NO179210B - Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette Download PDF

Info

Publication number
NO179210B
NO179210B NO950509A NO950509A NO179210B NO 179210 B NO179210 B NO 179210B NO 950509 A NO950509 A NO 950509A NO 950509 A NO950509 A NO 950509A NO 179210 B NO179210 B NO 179210B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
lif
cells
stated
polypeptide
murine
Prior art date
Application number
NO950509A
Other languages
English (en)
Other versions
NO950509L (no
NO950509D0 (no
NO179210C (no
Inventor
David Paul Gearing
Nicholas Martin Gough
Douglas James Hilton
Julie Ann King
Donald Metcalf
Edouard Collins Nice
Nicos Anthony Nicola
Richard John Simpson
Tracy Ann Willson
Original Assignee
Amrad Corp Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/AU1988/000093 external-priority patent/WO1988007548A1/en
Publication of NO950509L publication Critical patent/NO950509L/no
Application filed by Amrad Corp Ltd filed Critical Amrad Corp Ltd
Priority to NO950509A priority Critical patent/NO179210C/no
Publication of NO950509D0 publication Critical patent/NO950509D0/no
Publication of NO179210B publication Critical patent/NO179210B/no
Publication of NO179210C publication Critical patent/NO179210C/no

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et LIF (leukemiinhiberende faktor) polypeptid, et rekombinant DNA molekyl som koder for et LIF polypeptid samt vertscelle for å uttrykke dette.
Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.
Modne blodlegemer fremstilles ved klonal proliferasjon og samtidig differensiering av umodne forløperceller (Metcalf, D.
(1984) The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier, Amsterdam). For normale hemopoese celler, er de to prosessene med proliferasjon og differensiering knyttet nært sammen slik at de modne cellene med kort levetid suppleres kontinuerlig. Minst fire biokjemiske forskjellige vekstfaktorer, de kolonistimulerende faktorer (CSFer), er in vitro vist å stimulere proliferasjon og differensiering av forløperceller av granulocytter og makrofager: G-CSF, M-CSF, GM-CSF og multi-CSF (IL-3) (se Metcalf, D.
(1987), Proe. R. Soc. B. 230, 389-423, for nærmere redegjørelse).
I motsetning til normale celler, er leukemi-myeloidceller kjennetegnet ved at proliferasjon og differensiering ikke er koblet sammen slik at umodne stamceller akkumulerer, bibe-holder deres proliferasjonsevne og unnlater å differensiere. Det har vært betydelig uenighet når det gjelder typen av biologiske faktorer som er i stand til å indusere differensieringen av myeloid-leukemiceller in vitro og om visse faktorer er i stand til å indusere differensiering i fravær av proliferasjon. Det er således foreslått at proliferasjon og differensiering nødvendigvis formidles ved hjelp av forskjellige faktorer (Sachs, L. (1982), J. Cell. Physiol. Suppl., 1, 151-164). På den ene side, har to grupper beskrevet og renset en aktivitet (MGI-2 eller D-faktor) som er i stand til å indusere differensiering av den murine myeloid-leukemicellelinje Ml, som ikke stimulerer proliferasjon av normale stamceller (Lipton, J.H. og Sachs, L., 1981), Biochem. Biophys. Acta. 673, 552-569; Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., og Hozumi, M. (1984) J. Biol. Chem. 259, 10978-10982). På den annen side, har de foreliggende oppfinnere nylig vist at en av CSFene, nemlig G-CSF, er en sterk differensieringsinduserende stimulans for den murine myeloid-leukemicellelinjen, WEHI-3B D<+>, såvel som å være en proliferativ og differen-sierende stimulans for normale celler (Nicola, N.A., Metcalf, D., Matsumoto, M. og Johnson, G.R. (1983), J. Biol. Chem. 258, 9017-9023). Dessuten har Tomida, et.al. (Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M., Okabe, T. og Takaka, F.
(1986), FEBS Lett., 207, 271-275) vist at rekombinant G-CSF også er i stand til å indusere makrofag differensiering av Ml-celler. Sammenhengen mellom disse faktorer har vært en omdiskutert sak. Situasjonen ble ytterligere komplisert ved at man fant at tumor-nekrosefaktor a(TNFa) er i stand til å stimulere differensieringen av den humane myeloblastcellelinje ML-1 (Takeda, K., Iwamoto, S., Sugimoto, H., Takuma, T., Kawatani, N., Noda, M., Masaki, A., Morise, H., Arimura, H., og Konno, K. (1986) Nature 323, 338-340).
I et forsøk på å løse uoverensstemmelsene mellom dataene fra disse gruppene, har man nå biokjemisk fraksjonert mediumet behandlet med Krebs II ascites-tumorceller anvendt i en rekke tidligere undersøkelser og man har vist at det ikke bare inneholder autentisk G-CSF og GM-CSF, aktive og normale stamceller så vel som WEHI-3B D<+> celler, men også to biokjemisk forskjellige, men funksjonelt like, faktorer som er i stand til å indusere differensiering av Ml-celler. Disse sistnevnte faktorer er blitt benevnt leukemi-inhiberende faktor (LIF)-A og (LIF)-B pga. deres evne til å undertrykke proliferasjonen av Ml-leukemiceller in vitro og man har vist at de ikke induserer differensieringen av WEHI-3B D<+> celler og ikke stimulerer proliferasjonen av normale granulocytt/makrofag stamceller.
LIF fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er definert som et molekyl med følgende to egenskaper: (1) det har evnen til å undertrykke proliferasjonen av myeloid-leukemiceller slik som Ml celler, med assosiert differensiering av leukemicellene; og (2) det vil konkurrere med et molekyl med den heri definerte sekvens av murin LIF eller human LIF for binding til spesifikke cellulære reseptorer på Ml celler eller murine eller humane makrofager.
LIF har potensial for anvendelse som et terapeutisk ikke-proliferativt middel for å undertrykke noen former av myeloid leukemi, så vel som anvendelse som en reaksjonskomponent for å modifisere makrofagfunksjon og andre responser på infeksjoner, og for klinisk testing og undersøkelser i forbindelse med disse.
Uttrykket "polypeptid med LIF aktivitet" som anvendt heri, betegner et polypeptid eller glykopolypeptid med egenskapene til LIF som angitt over, omfattende bl.a. polypeptider med en aminosyresekvens som er helt eller delvis homolog med aminosyresekvensen av enten murin eller human LIF som angitt heri. Dette uttrykk omfatter også polypeptider som er helt eller delvis homologe med bare en del av aminosyresekvensen hos murin eller human LIF forutsatt av at polypeptidet har egenskapene til LIF som angitt over. Uttrykket omfatter videre polypeptider eller glykopolypeptider som er fremstilt ved ekspresjon i en vertscelle, som er inaktive når de uttrykkes, men som bearbeides ved hjelp av vertscellen til å gi aktive molekyler, så vel som polypeptider eller glykopolypeptider som er inaktive når de uttrykkes, men som er selektivt spaltbare in vitro eller in vivo til å gi aktive molekyler.
Murin LIF er et molekyl med følgende biologiske egenskaper: (a) induksjon av makrofag differensiering i celler fra murin myeloid leukemicellelinje Ml med tap av proliferasjonsevne og død av de klonogene leukemiceller, en virkning som er forsterket ved G-CSF; (b) selektiv binding til høyaffinitetsreseptorer på Ml celler og på normale murine monocytter og makrofager fra bukhulen, milten og benmargen, idet antall reseptorer øker med makrofag modning eller funksjonell aktivering, men ikke til granulocyttiske, erytroide eller lymfoide
celler fra disse vev;
(c) spesifikk binding av 125I-LIF til høyaf f initetsreseptorer er ikke utsatt for konkurranse fra G-CSF, GM-CSF, multi-CSF (interleukin-3), M-CSF, interleukiner 1,2, 4 eller 6, endotoksin eller en rekke andre vekstfaktorer, men er
utsatt for konkurranse fra umerket LIF,
(d) økning ved hjelp av bakteriell endotoksin i serumet hos normale eller atymiske mus, men ikke i endotoksinresi-stente C3H/HeJ mus; (e) fremstilling ved hjelp av forskjellige vev omfattende lunge, spyttkjertel, peritonealceller og benpipe; (f) reduksjon av overlevelsestiden in vitro av normale granulocytt-makrofag progenitorceller ved vekst i fravær av CSF; (g) en manglende evne til å undertrykke proliferasjon eller indusere differensiering av WEHI-3B D<+> murine myeloid-leukemiceller, murine myeloidceller transformert til leukemigenisitet ved infeksjon med retroviruser som uttrykker GM-CSF eller multi-CSF, jfr. murine leukemicellelinjer WEH2 65 og WR19; (h) ingen evne til å stimulere proliferasjonen av normale progenitorceller av granulocytt, makrofag, eosinofil, megakaryocytt, erytroid og mastcelle herkomst, og en manglende evne til å undertrykke klonal proliferasjon eller endre den kvantitative respons overfor stimulering ved CSFer in vitro, av progenitorceller av normale granulocytter, makrofager, megakaryocytter, eosinofile eller naturlige cytotoksiske celler, eller proliferasjonen av celler av de kontinuerlige cellelinjer 32CD1.13 og FDCP-1; (i) en manglende evne til å konkurrere med joderte derivater av granulocytt kolonistimulerende faktor (G-CSF) for binding til spesifikke cellulære reseptorer til tross for
evnen hos G-CSF til å indusere differensiering i Ml og WEHI-3B D<+> murine myeloide leukemiceller og til å
forsterke virkningen av LIF på Ml celler;
(j) virkningen av LIF har en manglende evne til å bli inhibert ved hjelp av antisera som er produsert spesifikt
mot tumor-nekrosefaktor (TNF);
(k) transskripter for murin LIF er vesentlig til stede i cytoplasmaet av LB3 og E9.D4 T-celler, de induseres ikke ved lectin concanavalin A i disse celler og er til stede i en rekke andre celletyper.
Murin LIF er også bestemt til å ha følgende egenskaper:
(1) et enkelt subenhet-glykoprotein med molekylvekt på 58.000±5000 som bestemt ved elektroforese i 8-25 % gradient polyakrylamidgeler inneholdende natriumdodecylsulfat med eller uten reduksjonsmiddel (2-merkaptoetanol eller ditiotreitol), og en molekylvekt på 23.000±5000 etter behandling med endoglykosidasen, N-glykanase; (m) et isoelektrisk punkt mellom 8,6 og 9,3; (n) primær aminosyresekvens som gitt detaljert i figurene 5, 6 og 10 heri; (o) kodes av nukleotidsekvensen gitt detaljert i figurene 5, 6 og 10 heri;
(p) en spesifikk aktivitet på 1-2 x 10<8> enheter/mg (hvor 50
enheter er definert som mengden LIF som i 1 ml induserer en 50 % reduksjon i klonedannelsen ved murine Ml myeloide
leukemiceller);
(q) kodes for av et unikt gen på murin kromosom 11 (som bestemt ved analyse av en gruppe somatiske cellehybrider fra ovarium i mus/kinesisk hamster) avgrenset av restrik-sjonsendonukleåse-spaltingsseter som vist i fig. 15;
(r) er homolog til en human gensekvens avgrenset, i kromosomal DNA, av restriksjonsendonuklease-spaltingsseter som vist i fig. 23.
Human LIF er et molekyl med følgende biologiske egenskaper i det native og/eller gjæravledede rekombinante produkt:
(a) induksjon av makrofag differensiering i celler av den murine myeloide leukemicellelinje Ml, med tap av proliferasjonsevne og død av de klonogene leukemiceller; (b) ingen evne til å stimulere proliferasjonen av normale humane progenitorceller av granulocytt, makrofag, eosinofil og erytroid herkomst; (c) en evne, i kombinasjon med G-CSF, til delvis å undertrykke proliferasjonen av celler av den humane leukemicellelinje U937 og, i kombinasjon med GM-CSF, proliferasjonen av de humane leukemicellelinjer U937 og HL60; (d) bindes spesifikt til murine LIF reseptorer på Ml celler og murine makrofager og konkurrerer fullstendig med murin <125>I-LIF for binding til slike celler; (e) bindes til spesifikke cellulære reseptorer på den humane hepatomcellelinje Hep-2G.
Human LIF er også bestemt til å ha følgende egenskaper:
(f) er identisk med murin LIF med omtrent 80 % av aminosyre-restene i det modne protein; (g) har den primære aminosyresekvens som er gitt detaljert i figurene 21, 22 og 24; (h) kodes for av et unikt gen bundet i det kromosomale DNA ved restriksjonsendonuklease-spaltingsseter som vist i fig. 23; (i) har, som en del av sekvensen av sitt gen, nukleotidsekvensen som er gitt detaljert i fig. 21.
I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse har man tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et LIF (leukemiinhiberende faktor) polypeptid som er kjennetegnet ved at den omfatter: (a) tilveiebringelse av vertsceller som inneholder et rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, samt seleksjonsmarkør, (b) dyrking av de nevnte celler under betingelser som leder til ekspresjon av polypeptidet, og
(c) utvinning av polypeptidet,
idet polypeptidet omfatter et modent polypeptid som er minst 78 % homologt med en aminosyresekvens valgt fra dem vist i figurene 10, 22 og 24.
Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en i alt vesentlig ren LIF. Vesentlig ren LIF fremstilles ved hjelp av vertsceller slik som gjærceller, pattedyrceller og E.coli, inneholdende rekombinant DNA molekyler som koder for aminosyresekvensen av LIF, eller noe av denne.
Betegnelsen "i alt vesentlig ren form" betegner en form av polypeptid eller glykopolypeptid hvori minst 90 % av polypeptidet eller glykopolypeptidet viser seg som et enkelt bånd ved elektroforese på en passende natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel, idet nevnte bånd er overensstemmende med LIF aktivitet.
I et annet aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse et rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet og som er kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som angitt i figurene 5, 10 (baser 1-63), 21 eller 24 (baser 1-543), idet nevnte polypeptid konkurrerer med et polypeptid med en aminosyresekvens som angitt i figurene 10, 22 eller 24 for binding til spesifikke cellulære reseptorer på Ml celler eller murine eller humane makrofager. Det nevnte rekombinante DNA molekyl omfattende en nukleotidsekvens som, ved ekspresjon i en passende vertscelle, koder for LIF polypeptidet er også kjennetegnet ved at den nevnte nukleotidsekvens hybridiserer under betingelser med 6 x SSC, 65°C eller strengere betingelser, til en sekvens av et LIF-kodende innskudd valgt fra de LIF-kodende innskudd av kloner pLIF7.2b, pLIFNKl, pLIFNK3 og pHGLIFBaml som definert i figurene 5, 6, 10 eller 21. Oppfinnelsen omhandler videre en vertscelle som er kjennetegnet ved at den er transformert med et rekombinant DNA molekyl og har evnen til å uttrykke LIF polypeptidet.
