 활성은 칼럼에 결합하지 않으며(LIF-A) 나머지는 결합하고 염 구배중 용출된다(LIF-B)(도 33). 마찬가지로, 추정의 인체 LIF는 렌틸-렉틴-세파로즈 크로마토그래프 상에서 쥐의 LIF와 같이 행동하는데, 그 칼럼에 결합한 일부분의 활성은 당단백질상의 만노즈-함유 탄수화물의 존재를 나타내는 것이다(도 34). 따라서, 쥐의 M1 세포 분화를 유도함에 있어서, 이것의 교차 반응성 및 쥐의 LIF 세포성 수용체를 특이적으로 인식하는 이것의 능력과 이것의 생화학적 분별화 특성에 의하면, 5637 세포 조건화된 배지에서의 인체 활성은 쥐 LIF와 천연 인체 유사체의 기준에 부합한다.

5637 세포 조건화된 배지로부터의 천연 인체 LIF를 실시예 1의 단계 2와 4에 의해 정제하며, 단계 2로부터의 1-결합 LIF 활성과 단계 4로부터의 결합 LIF 활성을 모은다. 이렇게 모은 LIF 활성을 실시예 1의 단계 5에서와 같이, 역-상 HPLC에 의해 분별하지만, 단, 브라운리(Brownlee) RP300 C8 칼럼을 2회 사용하는데, 이때 일차는 0.1% TFA에서 0-60% CH₃CN의 구배를 사용하며 그후, 이차로는 0.1% TFA중의 45-55% CH₃CN의 구배를 사용한다. 이차 구배에서 인체 LIF는 50% CH₃CN으로 용출되며, 8-25% 구배의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동될때 외적 분자량 73,000의 주요 실배 스테이닝 밴드를 나타낸다. 천연 정제된 인체 LIF는 실시예 10의 단계 5에서 설명된 바와 같이 방사능 요오드화되며 효모-유래된 인체¹²⁵I-LIF에 대하여 설명된 바와 같이(실시예 11의 단계 5) 쥐의 M1 세포와 마우스 골수 세포에 대하여 특이적으로 결합된다.

Claims (9)

1. M1 골수양 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있고, 도 15, 도 26 또는 도 29에서 정의되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 함유하고, M1 세포 또는 쥐(murine) 또는 인체 대식세포상의 특이 세포성 수용체와의 결합에 대해서 상기 서열의 폴리펩티드와 경쟁할 수 있는 백혈병 억제 인자(LIF) 활성을 갖는 LIF 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
2. M1 골수양 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있고, M1 세포 또는 쥐(murine) 또는 인체 대식세포상의 특이 세포성 수용체와의 결합에 대해서 도 15, 도 26 또는 도 29에서 정의되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 경쟁할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하고, 도 10, 도 15(염기 1-630), 도 25 또는 도 29(염기 1-543)에서 정의되는 뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부를 함유하는 재조합 DNA 분자.
3. M1 골수양 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있고, 도 15, 도 26 또는 도 29에서 정의되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 함유하고, M1 세포 또는 쥐(murine) 또는 인체 대식세포상의 특이 세포성 수용체와의 결합에 대해서 상기 서열의 폴리펩티드와 경쟁할 수 있는 백혈병 억제 인자(LIF) 활성을 갖는 LIF 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현되도록 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자로서, 상기의 뉴클레오티드 서열은 도 10, 도 11, 도 15 또는 도 25에서 정의된 클론 pLIF7.2b, pLIFNK1, pLIFNK3, 및 pHGLIFBam1의 LIF-암호화 삽입체로부터 선택된 LIF-암호화 삽입체의 서열과, 6×SSC, 65℃의 조건 또는 더 높은 스트린전시(stringency) 조건하에서 하이브리드화하는 것을 특징으로 하는 제조합 DNA 분자.
4. M1 골수양 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있고, 도 15, 도 26 또는 도 29에서 정의되는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 함유하고, M1 세포 또는 쥐(murine) 또는 인체 대식세포상의 특이 세포성 수용체와의 결합에 대해서 상기 서열의 폴리펩티드와 경쟁할 수 있는 백혈병 억제 인자(LIF) 활성을 갖는 LIF 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현되도록 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자로서, 상기의 뉴클레오티드 서열은 도 15, 도 26 및 도 29에서 정의되는 것에서 선택되는 성숙 폴리펩티드 아미노산 서열과 78% 이상의 상동성이 있는 성숙 폴리펩티드를 함유하는 폴리펩티드를 전핵 숙주 세포에서 발현되도록 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
5. 제4항에 있어서, 상기의 성숙 폴리펩티드는 도 29에서 정의되는 아미노산 서열과 완전 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 분자.
6. 제1항에 있어서, 상기 분자가 클로닝 벡터로서 사용하는데 적합하게 되도록 복제 기점을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분자.
7. 제6항에 있어서, 상기 분자가 발현 벡터로서 사용하는데 적합하게 되도록 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분자.
8. 제7항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포.
9. 도 10, 도 11, 도 15 또는 도 25에서 정의된 클론 pLIF7.2b, pLIFNK1, pLIFNK3, 및 pHGLIFBam1의 LIF-암호화 삽입체로 구성되는 군으로부터 선택되는 LIF 폴리펩티드-암호화 삽입체의 서열 또는 아서열(subsequence), 또는 대응되는 mRNA의 서열 또는 아서열에 대응하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 진단 시약 또는 프로브.

Images