I forbindelse med undersøkelser vedrørende LIF, særlig med henblikk på tilveiebringelse av alternative kilder av dette glykoprotein av både murin og human opprinnelse for å mulig-gjøre anvendelse både klinisk og på annen måte, har murin LIF også blitt renset fra Krebs II ascites tumorceller ved hjelp av en effektiv renseprosedyre (som beskrevet nærmere i NO patentsøknad nr. 885339) og er blitt underkastet delvis aminosyresekvensanalyse som et første trinn mot kjemisk eller biosyntetisk produksjon av denne faktor.
LIF som er blitt radioaktivt derivatisert med I<125> er blitt anvendt i et reseptor-konkurranseforsøk for å identifisere celler og vev fra murin og human opprinnelse som syntetiserer og produserer LIF. Som et resultat av denne undersøkelse, har et rekombinant DNA bibliotek av DNA kopier av mRNA fra en av disse kildene blitt screenet og murine LIF-kodende kloner identifisert ved hybridisering med radioaktivt merkede oligonukleotidkodende deler av den tidligere bestemte murine LIF aminosyresekvens, og ovennevnte murine LIF cDNA kloner er blitt underkastet nukleotidsekvensanalyse. Dessuten er den klonede murine LIF-kodende sekvens blitt anvendt som en hybridiseringsprobe for å identifisere et humant gen som koder for en homolog av murin LIF og hybridiseringsbetingelser er blitt etablert hvorunder nevnte hybridisering mellom spesier kan gjennomføres på en effektiv måte. Som et resultat er rekombinante DNA kloner som inneholder DNA sekvenser som koder for den human homolog av murin LIF blitt identifisert.
Som et resultat av denne konstruksjon av LIF-kodende sekvenser, er rekombinante DNA molekyler blitt konstruert som anvender klonede murine eller humane LIF-kodende DNA sekvenser til å styre syntesen av klonalt ren LIF, enten fullstendig eller delvis, i f.eks. dyrkede pattedyrceller, i gjær eller i bakterier.
I en spesiell utførelsesform vedrører oppfinnelsen ekspresjon av klonede humane og murine LIF gener i gjærceller, i fibroblaster og i E.coli, og modifikasjon av det klonede gen slik at det kan uttrykkes slik, så vel som etablering av de biologiske og biokjemiske egenskaper av rekombinant human og murin LIF.
I denne utførelsesform vedrører oppfinnelsen også som nevnt rekombinant DNA molekyl inneholdende nukleotidsekvenser som koder for human eller murin LIF, enten fullstendig eller delvis, i en form hvori nevnte nukleotidsekvenser er i stand til å styre syntesen og produksjonen av human eller murin LIF i gjærceller, fibroblaster eller E.coli, enten fullstendig eller delvis. Det er også tilveiebragt kloningsvektorer (slik som plasmider) og som nevnt vertsceller med slike rekombinant DNA molekyler innskutt deri. I en utførelsesform av oppfinnelsen er de humane og murine LIF gensekvensene modifisert og installert i en gjærekspresjonsvektor, YEpsecl. Gjærceller er blitt transformert med de oppnådde rekombinanter og mediumet som er kondisjonert med de således transformerte gjærceller har vist seg å inneholde en faktor med biologiske egenskaper som er analoge med dem til naturlig human og murin LIF.
Sett på bakgrunn av potensialet for anvendelse av LIF i behandling av pasienter med noen former av myeloid leukemi og pasienter med visse infeksjoner, er det oppnådd farmasøytiske preparater omfattende LIF, særlig human LIF, enten fullstendig eller delvis og som er fremstilt ved f.eks. anvendelse av klonede LIF-kodende DNA sekvenser eller ved kjemisk syntese. De farmasøytiske preparater kan også inneholde minst en annen biologisk regulator av blodlegemer, slik som G-CSF eller GM-CSF.
Undereksempel 1
Det følgende undereksempel viser trinnene anvendt for opp-nåelse av den N-terminale aminosyresekvens og aminosyresekvensene til forskjellige peptider dannet ved proteolytisk spaltning med trypsin eller Staphylococcus V8 protease.
LIF renset ved hjelp av prosedyren som beskrevet i eks. 1 i NO patentsøknad nr. 885339 (15 Jig) ble påført på en mikrorør
(2 mm) kolonne pakket med Brownlee RP 3 00 kuler (C8) og eluert på et HPLC system med en lineær gradient fra 0-60 % aceto-nitril i 0,1 % trifluoreddiksyre. Proteinet eluerte som en enkel topp i et volum på 100 ul. Dette ble påført på en glassfiberskål og ble tørket, for deretter å bli plassert i et sekvenseringskammer i en Applied Biosystem (Model 47OA) gassfaseproteinsekvensator. Proteinet ble sekvensert ved Edman kjemi og fenyltiohydantoinderivatene fra de individuelle aminosyrer ble identifisert ved HPLC på en Applied Biosystems 12OA PTH analysator.
En separat prøve av LIF (20 Hg) som også var renset ved hjelp av den ovennevnte prosedyre, ble fortynnet til 2 ml i 6 m guanidinhydroklorid, 0,2 M tris-HCl buffer pH 8,5, 2 mM ditiotreitol og inkubert ved 37°C i 2 timer. Deretter ble et 3 0 ganger molart overskudd av jodeddiksyre tilsatt og løs-ningen ble inkubert ved 37°C i ytterligere 15 min. Løsningen ble påført på den samme mikrorør HPLC kolonne og eluert som beskrevet over. Det reduserte og karboksymetylerte derivat av LIF (RCM-LIF) eluerte 3 min. senere fra kolonnen enn ubehand-let LIF og RCM-LIF (200 ul) ble fortynnet til 1 1 med 0,1 M tris-HCL buffer pH 8,0 inneholdende 0,02 % Tween 20, 1 mM CaCl2 og 2 ug TPCK-behandlet trypsin. Denne inkubasjon fikk fortsette i 18 timer ved 37°C og blandingen ble igjen påført på mikrorørkolonnen og eluert på samme måte som beskrevet over. Individuelle peptider viste seg som UV-absorberende topper, og ble samlet individuelt. Noen av disse peptidene ble sekvensert direkte som beskrevet over mens andre ble renset på nytt på den samme kolonne, men ved anvendelse av en 0-60 % acetonitrilgradient i 0,9 % NaCl pH 6,0 før sekvensering.
En andre prøve av RCM-LIF (200 ul = 10 ug) ble fortynnet til
1 ml med 0,05 M natriumfosfatbuffer pH 7,8 inneholdende 0,002 M EDTA og 0,02 % Tween 20, og ble spaltet med 2 ug Staphylococcus aureus V8 protease i 18 timer ved 37°C. Reaksjonsblandingen ble påført på den samme mikrorørkolonnen og eluert som beskrevet over.
De 2 6 aminosyrer som definerer LIF fra aminoterminalen ble i rekkefølge funnet å være: N-Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-Ala-Ile-Arg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Lys
Aminosyresekvensene for flere tryptiske peptider ble funnet til å være:
1. His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Lys
2. Met-Val-Ala-Tyr ...
3. Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys ..
4. Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys
5. Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Gln-Val-Lys
6. Asn-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-X-Gly-Ser-Ala-Asn-Ala-Leu-Phe-Leu-Val-Glu-Leu-Tyr ....
7. Leu-Val-Ile-Ser-Tyr...
8. Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-His-Ser-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-Gln.
9. Leu-X-Ala-Thr-Ile-Asp-Va1-Met-Arg.
10. Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-X-Gln-Ala-Phe.
Aminosyre sekvens en for et peptid dannet ved å spalte LIF med V8 protease var: Ala-Phe-Gln-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu^Gly-Thr-Tyr-Lys-Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-Val-Gln-Ala-Phe.
Undereksempel 2
Det følgende undereksempel viser trinnene som anvendes for å oppnå radioaktivt derivatisert LIF og for å identifisere LIF kilder ved hjelp av reseptor-konkurranseanalyser.
Fig. 1 er relatert til undereksempel 2: Binding av radiojodert ren LIF (omtrent 2 x IO<5> cpm/ng) til Ml myeloid-leukemiceller ved 0°C. Ml celler (5 x IO<6>) ble inkubert med <125>I-LIF (4 x 105 cpm) med eller uten konkurrerende faktorer i 2 timer hvoretter bundet radioaktivitet ble separert fra ubundet radioaktivitet ved sentrifugering gjennom føtalt kalveserum.
A. Titrering av umerket ren LIF og ren multi-CSF, GM-CSF, G-CSF eller M-CSF som konkurrerende faktorer i indikerte fortynninger (10 |il av hver fortynning tilsatt til et endelig volum på 80 jil) .
De høyeste konsentrasjoner av hver var henholdsvis IO<4 >enheter/ml; 3,5 x 10" enheter/ml; 3 x IO<4> enheter/ml; 5 x 10<4 >enheter/ml; 4 x 10<4> enheter/ml.
B. Evnen som ren LIF eller lipopolysakkarid (LPS) eller konsentrert (4-8 ganger) medium behandlet med forskjellige celler eller serum fra endotoksininjiserte mus har til å konkurrere med <125>I-LIF for binding til Ml celler som over.
LIF renset som beskrevet i eks. 1 i NO patentsøknad nr. 8853 3 9 ble radioaktivt merket med 1<25>I på tyrosin-rester som beskrevet tidligere (Nicola, N.A. og Metcalf, D., J. Cell. Physiol. 128:180-188, 1986) og ga <125>I-LIF med en spesifikk radioaktivitet på omtrent 2 x IO<5> cpm/ng. <125>I-LIF bandt seg spesifikt til Ml myeloide leukemiceller så vel som til murine "voksne" benmargceller, miltceller, tymusceller og peritoneale eksudatceller. Autoradiografisk analyse av cellene indikerte at <125>I-LIF bare bandt spesifikt til makrofager og deres forløperceller, med reseptortall økende med cellemodning og ikke påvisbart for noen andre typer hemopoese celler. Dette foreslår at LIF kan være klinisk nyttig for anvendelse ved modulering av makrofagfunksjonen i en rekke sykdomstilstander. Den spesifikke binding av <125>I-LIF til Ml myeloide leukemiceller eller til peritoneale makrofagpopulasjoner ble inhibert med umerket LIF, men ikke med en rekke andre hemopoese vekstfaktorer, omfattende G-CSF, GM-CSF, M-CSF (CSF-1), multi-CSF (interleukin 3), interleukiner 1,2,4,6, endotoksin eller andre vekstfaktorer (se f.eks. fig. 6). Evnen hos cellebehandlet medium eller celle-ekstrakter til å inhibere bindingen av <1>25I-LIF til slike cellepopulasjoner (radioaktiv reseptoranalyse for LIF) (fig. 6B) tilveiebragte således en spesifikk måling for tilstedeværelsen av LIF produksjon eller lagring ved forskjellige celler og vev. Medium kondisjonert med lektinaktiverte LB3 T celler vil f.eks. sterkt inhibere spesifikk binding av <125>I-LIF til Ml celler og således indikere at LB3 celler produserer LIF.
EKSEMPEL 1
Det følgende eksempel viser trinnene som anvendes for opp-nåelse av en klonet komplementær DNA kopi av mRNA som koder for murin LIF. Figurene 2 til 5 omhandler forskjellige trinn i metoden som er beskrevet i det etterfølgende. Figur 2 omhandler trinn 1 av kloningen av LIF cDNA kloner: akkumulering av mRNAer for hemopoese vekstregulatorer i cytoplasmaet av LB3 celler etter stimulering med lectin concanavalin A. Cytoplasmisk polyadenylert RNA (5 ug) fra WEHI-3B D" celler (spor 1), T celle klon LB3 celler dyrket ved IO<6 >celler/ml med 5 ug/ml concanavalin A i 5 timer (spor 2), og ustimulerte LB3 celler (spor 3) ble elektroforesebehandlet på formaldehyd-agarosegeler, overført til nitrocellulose og hybridisert med en <32>P-GM-CSF probe (felt a) eller en <32>P-multi-CSF probe (felt b) (for detaljer se Kelso, A., Metcalf, D. og Gough, N.M., J. Immunol. 136:1718-1725, 1986). Figur 3 vedrører trinn 3 av kloningen av LIF cDNA kloner: syntetisk oligonukleotid anvendt for identifisering av LIF kloner. En del av aminosyresekvensen av murin LIF nær den N-terminale enden (restene 15-26, se undereks. 1) er vist i øverste linje, de mulige kombinasjoner av mRNA sekvenser som kunne kode for dette peptid er vist i midten og oligonukleotidproben komplementær til denne mRNA sekvensen er vist nederst. Merk at for alle aminosyrerester unntatt Cys 17 og His 18, er oligonukleotidet bare komplementært til kodonene som oftest anvendes i pattedyr-kodeområder (Grantham et.al.,
Nucleic Acids Res. 9:43-77, 1981). For Cys 17 er sekvensen komplementær til begge kodoner. For His 18, er oligonukleotidet komplementært til CAU kodonet som er mindre hyppig anvendt. Det var usannsynlig at CAC kodonet ville anvendes da det ville danne, i konjunksjon med nabo Gly kodonet, det uvanlige CpG dinukleotidet (Swartz et.al, J. Biol. Chem. 238:1961-1967, 1962). Figur 4 vedrører trinn 4 i kloningen av LIF cDNA kloner: Identifiseringen av LIF cDNA kloner ved hybridisering med oligonukleotidet som illustrert i fig. 3. Figur 5 vedrører trinn 5 av kloningen av LIF cDNA kloner: nukleotidsekvens cDNA klon pLIF7.2b og LIF aminosyresekvens. Sekvensen av den mRNA synonyme kjede av cDNA er ført opp fra 5' til 3' med den forutsagte aminosyresekvens av LIF gitt over. Tallene i slutten av linjer indikerer stillingen av sluttresten (aminosyre eller nukleotid) på denne linje. Aminosyresekvensen er nummerert fortløpende fra den første rest kodet i dette klon. Aminosyresekvensområder bestemt ved analyse av proteinet har en strek over. Der er ingen uoverensstemmelser mellom de to. Pro 9 var den N-terminale rest bestemt ved direkte aminosyresekvensanalyse (undereks. 1). Syv potensielle N-bundne glykosyleringsseter (Neuberger, A. et.al. i Glycoproteins, Gottschalk, A., ed., Elsevier, Amsterdam, side 450-490, 1972) er indikert med stjerner og fire potensielle O-bundne glykosyleringsseter (Takahashi, N. et.al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81: 2021-2025, 1984) med skraveringer.
Trinn 1: Fremstilling av RNA inneholdende LIF mRNA. Celler av klonet murin T cellelinje LB3 (Kelso, A. og Metcalf, D. Exptl. Hematol. 13:7-15, 1985) ble stimulert med leetin concanavalin A i 6 timer for å øke akkumuleringen i cytoplasmaet av mRNAer som koder for forskjellige faktorer som regulerer veksten og differensieringen av hemopoese celler.
(Kelso, A., Metcalf, D. og Gough, N.M., J. Immunol. 136:1718-1725, 1986). (Fig. 2 viser f.eks. den økte produksjon av mRNA
som koder for de hemopoese vekstfaktorer GM-CSF og multi-CSF i celler som er stimulert slik.) Cytoplasmisk RNA ble fremstilt fra 5 x IO<8> concanavalin A-stimulerte LB3 celler ved anvend-
else av en teknikk som er beskrevet tidligere (Gough, N.M., J. Mol. Biol. 165:683-699, 1983). Polyadenylerte mRNA molekyler
ble skilt fra ribosomal RNA ved to omganger med kromatografi på oligo-dT cellulose ved anvendelse av standard prosedyrer (Maniatis, T. et.al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor,
New York, 1982).
Senere er det ved Northern blotting funnet at i motsetning til mRNAer for GM-CSF og multi-CSF, er LIF mRNA tilstede vesentlig i LB3 celler og dens tallrikhet økes ikke ved concanavalin A stimulering (Gearing, D.P. et.al.,
EMBO J. 6: 3995-4002, 1987).
Trinn 2: Syntese og kloning av et bibliotek av LB3 cDNA molekyler.
Dobbeltrådede DNA kopier av LB3 mRNA fremstilt som beskrevet
over ble syntetisert ved standard prosedyre (Maniatis, T.
et.al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982
og Gough, N.M. et.al., Nature 309:763-767 1984). Kort fortalt ble 10 (ig cytoplasmisk polyadenylert LB3 mRNA anvendt som et templat for syntese av enkeltrådet komplementær DNA (cDNA) i en reaksjon katalysert ved aviær myeloblastosevirus revers transkriptase og initiert med oligo-dT. Etter fullført reaksjon, ble mRNA nedbrutt ved inkubasjon ved 65°C i 1 time i 0,3 M NaOH, 1 mM EDTA. Etter nøytralisering av basen og utvinning av cDNA ved hjelp av etanolpresipitering, ble den enkeltrådede cDNA omdannet til dobbeltrådet i en reaksjon katalysert ved hjelp av Klenow fragmentet av E.coli DNA polymerase I. "Hårnålssløyfe" strukturen av cDNA ble deretter kuttet ved behandling med enkeltrådet spesifikk nuklease Sl og deretter ble forlengelser av deoksycytidinrester (med lengde omtrent 20-30 rester) knyttet til hver ende av den dobbeltrådede cDNA ved anvendelse av enzymet terminal deoksy-nukleotidyltransferase som beskrevet (Michelson, A.M. og
Orkin, S. J. Biol. Chem. 257:14773-14782, 1982). cDNA forlenget med dC ble fraksjonert ved elektroforese på en 1,5 % agarosegel og molekyler med en lengde som er større enn 500 bp ble utvunnet og annealet til et plasmid DNA molekyl (pJL3, Gough, N.M. et.al., EMBO J. 4:645:653, 1984) som var spaltet med restriksjonsendonukleasen Sac 1 og hvortil forlengelser av deoksyguanosinrester var tilknyttet (Michelson, A.M. og Orkin, J., J. Biol. Chem. 257:14773-14782, 1982). Det forlengede cDNA og plasmidmolekyler ble annealet som beskrevet (Gough, N.M. et.al., Biochemistry 19:2702-2710, 1980) og E.coli MC1061
(Casadaban, M. og Cohen, S., J. Mol. Biol. 138:179-207, 1980)
transformert med den baseparannealede cDNA/plasmidblanding og omtrent 50.000 uavhengig transformerte bakteriekolonier ble utvalgt ved vekst på agarplater inneholdende 10 ug/ml ampicillin. De transformerte bakteriekolonier ble fjernet fra agarplatene ved vasking med flytende vekstmedium inneholdende 50 ug/ml ampicillin og lagret som 10 uavhengige pooler i 10 % glycerol ved -70°C.
Trinn 3: Design av oligonukleotidprober.
En sekvens på 2 6 aminosyrer på den aminoterminale ende av LIF og rester fra 11 forskjellige peptider avledet ved spalting av LIF med trypsin og V8 protease er bestemt (se undereks. 1) . Disse aminosyresekvenser ga basis for design av oligonukleotider komplementære til bestemte definerte områder av mRNA som koder for LIF for anvendelse som hybridiseringsprober for å identifisere cDNA kloner svarende til LIF mRNA.
Hver naturlig forekommende aminosyre er kodet for i dens tilsvarende mRNA ved en spesifikk kombinasjon av 3 ribonukleo-sidtrifosfater (et kodon) (f.eks. Watson, J. Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1976). Visse aminosyrer er spesifisert ved kun ett kodon, mens andre er spesifisert ved så mange som 6 forskjellige kodone.r (f.eks. Watson, J. Molecular biology of the Gene, supra). Da derfor en rekke forskjellige kombinasjoner av nukleotidsekvenser faktisk vil kunne kode for enhver spesiell aminosyresekvens, vil derfor en rekke forskjellige degenererte oligonukleotider måtte bli konstruert for å imøtekomme hver mulig sekvens som potensielt koder for dette peptid. Der er imidlertid visse tekniske vanskeligheter ved anvendelse av meget degenererte oligonukleotider som hybridiseringsprober. Da imidlertid, for en gitt aminosyre, ikke alle kodoner anvendes med ekvivalent hyppighet (Grantham, R. et.al., Nucleic Acids Res. 9:43-73, 1981) og da, i pattedyrgenomet, CpG dinukleotidet er underrepresentert, idet det forekommer i bare 20 til 25 % av hyppigheten forventet ut fra basesammen-setningen (Swartz, M.N. et.al., J. Biol. Chem. 238:1961-1967, 1962), er det ofte mulig å forutsi den sannsynlige nukleotidsekvens som koder for et gitt peptid og således redusere kompleksiteten av en gitt oligonukleotidprobe. Ut fra det forutgående ble en rekke oligonukleotider svarende til forskjellige LIF peptider utformet og syntetisert ved hjelp av standard prosedyrer.
Trinn 4: Screening av et LB3 cDNA bibliotek for LIF-kodende kloner.
For screening av kolonier av bakterier ved hybridisering med oligonukleotidprober, ble 10.000-15.000 bakteriekolonier fra hver ansamling (pool) av ovennevnte LB3 cDNA bibliotek dyrket på agarplater (inneholdende 50 |Xg/ml ampicillin) , overført til nitrocellulosefilter-skåler og plasmid-DNA ble amplifisert ved inkubasjon av filterne på agarskåler inneholdende 200 |ig/ml kloramfenikol (Hanahan, D. og Meselson, M. Gene 10:63-67, 1980). Etter ny vekst av kolonier på den opprinnelige plate, ble et annet nitrocellulosefilter fremstilt som over. Masterplaten ble dyrket på nytt og deretter lagret ved 4°C. Plasmid DNA ble frigjort fra bakteriekolonier og fiksert til nitrocellulosefilterne som beskrevet tidligere (Maniatis, T. et.al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Før hybridisering ble filterne inkubert i flere timer ved 37°C i 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,2 % Ficoll., 0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % bovint serumalbumin, 50 ug/ml varmedenaturert laksespermie DNA, 50 ug/ml E.coli tRNA, 0,1 M ATP og 2 mM natriumpyrofosfat. Hybridisering ble gjennomført i den samme løsning inneholdende ytterligere 0,1 % NP40, ved 37°C i 18 timer. 500 ng av det syntetiske oligonukleotid som vist i fig. 8, ble radioaktivt merket i en reaksjon katalysert ved hjelp av polynukleotidkinase og inneholdende 500 jiCi [y-<32>P]ATP (spesifikk aktivitet 2000-3000 Ci/mmol) . [y-<32>P]ATP som ikke var innlemmet ble deretter separert fra det radioaktivt merkede oligonukleotid ved hjelp av ionebytterkromatografi på en NACS-PREPAC kolonne (Bethesda Research Laboratories) i henhold til produsentens instruksjoner. Radioaktivt merket oligonukleotid ble inkludert i hybridiseringsreaksjonen ved en konsentrasjon på omtrent 2 0 ng/ml. Etter hybridisering ble filterne omfattende vasket i 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved forskjellige temperaturer (som beskrevet under) og etter hver vask, ble filterne autoradiografert.
Begrunnelsen for å utføre flere påfølgende vaskinger var at ved lavere temperaturer vil alle kloner, med selv en liten grad av homologi med oligonukleotidet (så lite som omtrent 15 nukleotider), vise seg som autoradiografiske flekker som fremkommer på duplikatfiltere. Når temperaturen økes, vil oligonukleotidproben forsvinne fra kloner med det laveste homologinivå og de tilsvarende autoradiografiske signaler vil således gå tapt. Kloner med den høyeste grad av homologi (og således kloner som representerer de beste kandidater for inneholdelse av LIF cDNA sekvenser) vil bibeholde hybridisering ved den høyeste temperatur. Ved denne strategi er det således mulig å fokusere direkte på de sterkeste kandidater. Fig. 4 viser opptredenen til et sett kloner på et dobbelt filterpar inneholdende 15.000 LB3 cDNA kloner når vaske-temperaturen ble økt fra 46°C til 66°C. Flere kloner bibeholdt bare hybridisering til oligonukleotidet ved lavere temperaturer, mens flere bibeholdt hybridiseringen selv ved 66°C (f.eks. klonene 1 og 2). De sistnevnte kloner ble således utvalgt for ytterligere analyser og de tilsvarende bakteriekolonier ble fjernet fra masterplatene, renset og plasmid DNA ble fremstilt fra hvert bakterieklon ved hjelp av standard prosedyrer (Maniatis, T. et.al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Innledende strukturanalyser av disse kloner (ved fastsettelse av størrelsen av det innskutte cDNA, ved kartlegging av lokaliseringen av spaltingsseter for forskjellige restriksjonsendonukleaser og ved testing for hybridisering med forskjellige oligonukleotider svarende til forskjellige LIF peptider) indikerte at hvert av disse kloner faktisk var identiske; dvs. at de representerte forskjellige isolater av samme opprinnelige kloning. Således ble ytterligere detaljerte analyser gjennomført bare på ett klon, pLIF7.2b.
Trinn 5: Bestemmelse av nukleotidsekvensen til pLIF7. 2b.
Nukleotidsekvensanalyse av cDNA delen av klon pLIF7.2b ble gjennomført ved dideoksykjedetermineringsmetoden (Sanger, F. et.al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 74:5463-5467, 1977), ved anvendelse av alkalisk eller varmedenaturert dobbeltrådet plasmid DNA som templat, med en rekke oligonukleotider komplementære både til områdene av vektoren (pJL3) som flankerer cDNA og til sekvenser i cDNA innskuddet som primere, og ved anvendelse av både Klenow-fragmentet av E.coli DNA polymerase I og aviær myeloblastosevirus revers transkriptase som polymeraser i sekvenseringsreaksjonene. Sekvensen som således er bestemt for cDNA delen av klon pLIF7.2b er vist i fig. 5. Slike analyser bekrefter at dette klon virkelig inneholder en DNA kopi av et mRNA med evne til å kode for LIF-molekylet, da alle aminosyresekvensene som er bestemt tidligere for forskjellige peptider av LIF-molekylet kan bli funnet innen den eneste translasjonsleseramme som strekker seg over hele cDNA og ikke er avbrutt av stopp-kodoner. Dette klon inneholder imidlertid ikke en fullstendig kopi av LIF kodeområdet da (a): det ikke, ved 5'-enden, strekker seg forbi et område som koder for en antatt hydrofob ledersekvens initiert ved et metionin-kodon og (b): det inkluderer ikke, på sin 3'-ende, et "in-frame" translasjonsstoppkodon. Ved 5'-enden strekker det seg imidlertid forbi begynnelsen av det området som koder for det modne protein som bestemt ved sammenligning med den tidligere bestemte aminoterminale aminosyresekvens (rest Pro 9 i fig. 5) .
EKSEMPEL 2
Det følgende eksempel beskriver trinnene som anvendes for å konstruere en kopi i full lengde av det murine LIF kodeområde, installere dette kodeområdet i en gjærekspresjonsvektor og fremstille murin LIF. Figurene 6-9 vedrører forskjellige trinn i metoden som er beskrevet under. Figur 6: vedrører trinn 1 av ekspresjonen av murin LIF i gjærceller: den C-terminale aminosyresekvens av LIF. Aminosyresekvensen på den C-terminale ende av pLIF7.2b leserammen er vist over sekvensen av en Staphylococcal V8 protease og et tryptisk peptid avledet fra LIF renset fra Krebs ascites tumorceller. Merk at disse sistnevnte peptider strekker seg forbi pLIF7.2b LIF sekvensen med 9 aminosyrer og terminerer ved den samme rest. Nukleotidet og aminosyresekvensen i det tilsvarende området av klon pLIFNKl er vist i nederste linje, som bekrefter C-terminalen påvist ved direkte aminosyresekvensering. Nummereringsystemet er det samme som i fig. 5. Figur 7: Vedrører trinn 2 av ekspresjonen av murin LIF i gjærceller: rekonstruksjon av pLIF7.2b cDNA for innføring i gjærekspresjonsvektoren, YEpsecl. Partiell nukleotidsekvens av pLIF7.2b cDNA og dens kodede aminosyresekvens er vist i øverste linje. Nummereringen er i overensstemmelse med figurene 5 og 6. Den andre og tredje linjen viser sekvensen av henholdsvis pLIFmutl og pLIFmut2. Stjerner indikerer stoppkodoner. Restriksjonsseter (Barn HI, Hind III og Eco RI) anvendt for kloning i YEpsecl (Baldari, C. et.al., EMBO J. 6: 229-234, 1987) og pGEX-2T (Smith, D.B. og Johnson, K.G., Gene, 1988) er indikert. Bunnlinjen viser partiell sekvens av K.lactis killertoksin signalsekvens i YEpsecl. Sekvensen Gly-
Ser kodet ved Barn HI restriksjonssetet gjenkjennes på effektiv måte av signalpeptidase (Baldari, C. et.al, EMBO J. 6: 229-234, 1987) . Figur 8: vedrører trinn 4 i ekspresjonen av murin LIF i gjærceller: den biologiske aktivitet av gjæravledet rekombinant LIF i kulturer av Ml leukemiceller. Titrering i Ml kulturer av gjæravledet rekombinant LIF (-•-) mot renset nativ LIF-A (-o-j viser lik konsentrasjonsavhengig induksjon av differensiering i Ml kolonier (felt A) og undertrykkelse av kolonidannelse (felt B). Hvert punkt representerer gjennom-snittsverdien fra duplikatkulturer. Figur 9: vedrører trinn 5 av ekspresjonen av murin LIF i gjærceller: evnen som forskjellige fortynninger av autentisk nativ murin LIF-A (-o-), kondisjonert medium fra gjærceller inneholdende LIFmutl/YEpsecl rekombinant indusert med galaktose (-•-), og kondisjonert medium fra de samme gjærceller, men ikke indusert med galaktose (-+-), har til å konkurrere med nativ <125>I-LIF-A for binding til cellulære reseptorer på murine peritonealceller.
Trinn 1: bestemmelse av aminosyresekvensen i C-terminalen av murin LIF.
cDNA klon pLIF7.2b i eks. 1 inneholder en ufullstendig kopi av murin LIF mRNA. Ved 5'-enden, koder cDNA for 8 rester som er N-terminale til den første resten bestemt ved N-terminal aminosyresekvensanalyse (Pro 9 i fig. 5). Ved 3'-enden er imidlertid pLIF7.2b ufullstendig da den ikke inneholder et "in frame" translasjonsstoppkodon. Inspeksjon av aminosyresekvensen til to LIF peptider bestemt ved direkte aminosyresekvensering (undereks. 1) foreslår at pLIF7.2b kun manglet 27 nukleotider av kodeområdet i 3'-enden. Som vist i fig. 6, startet et V8-avledet peptid ved resten Ala 162 i cDNA-sekvensen og strakte seg forbi aminosyresekvensen utledet fra cDNA klonet med 9 rester. Et tryptisk peptid inneholdt i V8 peptidet terminerte ved den samme rest, og foreslår at Phe 187
er den C-terminale rest til proteinet. For å bekrefte denne konklusjon, ble et LIF cDNA klon som overlapper med pLIF7.2b og strekker seg mot 3' isolert og underkastet nukleotidsekvensanalyse.
For å konstruere og kartlegge et passende cDNA bibliotek hvorfra man kan isolere et slik klon, ble en rekke forskjellige mRNA prøver screenet ved hjelp av Northern blot hybridisering for å identifisere RNA-prøvene med høyeste konsentrasjon av LIF mRNA molekyler. Cytoplasmisk polyadenylert RNA, fremstilt i alt vesentlig som beskrevet tidligere (Gough, N.M., J. Mol. Biol. 165: 683-699, 1983), ble fraksjonert på 1 % agarosegeler inneholdende 20 mM morfo-linopropansulfonsyre (MOPS), 5 mM natriumacetat, 1 mM EDTA (pH 7,0) pluss 6 % (vekt/vekt) formaldehyd, filtere inneholdende RNA ble neddyppet i 2 x SSC, inneholdende 0,2 % Ficoll, 0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrofosfat, 1 mM ATP, 50 ug/ml denaturert laksespermie DNA og 50 Jig/ml E.coli tRNA, ved 67°C i flere timer. Hybridisering var i samme buffer pluss 0,1 % SDS ved 67°C. Proben anvendt til å påvise LIF transkripter bestod av et omtrentlig 750 bp Eco RI - Hind III fragment inneholdende cDNA innskuddet av pLIF7.2b subklonet i pSP65. Dette fragment inneholder ikke bare cDNA sekvensen, men også G-C forlengelser og omtrent 150 bp av pJL3 vektor sekvensen. Riboprober av omtrent 2 x IO<9> cpm/ug ble avledet ved transkripsjon av denne SP6 sub-klonen ved anvendelse av reagenser fra BRESA (Adelaide). Proben ble inkludert i hybridisering ved omtrent 2 x IO<7 >cpm/ml. Filterne ble vasket omfattende i 2 x SSC, 2 mM EDTA, 0,1 % SDS ved 67°C og til slutt i 0,2 x SSC ved 67°C før autoradiografi.
Slike analyser viste at LIF transkripter var tilstede i små mengder i en rekke hemopoese cellelinjer og at der var betydelig variasjon i mengden av LIF mRNA i forskjellige batcher av Krebs RNA. To batcher av Krebs ascites tumorcelle RNA ble valgt for syntese av to cDNA bibliotek. cDNA bibliotek ble konstruert ved anvendelse av reagenser fra Amersham
(Produkt nr. RPN.1256 og RPN.1257) og med anvendelse av leverandørens instruksjoner; idet kloningsvektoren var XGT10. Omtrent 4 x IO<5> rekombinante kloner ble oppnådd og screenet ved hybridisering med et oligonukleotid svarende til en sekvens på 3 6 rester ved 3'-enden av pLIF7.2b sekvensen: nukleotidene 500-535 (inklusive) i fig. 5.
Fag-plaquer som representerer Krebs cDNA biblioteket ble dyrket i en densitet på omtrent 50.000 plaques pr. 10 cm petriskål, overført i duplikat til nitrocellulose og behandlet ved anvendelse av standard teknikker (Maniatis, T. et.al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Før hybridisering, ble filterne inkubert i flere timer ved 37°C i 6 x SSC (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat), 0,2 % Ficoll,
0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrofosfat, 1 mM ATP, 50 mg/ml denaturert laksespermie DNA og 50 u/ml E.coli tRNA. Hybridisering utføres i samme løsning inneholdende 0,1 % NP40, ved 37°C i 16-18 timer. Ovennevnte oligonukleotidprobe, som var radioaktivt merket ved anvendelse av [y-<32>P] ATP og polynukleotidkinase til en spesifikk aktivitet på omtrent IO<9> cpm/ug og separert fra ikke-innlemmet markør ved ionebytterkromatografi på NACS kolonne (Bethesda Research Laboratories), var inkludert i hybridiseringen i en konsentrasjon på omtrent 20 ng/ml. Etter hybridisering ble filterne vasket omfattende i 6 x SSC, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved 60°C. En plaque som representerer klon A.LIFNK1, positiv på duplikatfiltere, ble plukket og screenet på nytt ved en lavere densitet, som før.
cDNA innskuddet på omtrent 950 bp i X.LIFNK1, som hybridiserte med ovennevnte oligonukleotid, ble subklonet inn i en plasmid-vektor (pEMBL8+, Dente, L. et.al, Nucl. Acids Res. 11: 1645-1655, 1983) til å danne klon pLIFNKl. Nukleotidsekvensanalyse av cDNA innskuddet i pLIFNKl ble utført ved hjelp av dideoksykjedetermineringsmetoden (Sanger, F. et.al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 74: 5463-5467, 1977) ved anvendelse av alkalie-denaturert dobbeltrådet plasmid DNA som templat (Chen, E.Y. og Seeburg, P.H., DNA 4: 165-170, 1985), en rekke oligonukleo-
tider som var komplementære både til områder i vektoren som omgir cDNA og til sekvensene inne i cDNA innskuddet som primere, og ved anvendelse av både Klenow-fragmentet av E.coli DNA polymerase og AMV revers transkriptase som polymerase i sekvenseringsreaksjonene. Nukleotidsekvensen av en del av cDNA innskuddet i pLIFNKl er vist i figur 6. Aminosyresekvensen spesifisert ved pLIFNKl er identisk i den C-terminale ende med de 9 aminosyrer som var forutsagt ved direkte aminosyresekvensering til å utgjøre den C-terminale enden av LIF, og bekrefter at Phe 187 er den C-terminale rest av LIF, da, i pLIFNKl cDNA sekvensen, kodonet for denne rest umiddelbart er etterfulgt av et "in frame" translasjons stoppkodon.
Trinn 2: Konstruksjon av et LIF kodonområde i en gjærekspresjonsvektor.
Initial produksjon av proteinet kodet av LIF cDNA klonene ble oppnådd i et eukaryotisk system (gjær), slik at det uttrykte produkt vil være glykosylert, utskilt og riktig sammenfoldet. Den anvendte ekspresjonsvektor, YEpsecl (Baldari, C. et.al., EMBI J. 6: 229-234, 1987), tilveiebringer en N-terminal ledersekvens avledet fra killer toksingenet av Kluyveromyces lactis, som tidligere er vist å styre den effektive sekresjon av interleukin 1 (Baldari, C. et.al., EMBO J. 6: 229-234, 1987), transkribert fra en galaktoseinduserbar hybrid GAL-CYC promoter.
For å uttrykke proteinet kodet av pLIF7.2b i denne vektor, var det nødvendig å modifisere cDNA på flere måter (se fig. 7). Ved 5'-enden var det nødvendig, ikke bare å fjerne de få nukleotidene som spesifiserer den partielle pattedyr ledersekvens, men også å inkludere et passende restriksjonsendonuklease-spaltingssete (Barn HI) for å tillate insertion "in-frame" med K.lactis lederen og bibeholde et passende signalpeptidase-spaltingssete (Gly-Ser). I 3'-enden ble to versjoner av det kodende området for LIF konstruert. En versjon (LIFmutl) ble konstruert slik at et stoppkodon fulgte umiddelbart etter det siste kodon av pLIF7.2b (Gin 178). Den andre versjon (LIFmut2) ble konstruert ved å tilføye en sekvens som koder for de 9 aminosyrerester som er kjent for å være fraværende fra pLIF7.2b (se over), etterfulgt av et "in-frame" translasjons-stoppkodon. Et passende restriksjonsendonuklease-spaltingssete (Hind III) kompletterte begge de konstruerte versjoner. Alle disse modifikasjoner ble oppnådd ved hjelp av oligonukleotidmediert mutagenese: det omtrentlige 750 bp Eco RI - Hind III fragmentet som bærer det 535 bp cDNA innskuddet av pLIF7.2b, bundet ved hjelp av G-C forlengelser og en del av pJL3 vektoren ble subklonet inn i plasmid pEMBL8+ (Dente, L. et.al., Nucl. Acids Res. 11: 1645-1655, 1983) og enkeltrådet DNA ble fremstilt som beskrevet (Cesarini, G. og Murray, J.A.H. i Setlow, J.K. og Hollaender, A. (eds), Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, New York, vol. 8, 1987). In vitro mutagenese ble gjennomført som beskrevet (Nisbet, I.T. og Beilharz, M.W., Gene Anal. Techn. 2: 23-29, 1985), ved anvendelse av oligonukleotider med henholdsvis 35, 51 og 61 baser, for å modifisere 5'-enden og 3'-enden av cDNA som angitt over. Barn HI - Hind III fragmenter inneholdende de modifiserte LIF cDNA sekvenser ble ligert inn i plasmid YEpsecl og nukleotidsekvensen av innskuddene i de oppnådde rekombinanter ble bestemt.
Trinn 3: Innføring av YEpsecl/LIF rekombinanter i gjærceller.
S.cerevisiae stamme GY41 (leu2 ura3 adel his4 met2 trp5 gall
cir+; x 4003-5b fra Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) ble transformert ved hjelp av polyetylenglykolmetoden (Klebe, R.J. et.al., Gene 25: 333-341, 1983). Transformanter ble utvalgt og holdt på et syntetisk minimalt medium (2 % karbonkilde, 0,67 % gjær-nitrogenbase (Difco) supplert med 50 ug/ml av de nødvendige aminosyrer) under uracil deprivasjon. Ekspresjon av innskudd-sekvenser i plasmid YEpsecl ble oppnådd ved å dyrke transformanter i enten et ikke-selektivt fullstendig medium (1 % gjærekstrakt, 2 % pepton) eller i et syntetisk minimalt medium, idet hvert inneholder 2 % galaktose.
Trinn 4: Bestemmelse av de biologiske egenskaper for gjæravledet LIF.
Forsøk vedrørende differensierings-induserende aktivitet og leukemi-undertrykkende aktivitet av gjærkondisjonert medium ble gjennomført i 1 ml kulturer inneholdende 300 Ml celler (fra Dr. M. Hozumi, Saitama Cancer Research Centre, Japan) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med en sluttkonsentrasjon på 20 % føtalt kalveserum og 0,3 % agar. Material som skulle analyseres ble tilsatt i seriefortynnede 0,1 ml volumer til dyrkingsskålen før tilsetning av cellesuspensjonen i agarmedium. Kulturene ble inkubert i 7 døgn i en fullstendig fuktet atmosfære ved 10 % C02. Kulturene ble bedømt ved anvendelse av et disseksjonsmikroskop ved 3 5 gangers forstør-relse, en bedømming som differensierte alle kolonier med en rosett av dispergerte celler eller som totalt besto av dispergerte celler. Morfologisk undersøkelse av koloniene ble gjennomført ved å fiksere hele kulturen med 1 ml 2,5 % glutaraldehyd, hvorpå tørre kulturer ble farget på mikroskop-glassplater ved anvendelse av acetylcholinesterase/Luxol Fast Blue/Haematoxylin.
Målinger for kolonistimulerende aktivitet ble gjennomført ved anvendelse av 75.000 C57BL benmargsceller som beskrevet tidligere (Metcalf, D., The Hemopoietic Colony Stimulating Factors Elsevier, Amsterdam, 1984) . Analyser vedrørende differensieringinduserende aktivitet på WEHI-3B D<+> celler ble gjennomført som beskrevet tidligere (Nicola, N. et.al., J. Biol. Chem. 258: 9017-9023, 1983).
Medium fra gjærkulturer inneholdende det kodende område i full lengde (LIFmut2), men ikke fra kulturer av ikke-transformert gjær, gjær inneholdende vektoren YEpsecl alene, eller gjær inneholdende det ufullstendige kodeområde (LIFmutl), er i stand til å indusere typisk makrofag differensiering i kulturer av Ml kolonier (fig. 8A). Som tilfellet med renset nativ LIF, vil det gjæravledede material, med økende konsentrasjoner, også progressivt redusere antall og størrelse av Ml kolonier som utvikler seg (fig. 8B). Sammenligning med renset nativ LIF indikerer at det gjærkondisjonerte medium inneholdt opp til 16.000 enheter/ml (omtrent 130 ng/ml) av LIF. Gjæravledet LIF, som renset nativ LIF-A, mislykkes i å stimulere kolonidannelse med normale granulocytt-makrofag-progenitorceller eller å indusere differensiering i, eller undertrykke proliferasjon av WEHI-3B D<+> leukemikolonier.
Størrelsesfraksjonering på en Sephacryl S-200 kolonne, indikerte at gjæravledet LIF eluerte samtidig med proteiner med tilsynelatende molekylvekter fra 67.000 til 150.000 Dalton, sammenlignet med 58.000 Dalton for LIF avledet fra Krebs-celler.
Fravær av LIF aktivitet i medium kondisjonert med gjær inneholdende et ufullstendig kodeområde (LIFmutl) foreslår at de ni hydrofobe C-terminale rester som mangler i denne konstruerte enhet kan være nødvendig for LIF funksjon. Mens disse rester kan virke sammen med reseptoren, kan de også utgjøre en del av en hydrofob kjerne i proteinet, og således kan deres fravær forhindre rett sammenfolding. Alternativt kan de i noen henseender være nødvendig for effektiv sekresjon av LIF.
Trinn 5: Reseptorbindingsspesifisitet av gjæravledet murin LIF og renset nativ LIF-A fra Krebs II ascites celle behandlet medium.
Renset murin LIF-A (se eks. 1 i NO patentsøknad nr. 885339) ble jodert som angitt tidligere (undereks. 2). Peritonealceller ble høstet ved utskylling fra mus hvori en stor mengde makrofager var blitt indusert i bukhulen med tioglykolat. Disse cellene ble vasket og resuspendert til 2,5 x 10<6>/50 ul i Hepes-bufret RPMI medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum. Celler i 50 ul prøver ble inkubert med 200.000 cpm <125>I-LIF-A (10 ul, i samme medium) og 10 ul kontrollmedium eller serie-fortynninger av ikke-merket ren murin LIF-A eller gjæravledet murin LIF, fortynnet to ganger. Ved passende konsentrasjoner konkurrerte supernatant fra galaktoseindusert gjær inneholdende LIFmut2 konstruert enhet (fig. 7) med 12<5>I-LIF-A for binding til dens reseptorer på peritonealceller mens ikke-indusert gjærsupernatant ikke konkurrerte (fig. 9). Graden av konkurranse var lik den for autentisk nativ LIF-A, som indikerer at gjæravledet LIF-A inneholdt all informasjon som var nødvendig for binding til LIF-A cellulære reseptorer.
EKSEMPEL 3
Det følgende eksempel viser trinnene anvendt for å uttrykke rekombinant murin LIF i pattedyrceller.
Ledsagende figur 10 vedrører trinn 1 i metoden som er beskrevet under: Nukleotidsekvensen av cDNA delen av klon PLIFNK3 . Nukleotidsekvensen av den mRNA-synonyme tråd er tilstede i orienteringen 5' til 3' med den utledede aminosyresekvens av LIF gitt over. Den N-terminale aminosyrerest som er bestemt tidligere er indikert som +1.
Eco RI setet i 5'-enden av cDNA og Xba I setet som spenner over stoppkodonet (anvendt ved innskyting av LIF kodeområdet i pMP-Zen i trinn 2) er indikert.
Trinn 1: Bestemmelse av aminosyresekvensen av den N-terminale ledersekvens av murin LIF.
cDNA klonene pLIF7.2b og pLIFNKl (se over) inneholder ufullstendige kopier av LIF mRNA. Skjønt de sammen inneholder det fullstendige kodeområdet for den modne del av LIF proteinet, inneholder de ikke den fullstendige hydrofobe ledersekvens som er nødvendig for sekresjon av LIF fra pattedyrceller.
For å isolere et cDNA klon som inneholder området som koder for den hydrofobe leder, ble det foretatt screening (som over) av ytterligere IO<6> cDNA kloner konstruert som over (eks. 2), ved anvendelse av samme batch av Krebs mRNA som et templat, ved anvendelse av to nukleotider som prober tilsvarende en sekvens av 35 rester ved 5'-enden og 3 6 rester ved 3'-enden av pLIF7.2b sekvensen (nukleotidene 67-102 og 500-535 i fig. 5).
To plaques som representerer klonene A,LIFNK2 og Å,LIFNK3, som var positive på duplikat-filtere ble plukket og screenet på nytt ved lavere tetthet, som tidligere. Da Å.LIFNK3 ble vist å hybridisere med hver av de to anvendte oligonukleotider, ble denne valgt for ytterligere analyser.
cDNA innskuddet på omtrent 1400 bp i A.LIFNK3 ble subklonet inn i plasmidvektoren pEMBL 8" (Dente, L. , et.al., Nucleic Acids Res. 11:1645-1655, 1983) for å danne klon pLIFNK3. Nukleotidsekvensanalyse av cDNA innskuddet av pLIFNK3 ble gjennomført som for pLIF7.2b og pLIFNKl (over).
Nukleotidsekvensen av cDNA innskuddet i pLIFNK3 er vist i fig. 10, og indikerer at pLIFNK3 inneholder et fullstendig LIF-kodende område: der er et initieringskodon (AUG) i 23-25 stillingen i pLIFNK3 sekvensen, som går forut for en sekvens som koder for en typisk hydrofob ledersekvens på 24 aminosyrerester.. Kodeområdet strekker seg til samme translasjons-stoppkodon som definert tidligere ved pLIFNKl (over).
Trinn 2: Introduksjon av et LIF kodende område i en pattedyr-ekspresj onsvektor.
Den pattedyr-ekspresjonsvektor som ble valgt initialt var den retrovirale ekspresjonsvektor pMP-Zen. Vektoren er avledet fra Moloney murin leukemivirus-basert vektor pZIPNeo SV(X)
(Cepko, C.L. et.al., Cell 37:1053-1062, 1984) ved utelatelse av neo<R> genet sammen med nærliggende SV40 og plasmidsekvenser, idet man har tilbake et Xho I ekspresjonssete. 3'-området av vektoren er også modifisert til å innlemme enhanceren fra den lange terminale repetisjon (LTR) av det myeloproliferative sarkomvirus (MPSV) (Bowtel, D.D.L. et.al., Mol. Biol. Med. 4:229-250, 1987). Denne vektor ble først og fremst valgt siden LIF/PMP-Zen rekombinanten kan "pakkes" inn i hjelperfrie infeksiøse retroviruspartikler ved passering gjennom \|/2 celler
(Mann, R., et.al., Cell, 33:153-159, 1983). Slike viruspar-tikler kan så anvendes for effektivt å introdusere (ved infeksjon) LIF/pMP-Zen rekombinanten inn i en rekke murine celletyper (Mann, R. et.al., Cell 33:153-159, 1983). For det andre er denne spesielle vektor, som anvender MPSV LTRer for ekspresjon av det fremmende kodeområdet, blitt vist å styre den effektive ekspresjon av annen bestemt hemopoese vekst og andre differensieringsfaktorer omfattende GM-CSF.
Segmentet av pLIFNK3 er valgt for innskytelse inn i pMP-Zen som strekker seg fra stilling 1 (et Eco Ri sete) til stilling 630 (et Xba 1 sete som spenner over stoppkodonet) - se fig. 10. Dette segment ble valgt da det ikke inneholder stort mer enn det området som koder for pre-LIF og utelukker hele det 3' utranslaterte området, som kan inneholde sekvenser som gir mRNA ustabilitet (f.eks. Shaw, G. og Kamen, R., Cell 46:659-667, 1986; Verma, I.M. og Sassone-Corsi, P., Cell 51: 513-514, 1987). For å innskyte dette segment i pMP-Zen, ble det først innskutt mellom Eco RI og Xba I setene av pIC20H (Marsh, J.L. et.al., Gene 32: 481-485, 1984) ved hjelp av standard teknikker (Maniatis et.al., 1982, supra). cDNA innskuddet ble deretter gjenvunnet fra polylinkeren av pIC20H plasmidet ved Sal I pluss Xho I spalting, idet man således får dannet et LIF cDNA fragment med kohesive ender som er passende for å innskyte i Xho I kloningssetet av pMP-Zen. Innskytningen av LIF cDNA fragmentet inn i pMP-Zen ble oppnådd ved hjelp av standard teknikker (Maniatis et.al., 1982, supra).
Trinn 3 : Introduksjon av pMP-Zen/LIF rekombinanten inn i murine fibroblaster.
pMP-Zen/LIF DNA ble innført i vj/2 f ibroblaster ved hjelp av elektroporering (Potter et.al., PNAS 81:7161-7165, 1984).
30 ug pMP-Zen/LIF DNA pluss 3 ug pSV2Neo DNA (Southern, P.J. og Berg, P., J. Mol. App. Genet 1:327-341, 1982) ble blandet med 1 x IO<6>\jf2 fibroblaster i 1 ml DME/10 % FCS (Dulbeccos modified Eagles medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum) og underkastet en puls på 500v ved en kapasitans på 25 uF (ved anvendelse av en BioRad Gene-Pulser model No. 1652078). Transfektanter ble initialt utvalgt på basis av resistens overfor det antibiotiske G418 gitt ved pSV2Neo DNA. G418 resistente Xf2 celler ble selektert i 400 ug/ml G418 ved hjelp av standard prosedyrer (Mann, R. et.al, Cell 33: 153-159, 1983) . Av de 19 G418-resistente kloner som ble undersøkt, inneholdt 2 også pMP-Zen/LIF konstruksjonen som bestemt ved LIF aktivitet detekterbar i \ y2 kondisjonert medium.
Trinn 4: Bestemmelse av de biologiske egenskaper for vj/2 — avledet LIF.
Analyser for differensieringsinduserende aktivitet og leukemi-undertrykkende aktivitet av kondisjonert medium fra pMP-Zen/LIF inneholdende \}/2 celler ble gjennomført som beskrevet tidligere. Medium fra kulturer fra IO<6> \\ f2 celler i 3 ml DME/10 % FCS ble målt for differensieringsinduserende aktivitet. Resultatene for to positive kulturer er vist i følgende tabell:
Således kan signifikante nivåer av biologisk aktiv rekombinant murin LIF fremstilles i dette ekspresjonssystem.
Trinn 5: Transmisjon av pMP-Zen/LIF retrovirus \|/2 celler til hemopoese celler.
Infeksiøs pMP-Zen/LIF retrovirus kunne overføres fra "moder \j/2-cellelinjene til hemopoese celler av linjen FDC-P1 (Dexter, T.M. et.al., J. Exp. Med. 152:1036-1047, 1980) ved ko-dyrking. 10<6>\|/2 celler ble blandet med IO<6> FDC-P1 celler i 10 ml DME/10 % FCS inneholdende den optimale konsentrasjon av WEHI-3BD" kondisjonert medium for vekst av FDC-Pl celler. Etter 2 døgns inkubasjon, ble de ikke-adhererte FDC-Pl celler fjernet, vasket fri fra alle adhererte \y2 celler og dyrket i 16 timer i 3 ml av det samme medium. Behandlet medium ble høstet og målt for differensieringsinduserende og leukemi-undertrykkende
aktivitet som beskrevet tidligere. Resultatene er vist i følgende tabell:
Således er \y2 kloner, \j/2-lla og \|/2-lld, i stand til å trans-mittere biologisk aktive pMP-Zen/LIF retrovirus til hemopoese celler. Disse kloner vil derfor kunne anvendes til infeksjon av normale murine hemopoese progenitorceller som kan anvendes til å rekonstituere hemopoese systemet til strålebehandlet mus for å studere virkningene av høynivå-ekspresjon av nativ LIF på normal murin hemopoese, på en måte som er analog med den anvendt for Zen/GM-CSF virusinfeksjon.
EKSEMPEL 4
Det følgende eksempel viser trinnene anvendt for å uttrykke rekombinant murin LIF i E.coli celler.
Ledsagende fig. 11 vedrører trinn 1 i metoden som er beskrevet under: Nukleotidsekvensen i glutation-S-transferase/trombin-spaltingssete/LIF koblingen i plasmid pGEX-2T/LIF, og sekvensen i koplingen av kodet fusjonsprotein. Den C-terminale ende av glutation-S-transferase, trombin-spaltingssetet og den N-terminale ende av de murine LIF deler av det tredelte fusjonsprotein sammen med nukleotidsekvensen som koder for denne aminosyresekvens er vist. Det forventede sete for spalting ved hjelp av trombin er indikert med en pil.
Trinn 1: Introduksjon av et LIF-kodende område inn i en E.coli ekspresjonsvektor.
Ekspresjonsvektoren anvendt for å uttrykke LIF i E.coli var pGEX-2T (Smith, D.B. og Johnson, K.S., Gene, 1988), som styrer syntesen av fremmede polypeptider som fusjoner med C-terminalen av Sj26, en 26kD glutation-S-transferase (E.C. 2.5.1.18) kodet for av den parasittiske helmint Schistosoma japonicum. I de fleste tilfeller har fusjonsproteiner vist seg å være oppløselige i vandige løsninger og kan renses fra urene bakterielysater under ikke-denaturerende betingelser ved hjelp av affinitetskromatografi på immobilisert glutation. Den spesielle vektor pGEX-2T er blitt konstruert slik at glutation-S-transferase bæreren kan spaltes fra fusjonsproteinet ved spalting med setespesifikt proteasetrombin.
Det fullstendige kodeområde av murin LIF, avledet fra plasmid pLIFmut2 (se eks. 2 og fig. 7 over) ble innført som et Barn HI - EcoRI fragment inn i det multiple kloningssete av pGEX-2T (Smith D.B. og Johnson, K.S., supra), og således plassere det LIF-kodende området 3' og i samme translasjonsleseramme som den til glutation-S-transferasen og trombin-spaltingssetet. Således vil LIF-proteinet være lokalisert C-terminalt til disse elementene i et tredelt glutation-S-transferase/trombin-spaltingssete/LIF fusjonsprotein (se fig. 11). Det skal bemerkes at stillingen av trombin-spaltingssetet er slik at to aminosyrerester (Gly-Ser) vil være heftet til den N-terminale ende av LIF proteinet etter trombinspalting. Konstruksjonen av ovennevnte plasmid, pGEX-2T/LIF, ble oppnådd ved standard teknikker, og plasmidet ble innført i E.coli NM 522 (Gough, J.A. og Murray, N.M., J. Mol. Biol. 166: 1-19, 1983) ved hjelp av standard teknikker.
Trinn 2: Ekspresjon og rensing av glutation-S-transferase/LIF fusj onsprotein.
For å indusere ekspresjonen av glutation S-transferase/LIF fusjonsproteinet, ble 10 ml kulturer av E.coli NM 522 celler inneholdende pGEX-2T/LIF dyrket til logaritmisk fase i Luria ekstrakt, og isopropyl~P-D-tiogalaktopyranosid ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,1 mM. Etter ytterligere 4 timers vekst, hvorunder glutation-S-transferase/LIF genet uttrykkes, ble cellene høstet ved sentrifugering og resuspendert i 1 ml muse-tonisitet fosfatbufret saltløsning (MTPBS:150 mM NaCl, 16 mM Na2HP04, 4 mM NaH2P04, pH 7,3). Celler ble lysert på is ved hjelp av forsiktig lydbehandling og etter tilsetning av Triton X-100 til 1 %, ble nedbrutt cellemateriale fjernet ved sentrifugering (10.000 g, 5 min. 4°C) . Den klarede supernatant ble blandet ved romtemperatur i et 50 ml polypropylenrør på en roterende plate med 200 jxl 50 % glutation-agarosekuler (svovelbinding, Sigma). (Før anvendelse, ble kulene for-svellet i MTPBS, vasket to ganger i den samme buffer og lagret 1 MTPBS ved 4°C i form av en 50 % oppløsning, volum/volum. ) Etter absorpsjon (5 min.), ble kulene samlet ved sentrifugering (500 g, 1 min.) og vasket tre ganger i MTPBS/Triton X-100. Glutation-S-transferase/LIF fusjonsproteinet ble deretter eluert ved konkurranse med fri glutation: kulene ble inkubert med 100 ul 50 mM Tris. HCl, 5 mM redusert glutation (pH 7,5) i 2 min. ved romtemperatur og kulene ble fjernet ved sentri-fuger ing. Elueringstrinnet ble gjennomført to ganger, og de to prøvene på 100 ul av eluatet ble samlet.
100 ul av glutation-S-transferase/LIF fusjonsproteinet ble behandlet med trombin som beskrevet (Smith, D.B. og Johnson, K. S., supra).
1 ul prøver av ikke-spaltet og trombinspaltet glutation-S-transf erase LIF fusjonsproteiner ble elektroforesebehandlet på en Pharmacia Phast Gel (8-25 % polyakrylamid-gradient gel). Etter farging med Coomassie Blue, fremkom en enkel protein-spesie med relativ molekylvekt -4 6 kDa i det ikke-spaltede preparat, og i det trombin-spaltede preparat fremkom to hovedbånd på ~2 6 kDa og -20 kDa (svarende til de forventede størrelser av henholdsvis fusjonsproteinet (46 kDa), glutation-S-transferase (26 kDa) og LIF proteinene (20 kDa)). Ved å estimere massen av de Coomassie-fargede bånd på denne gel, ble utbyttet av glutation-S-transferase/LIF protein fra den opprinnelige 10 ml E.coli kultur estimert til å være -1,5 ug.
Analyser for differensieringsinduserende aktivitet og leukemi-undertrykkende aktivitet av både glutation-S-transferase/LIF fusjonsprotein og det trombin-spaltéde LIF preparat, ble utført ved anvendelse av murine Ml celler (som beskrevet tidligere). Begge preparater av LIF ble bestemt til å være biologiske aktive, med spesifikke aktiviteter ut over 7xl0<6 >enheter/mg.
EKSEMPEL 5
Det følgende eksempel viser trinnene anvendt til å bestemme om det murine genom inneholder noen andre gener som er nær beslektet med genet som koder for sekvensen tilstede i klon pLIF7.2b (eks. 1), og utledning av et kart av lokaliseringen av restriksjonsendonuklease-spaltingsseter rundt LIF-genet.
De ledsagende figurer vedrører forskjellige trinn i metoden som er beskrevet under: Figur 13: vedrører trinn 1: hybridisering av mus DNA med en pLIF7.2b-avledet probe under mere og mindre stringente betingelser. BALB/c lever DNA spaltet med de indikerte restrik-sjonsenzymer ble undersøkt med hensyn på LIF gensekvenser som beskrevet i eks. 5 trinn 1. I det venstre felt, ble hybridisering gjennomført ved 65°C i 2 x SSC, og endelig vasking ble utført ved 65°C i 0,2 x SSC. I det høyre felt, ble hybridisering og vasking begge gjennomført i 6 x SSC ved 65°C. I det venstre felt, var lineær pLIF7.2b plasmid DNA (5,6 kb) inkludert i en mengde ekvivalent til 10 og 1 kopier pr. haploid musegenom (henholdsvis 400 pg og 40 pg) med antatt molekylvekt for det haploide musegenom på 3 x IO<9> bp (Laird, C.D., Chromosoma, 32: 378-406, 1971). Størrelsen av hybridiserings-genomfragmentene er indikert. Figur 14: vedrører trinn 2: Hybridisering av mus DNA spaltet med forskjellige restriksjonsendonukleaser, enten alene eller i parvise kombinasjoner, med en mus LIF probe. Spaltet DNA ble elektroforesebehandlet på 0,8 % agarosegeler og hybridisert med pLIF7.2b cDNA fragmentet som beskrevet i eks. 5, trinn 1, under meget stringente betingelser. Figur 15: vedrører trinn 2: Restriksjonsendonuklease-spaltingskart av det murine LIF gen. Området til kromosomal DNA inneholdende sekvenser svarende til cDNA klonet pLIF7.2b er indikert med en firkant. Restriksjonssetene gitt over (Eco R5) og under (Xba I, Barn HI, Pst I og Stu I) hovedlinjen, er ikke blitt orientert mht. hovedlinjen. Den relative lokalisering av seter innen komplekset under linjen er som indikert. Figur 16: vedrører trinn 3: Kromosomal bestemmelse av det murine LIF gen. I felt 1 var BALB/c musembryo-DNA elektroforesebehandlet, i felt 2 DNA fra ovarieceller fra kinesisk hamster og i felt 3-8 DNA fra hybridklonene I-18A HAT, I-18A-2a-8AG; EBS 58; EBS 11; EBS 4; og I-13A-la-8AG (Cory, S. et.al, EMBO J. 2: 213-216, 1983). Det murine kromosominnhold av disse hybrider er gitt i Cory S. et.al., (EMBO J. 2: 213-216, 1983). All DNA ble spaltet med Barn HI. Stillingen til 3 kbp Barn HI fragmentet som bærer det murine LIF gen er indikert .
Trinn 1: Bestemmelse av antall LIF-relaterte gener i det murine genom.
På bakgrunn av dataene (se eks. 1 i NO patentsøknad nr. 885339) om at medium kondisjonert med Krebs II celler inneholder to biokjemisk separerbare, men funksjonelt like faktorer som er i stand til å indusere differensieringen av Ml celler (LIF-A og LIF-B), ønsket man å bestemme hvor mange gener der er i det murine genom relatert til spesiene som er renset og klonet. Southern blotting av murin genom DNA spaltet med forskjellige restriksjonsendonukleaser ble derfor hybridisert med en probe avledet fra pLIF7.2b under både meget stringente og mindre stringente betingelser.
20 (lg prøver av genom DNA med høy molekylvekt fra BALB/c muselever ble spaltet fullstendig med forskjellige restriksjonsendonukleaser, fraksjonert ved elektroforese i 0,8 % agarosegeler og overført til nitrocellulose. Før hybridisering, ble filterne inkubert i flere timer ved 65°C i enten 6 x SSC (lite stringente betingelser) eller 2 x SSC (meget stringente betingelser) (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat), 0,2 % Ficoll, 0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrofosfat, 1 mM ATP, 50 Jig/ml denaturert laksespermie DNA og 50 ug/ml E.coli tRNA. Hybridiseringen gjennomføres i den samme løsning inneholdende 0. 1 % SDS, ved 65°C i 16 - 18 timer. Filterne ble deretter vasket i enten 6 x SSC, 0,1 % SDS ved 65°C (lite stringente betingelser) eller i 2 x SSC, 0,1 % SDS ved 65°C, etterfulgt av 0,2 x SSC, ved 65°C (meget stringente betingelser) som gitt detaljert i teksten i fig. 13. Hybridiseringsproben som ble anvendt var som tidligere gitt, det omtrentlige 750 bp Eco RI - Hind III fragmentet som spenner over cDNA innskuddet i pLIF7.2b radioaktivt merket til en spesifikk aktivitet på omtrent 4 x IO<8> cpm/ug ved nick-translasjon og inkludert i hybridiseringen ved en konsentrasjon på omtrent 2 x IO<7 >cpm/ml.
I muselever DNA (fig. 13) så vel som i DNA fra Krebs II celler, LB3 T celler og WEHI265 monocyttiske celler (ikke vist) detekterte LIF proben unike Eco RI Barn HI og Hind III fragmenter på omtrent henholdsvis 11,3 og 13 kbp. Det samme hybridiseringsmønster var tydelig ved både meget (0,2 x SSC, 65°C) og mindre stringente betingelser (6 x SSC, 65°C) (fig.
13). Ved hybridisering under mindre stringente betingelser og vaskeforhold fremkom ingen ytterligere bånd. Likeledes ble også unike hybridiseringsfragmenter påvist i Pst I, Stu I, Sac 1, Eco R5 og Bgl II spaltet genom DNA (fig. 13). Dessuten, i forsøket som er vist i fig. 11, var pLIF7.2b plasmid DNA inkludert ved en konsentrasjon som var ekvivalent med 10 og 1 kopier per haploide musegenom (spor 1 og 2). Hybridiserings-intensiteten av de genome LIF sekvenser var ikke særlig forskjellig fra intensiteten til den unike genstandard (spor 2) .
Sett under ett, indikerer dataene i det foregående at LIF genet er unikt i det murine genom, uten nære slektninger. Således er det lite trolig at de to spesiene av LIF er produkter av forskjellige gener, men at de heller representerer posttranskripsjons- eller posttranslasjons-varianter av det samme genprodukt.
Trinn 2: Utledning av et restriksjonsendonuklease-spaltingskart av det murine LIF gen.
For å bestemme plasseringen av restriksjonsendonuklease-spaltingsseter i og rundt det murine LIF gen, og således tilveiebringe et molekylært fingerprint av dette gen, ble DNA fra muselever eller fra Krebs ascites tumorceller spaltet med forskjellige restriksjonsendonukleaser og underkastet Southern blotting som beskrevet i trinn 1 (under meget stringente hybridiserings- og vaskebetingelser). Eksempler på slike forsøk er vist i fig. 14. Analyser av størrelsen av spal-tingsproduktene gjør det mulig å danne et kart av lokaliseringen av hvert spaltingssete rundt LIF genet (fig. 15).
Trinn 3: Kromosomal bestemmelse av det murine LIF gen.
For å bestemme kromosomet hvorpå mus LIF genet er plassert, ble DNA fra ovarie somatiske cellehybrid cellelinjer fra seks mus/kinesisk hamster undersøkt og som inneholder forskjellige musekromosomer (Cory, S. et.al., EMBO J. 2: 213-216, 1983; Francke, U. et.al., Cytogenet. Cell. Genet. 19: 57-84, 1977). Southern blot analyser gjennomført som beskrevet i trinn 1 (ved anvendelse av meget stringente hybridiserings- og vaskebetingelser) indikerte at 3 kbp Barn HI fragmentet som inneholder det murine LIF gen var fraværende i alle hybridene (fig. 16). Da kromosom 11 er det eneste musekromosom som ikke er inneholdt i noen av disse linjene (Cory, S. et.al., EMBO J. 2: 213-216, 1983), en karakterisering av mus/kinesisk hamster hybrider (Francke, U. et.al., Cytogenet. Cell. Genet. 19: 57-84, 1977), er det sannsynlig at LIF genet er på dette kromosom. Av samme grunn har også det murine GM-CSF gen (Barlow, D.P. et.al-, EMBO J. 6: 617-623, 1987) og Multi-CSF gen (Iheo, J.N. og Kozak, C.A., National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility, Annual Report, 1984) blitt tillagt kromosom 11, noe som er bekreftet ved hjelp av genetiske bindingsundersøkelser (Barlow, D.P. et.al., EMBI J. 6: 617-623, 1987) .
EKSEMPEL 6
Det følgende eksempel viser trinnene som anvendes for å etablere betingelser hvorunder det klonede murine LIF cDNA kan anvendes for å identifisere, ved hybridisering, et humant gen eller mRNA eller rekombinant DNA kloner inneholdende humane LIF-kodende sekvenser.
Den ledsagende figur (fig. 17) vedrører trinn 2 i metoden som er beskrevet under: hybridisering av <32>P-merket fragment av cDNA fra klon pLIF7.2b under forskjellige betingelser til genom DNA av både museopprinnelse og human opprinnelse. I hvert tilfelle, inneholder spor 1 15 ug murin (LB3) DNA og spor 2 og 3 inneholder 15 ug human DNA (fra henholdsvis cellelinjene Raji eller Ramos). Betingelsene ved hybridisering og vasking som anvendes for hvert filter er beskrevet i trinn 2. Det omtrentlige 10 kbp Eco RI fragment inneholdende det murine LIF gen, og det omtrentlige 9 kbp Eco RI fragment inneholdende den humane homolog, er vist med piler. Molekylvekt-standarder er gitt til venstre. To forskjellige auto-radiograf iske avbildninger (16 timer og 62 timer) er vist.
Trinn 1: Fremstilling og radioaktiv merking av et fragment av cDNA fra pLIF7.2b.
pLIF7.2b plasmid DNA ble amplifisert ved vekst i E.coli MC1061 (Casadaban, M. og Cohen, S., J. Mol. Biol. 138:179-207, 1980), ekstrahert fra E.coli cellene ved hjelp av standard prosedyrer (Maniatis, J. et.al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor,
New York, 1982) og renset ved hjelp av CsCl-gradient sentrifugering. pLIF7.2b plasmid DNA som således var renset ble spaltet med restriksjonsendonukleaser Eco RI og Hind III for å frigjøre et cDNA-holdig fragment på -770 bp fra vektoren (pJL3), som ble løst fra vektorsekvenser ved elektroforese gjennom en 1,5 % agarosegel.
200 ng pLIF7.2 cDNA fragment som således var renset, ble radioaktivt merket til en spesifikk aktivitet på omtrent 3 x IO<8> cpm/ug ved hjelp av nick-translasjon (Rigby, P.W.J., Dieckmann, M., Rhodes, C. og Berg, P., J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) i en reaksjon inneholdende 100 uCi [a<32>P]-dATP. Det radioaktivt merkede cDNA fragment ble renset fra uinkorporert markør ved presipitering i nærvær av 1 M natriumper-klorat og 33 % isopropanol.
Trinn 2: Hybridisering av Southern blot av mus og human genom DNA med en pLIF7.2b cDNA probe.
Genom DNA (15 ug) med høy molekylvekt fra den murine T-cellelinje LB3 (felt 1) og fra to humane B-cellelinjer (Raji og Ramos; felt 2 og 3) spaltet med restriksjonsendonukleasen Eco RI ble elektroforesebehandlet gjennom en 0,8 % agarosegel og overført til nitrocellulose ved anvendelse av standard teknikker (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517, 1975). Fem identiske Southern blot ble fremstilt inneholdende hvert av disse tre DNAer. Før hybridisering ble filterne inkubert i flere timer ved 55°C i enten 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,2 % Ficoll, 0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % bovint serumalbumin, 50 ug/ml varmedenaturert laksespermie DNA, 50 ug/ml E.coli tRNA, 0,1 mM ATP og 2 mM natriumpyrofosfat (filtere a, b, c, d) eller i 0,3M NaCl, 0,03 M natriumcitrat, med de samme tilsatte bestanddeler (filter e). Hybridisering med <32>P-merket pLIF7.2b cDNA fremstilt i trinn 1 ble gjennomført i de samme løsningene som prehybridiseringen, inneholdende ytterligere 0,1 % natriumdodecylsulfat, ved 55°C (filtere a, b, c) , eller 65°C (filtere d, e) i 16 timer. <32>P-merket cDNA ble denaturert ved koking før hybridisering og ble inkludert i hybridiseringsreaksjonen ved -10<7> cpm/ml.
Etter hybridisering ble filterne vasket i enten 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved 55°C (filter a) 60°C (filter b) eller 65°C (filterne c, d) eller i 0,3M NaCl, 0,03 M natriumcitrat, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved 65°C (filter e). Etter grundig vasking ble filterne autoradiografert ved -70°C ved anvendelse av Kodak XAR-5 film og to forsterkningsskjermer. Fig. 17 viser resultatene av et slikt forsøk, hvori to av hybridiserings/vaskesysternene som er beskrevet (filterne d og e) tillot at både det murine LIF gen (tilstede på et omtrentlig 10 kbp Eco RI fragment) og det humane LIF gen (tilstede på et omtrentlig 9 kbp Eco RI fragment) ble påvist over ikke-spesifikk restbakgrunnshybridi-sering. Alle andre forhold som ble testet ga et uaksepterbart høyt nivå av bakgrunnshybridisering (filterne a, b, c).
EKSEMPEL 7
Det følgende eksempel viser trinnene som anvendes for å oppnå et klonet humant gen homologt til murin LIF.
De ledsagende figurer vedrører forskjellige trinn i metoden som er beskrevet under. Figur 18: vedrører trinn 1 i kloningen av det humane LIF gen: påvisning av LIF genet ved hjelp av Southern blot hybridisering ved anvendelse av en mus LIF cDNA probe. Genom DNA fra den humane cellelinje RAMOS ble spaltet med de indikerte restriksjonsendonukleaser og hybridisert under betingelser beskrevet i eks. 6, trinn 1, med et mus cDNA fragment avledet fra pLIF7.2b. Figur 19: vedrører trinn 1 i kloningen av det humane LIF gen: påvisning av LIF genet ved hjelp av Southern blot hybridisering ved anvendelse av en mus LIF cDNA probe under en rekke hybridiseringsbetingelser. Genom DNA fra den humane cellelinje RAMOS (H) eller muselever DNA (M) spaltet med restriksjonsendonuklease Barn HI ble hybridisert med en murin LIF cDNA probe (pLIF7.2b) under en rekke hybridiserings- og vaskebetingelser. Temperaturer og konsentrasjoner av SSC anvendt for hybridisering er indikert i den øverste linjen, og vaskebetingelsene i den andre linjen (se eks. 7, trinn 1). Figur 20: vedrører trinn 2 i kloningen av det humane LIF gen: restriksjonsendonukleasespalting av tre mulige LIF gen kloner. 1 ug DNA fra A. fag av klonene A.HGLIF1, XHGLIF2 og X.HGLIF3 ble spaltet med Sal I, Barn HI eller Pst I, elektroforesebehandlet på en 0,8 % agarosegel (venstre felt), overført til nitrocellulose og hybridisert (som gitt tidligere) med PLIF7.2 cDNA. De omtrentlige størrelser av hybridiseringsfragmentene er indikert. Figur 21: vedrører trinn 3 i kloningen av det humane LIF gen: nukleotidsekvensen av den mRNA-synonyme tråd av et 1,3 kbp segment av XHGLIl som spenner over det humane LIF gen (H), er gitt i en 5' til 3' orientering. Tilsvarende nukleotidsekvens av det murine LIF mRNA (M) avledet fra cDNA kloner pLIF7.2b, pLIFNKl og pLIFNK3 er oppstilt under det humane gen og er gitt i mindre bokstavtyper. Identiteter mellom musesekvenser og de humane sekvenser er indikert med stjerner. Den antatte N-terminale rest av moden human LIF, ved analogi med muse LIF, er gitt som +1. Figur 22: vedrører trinn 3 i kloningen av det humane LIF gen: aminosyresekvens av human LIF og sammenligning med muse LIF. Aminosyresekvensen av moden murin LIF (M) som bestemt ved direkte aminosyresekvensering, og analyser av cDNA klonene pFLIF7.2b, pLIFNKl og pLIFNK3 er gitt i øverste linje, med den tilsvarende sekvens av human LIF (H), som utledet fra sekvens-
en av Å.HGLIF1, gitt under. Identiteter er indikert med stjerner.
Figur 23: vedrører trinn 4 i kloningen av det humane LIF gen: restriksjonsendonuklease-spaltingskart av det humane LIF gen. Exoner av det humane gen homologe med pLIF7.2b (fig. 21) er indikert som firkanter. Retningen for transkripsjon av genet er indikert ved pilen under linjen.
Trinn 1: Påvisning av humant LIF gen med en museprobe.
En metode er angitt tidligere for anvendelse av et radioaktivt merket fragment av mus LIF cDNA klonet pLIF7.2b som en hybridiseringsprobe for å detektere det humane LIF gen.
Figur 18 viser at denne metoden tillater at det humane LIF gen detekteres i human genom DNA spaltet med en rekke restriksjonsendonukleaser. Analyser slik som denne, og andre geler som ikke er vist, åpenbarte størrelsene av DNA fragmenter dannet ved hjelp av en rekke restriksjonsendonukleaser hvorpå det humane LIF gen er lokalisert. Slike data er viktige i de påfølgende trinn i dette eksempel, ikke bare for å etablere betingelser hvorunder museproben kan anvendes som en hybridiseringsprobe for å detektere det humane, men også for å tilveiebringe diagnostiske restriksjonskart data til hjelp i identifisering av humane genome LIF kloner.
En større grad av homologi mellom musesekvenser og de humane LIF sekvenser var tydelig når mus og human genom DNA spaltet med Barn HI ble hybridisert med en mus LIF cDNA probe under en rekke hybridiserings- og vaskeforhold, (fig. 19). Når betingelsene som gjelder hybridisering og vasking ble mer stringente slik at bakgrunnsflekker ble redusert, viste det seg et unikt fragment på ~3 kbp som hybridiserer med museproben. Det humane gen bibeholdt tydelig vesentlig hybridisering selv ved 65°C i 0,2 x SSC.
Trinn 2: Screening av et humant genom bibliotek og isolering av et klon inneholdende LIF genet.
Et bibliotek av human genom DNA, delvis spaltet med Sau 3A og ligert inn i X fag kloningsvektor EMBL3A, ble screenet for LIF genholdige kloner ved hybridisering med mus cDNA som en probe. Fragmentet av LIF cDNA ble radioaktivt merket og hybridi-seringsbetingelsene var som gitt over (eks. 1). Kort sagt ble fag-plaques som representerer det genome bibliotek dyrket i en tetthet på -50.000 plaques pr. 10 cm petriskål og overført til mikrocellulose som beskrevet (Maniatis, T. et.al., Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Før hybridisering ble filtere inkubert i flere timer ved 65°C i 6 x SSC (SSC =
0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat), 0,2 % Ficoll, 0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrofosfat, 1 mM ATP, 50 ug/ml denaturert laksespermie DNA og 50 ug/ml E.coli tRNA. Hybridisering som i den samme løsning inneholdende 0,1 % SDS, ved 65°C i 16-18 timer. LIF cDNA fragmentet, radioaktivt merket ved hjelp av nick-translasjon ved anvendelse av [a<32>P] dATP til en spesifikk aktivitet på -2 x IO<8> cpm/ug ble inkludert i hybridiseringen ved en konsentrasjon på -2 x IO<6> cpm/ml. Etter hybridisering ble filterne vasket grundig i 6 x SSC, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved 65°C og deretter autoradiografert. Plaques som var positive på duplikatfiltere ble plukket og screenet på nytt ved lavere densitet, som tidligere.
Tre kloner ble således identifisert og renset: XHGLIF1, 2 og 3. For å bestemme sammenhengen mellom disse kloner og for å bestemme hvilke, om noen, som inneholder det humane LIF gen, ble DNA fremstilt fra hvert klon og spaltet med disse restriksjonsendonukleaser: Sal I som frigjør hele segmentet av klonet genom DNA og Barn HI og Pst I som spalter i og rundt LIF-genet til å danne karakteristiske fragmenter på henholdsvis -3 kbp og 1,8 kbp og 0,6 kbp (som bestemt over). Etter spalting av rekombinant fag DNAer og ny oppløsning ved hjelp av elektroforese på agarosegeler (fig. 20, venstre felt), ble DNA overført til nitrocellulose og hybridisert med mus LIF cDNA proben (under betingelsene som er gitt over) for å frigjøre fragmenter inneholdende LIF genet (fig. 20, høyre felt). Denne analysen viste at (a) alle tre kloner viste seg å være identiske; (b) alle inneholder et -9 kbp segment av genom DNA inneholdende et område som er homologt med mus LIF proben;
(c) området som er homologt med mus cDNA er tilstede på et
3 kbp Barn HI fragment og på 1,8 og 0,6 kbp Pst I fragmenter, egenskaper til det humane LIF gen (se over). Således konkluderte man med at alle tre kloner inneholder et segment av kromosomal DNA som omfatter det humane LIF gen.
Trinn 3: Bestemmelse av nukleotidsekvensen av det humane LIF gen.
~3 kbp Barn HI fragmentet av ?iHGLIFl som er vist over til å hybridisere med mus LIF cDNA proben ble reklonet inn i plasmidvektoren pEMBL8<+> og førte til klon pHGLIFBaml og ble underkastet nukleotidsekvensanalyse. Nukleotidsekvensering ble gjennomført ved hjelp av dideoksykjede-termineringsmetoden (Sanger, F. et.al., Pro. Nati. Acad. Sei., USA. 74: 5463-5467, 1977) ved anvendelse av alkalisk denaturert dobbeltrådet plasmid DNA som templat, en rekke oligonukleotider som er komplementære til sekvensene i genet som primere og ved anvendelse av både Klenow fragmentet av E.coli DNA polymerase I og aviær myeloblastosevirus revers transkriptase som polymeraser i sekvenseringsreaksjonene.
Hele nukleotidsekvensen av Barn HI fragmentet som spenner over LIF genet (2840bp) ble bestemt, hvorav 12 97bp er vist i fig. 21. Oppstilling av denne sekvens med den murine LIF mRNA sekvens viste at sekvensene som koder for det modne humane LIF protein er tilstede på to exoner separert ved hjelp av et intron på 693bp (fig. 21). For området som koder for det modne protein er der en høy grad av homologi mellom de to spesier både på nukleotid og aminosyresekvensnivået. Innen exon 1 er der 88 % nukleinsyresekvens-homologi (114/129 rester sammenlignet) og 91 % aminosyresekvens-homologi (39/43) for området som koder for det modne protein (stilling 58-186). Exon 2 er noe mindre homolog, 77 % på nukleotidnivået (318/411) og 74 % på aminosyrenivået (101/136) i kodeområdet. Når man ser på det modne protein som et hele, er mus og humane LIF sekvenser bestemt her identiske i 140 av 179 stillinger (78 %) uten innskudd eller delesjoner (fig. 22). Dessuten er mange av forskjellene meget konservative substitusjoner (Lys:Arg, Glu:Asp og Leu:Val:Ala).
I 5'-enden av kodonet for den N-terminale prolinrest av moden LIF, (stilling 58 i fig. 21), er det humane gen homologt med den murine LIF mRNA gjennom et område som koder for det meste av den hydrofobe leder. Hele lederen er imidlertid ikke kodet på dette exon, da mRNA og gensekvensene divergerer i et typisk RNA spleisested (TCCCCAG) (Mount, S.M., Nucleic Acids Res. 10:459-472, 1982). Exonet som spesifiserer det 5' utranslaterte området og de første rester av lederen er ikke tilstede innen 1097 bp 5' av dette spleisested. I mus LIF genet, er exonet som spesifiserer de første 6 aminosyrerester til den hydrofobe leder lokalisert -1,5 kbp 5' av det analoge spleisested.
Trinn 4: Derivasjon av et restriksjonsendonuklease-spaltingskart av det humane LIF gen.
For å bestemme plasseringen av restriksjonsendonuklease-spaltingssetene i og omkring det humane LIF gen, og således tilveiebringe et molekylært fingerprint av dette gen, ble human genom DNA (fra RAMOS cellelinjen) spaltet med forskjellige restriksjonsendonukleaser alene og i parvise kombinasjoner og underkastet Southern blot analyser som beskrevet i eks. 5, med unntak av at proben som ble anvendt var 3 kbp Barn HI fragmentet avledet fra pHGLIFBaml beskrevet i trinn 3 over og radioaktivt merket ved hjelp av nick-translasjon. Analyser av de således utledede data (ikke vist) så vel som det som er vist i fig. 18 og utledet fra analyser av A.HGLIF1 og pHGLIFBaml, gav restriks jonsendonuklease-spaltings-kartet som er vist i fig. 23.
EKSEMPEL 8
Det følgende eksempel gir i detalj modifikasjoner som er utført på det klonede humane LIF genet for å tillate ekspresjon i gjærceller og bestemmelse av de biologiske og biokjemiske egenskaper av det rekombinante humane LIF som således er utledet.
Figur 12: vedrører trinn 1: oligonukleotider anvendt til å modifisere det humane LIF gen for innlemmelse i YEpsecl. Oligonukleotid (a) svarer til 5'-enden av kodeområdet (restene 31 til 69 i fig. 21). Oligonukleotid (b) svarer til midten av kodeområdet (restene 163 til 186 og 880 til 903 i fig. 21).
Den delen av dette oligonukleotid som er komplementær til exon 1 er understreket med tankestreker, og den som er komplementær til exon 2 med prikker. Oligonukleotid (c) svarer til 3'-enden av kodeområdet (fra stilling 1279 i fig. 21). Oligonukleotidene (a) og (b) introduserer de indikerte restrik-sj onsendonuklease-spaltingsseter. Figur 24: vedrører trinn 1: nukleotidsekvens av, og aminosyresekvens kodet for av, det syntetiske humane LIF cDNA utledet ved mutagenese av det klonede humane LIF gen. Barn HI og Hind III spaltingsseter innført ved oligonukleotidene (a) og (c) (fig. 12) er indikert. Den antatte N-terminale aminosyre til modent LIF (ved analogi med musen) er angitt som +1. Figur 25: vedrører tinn 3: Induksjon av differensiering i kolonier av Ml leukemiceller ved fortynninger av renset nativ murin LIF (o o) og behandlet medium fra gjærceller inneholdende YEpsecl/HLIF rekombinanten indusert med galaktose (• •). Medium fra ikke-induserte gjærkulturer inneholdende YEpsecl/HLIF rekombinanten (o o) var inaktivt. Gjennom-snittlige data fra gjentatte 7 døgns kulturer er gitt. Figur 26: vedrører trinn 4: konkurranse mellom gjæravledet HLIF og nativ murin 125I-LIF for binding til spesifikke reseptorer på murine Ml celler. Fortynninger av autentisk nativ murin LIF-A (o o) , rekombinant murin LIF (• •) og behandlet medium fra gjærceller inneholdende YEpsecl/HLIF konstruksjon som var uindusert (■ ■) og indusert med galaktose (□ □) ble testet for evnen til å konkurrere med nativ <125>I-LIF-A for bindingen til cellulære reseptorer på murine Ml celler ved 37°C, som gitt tidligere.
Trinn 1: Modifisering av det humane LIF gen for ekspresjon i gjær.
Isoleringen av et rekombinant DNA klon inneholdende det humane LIF gen og nukleotidsekvensen av det ovennevnte gen er gitt tidligere (eks. 7). Nukleotidsekvensen til 1297bp av DNA som spenner over de to exoner som koder for det modne humane LIF protein er vist i fig. 21.
Murin rekombinant LIF er tidligere fremstilt i gjærceller ved anvendelse av gjærekspresjonsvektoren, YEpsecl (eks. 2). Denne vektor tilveiebringer en N-terminal ledersekvens utledet fra killer toksingenet av Kluyveromyces lactis, transkribert fra en galaktoseinduserbar hybrid GAL-CYC promoter.
For å uttrykke proteinet kodet av det humane LIF gen i denne vektor, var det nødvendig å modifisere genet på flere måter.
I 5'-enden av området som koder for det modne protein ble et spaltingssete for restriksjonsendonuklease Barn HI introdusert for å tillate innskudd i rammen med K.lactis leder og å bibeholde et passende signalpeptidase-spaltingssete (Gly-Ser). Den samme modifikasjon som tidligere ble anvendt på mus cDNA (pLIF7.2b) ble gjennomført her. I midten ble den 693 bp intervenerende sekvens fjernet, med sammenkobling av to exoner i samme translasjonsleseramme. I 3'-enden ble et andre translasjons-stoppkodon introdusert umiddelbart 3' av det naturlige stoppkodon, etterfulgt av et Hind III sete for innskytelse i YEpsecl. Alle modifikasjoner ble oppnådd ved oligonukleotid-formidlet mutagenese: ~3 kbp BAM HI fragmentet som spenner over LIF genet ble subklonet inn i plasmidet pEMBL8+, (Dente, L. et.al., Nucleic Acids Res. 11:1645-1655, 1983) og enkeltrådet DNA ble fremstilt ved Fl superinfeksjon. In vitro mutagenese ble gjennomført som beskrevet (Nisbet, I.T. og Beilharz, M.W., Gene Anal. Techn. 2:23 29, 1985), ved anvendelse av oligonukleotider av henholdsvis 39, 48 og 39 baser for å modifisere 5'-enden, midten og 3'-enden av genet som gitt over (fig. 12). Nukleotidsekvensen til det modifiserte humane LIF kodende området er gitt i fig. 24.
Trinn 2: Introduksjon av YEpsecl/HLIF rekombinanten inn i gjærceller.
S.cerevisiae stamme GYl<+>(leu2 ura3 ade2 trpl cir+; fra G. Cesareni, EMBL Heidelberg) ble transformert ved hjelp av polyetylenglykol-metoden (Klebe, R.J. et.al., Gene 25: 333-341, 1983). Transformanter ble valgt og holdt på et syntetisk minimalt medium (2 % karbonkilde, 0,67 % gjærnitrogenbase (Difco) tilsatt 50 ug/ml av de påkrevde aminosyrer) under urasildeprivasjon. Rekombinant HLIF ble fremstilt ved hvilken som helst av de to metoder. Enten (1), ble Ura<+> transformanter dyrket til stasjonær fase i et ikke-selektivt medium inneholdende 2 % galaktose, og mediumet ble analysert for LIF aktivitet eller (2), Ura<+> transformanter ble dyrket til stasjonær fase i et selektivt minimalt medium inneholdende 2 % glukose. Cellene ble deretter vasket og resuspendert i det samme volum av det selektive minimale medium inneholdende 2 % etanol og dyrket i 8 timer for å overvinne glukose-represjon. Transkripsjon av HILF innskuddet ble deretter indusert ved å fortynne cellene (1:10) i et syntetisk minimalt medium inneholdende 2 % galaktose. Prøver av kultursuper-natanten ble fjernet ved forskjellige tidsrom etter induksjon, filtrert gjennom Millipore filtre (0,2 |im) og analysert direkte for LIF aktivitet.
Trinn 3: Bestemmelse av de biologiske egenskaper for gjæravledet HLIF.
Sett på bakgrunn av den høye grad av sekvenslikhet mellom mus og human LIF, ble aktiviteten av gjæravledet human LIF på murine Ml celler vurdert. Analyser av differensieringsinduserende aktivitet og leukemi-undertrykkende aktivitet av gjærkondisjonert medium ble gjennomført i 1 ml kulturer inneholdende 3 00 murine Ml celler (fra Dr M. Hozumi, Saitama Cancer Research Centre, Japan) i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium med en sluttkonsentrasjon på 20 % føtalt kalveserum og 0,3 % agar. Materialer som skulle analyseres ble tilsatt i seriefortynnede 0,1 ml volumer til dyrkingsskålene før tilsetningen av cellesuspensjonen i agarmedium. Kulturene ble inkubert i 7 døgn i en atmosfære som var mettet med fuktighet på 10 % C02 i luft. Kulturene ble bedømt ved anvendelse av et disseksjonsmikroskop ved 35 ganger forstørrelse, en bedømming som differensierte kolonier med en rosett av dispergerte celler eller som helt var sammensatt av dispergerte celler. Morfologisk undersøkelse av koloniene ble gjennomført ved å fiksere hele kulturen med 1 ml 2,5 % glutaraldehyd hvoretter de tørre kulturer ble farget på mikroskop-glassplater ved anvendelse av acetylcholinesterase/Luxol Fast Blue/Haema-toxylin.
Medium fra galaktoseinduserte kulturer av gjær inneholdende det humane kodende området i YEpsecl, men ikke fra uinduserte kulturer av de samme gjærceller, fra kulturer av ikke-transformert gjær eller gjær inneholdende vektoren YEpsecl alene, er i stand til å indusere typisk makrofag-differensiering i kulturer av Ml kolonier (fig. 25). Som med murin LIF, reduserte også det gjærutledede humane material progressivt antall og størrelse av Ml kolonier som utviklet seg med økende konsentrasjoner. Sammenligning med renset nativ murin LIF indikerte at gjærbehandlet medium inneholdt opp til 50.000 enheter/ml av human LIF.
Trinn 4: Reseptorbindings-spesifisitet av gjæravledet human
LIF.
Renset murin LIF-A ble jodert som angitt tidligere. Ml celler ble vasket og resuspendert til 2,5 x 10<6>/50 ul i Hepes-bufret RPMI medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum. Celler i 50 ul prøver ble inkubert med 200.000 cpm av 125I-LIF-A (10 ul i samme medium) og 10 ul kontrollmedium eller seriefortyn-ninger (fortynnet to ganger) av ikke-merket ren murin LIF-A eller behandlet medium fra galaktoseinduserte eller uinduserte kulturer av gjærtransformanter inneholdende YEpsecl/HLIF kons truks j onen.
Medium behandlet med galaktoseinduserte gjærceller inneholdende YEpsecl/HLIF rekombinanten er i stand til å konkurrere med nativ murin <125>I-LIF-A for binding til spesifikke cellulære reseptorer på murine Ml celler i samme grad som nativ og rekombinant murin LIF-A, ved 37°C. (Fig. 26) og ved 0°C (ikke vist). Medium fra uinduserte gjærceller og fra gjærceller inneholdende vektoren YEpsecl alene konkurrerte ikke. Således synes der å være en sterk konservering av reseptor-bindings-området i murin og human LIF, som er overensstemmende med den høye graden av primær aminosyresekvenslikhet.
Trinn 5: Rensing, sekvensering og jodering av gjæravledet human LIF.
Human LIF i medium behandlet med galaktoseinduserte gjærceller inneholdende YEpsecl/HLIF rekombinanten ble renset ved anvendelse av trinnene 2 og 4 i eks. 1 i NO patentsøknad nr. 885339 med unntak av at LIF aktiviteten som binder seg til DEAE-Sepharosé CL-6E- kolonnen og som elueres med salt-gradienten ble samlet i trinn 2. Renset gjæravledet human LIF ble merket med radioaktivt jod ved å inkubere 1 (lg human LIF i 50 ul 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 7,2, med 1 mCi Na 125I
(2,7 ul) og 5 ul 0,2 mM ICI i 2 M NaCl i 60 sek. <125>I-LIF ble separert fra uinkorporert 125I ved at reaksjonsblandingen ble ført gjennom en kolonne av Sephadex G-25 M (Pharmacia) ekvilibrert i fosfat-bufret (20 mM, pH 7,4) saltoppløsning (0,15 M) inneholdende 0,02 % Tween 20 og 0,02 % natriumazid. Human <125>I-LIF ble elektroforesebehandlet på en 8-25 % gradient natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel som et eneste bredt bånd med tilsynelatende molekylvekt på 170.000. Human <125>I-LIF bandt seg spesifikt til murine Ml celler og benmargceller og
bekreftet evnen som human LIF har til å binde seg til murine LIF reseptorer. Renset gjæravledet human LIF (omtrent 10 ug)
ble underkastet aminoterminal aminosyresekvensering som beskrevet i undereks. 1 og ga en eneste sekvens:
Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala
Denne er identisk med den forutsagte aminosyresekvens av human
LIF (fig. 22) med unntak av at sekvensen begynner ved den
fjerde aminosyren sammenlignet med starten av murinsekvensen (se undereks. 1) som er:
Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala
Dette indikerer at den rensede gjæravledede humane LIF mangler
de tilsvarende første tre aminosyrer til musesekvensen, men er enda biologisk aktiv og enda i stand til å binde til den murine LIF reseptor. De første tre aminosyrer viser seg således å være unnværlige for den biologiske aktiviteten til
LIF.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF (leukemi-inhiberende faktor) polypeptid, karakterisert ved at den omfatter: (a) tilveiebringelse av vertsceller som inneholder et rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, samt seleksjonsmarkør, (b) dyrking av de nevnte celler under betingelser som leder til ekspresjon av polypeptidet, og (c) utvinning av polypeptidet, idet polypeptidet omfatter et modent polypeptid som er minst 78 % homologt med en aminosyresekvens valgt fra dem vist i figurene 10, 22 og 24.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det modne polypeptid har fullstendig homologi med aminosyresekvensen som vist i figur 24.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at polypeptidet er glykosylert ved hjelp av vertscellen.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at promoteren er en galaktoseinduserbar hybrid GAL-CYC promoter.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at signalsekvensen som koder for ekspresjon av en ledersekvens som styrer sekresjonen av polypeptidet er avledet fra signalsekvensen i killertoksin-genet av Kluyveromyces lactis.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at vektoren er avledet fra Moloney murin leukemivirus.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at vektoren ytterligere omfatter LTR enhanceren av myeloproliferativ sarkomavirus.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at vektoren mangler den 3' utranslaterte region i nativ LIF mRNA.
9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at vektoren er en som styrer ekspresjonen av et glutation-S-transferase/LIF fusj onsprotein.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at vektoren er en som styrer ekspresjonen av et glutation-S-transferase/trombin-spaltingssete/LIF fusj onsprotein.
11. Rekombinant DNA molekyl som koder for et LIF polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som angitt i figurene 5, 10 (baser 1-63), 21 eller 24 (baser 1-543), idet nevnte polypeptid konkurrerer med et polypeptid med en aminosyresekvens som angitt i figurene 10, 22 eller 24 for binding til spesifikke cellulære reseptorer på Ml celler eller murine eller humane makrofager.
12. Rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 11 omfattende en nukleotidsekvens som, ved ekspresjon i en passende vertscelle, koder for LIF polypeptidet, karakterisert ved at den nevnte nukleotidsekvens hybridiserer under betingelser med 6 x SSC, 65°C eller strengere betingelser, til en sekvens av et LIF-kodende innskudd valgt fra de LIF-kodende innskudd i kloner pLIF7.2b, pLIFNKl, pLIFNK3 og pHGLIFBaml som definert i figurene 5, 6, 10 eller 21.
13. Molekyl som angitt i krav 12, karakterisert ved at det ferdige polypeptid har fullstendig homologi med aminosyresekvensen som vist i figur 24.
14. Molekyl som angitt i krav 11 - 13, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et replikasjonsutgangspunkt hvorved det nevnte molekyl gjøres egnet for anvendelse som en kloningsvektor.
15. Molekyl som angitt i krav 14, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en promotersekvens som er operabelt bundet til den nevnte nukleotidsekvens hvorved det nevnte molekyl gjøres egnet for anvendelse som en ekspresjonsvektor.
16. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med et rekombinant DNA molekyl som angitt i krav 11 og har evnen til å uttrykke LIF polypeptidet.
17. Vertscelle som angitt i krav 16, karakterisert ved at vertscellen er en gjærcelle.
18. Vertscelle som angitt i krav 17, karakterisert ved at vertscellen er av arten Saccharomyces cerevisiae.
19. Vertscelle som angitt i krav 16, karakterisert ved at vertscellen er en pattedyrcelle.
20. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at vertscellen er hemopoese celler.
21. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at vertscellen er E. coli celler.
NO950509A 1987-04-02 1995-02-10 Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette NO179210C (no)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO950509A NO179210C (no) 1987-04-02 1995-02-10 Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPI120987 1987-04-02
AUPI331787 1987-07-24
AUPI490387 1987-10-15
AUPI600587 1987-12-21
PCT/AU1988/000093 WO1988007548A1 (en) 1987-04-02 1988-03-31 Leukaemia-inhibitory factor
NO885339A NO178265C (no) 1987-04-02 1988-11-30 Leukemiinhiberende faktor for anvendelse in vitro, fremgangsmåte for å rense denne, anvendelse derav for testing og/eller diagnostisering in vitro samt diagnostisk reagens eller probe
NO950509A NO179210C (no) 1987-04-02 1995-02-10 Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO950509L NO950509L (no) 1989-02-01
NO950509D0 NO950509D0 (no) 1995-02-10
NO179210B true NO179210B (no) 1996-05-20
NO179210C NO179210C (no) 1996-08-28

Family

ID=27542919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO950509A NO179210C (no) 1987-04-02 1995-02-10 Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette

Country Status (1)

Country Link
NO (1) NO179210C (no)

Also Published As

Publication number Publication date
NO950509L (no) 1989-02-01
NO950509D0 (no) 1995-02-10
NO179210C (no) 1996-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK174970B1 (da) Leukæmi-hæmmende faktor (LIF), DNA der koder herfor, værtsceller med DNA samt fremgangsmåde til fremstilling af LIF
JP2740417B2 (ja) ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法
EP0489116B1 (en) Fusion proteins comprising gm-csf and il-3
JPS61501627A (ja) ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａ
JPH02501925A (ja) ヒト　インターロイキン‐３　蛋白質
CN101014626A (zh) 糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素
JPH01501283A (ja) 新規な型のコロニー刺激因子―１
DK175865B1 (da) Interleukin-7
KR20000019788A (ko) 대장균 엔테로톡신ⅱ 신호펩티드의 변형체와 인체성장호르몬의융합단백질을 발현하는 재조합 미생물 및 그를 이용한 인체성장호르몬의 제조방법
JPH06505631A (ja) 巨核球刺激因子
CN113637068B (zh) 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l5t及其制备方法和用途
NO301482B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av renset rekombinant human-IL-3-analogprotein som omfatter Met3huIL-3(Pro8Asp15Asp70), isolert DNA-sekvens, rekombinant ekspresjonsvektor og gjærvertscelle
HUT54411A (en) Process for producing mutants of human interleukine-3
BRPI9610977A2 (pt) agonistas receptores hematopoiéticos multi-funcionais
AU609128B2 (en) Leukaemia-inhibitory factor
CA2213512A1 (en) Method for producing bioactive fusion protein
JPS6363199B2 (no)
NO179210B (no) Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette
CN107353347A (zh) 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法
Nishizawa et al. Biologically active human and mouse nerve growth factors secreted by the yeast Saccharomyces cerevisiae
US20030004098A1 (en) Leukaemia inhibitory factor
JPS62502305A (ja) ポリペプチドの産生を向上する方法
KR0121322B1 (ko) 백혈병 억제 인자 제조를 위한 재조합 dna 분자 및 숙주 세포
NZ224105A (en) Leukaemia inhibitory factor
HU207342B (en) Process for producing human or mouceleukemie inhibitor factor /lif/ and pharmaceutical compositions of lif activity and process for purifying lif after or without glycozilation

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired