DK174970B1 - Leukæmi-hæmmende faktor (LIF), DNA der koder herfor, værtsceller med DNA samt fremgangsmåde til fremstilling af LIF - Google Patents

Description

DK 174970 B1

Opfindelsens område

Opfindelsen angår polypeptider med leukæmi-hæmmende faktor (LIF)-aktivitet, DNA der koder herfor, værtsceller med DNA samt en fremgangs-5 måde til fremstilling af LIF.

Opfindelsens baggrund

Modne blodlegemer produceres ved klonformering og samtidig differentiering 10 af umodne præcursorceller (Metcalf, D. (1984) The Hemopoietic Colony Stimulating Factors. Elsevier, Amsterdam). Ved normale hæmopoietiske celler er de to formerings- og differentieringsprocesser tæt koblet således, at de kortlivede modne celler kontinuerligt fornyes. Mindst fire biokemisk forskellige vækstfaktorer, kolonistimuleringsfaktoreme (CSF's), er in vitro blevet vist at 15 stimulere formeringen og differentieringen af præcursorceller af granulocyter og makrofager: G-CSF, M-CSF. GM-CSF og Multi-CSF (IL-3) (se Metcalf, D.

(1987), Proc. R. Soc. B.. 230. 389-423, for redegørelse).

I modsætning til normale celler er myeloide leukæmiceller ejendommelige 20 ved en afkobling af formering og differentiering således, at umodne stamceller akkumuleres, bibeholder deres formeringskapacitet og differentieres ikke.

Der har været betydelige meningsuoverensstemmelser med hensyn til arten af biologiske faktorer, der er i stand til at inducere differentieringen af myeloide leukæmiceller in vitro og hvorvidt visse faktorer er i stand til at inducere 25 differentiering i fravær af formering. Det er endda blevet foreslået, at formerings- og differentieringsbegivenhedeme nødvendigvis medieres af forskellige faktorer (Sachs, L, (1982), J. Cell. Physiol. SuppI.. 1, 151-164). På den , ene side har to grupper beskrevet og oprenset en aktivitet (MGI-2 eller D- faktor), der er i stand til at inducere differentieringen af den murine myeloide 30 leukæmicellelinie M1, hvilken aktivitet ikke stimulerer formeringen af normale stamceller (Lipton, J.H. og Sachs, L, (1981), Biochem, Biophvs. Acta, 673. 552-569; Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y. og Hozumi, M. (1984), jL Biol. Chem.. 259. 10978-10982). På den anden side er det tidligere blevet vist, at ét af CSF'eme, G-CSF, er en stærk differentierings-inducerende sti-35 mulus for den murine myeloide leukæmicellelinie, WEHI-3B D+, såvel som at 2 DK 174970 B1 være en stiv formerings- og differentieringsstimulus for normale celler (Nicola, N.A., Metcalf, D., Matsumoto, M. og Johnson, G.R., (1983), J. Biol.

Chern.. 258. 9017-9023). Desuden har Tomida et al., (Tomida, M., Yamamo-to-Yamaguchi, Y.( Hozumi, M., Okabe, T. og Takaka, F. (1986), FEBS Lett..

5 207. 271-275) vist, at rekombinant G-CSF også er i stand til at inducere ma- krofagdifferentieringen af M1-celler. Forholdet mellem disse faktorer har væ- " ret genstand for debat. Situationen blev yderligere kompliceret ved den opdagelse, at tumornekrosisfaktor a(TNF a) er i stand til at stimulere differentieringen af den humane myeloblastiske cellelinie ML-1 (Takeda, K., Iwamoto, 10 S., Sugimoto, H., Takuma, T., Kawatani, N„ Noda, M., Masaki, A., Morise, H., Arimura, H. og Konno, K. (1986), Nature. 323. 338-340).

I et forsøg på at løse uoverensstemmelserne mellem disse gruppers data er det af Krebs ll-ascitestumorceiler konditionerede medium, der er blevet an-15 vendt i et antal tidligere studier, blevet biokemisk fraktioneret og det er blevet vist, at det ikke kun indeholder autentisk G-CSF og GM-CSF, der er aktive på normale stamceller såvel som WEHI-3B D+-celler, men også to biokemisk forskellige, men funktionelt lignende, faktorer, der er i stand til at inducere differentieringen af M1-celler. Disse sidste faktorer er blevet benævnt leu-20 kæmi-hæmmende faktor (LIF)-A og LIF-B, på grund af deres evne til at undertrykke formeringen af M1-leukæmiceller in vitro og det er blevet vist, at de ikke inducerer differentieringen af WEHI-3B D+-celler og ikke stimulerer formeringen af normale granulocyt/makrofag-stamceller.

25 Sammendrag af opfindelsen

Ifølge den foreliggende opfindelse defineres LIF som et molekyle, der har følgende to egenskaber: (1) det har evnen til at undertrykke formeringen af myeloide leukæmiceller, såsom M1-celler med forbundet differentiering af 30 leukæmicellerne, og (2) det vil konkurrere med et molekyle, der har den heri definerede sekvens af murin LIF eller human LIF, om binding til specifikke cellulære receptorer på M1-celler eller murine eller humane makrofager. LIF Kan potentielt anvendes som et terapeutisk ikke-formerende middel til undertrykkelse af visse former af myeloid leukæmi såvel som et reagens til modifi- 3 DK 174970 B1 cering af makrofagfunktion og andre reaktioner på infektioner og til klinisk afprøvning og forskning i forbindelse med disse.

Betegnelsen "polypeptid med LIF-aktivitet", som anvendt heri, betegner et 5 polypeptid eller glycopolypeptid med de ovenfor definerede LIF-egenskaber, herunder, men ikke begrænset til, polypeptider med en aminosyresekvens, der er fuldstændigt eller delvis homolog med aminosyresekvensen af enten murin eller human LIF som beskrevet heri. Denne betegnelse omfatter også polypeptider, der er fuldstændigt eller delvis homologe med kun en del af 10 aminosyresekvensen af murin eller human LIF, forudsat at polypeptidet har de ovenfor definerede LIF-egenskaber. Denne betegnelse omfatter yderligere polypeptider eller glycopolypeptider, der er produceret ved ekspression i en værtscelle, hvilke polypeptider eller glycopolypeptider er inaktive ved ekspressionen, men som processeres af værtscellen til at give aktive molekyler, 15 såvel som polypeptider eller glycopolypeptider, der er inaktive ved ekspressionen, men som selektivt kan kløves in vitro eller in vivo til at give aktive molekyler.

Murin LIF er et molekyle med følgende biologiske egenskaber: 20 (a) induktion af makrofagdifferentiering i celler af den murine myeloide leukæmicellelinie M1 med tab af formeringskapacitet og død af de klono-gene leukæmiceller, en virkning der potenseres af G-CSF, 25 (b) selektiv binding til højaffinitetsreceptorer på M1-celler og på normale murine monocyter og makrofager fra bughulen, milten og knoglemarven, hvor antallet af receptorer stiger med makrofagmodning eller funktionel aktivering, men ikke til granulocytiske, erythroide eller lymfoide celler fra disse væv, 30 (c) G-CSF, GM-CSF, Multi-CSF (interleukin-3), M-CSF, interleukiner 1, 2, 4 eller 6, endotoxin eller et udvalg af andre vækstfaktorer konkurrerer ikke med den specifikke binding af 12®I-LIF til højaffinitetsreceptorer, men umærket LIF konkurrerer herom, 35 4 DK 174970 B1 (d) forhøjelse ved bakteriel endotoxin i serum hos normale eller atymiske mus, men ikke i endotoxin-resistente C3H/HeJ-mus, (e) produktion ved forskellige væv, herunder lunge, spytkirtel, bughindecel- 5 ler og knogleskaft, (f) reduktion af overlevelsestiden in vitro af normale granulocyt-makrofagstamceller ved dyrkning i fravær af CSF, 10 (g) en manglende evne til at undertrykke formering eller inducere differen tiering af murine WEHI-3B D+ myeloide leukæmiceller, murine mye-loidceller, der er transformeret til leukæmogenicitet ved infektion med retroviruser, der udtrykker GM-CSF eller Multi-CSF, de murine leukæmicellelinier WEHI265 og WR19, 15 (h) ingen evne til at stimulere formeringen af normale stamceller af granu-locyt-, makrofag-, eosinophil-, megakaryocyt-, erythroid- og mastcellelinier og en manglende evne til at undertrykke klonformeringen eller ' ændre den kvantitative reaktionsdygtighed over for stimulering med 20 CSF'er in vitro af stamfædre af normale granulocyter, makrofager, me- gakaryocyter, eosinofiler eller naturlige cytotoksiske celler eller formeringen af celler af de kontinuerlige cellelinier 32CD1.13 og FDCP-1, (i) en manglende evne til at konkurrere med de ioderede derivater af gra- 25 nulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF) om binding til specifikke cel lulære receptorer på trods af G-CSF's evne til at inducere differentiering i M1 og WEHI-3B D+ murine myeloide leukæmiceller og til at potentse-re virkningen af LIF på M1-celler, 30 (j) en manglende evne til at LIF-virkningen kan hæmmes af antisera, der specifikt er produceret mod tumornekrosisfaktor (TNF), (k) murine LIF-transkriptioner forekommer konstitutivt i cytoplasmaet af LB3- og E9,D4-T-celler, induceres ikke af lectinet concanavalin A i dis-35 se celler og forekommer i et antal af andre celletyper, 5 DK 174970 B1 murin LIF har også fået bestemt følgende egenskaber: (I) en enkelt glycoproteinunderenhed med molekylvægt på 58.000 ± 5.000 5 som bestemt ved elektroforese i 8-25% gradient polyacrylamidgeler med natriumdodecylsulfat med eller uden reduktionsmiddel (2-mercaptoethanol eller dithiothreitol) og en molekylvægt på 23.000 ± 5.000 efter behandling med endoglycosidasen, N-glycanase, 10 (m) et isoelektrisk punkt mellem 8,6 og 9,3 (n) den primære aminosyresekvens, der er beskrevet detaljeret i figurerne 10,11 og 15 heri, 15 (o) er indkodet i nukleotidsekvensen, der er beskrevet detaljeret i figur 10, 11 og 15 heri, (p) en specifik aktivitet på 1-2 x 10® enheder/mg (hvor 50 enheder er defineret som den LIF-mængde, der i 1 ml inducerer en 50% reduktion af 20 klonformeringen af murine M1 myeloide leukæmiceller), (q) er indkodet i et unikt gen på murint kromosom II (som bestemt ved analyse af et panel af somatiske mus-/kinesisk hamster-ovarie-cellehybrider) begrænset af restriktionsendonukleasekløvningssteder 25 som illustreret i figur 19 heri, (r) er homolog med en human gensekvens, der er begrænset i kromosomalt DNA ved restriktionsendonukleasekløvningssteder som illustreret i figur 27 heri.

30

Human LIF er et molekyle med følgende biologiske egenskaber af det native produkt og/eller gærafledte rekombinantprodukt: 6 DK 174970 B1 (a) induktion af makrofagdifferentiering i celler af den murine myeloide leukæmicellelinie M1, med tab af formeringskapacitet og død af de klono-gene leukæmiceller, 5 (b) ingen evne til at stimulere formeringen af normale humane stamceller af granulocyt-, makrofag-, eosinofil- og erythroidlinier, (c) en evne til, i kombination med G-CSF, delvis at undertrykke formeringen af celler af den humane leukæmicellelinie U937 og, i kombinati- 10 on med GM-CSF-, formeringen af de humane leukæmicellelinier U937 og HL60, (d) bindes specifikt til murine LIF-receptorer på M1 -celler og murine makrofager og konkurrerer fuldstændigt om bindingen med murin 125I-LIF til 15 sådanne celler, (e) bindes til specifikke cellulære receptorer på den humane hepatomacel-lelinie Hep-2G.

20 Det er også blevet konstateret, at human LIF har følgende egenskaber (f) er identisk med murin LIF i tilnærmelsesvis 80% af aminosyrerester i det modne protein, 25 (g) den primære aminosyresekvens, der er beskrevet detaljeret i figur 25, 26 og 29 heri, (h) er indkodet i unikt gen, der er begrænset i kromosomalt DNA ved restriktionsendonukleasekløvningssteder som illustreret i figur 27 heri, 30 (i) har som en del af dets gensekvens den heri i figur 25 detaljeret beskrevne nukleotidsekvens.

Henvisningerne heri til "i væsentligt ren form" betegner en form af polypeptid 35 eller glycopolypeptid, hvori mindst 90% af polypeptidet eller glycopolypeptidet 7 DK 174970 B1 forekommer som et enkelt bånd, ved elektroforese på en passende natrium-dodecylsulfatpolyacrylamidgel, hvilket bånd er sammenfaldende med LIF-aktivitet.

5 Ifølge den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt polypeptider med leukæmi-hæmmende faktor (LIF)-aktivitet der er særegne ved* at de er i stand til at undertrykke proliferationen af M1 myeloide leukæmi celler, at det helt eller delvist omfatter aminosyresekvensen vist i figur 15, 26 eller 29 samt at det er i stand til at konkurrere med et polypeptid med nævnte sekvens om binding til 10 specifikke cellulære receptorer på M1 celler eller murine eller humane makrofager.

Der er desuden tilvejebragt rekombinante DNA-molekyler der er særegne ved* at de omfatter en nukleotidsekvens, der efter ekspression i en passende 15 værtscelle koder for et polypeptid med LIF-aktivitet ifølge den foreliggende opfindelse. Opfindelsen omhandler ligeledes sådanne værtsceller.

Endelig omhandler opfindelsen fremgangsmåder til fremstilling af et polypeptid med LIF-aktivitet ifølge den foreliggende opfindelse. Sådanne frem-20 gangsmåder er særegne ved, at værtsceller ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes og dyrkes under betingelser hvorved det rekombinante protein udtrykkes. Det rekombinante protein genvindes efterfølgende.

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen 25 I den foreliggende undersøgelse af LIF, navnlig med hensyn til tilvejebringelse af alternative kilder til dette glycoprotein af både murin og human oprindelse til at muliggøre anvendelse i kliniske og andre anvendelser, er murin-LIF blevet oprenset fra Krebs ll-ascitestumorceller ved en effektiv oprens-30 ningsprocedure og er blevet underkastet delvis aminosyresekvensanalyse som et første trin mod kemisk eller biosyntetisk produktion af denne faktor.

Der er blevet anvendt radioaktivt derivat af LIF med I125 i en receptorkonkur-renceanalyse til identifikation af celler og væv af murin og human oprindelse, 35 der syntetiserer og producerer LIF. Som et resultat af denne undersøgelse er 8 DK 174970 B1 et rekombinant DNA-bibliotek af DNA-kopier af mRNA fra en af disse kilder blevet screenet og murine LIF-kodende kloner er blevet identificeret ved hy-bridisering med radioaktivt mærkede oligonukleotider, der koder for dele af den tidligere bestemte murine LIF-aminosyresekvens og de førnævnte muri-5 ne LIF-cDNA-kloner er blevet underkastet nukleotidssekvensanalyse. Desuden er den klonede murine-UF kodende sekvens blevet anvendt som en hy-dridiseringsprobe til identificering af et humant gen, der koder for en homolog af murin-LIF og der er blevet fastsat hybridiseringsbetingelser, hvorunder artkrydsningshydridiseringen (engelsk: cross-species hybridization) kan udfø-10 res effektivt. Som et resultat er rekombinante DNA-kloner, der indeholder DNA-sekvenser, der koder for den humane homolog af murin-LIF, blevet identificeret.

Som et resultat af denne konstruktion af LIF-kodende sekvenser er der blevet 15 konstrueret rekombinante DNA-molekyler, der anvender klonede murine eller humane LIF-kodende DNA-sekvenser til dirigering af syntesen af klonalt rent LIF, enten fuldstændigt eller delvist, f.eks. i dyrkede mammale celler, i gær eller i bakterier. Den foreliggende opfindelse omhandler således i det væsentlige ren LIF, der er produceret på denne måde.

20

Kort beskrivelse af figurerne

Figur 1: er en grafisk gengivelse, der viser trin 2 af oprensningen af LIF på DEAE-Sepharose CL-6B. Det vandrette liniestykke viser, hvilke fraktioner der 25 blev opsamlet til oprensningstrinnet i trin 3.

Hour 2: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3 af oprensningen af UF på Linse-lectin Sepharose 4B. Det vandrette liniestykke viser, hvilke fraktioner der blev opsamlet til oprensningstrinnet i trin 4.

30

Figur 3: er en grafisk gengivelse, der viser trin 4 af oprensningen af LIF på CM-Sepharose CL-6B. Det vandrette liniestykke viser, hvilke fraktioner der blev opsamlet til oprensningstrinnet i trin 5.

DK 174970 Bi 9

Figur 4: er en grafisk gengivelse, der viser trin 5 af oprensningen af LIF på en fedtsyreanalyse HPLC-søjle. Det vandrette liniestykke indikerer, at der blev opsamlet fraktioner på 39,6-41,3 % v/v acetonitril.

5 Figur 5: er en grafisk gengivelse, der viser molekylvægten og renheden af ’ oprenset LIF. Det øvre panel viser migrering af proteinstandarder (93.000, 67.000, 43.000, 30.000, 20.000 og 14.000 molekylvægt) og oprenset LIF (2 præparationer) på 8-25 % w/w polyacrylamid SDS-gel. Proteinet og biologisk aktivitet er begge forbundet med et protein med molekylvægt 58.000.

10

Figur 6: er en grafisk gengivelse, der viser binding af radioioderet-ren LIF (ca. 2x10® cpm/ng) til M1-myeloidleukæmiceller ved 0°C. M1 -celler (5 x 10®) blev inkuberet med ^2®I-LIF (4x10® cpm) med eller uden konkurrerende faktorer i 2 timer, hvorefter bundet radioaktivitet blev separeret fra 15 ubundet radioaktivitet ved centrifugering gennem kalvefosterserum. (A). Tit rering af umærket ren LIF og ren multi-CSF, GM-CSF, G-CSF eller M-CSF som konkurrerende faktorer ved de viste fortyndinger (10 pi af hver fortynding sat til et slutvolumen på 80 μΙ). De højeste koncentrationer af hver var henholdsvis 10^ enheder/ml, 3,5 x 10^ enheder/ml, 3x10^ enheder/ml, 5 x 20 10^ enheder/ml, 4 x 10^ enheder/ml. (B). Evne hos ren LIF eller lipopoly- saccharid (LPS) eller koncentrerede (4-8-gange) medier konditioneret med forskellige celler eller serum fra endotoxininjicerede mus til at konkurrere om binding af 12®I-LIF til M1-celler som ovenfor.

25 Figur 7: er en grafisk gengivelse, der viser trin 1 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: akkumuleringen af mRNA'er for hæmopoietiske vækstregulatorer i cytoplasmaet af LB3-celler efter stimulering med lectinet concanavalin A. Cy-toplasmatisk polyadenyleret RNA (5 pg) fra WEHI-3B D"-celler (spor 1), T-celleklon LB3-celler dyrket ved 106-celler/ml med 5 pg/ml concanavalin A i 5 30 timer (spor 2) og ustimulerede LB3-celler (spor 3) blev elektroforeret på for-maldehydagarosegeler, overført til nitrocellulose og hybridiseret med en ®2P-GM-CSF-probe (panel a) eller en ®2P-multi-CSF-probe (panel b) (se Kelso,

Metcalf og Gough, et al., 1986, supraj.

10 DK 174970 B1

Figur 8: er en gengivelse, der viser trin 3 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: syntetisk oligonukleotid anvendt til identifikation af LIF-kloner. En del af ami-nosyresekvensen af murin LIF nær N-terminalen (rester 15-26, se eksempel 2) er vist på den øverste linie, de mulige kombinationer af mRNA-sekvenser, 5 der kunne kode for dette peptid i midten, og oligonukleotidproben, der er komplementær med denne mRNA-sekvens, nederst. Bemærk, at for alle aminosyrerester med undtagelse af Cys 17 og His 18 er oligonukleotidet kun komplementært med de mest hyppigt anvendte codoner i mammale kodende områder (Grantham et al., 1981, supra). For Cys 17 er sekvensen komple-10 mentær med begge codoner. For His 18 er oligonukleotidet komplementært med det mindre hyppige CAU-codon. Det blev anset for usandsynligt, at CAC-codonet ville blive anvendt, idet det, sammen med nabo-Gly-codonet, ville frembringe det sjældne CpG-dinukleotid (Swartz et al., 1962 supra).

15 Figur 9: er en grafisk gengivelse, der viser trin 4 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: identifikationen af LIF-cDNA ved hybridisering med det i figur 8 illustrerede oligonukleotid.

Figur 10: er en gengivelse af trin 5 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: nukleo-20 tidsekvens af cDNA-klon pLIF7,2b og LIF-aminosyresekvens. Sekvensen af den mRNA-synonyme streng af cDNA'et er betegnet 5' til 3' med den oven for angivne forudsagte aminosyresekvenser af LIF; tal ved linieendeme angiver slutrestens position (aminosyre eller nukleotid) på den linie. Aminosyre-sekvensen er nummeret fortløbende fra den første rest, der er indkodet i 25 denne klon. Aminosyresekvensområder, der er bestemt ved analyse af proteinet, er overstreget; der er ingen uoverensstemmelser mellem de to. Pro 9 var den N-terminale rest, der blev bestemt ved direkte aminosyresekvens-analyse (eksempel 2). Syv potentielle N-bundne glycosyleringssteder (Neu-berger et al., 1972, supra) er angivet med stjerner, og fire potentielle O-30 bundne glycosyleringssteder (Takahashi et al., 1984, supra) med skravering.

Figur 11: er en gengivelse, der viser trin 1 af ekspressionen af murin LIF i gærceller: C-terminal aminosyresekvens af LIF. Aminosyresekvensen ved C-terminalen af pLIF7,2b-læserammen er vist oven for sekvensen af en 35 Staphylococcus V8-protease og et tryptisk peptid afledt fra LIF oprenset fra DK 174970 B1 4 4 • i

Krebs ascites-tumorceller. Bemærk, at disse sidstnævnte peptider forlænger pLIF7,2b LIF-sekvensen med 9 aminosyrer og terminerer ved samme rest. Nukleotidet og aminsyresekvensen ved det korresponderende område af klon pLIFNKI er vist ved den nederste linie, hvilket bekræfter den ved direkte 5 aminosyresekventering tildelte C-terminal. Nummereringssystemet er som i figur 10.

Figur 12: er en gengivelse, der viser trin 2 af ekspressionen af murin LIF i gærceller: rekonstruktion af pLIF7,2b-cDNA til insertion i gærekspressions-10 vektoren, Yepsed. Partiel nukleotidsekvens af pLIF7,2b-cDNA'et og dets indkodede aminosyresekvens er vist på den øverste linie. Nummerering er ifølge figur 10 og 11. Anden og tredje linie viser sekvensen af pLIFmutl henholdsvis pLIFmut2. Stjerner viser stopcodoner. Der er vist restriktionssteder (Bam HI, Hind III og Eco R1) anvendt til kloning i Yepsed (Baldari, 1987, 15 supra) og pGEX-2T (Smith and Johnson, 1988, supra). Den nederste linie viser partiel sekvens af K. lactis-dræbertoxinsiqnalsekvensen i Yepsed. Sekvensen Gly-Ser, der er indkodet ved Barn Hl-restriktionsstedet, genkendes effektivt af signalpeptidase (Baldari et al., 1987, supra).

20 Fiaur 13: er en grafisk gengivelse, der viser ekspression af murin LIF i gærceller den biologiske aktivitet af gærafledt rekombinant LIF i kulturer af M1 leukæmiceller. Titrering i M1-kulturer af gærafledt rekombinant LIF (·· -) versus oprenset nativ LIF-A (-o-) med lignende koncentrationsafhængig induktion af differentiering i M1-kolonier (panel A) og undertrykkelse af koloni-25 dannelse (panel B). Hvert punkt repræsenterer middelværdien fra dobbeltkulturer.

Figur 14: er en grafisk gengivelse, der viser ekspression af murin LIF i gærceller: evnen hos forskellige fortyndinger af autentisk nativ murin LIF-A (-o-), 30 konditioneret medium fra gærceller indeholdende LIFmutl/Yepsed - rekombinanten induceret med galactose (· -) og konditioneret medium fra samme gærceller, men ikke induceret med galactose (-+-) til at konkurrere om bindingen af nativ 125|_yp_A til cellulære receptorer på murine bughindeceller.

35 DK 174970 B1 12

Figur 15A og 15B: er gengivelser, der viser trin 1 af den i eksempel 6 beskrevne metode. Nukleotidsekvensen af cDNA-delen af klon pLIFNK3. Nu-kleotidsekvensen af den mRNA-synonyme streng er vist i 5 - til 3-orienter-ingen med den oven for angivne udledte aminosyresekvens af LIF. Den tidli-5 gere bestemte N-terminale aminosyrerest er vist som +1. Eco R1-stedet ved 5'-enden af cDNA'et og Xba 1-stedet, det spænder over stopcodonet (anvendt i insertion af det LIF-kodende område i pMP-Zen i trin 2) er vist.

Fiour 16: er en gengivelse, der viser trin 1 af den i eksempel 7 beskrevne 10 metode. Nukleotidsekvensen ved glutathion S-transferase/thrombin- kløvningssted/LIF-forbindelsen i plasmid pGEX-2T/LIF og sekvensen ved forbindelsen af det indkodede fusionsprotein. C-Terminalen af glutathion S-transferase, thrombinkløvningsstedet og N-terminalen af de murine LIF-dele af det tredelte fusionsprotein sammen med den nukleotidsekvens, der koder 15 for denne aminosyresekvens, er vist. Det forventede kløvningssted med thrombin er vist ved en pil.

Fiour 17: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 1: hybridisering af muse DNA med en pLIF7,2b-afledt probe under høj- og lavstringensbetingelser.

20 BALB/c lever-DNA fordøjet med de angivne restriktionsenzymer blev probet for LIF-gensekvenser, som beskrevet i eksempel 8, trin 1.1 det venstre panel foregik hybridisering ved 65 °C i 2 x SSC, og slutvask ved 65°C i 0,2 x SSC. I det højre panel foregik både hybridisering og vask i 6 x SSC ved 65°C. I det venstre panel medtoges lineær pLIF7,2b-plasmid DNA (5,6 kb) i en mængde, 25 der er ækvivalent med 10 og 1 kopier pr. haploid musegenom (400 pg henholdsvis 40 pg), idet der antages en molekylvægt for det haploide musegen på 3 x 10^ bp (Laird, 1971, supra). Størrelserne af de hybridiserende ge-nomfragmenter er vist.

30 Figur 18: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 2: hybridisering af muse DNA kløvet med forskellige restriktionsendonukleaser, alene og i parvise kombinationer, med en muse LIF-probe. Fordøjede DNA'er blev elektroforer-et på 0,8% w/v agarosegeler og hybridiseret med pLIF7,2b cDNA-frag mentet som beskrevet i eksempel 8, trin 1, under højstringensbetingelser.

35 DK 174970 B1 13

Figur 19: er en skematisk gengivelse, der viser trin 2: restriktionsendo-nukleasekløvningskort af det murine LIF-gen. Det kromosomale DNA-område, der indeholder korresponderende sekvenser til cDNA-klonen pLIF7,2b er angivet ved indramning. De oven for (Eco R5) og neden for (Xba 5 I, Barn Hl, Pst I og Stu I) centrallinien angivne restriktionssteder er blevet orienteret i forhold til centrallinien. Den relative lokalisering af steder inden for komplekset under linien er som vist.

Figur 20: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 3: kromosomal fastlæg-10 gelse af det murine LIF-gen. I spor 1 blev BALB/c museembryo-DNA elektro-foreret, i spor 2, DNA fra ovarieceller fra kinesisk hamster, og i spor 3-8 DNA fra de hybridiserede kloner 1-18A HAT, l-18A-2a-8AG; EBS 58; EBS 18; EBS 4; og l-13A-1a-8AG (Cory et al., 1983, supra). Indholdet af murint kromosom i disse hybrider er angivet i Cory et al, 1983, supra. Alle DNA'er blev fordøjet 15 med Barn Hl. Positionen af 3 kbp Barn Hl-fragmentet, der bærer det murine LIF-gen, er vist.

Figur 21: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 2 af den i eksempel 9 beskrevne metode: hybridisering af 32P-mærket fragment af cDNA fra klon 20 pLIF7,2b under forskellige betingelser til genomt DNA af både murin og human oprindelse. I hvert tilfælde indeholder spor 115 pg murin (LB3) DNA, og spor 2 og 3 indeholder 15 pg human DNA (fra cellelinierne Raji henholdsvis Ramos). De til hvert filter anvendte hybridiserings- og vaskebetingelser er beskrevet i trin 2. Eco Rl-fragmentet på ca. 10 kbp indeholdende det murine 25 LIF-gen og Eco Rl-fragmentet på ca. 9 kbp indeholdende den humane homolog er angivet ved pile. Molekylvægtstandarder er angivet til venstre. To forskellige autoradiografiske eksponeringer (16 timer og 62 timer) er vist.

9

Figur 22: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 1 af kloningen af det hu-30 mane LIF-gen: påvisning af LIF-genet ved Southern blot-hybridisering under anvendelse af en muse LIF-cDNA-probe. Genomisk DNA fra den humane cellelinie RAMOS blev fordøjet med de viste restriktionsendonukleaser og hybridiseret under de i eksempel 19, trin 1, beskrevne betingelser med et muse cDNA-fragment afledt fra pLIF7,2b.

35 14 DK 174970 B1

Figur 23: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 1 af kloningen af det humane LIF-gen: påvisning af LIF-genet ved Southern blot-hybridisering under anvendelse af en muse-LIF cDNA-probe under et udvalg af hybridiserings-betingelser. Genomisk DNA fra den humane cellelinie RAMOS (H) eller mu-5 selever DNA (M) fordøjet med restriktionsendonuklease Barn Hl blev hybridiseret med en murin LIF cDNA-probe (pLIF7,2b) under et udvalg af hybridiserings- og vaskebetingelser. De til hybridisering anvendte temperaturer og SSC-koncentrationer er vist på den øverste linie, og vaskebetingelserne på den anden linie (se eksempel 10, trin 1).

10

Figur 24: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 2 af kloningen af det humane LIF-gen: restriktionsendonukleasekløvning af tre mulige LIF-genkloner.

1 pg DNA fra λ-fag af klonerne AHGLIFI, AHGLIF2 og AHGLIF3 blev fordøjet med Sa[ I, Barn Hl eller Pst I, elektroforeret på 0,8% w/v agarosegel (venstre 15 panel), overført til nitrocellulose og hybridiseret (som tidligere beskrevet) med pLIF7,2b cDNA. De hybridiserende fragmenters omtrentlige størrelser er vist.

Figur 25A-25C: er gengivelser, der viser trin 3 af kloningen af det humane LIF-gen: nukleotidsekvensen af den mRNA-synonyme streng af et 1,3 kbp-20 segment af AHGLIF1, der spænder over det humane LIF-gen (H), er præsenteret i 5'- til 3'-orientering. Den korresponderende nukleotidsekvens af det murine LIF-mRNA (M) afledt fra cDNA-kloneme pLIF7,2b, pLIFNKI og pLIFNK3, er opstillet neden under det humane gen og angivet med små bogstaver. Identitet mellem muse- og humansekvenseme er vist ved stjerner.

25 Den formodede N-terminale rest af moden human LIF, ved analogi med muse-LIF, er betegnet som +1.

Figur 26A οα 26B: er gengivelser, der viser trin 3 af kloningen af det humane LIF-gen: aminosyresekvens af human LIF og sammenligning med muse-LIF.

30 Aminosyresekvensen af moden murin LIF (M) som bestemt ved direkte ami-nosyresekventering og analyse af cDNA-klonerne pLIF7,2b, pLIFNKI og pLIFNK3 er anført på den øverste linie med den korresponderende sekvens af human LIF (H), som afledt fra sekvensen af AHGLIF1 anført nedenunder. Identiteter er vist med stiplinger, forskelle er vist ved angivelse af amino-35 syren.

15 DK 174970 B1

Figur 27: er en skematisk gengivelse, der viser trin 4 af kloningen af det humane LIF-gen: restriktionsendonukleasekløvningskort af det humane LIF-gen. Exonerne af det med pLIF7,2b (figur 25) homologe humane gen er vist 5 som indramninger. Genets transkriptionsretning er vist med pilen under linien.

Figur 28: er en gengivelse, der viser trin 1: oligonukleotider anvendt til modifikation af det humane LIF-gen til inkorporering i Yepsecl. Oligonukleotid (a) 10 svarer til 5-enden af det kodende område (rester 31 - 69 i figur 25). Oligonukleotid (b) svarer til midten af det kodende område (rester 16 -186 og 880 - 903 i figur 25). Den del af dette oligonukleotid, der er komplementær med exon 1, er understreget med stiplinger og den, der er komplementær med exon 2, med prikker. Oligonukleotid (c) svarer til 3'-enden af det kodende 15 område (fra position 1279 i figur 25). Oligonukleotideme (a) og (b) introducerer de viste restriktionsendonukleasekløvningssteder.

Fiour 29A οο 29B: er gengivelser, der viser a trin 1: nukleotidsekvens af og aminosyresekvens indkodet af det syntetiske humane LIF cDNA afledt ved 20 mutagenese af det klonede humane LIF-gen. Barn Hl- og Hind I Il-kløvningsstederne, der er introduceret af oligonukleotideme (a) og (c) (figur 28) er vist.

Den formodede N-terminale aminosyre af moden LIF (ved analogi med musen) betegnes som +1.

25 Figur 30: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3: induktion af differentiering i kolonier af M1-leukæmiceller ved fortyndinger af oprenset nativ murin LIF (o-------o) og konditioneret medium fra gærceller indeholdende Yepsecl/HLIF-rekombinanten induceret med galactose ^_· ). Medium fra uinducerede gærkulturer indeholdende Yepsed/HLIF-rekombinanten 30 (o_o) var inaktivt. Der vises gennemsnitsdata fra gentagne 7-dages kulturer.

Figur 31: er en grafisk gengivelse, der viser trin 4: konkurrence mellem gærafledt HLIF og nativ murin 125I-LIF om binding til specifikke receptorer på mu-35 rine M1 -celler. Fortyndinger af autentisk nativ murin LIF-A (eksempel 1) 16 DK 174970 B1 (o_o), rekombinant murin LIF ^_· )og konditioneret medium fra gærceller indeholdende Yepsec1/HLIF-konstruktionen, uinduceret (_) og induceret med galactose (□_□) blev afprøvet for evne til at konkurrere om binding af nativ 125I-LIF-A til cellulære receptorer på murine 5 M1-celler ved 37°C, som tidligere beskrevet.

Figur 32: er en grafisk gengivelse, der viser trin 2 af identifikationen af en formodet human LIF: evnen hos forskellige fortyndinger af medium konditioneret med den humane blærecarcinomacellelinie 5637 (ATCC nr. HTB9)

10 (- o -) rå eller (- + -) ikke-bindende DEAE-fraktion eller af nativ murin LIF-A

(- o -) til at konkurrere om bindingen af murin 1^^I-LIF-A til cellulære receptorer på murine bughindeceller. Den manglende evne hos human G-SCF (- -) til at konkurrere om binding er også vist (ufortyndet = 5 pg/ml).

15 Figur 33: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3 af identifikationen af en formodet human LIF: fraktioneringen af medium konditioneret med den humane blærecarcinomacellelinie 5637 på en DEAE-Sepharose CL-6B-søjle, elueret nøjagtigt som for den tidligere beskrevne fraktionering af murin LIF-A (eksempel 1), og evnen hos individuelle fraktioner fra denne fraktionering til 20 at inducere dannelsen af differentierede murine M1-cellekolonier. Panel A viser saltgradienten; Panel B viser fraktioneringen af 5637-konditioneret medium; Panel C viser fraktioneringen af Krebs ll-celle-konditioneret medium til sammenligning.

25 Fig. 34: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3 af identifikationen af en formodet human LIF: Fraktioneringen af medium konditioneret med den humane blærecarcinomacellelinie 5637 på en søjle af linse-lectin-Sepharose 4B; elueret som tidligere beskrevet for fraktioneringen af murin LIF-A (eksempel 1), og evnen hos individuelle fraktioner fra denne fraktionering til at inducere 30 dannelse af differentierede kolonier af murine M1 -cellekolonier. Panel A viser gradienten af a-methyl-DO-mannopyrannosid; Panel B viser fraktioneringen af 5637-konditioneret medium; og Panel C viser fraktioneringen af Krebs ll-celle-konditioneret medium til sammenligning.

Eksempel 1 17 DK 174970 B1

De ledsagende figurer 1-5 angår forskellige trin af den nedenfor beskrevne oprensningsmetode, der viser, hvor LIF forenes i hvert fraktioneringstrin og 5 som giver bevis for dets renhed. I figurerne:

Figur 1: er en grafisk gengivelse, der viser trin 2 af oprensningen af LIF på DEAE-Sepharose CL-6B. Det vandrette liniestykke viser, hvilke fraktioner der blev opsamlet til oprensningstrinnet i trin 3.

10

Figur 2: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3 af oprensningen af LIF på Linse-lectin Sepharose 4B. Det vandrette liniestykke viser, hvilke fraktioner der blev opsamlet til oprensningstrinnet i trin 4.

15 Figur 3: er en grafisk gengivelse, der viser trin 4 af oprensningen af LIF på CM-Sepharose CL-6B. Det vandrette liniestykke viser, hvilke fraktioner der blev opsamlet til oprensningstrinnet i trin 5.

Figur 4: er en grafisk gengivelse, der viser trin 5 af oprensningen af LIF på 20 en fedtsyreanalyse HPLC-søjle. Det vandrette liniestykke indikerer, at der blev opsamlet fraktioner på 39,6-41,3 % v/v acetonitril.

Figur 5: er en grafisk gengivelse, der viser molekylvægten og renheden af oprenset LIF. Det øvre panel viser migrering af proteinstandarder (93.000, 25 67.000, 43.000, 30.000, 20.000 og 14.000 molekylvægt) og oprenset LIF (2 præparationer) på 8-25 % w/w polyacrylamid SDS-gel. Proteinet og biologisk aktivitet er begge forbundet med et protein med molekylvægt 58.000.

Trin 1 30

Krebs ll-tumorceller (1 x 6®) injiceres intraperitonealt i C57B16/6fj/WEHI mus og efter 7 dage aflives musene og den peritoneale væske fjernes. Cellerne centrifugeres, resuspenderes ved 5x10® celler/ml i Dulbeccos modificerede Eagles medium indeholdende E. coli lipopolysaccharid (200ng/ml) og inkube- 18 DK 174970 B1 res i 24 timer ved 37°C i en fugtet inkubator indeholdende 10% CO2 i luft.

Cellerne centrifugeres igen, det konditionerede medium fjernes, suppleres op til 0,02% (vægt/volumen) natriumazid og opbevares ved 4°C. 36 I Konditioneret medium koncentreres til 100 ml under anvendelse af en HIP10-8 hulfi-5 berpatron i en Amicon DC2A koncentrator, ombyttet i 10mM Tris-HCI-puffer Ph 8,0 indeholdende 1mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), natriumazid (0,02% vægt/volumen) og Tween 20 (0,02% volumen/volumen) og rekon-centreret til 20 ml over en YM-10 membran i en omrørt Amicon-celle.

10 Trin 2

Koncentratet påføres en søjle (2,5 x 30 cm) af DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) ækvilibreret i samme puffer og elueret med 200 ml ækvilibre-ringspuffer fulgt af 400 ml lineær gradient til 0,3M NaCI i samme puffer.

15 Strømningshastigheden er 25 ml/time og 5,8 ml fraktioner opsamles og analyseres. (Se figur 1).

Trin 3 20 De proteinfraktioner, der ikke kunne bindes til gelen under prægradient-trinet og som indeholdt aktivitet på murine M1-celler, forenes, koncentreres over en YM-10-membran, udskiftes i 100 mM natriumacetatpuffer pH 6,0 indeholdende 1mM MgCtø,1mM PMSF, 0,2% natriumazid og 0,02% Tween 20 og påføres en søjle (1x4 cm) af linse-lectin-Sepharose 4B (Pharmacia) ækvilibreret 25 i samme puffer. Søjlen elueres med 25 ml ækvilibreringspuffer og herefter med en 100 ml lineær gradient til 0,5 m a-methyl-D-mannopyranosid i den samme puffer ved en strømningshastighed på 10 ml/time. Fraktioner på 3 ml opsamles og analyseres. (Se figur 2).

30 Trin 4

De proteinfraktioner, der bindes til gelen og elueres med sukkeret og har aktivitet på M1-celler, forenes, koncentreres og udskiftes i 100mM natriumacetatpuffer pH 5,0 indeholdende 1mM PMSF, 0,02% natriumazid og 0,02% 35 Tween 20 og påført en søjle (1,0 x 4,0 cm) af CM-Sepharose CL-6B (Phar- 19 DK 174970 B1 macia) ækvilibreret i samme puffer. Søjlen elueres med 25 ml ækvilibre-ringspuffer og herefter med en 100 ml lineær gradient til 1,0M NaCI i samme puffer og herefter med 25 ml 1,0M NaCI justeret med NaOH til pH 10. Strømningshastigheden er 2,0 ml/time og der opsamles 3,0 ml fraktioner. (Se figur 5 3).

Trin 5

De proteinfraktioner, der bindes til gelen og elueres med NaCI-gradienten og 10 har aktivitet på M1-celler forenes, koncentreres til 2 ml over en YM-10 membran og udskiftes i 20mM ammoniumacetatpuffer pH 5,0 indeholdende 0,02% Tween 20 og filtreres herefter gennem et 0,45 μ Millipore-filter. De forenede fraktioner påfyldes en injektor til et højtydende væskechromatogra-fisystem (Beckman) udstyret med en Waters fedtsyreanalysesøjle og dob-15 beltpumper med gradientprogrammering. Søjlen ækvilibreres i vand indeholdende 0,1% (volumen/volumen) trifluoredikkesyre (TFA), prøven injiceres og søjlen elueres herefter med en 5 minutter lineær gradient til 34,8% (volumen/volumen) acetonitril i vand og 0,1% TFA og elueres herefter med en 50 minutters lineær gradient til 49,8% (volumen/volumen) acetonitril i vand og 20 0,1% TFA. Strømningshastigheden er 1 ml/min. og der opsamles 1 ml frakti oner i polypropylenrør indeholdende 50 μΙ 100mM ammoniumbicarbonat og 0,4% Tween 20. (Se figur 4).

Fraktionerne med aktivitet på M1-celler fra trin 5 bestod af 2 overlappende 25 ultraviolet-absorberende toppe. Hver top var forbundet med aktivitet på M1-celler og hver top svarede til et enkelt proteinbånd med Mr 58.000 på na-triumdodecylsulfatpolyacrylamidgeler under anvendelse af sølvfarvning. I hvert tilfælde indeholdt proteinbåndet med Mr 58.000 den biologiske aktivitet på M1-celler som fastsat ved skæring af et parallelspor på gelen (også ladet 30 med LIF) til 1 mm strimler, ekstrahere proteinet fra gelstrimlerne og analysere det ekstraherede protein for dets evne til at undertrykke formering og inducere differentiering i M1-celler i semi-faste agarkulturer. (Se figur 5).

Eksempel 2 20 DK 174970 B1 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til opnåelse af den N-terminale aminosyresekvens og aminosyresekvenser af forskellige peptider, 5 der er frembragt ved proteolytisk kløvning med trypsin eller Staphylococcus V8 protease.

LIF, der var oprenset ved proceduren ifølge eksempel 1 (15 pg) påførtes en mikrobore (2 mm) sølje pakket med Brownlee RP300 perler (C8) og eluere-10 des på et HPLC-system med en lineær gradient på fra 0-60% acetonitril i 0,1% trifluoredikkesyre. Proteinet elueredes som en enkelt top i et volumen på 100 μΙ. Dette påførtes en glasfiberskive og fik lov til at tørre og blev herefter placeret i sekvenseringskammeret i et Applied Biosystem (Model 470A) gasfaseproteinsekvenseringsapparat. Proteinet blev sekventeret ved Edman-15 kemi og phenylthiohydantoinderivateme af de individuelle aminosyrer blev identificeret ved HPLC på et Applied Biosystems 120A PTH-analyse-ringsapparat.

En separat prøvemængde af LIF (20 pg), der også var oprenset ved før-20 nævnte procedure, fortyndedes til 2 ml i 6m guanidinhydrochlorid, 0,2M Tris-HCI puffer pH 8,5, 2mM dithiothreitol og blev inkuberet ved 37°C i 2 timer. Herefter tilsattes et 30 gange molært overskud af iodedikkesyre og opløsningen inkuberedes ved 37°C i yderligere 15 minutter. Opløsningen påsattes samme mikrobore HPLC-søjle og blev elueret som beskrevet ovenfor. Det 25 reducerede og carboxymethylerede derivat af LIF (RCM-LIF) elueredes 3 minutter senere fra søjlen end det ubehandlede LIF og RCM-LIF (200 μΙ) fortyndedes til 1 ml med 0,1 M Tris HCI-puffer pH 8,0 indeholdende 0,02%

Tween 20, 1mM CaCl2 og 2 pg TPCK-behandlet trypsin. Denne inkubering fik lov til at foregå i 18 timer ved 37°C og blandingen blev herefter igen påført 30 mikroboresøjlen og elueret på samme måde som beskrevet ovenfor. Individuelle peptider fremkom som UV-absorberende toppe og blev opsamlet individuelt. Nogle af disse peptider blev sekventeret direkte som beskrevet ovenfor, medens andre blev genoprenset på samme søjle, men under anvendelse af en 0-60% acetonitrilgradient i 0,9% NaCI pH 6,0 før sekventeringen.

35 21 DK 174970 B1

En anden prøvemængde af RCM-LIF (200 pi = 10 pg) fortyndedes til 1 ml med 0.05M natriumphosphatpuffer, pH 7,8 indeholdende 0.002M EDTA og 0,02% Tween 20 og blev fordøjet med 2 pg Staphylococcus aureus V8 protease i 18 timer ved 37°C. Reaktionsblandingen blev påført samme mikrobo-5 resøjle og elueredes som beskrevet ovenfor.

De 26 aminosyrer, der definerer LIF fra aminoterminalen i sekvens, fandtes at være: 10 N-Pro-Leu-Pro-lle-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-Ala-lle-Arg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-GIn-lle-Lys.

Aminosyresekvensen af adskillige tryptiske peptider fandtes at være: 15 1. His-Pro-Cys-His-Gly-AsnrLeu-Met-Asn-Gln-lle-Lys 2. Met-Val-Ala-Tyr...

3. Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys..

4. Leu-Gly-Cys-GIn-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys 5. Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-GIn-Val-Lys 20 6. Asn-GIn-Leu-Ala-GIn-Leu-X-Gly-Ser-Ala-Asn-Ala-Leu-Phe-Leu-Val-

Glu-Leu-Tyr....

7. Leu-Val-lle-Ser-Tyr...

8. Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-His-Ser-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-GIn.

25 9. Leu-X-Ala-Thr-lle-Asp-Val-Met-Arg.

10. Gln-Val-lle-Ser-Val-Val-X-GIn-Ala-Phe.

Aminosyresekvensen af et peptid frembragt ved fordøjelse af LIF med V8 proteasen var: 30

Ala-Phe-GIn-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-GIn-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys-GIn-Val-

Ile-Ser-Val-Val-Val-GIn-Ala-Phe.

Eksempel 3 22 DK 174970 B1 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til opnåelse af radioaktivt LIF-derivat og til identifikation af LIF-kilder ved en receptorkonkurrenceanalyse.

5

Ledsagende figur 6 angår eksempel 3: binding af radioioderet-ren LIF (ca. 2 x 10® cpm/ng) til M1-myeloidleukæmiceller ved 0°C, M1-celler (5 x 10®) inkuberedes med 125I-LIF (4x10® cpm) med eller uden konkurrende faktorer i 2 timer, hvorefter bundet radioaktivitet separeredes fra ubundet radioaktivitet 10 ved centrifugering gennem kalvefosterserum. A. Titrering af umærket ren LIF og ren Multi-CSF, GM-CSF, G-CSF eller M-CSF som konkurrende faktorer ved de viste fortyndinger (10 μΙ af hver fortynding sat til et slutvolumen på 80 M«).

15 De højeste koncentrationer af hver var 104 enheder/ml, 3,5 x 104 enhe-der/ml, 3 x 104 enheder/ml, 5 x 104 enheder/ml henholdsvis 4 x 104 enheder/ml. B. Evne af ren LIF eller lipopolysaccharid (LPS) eller koncentrerede (4-8-gange) medier konditioneret med forskellige celler eller serum fra indo-toxininjicerede mus til at konkurrere med 12®I-LIF om binding til M1 -celler 20 som ovenfor.

Oprenset LIF, fra Krebs ll-ascitescellekonditioneret medium som beskrevet i eksempel 1, blev radioaktivt mærket med ^ 2®l på tyrosinrester der, som beskrevet tidligere (Nicola, N.A., og Metcalf, D., J. Cell. Phvsiol. 128:180-188.

25 1986), producerer 12®I-LIF med en specifik radioaktivitet på 2 x 10® cpm/ng.

12®I-LIF Bundet specifikt til myeloide M1-leukæmiceller såvel som voksen murin knoglemarv, milt, thymus og bughindeexudatceller. Celleautoradiogra-fisk analyse viste, at 12®I-LIF blev specifikt bundet kun til makrofager og deres præcursorceller med stigende receptorantal med cellemodning og ikke 30 påviseligt med nogen som helst anden hæmopoietisk celletype. Dette antyder, at der kan være klinisk egnede anvendelser for LIF ved modulering af makrofagfunktion i et udvalg af sygdomstilstande. Den specifikke binding af ^2®I-LIF til myeloide M1-leukæmiceller eller til bughinde-makrofagpopulationer hæmmedes af umærket LIF, men ikke af et udvalg af 35 andre hæmopoietiske vækstfaktorer, herunder G-CSF, GM-CSF, M-CSF

23 DK 174970 B1 (CSF-1), Multi-CSF (interleukin 3), interleukiner 1, 2, 4, 6, endotoxiner eller andre vækstfaktorer (se f.eks figur 6). De cellekonditionerede mediers eller celleekstrakters evne til at hæmme bindingen af til sådanne celle populationer (radioreceptoranalyse for LIF) (figur 6B) tilvejebringer således 5 en specifik analyse for forekomst af UF-produktion eller lagring i forskellige celler og væv. F.eks. hæmmede et medium, der var konditioneret med lectin-aktiviterede LB3-T-celler stærkt specifik binding af 1^^I-LIF til M1-celler, og viste således, at LB3-celler producerer LIF.

10 Eksempel 4 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til opnåelse af en klonet komplementær DNA-kopi af det mRNA, der koder for murin LIF.

15 Ledsagende figurer 7 til 10 angår de forskellige trin af den nedenfor beskrevne metode. I figurerne:

Fiour 7: er en grafisk gengivelse, der viser trin 1 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: akkumuleringen af mRNA'er for hæmopoietiske vækstregulatorer i 20 cytoplasmaet af LB3-celler efter stimulering med lectinet concanavalin A. Cy-toplasmatisk polyadenyleret RNA (5 pg) fra WEHI-3B D'-celler (spor 1), T-celleklon LB3-celler dyrket ved 10®-celler/ml med 5 pg/ml concanavalin A i 5 timer (spor 2) og ustimulerede LB3-celler (spor 3) blev elektroforeret på for-maldehydagarosegeler, overført til nitrocellulose og hybridiseret med en 32p_ 25 GM-CSF-probe (panel a) eller en 32P-multi-CSF-probe (panel b) (se Kelso,

Metcalf og Gough, et al., 1986, supra).

Fiour 8: er en gengivelse, der viser trin 3 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: syntetisk oligonukleotid anvendt til identifikation af LIF-kloner. En del af ami-30 nosyresekvensen af murin LIF nær N-terminalen (rester 15-26, se eksempel 2) er vist på den øverste linie, de mulige kombinationer af mRNA-sekvenser, der kunne kode for dette peptid i midten, og oligonukleotidproben, der er komplementær med denne mRNA-sekvens, nederst. Bemærk, at for alle aminosyrerester med undtagelse af Cys 17 og His 18 er oligonukleotidet kun 35 komplementært med de mest hyppigt anvendte codoner i mammale kodende 24 DK 174970 B1 områder (Grantham et al., 1981, supra). For Cys 17 er sekvensen komplementær med begge codoner. For His 18 er oligonukleotidet komplementært med det mindre hyppige CAU-codon. Det blev anset for usandsynligt, at CAC-codonet ville blive anvendt, idet det, sammen med nabo-Gly-codonet, 5 ville frembringe det sjældne CpG-dinukleotid (Swartz et al., 1962 supra).

Figur 9: er en grafisk gengivelse, der viser trin 4 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: identifikationen af LIF-cDNA ved hybridisering med det i figur 8 illustrerede oligonukleotid.

10

Figur 10: er en gengivelse af trin 5 af kloningen af LIF-cDNA-kloner: nukleo-tidsekvens af cDNA-klon pLIF7,2b og LIF-aminosyresekvens. Sekvensen af den mRNA-synonyme streng af cDNA'et er betegnet 5' til 3' med den oven for angivne forudsagte aminosyresekvenser af LIF; tal ved linieenderne angi-15 ver slutrestens position (aminosyre eller nukleotid) på den linie. Aminosyre-sekvensen er nummeret fortløbende fra den første rest, der er indkodet i denne klon. Aminosyresekvensområder, der er bestemt ved analyse af proteinet, er overstreget; der er ingen uoverensstemmelser mellem de to. Pro 9 var den N-terminale rest, der blev bestemt ved direkte aminosyresekvens-20 analyse (eksempel 2). Syv potentielle N-bundne glycosyleringssteder (Neu-berger et al., 1972, supra) er angivet med stjerner, og fire potentielle O-bundne glycosyleringssteder (Takahashi et al., 1984, supra) med skravering.

Trin 1 25

Fremstilling af RNA. der indeholder LIF mRNA.

Celler af den klonede murine T-cellelinie LB3 (Kelso, A. og Metcalf, D., Exptl, Hematol.. 13:7-15, 1985) stimuleredes med lectinet concanavalin A i 6 timer 30 til forstærkning af akkumulationen i cytoplasmaet af mRNA'er, der koder for forskellige faktorer, der regulerer væksten og differentieringen af hæmopoie-tiske celler (Kelso, A., Metcalf, D. og Gough, N.M., J. Immunol. 136:1718-1725, 1986). (F.eks. viser figur 7 den forøgede produktion af mRNA'er, der koder for de hæmopoietiske vækstfaktorer GM-CSF og Multi-CSF i således 35 stimulerede celler). Cytoplasmatisk RNA blev fremstillet fra 5x10® concana- 25 DK 174970 B1 vaiin A-stimulerede LB3-celler under anvendelse af den tidligere beskrevne teknik (Gough, N.M., J. Mol. Biol. 165:683-699. 1983). Polyadenylerede mRNA-molekyler blev adskilt fra ribosomal RNA ved to omgange af chroma-tografi på oligo-dT-cellulose under anvendelse af standardprocedurer (Ma-5 niatis, T. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, New York, 1982).

Det blev efterfølgende fundet ved Northern Blot-analyse, at, i modsætning til mRNA'eme for GM-CSF og Multi-CSF, forekommer LIF mRNA'et konstitutivt i LB3-celler og dets rigelighed forøges ikke ved concanavalin A-stimulering 10 (Gearing, D.P. et al., EMBO J. 6:3995-4002,1987).

Trin 2

Syntese oa kloning af et bibliotek af LB3 cDNA-molekvler 15

Dobbeltstrengede DNA-kopier af det som ovenfor beskrevet fremstillede LB3 mRNA blev syntetiseret ved standardprocedurer (Maniatis, T. et al.. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, New York, 1982 og Gough, N.M. et al., Nature 309:763-767. 1984). I korthed anvendes 10 pg cytoplasmatisk polyade-20 nyleret LB3 mRNA som en template for syntese af enkeltstrenget komplementært DNA (cDNA) i en reaktion, der var katalyseret af aviær myeloblasto-sisvirus-reverstranskriptase og under anvendelse af oligo-dT som primer.

Efter fuldendelse af denne reaktion blev mRNA'et nedbrudt ved inkubering ved 65 °C i 1 time i 0,3 M NaOH, 1 mM EDTA. Efter neutralisering af basen 25 og genvinding af cDNA'et ved ethanolpræcipitation konverteredes det enkelt-strengede cDNA til dupleksform i en reaktion, der var katalyseret af Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I. cDNA'ets "håmåle’-struktur blev herefter kløvet ved behandling med den enkeltstrengspecifikke nuklease S1 og herefter påsattes ender af deoxycytidinrester (restlængde ca. 20-30) til 30 hver ende af det dobbeltstrengede cDNA under anvendelse af enzymet terminal deoxynukleotidyltransferase som beskrevet (Michelson, A.M. og Orkin, S., J. Biol. Chem. 257:14773-14782. 1982). cDNA'et Med dC-ender fraktioneredes ved elektroforese på en 1,5% agarosegel og molekyler større end 500 bp's længde blev genvundet og hybridiseret til et plasmid DNA-molekyle 35 (pJL3, Gough, N.M. et al., EMBO J. 4:645-653, 1984), der var blevet kløvet 26 DK 174970 B1 med restriktionsendonukleasen Sac 1 og hvortil ender af deoxyguanosin-rester var blevet hæftet (Michelson, A.M. og Orkin, J., J. Biol. Chem.. 257:14773-14782. 1982). cDNA'et Og plasmidmolekyleme med påsatte ender hybridiseredes som beskrevet (Gough, N.M. et al., Biochemistry.

5 19:2702-2710, 1980) og E. coli MC1061 (Casadaban, M. og Cohen, S., J.

Mol. Biol.. 138:179-207. 1980) blev transformeret med den hybridiserede cDNA/plasmidblanding og ca. 50.000 uafhængigt transformerede bakteriekolonier selekteredes ved vækst på agarplader indeholdende 10 pg/ml ampicillin. De transformerede bakteriekolonier fjernedes fra agarplademe ved 10 vask med flydende vækstmedium indeholdende 50 pg/ml ampicillin og opbevaredes som 10 uafhængige puljer i 10% glycerol ved -70°C.

Trin 3 15 Konstruktion af oliaonukleotidprober

Der er blevet bestemt en sekvens på 26 aminosyrer ved aminoterminalen af LIF og rester fra 11 forskellige peptider, der er afledt ved fordøjelse af LIF med trypsin og V8-protease (se eksempel 2). Disse aminosyresekvenser til-20 vejebragte basis for konstruktion af komplementære oligonukleotider til visse definerede områder af det mRNA, der koder for LIF, til anvendelse som hybrid iseringsprober til identifikation af korresponderende cDNA-kloner til LIF-mRNA.

25 Hver naturligt forekommende aminosyre er indkodet i dens korresponderende mRNA ved en specifik kombination af 3 ribonukleotidtriphosphater (et codon) (f.eks. Watson, J., Molecular Biology of the Gene. 3. udg., Benja-min/Cummings, Menlo Park, Calif., 1976). Visse aminosyrer er kun specificeret ved et codon, medens andre er specificeret ved op til 6 forskellige codo-30 ner (f.eks. Watson, J., Molecular Biology of the Gene, supra). Idet et stort antal forskellige kombinationer af nukleotidsekvenser derfor faktisk kan kode for en hvilken som helst bestemt aminosyresekvens, er det nødvendigt, at konstruere et stort antal forskellige degenererede oligonukleotider, for at tage højde for enhver mulig sekvens, der potentielt koder for det peptid. Der er 35 imidlertid visse tekniske begrænsninger i anvendelsen af stærkt degenerere- DK 174970 B1 Λ ^ Z/ de oligonukleotider som hybridiseringsprober. Men idet ikke alle codoner for en given aminosyre anvendes med lige stor hyppighed (Grantham, R. et al.,

Nucleic Acids Res. 9:43-73, 1981) og idét CpG dinukleotidet i det mammale genom er underrepræsenteret, forekommer med kun 20-25% af den forven-5 tede frekvens af basesammensætning (Swartz, M.N. et al., J. Biol, Chem. 238:1961-1967. 1962), er det ofte muligt at forudsige den sandsynlige nu-kleotidsekvens, der koder for et givet peptid og dermed reducere kompleksi-citeten af en given oligonukleotidprobe. Under forudsætning af de foregående overvejelser blev der under anvendelse af standardprocedurer konstrueret 10 og syntetiseret et antal oligonukleotider, der svarer til forskellige LIF-peptider.

Trin 4

Screening af et LB3-cDNA-bibliotek for LIF-kodende kloner 15

Til screening af bakteriekolonier ved hybridisering med oligonukleotidprober dyrkedes 10.000-15.000 bakteriekolonier fra hver pulje af det førnævnte LB3-cDNA-bibliotek på agarplader (indeholdende 50 pg/ml ampicillin), overførtes til nitrocellulosefilterskiver og plasmid DNA blev forstærket ved inkubering af 20 filtrene på agarplader indeholdende 200 pg/ml chloramphenicol (Hanahan, D. og Meselson, M., Gene. 10:63-67, 1980). Efter gendyrkning af kolonier på den originale plade fremstilledes et andet nitrocellulosefilter som ovenfor.

Den originale plade blev gendyrket en anden gang og herefter opbevaret ved 4 °C. Plasmid DNA frigjortes fra bakteriekolonierne og blev fikseret til nitro-25 cellulosefiltrene som tidligere beskrevet (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, New York, 1982). Før hybridisering inkuberedes filtre i adskillige timer ved 37°C i 0,9 M NaCI, 0,09 M natriumcitrat, 0,2% Fi-coll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% bovinserumalbumin, 50 pg/ml varmede-natureret laksesperm DNA, 50 pg/ml E. coli tRNA, 0,1 M ATP og 2 mM na-30 triumpyrophosphat. Hybridisering udførtes i den samme opløsning, der yderligere indeholdt 0,1% NP40 ved 37°C i 18 timer. 500 ng Af det i figur 8 viste syntetiske oligonukleotid blev mærket radioaktivt i en reaktion, der var katalyseret af polynukleotidkinase og som indeholdt 500 pCi af [γ-32ρ]ΑΤΡ (specifik aktivitet 2.000-3.000 Ci/mmol). Uinkorporeret [γ -32P]ATP frasepareres 35 herefter det radioaktivt mærkede oligonukleotid ved ionbytningschromatografi 28 DK 174970 B1 på en NACS-PREPAC-søjle (Bethesda Research Laboratories) ifølge fremstillerens instruktioner. Det radioaktivt mærkede oligonukleotid blev medtaget i hybridiseringsreaktionen i en koncentration på ca. 20 ng/ml. Efter hybridise-ring blev filtrene vasket omhyggeligt i 0,9M NaCI, 0,09M natriumcitrat, 0,1% 5 natriumdodecylsulfat ved forskellige temperaturer (som nedenfor beskrevet) og blev efter hver vask autoradiograferet.

Rationalet bag udførelsen af successive vaskerunder var, at ved lavere temperaturer ville alle kloner med selv en lille homologigrad med oligonukleotidet 10 (så lidt som ca. 15 nukleotider) blive afsløret som autoradiografiske pletter, der fremkom på dobbelte filtre. Idet temperaturen forøges, ville oligonukleo-tidproben blive smeltet fra kloneme med det laveste homologiniveau og de korresponderende autoradiografiske signaler ville således være tabt. Kloner med den højeste homologigrad (og dermed kloner, der repræsenterer de 15 bedste kandidater for indhold af LIF-cDNA-sekvenser) vil bibeholde hybridi-sering ved den højeste temperatur. Ved denne strategi er det således muligt at fokusere direkte på de stærkeste kandidatkloner. Figur 9 viser et sæt af kloners ydelse på et dobbelt filterpar indeholdende 15.000 LB3-cDNA-kloner, idet vasketemperaturen blev forøget fra 46°C til 66°C. Adskillige kloner bibe-20 holdt kun hybridisering til oligonukleotidet ved lavere temperaturer, medens adskillige bibeholdt hybridisering selv ved 66°C (f.eks. klon 1 og 2). Sidstnævnte kloner selekteredes således til yderligere analyse, og de korresponderende bakteriekolonier blev fjernet fra de oprindelige plader og oprenset, og plasmid-DNA blev fremstillet fra hver bakterieklon ved standardprocedurer 25 (Maniatis, T. et al. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, 1982). Præliminær strukturanalyse af disse kloner (ved fastsættelse af størrelsen af det indsatte cDNA ved kortlægning af kløvningsstedslokaliseringeme for forskellige restriktionsendonukleaser og ved at teste for hybridisering med forskellige oligonukleotider, der svarer til forskellige LIF-peptider) viste, at hver af disse 30 kloner faktisk var identiske; dvs., at de repræsenterede forskellige isolater af samme oprindelige kloningsbegivenhed. Således blev der udført yderligere detaljeret analyse på kun én klon, pLIF7,2b.

29 DK 174970 B1

Trin 5

Bestemmelse af pLIF7.2b-nukleotidsekvensen 5 Nukleotidsekvensanalyse af cDNA-delen af klon pLIF7,2b udførtes ved di-deoxykædetermineringsmetoden (Sanger, F. et al., Proc.Natl.Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) under anvendelse af base- eller varmedenatureret dobbeltstrenget plasmid-DNA som template, et udvalg af oligonukleotider, der var komplementære med både de områder af vektoren, (pJL3), der flankerer 10 cDNA'et, og med sekvenser inden for cDNA-insertionet som primere og under anvendelse af både Klenow-fragmentet af E. coli-DNA-polvmerase I og aviær myeloblastosisvirus-reverstranskriptase som polymeraser i sekvente-ringsreaktioneme. Den således bestemte sekvens for cDNA-delen af klon pLIF7,2b vises i figur 10. Denne analyse bekræftede, at denne klon faktisk 15 indeholder en DNA-kopi af et mRNA med kapacitet til at kode for LIF-molekylet, idet der inden for den eneste translationale læseramme, der spænder over hele cDNA'et uafbrudt af stopcodoner, kan findes alle de tidligere for forskellige peptider af LIF-molekylet bestemte aminosyresekvenser.

Denne klon indeholder imidlertid ikke en fuldstændig kopi af det LIF-kodende 20 område, idet (a) det ikke strækker sig over 5-enden gennem et område, der koder for en formodet hydrofob ledersekvens, der initieres af et methioninco-don, og (b) det omfatter ikke ved dets 3-ende et translationelt stopcodon inden for læserammen. Det strækker sig imidlertid over 5'-enden forbi starten af det område, der koder for det modne protein, som bestemt ved sammen-25 ligning med den tidligere bestemte amino-terminale aminosyresekvens (rest Pro 9 i figur 10).

Eksempel 5 30 Følgende beskriver de anvendte trin til konstruktion af en hel-længde kopi af det murine LIF-kodende område til installering af dette kodende område i en gærekspressionsvektor og til at producere murin LIF.

De ledsagende figurer angår forskellige trin af ovenfor beskrevne metode. I 35 figurerne: 30 DK 174970 B1

Figur 11: er en gengivelse, der viser trin 1 af ekspressionen af murin LIF i gærceller: C-terminal aminosyresekvens af LIF. Aminosyresekvensen ved C-terminalen af pLIF7,2b-læserammen er vist oven for sekvensen af en 5 Staphylococcus V8-protease og et tryptisk peptid afledt fra LIF oprenset fra Krebs ascites-tumorceller. Bemærk, at disse sidstnævnte peptider forlænger pLIF7,2b LIF-sekvensen med 9 aminosyrer og terminerer ved samme rest. Nukleotidet og aminsyresekvensen ved det korresponderende område af klon pLIFNKI er vist ved den nederste linie, hvilket bekræfter den ved direkte 10 aminosyresekventering tildelte C-terminal. Nummereringssystemet er som i figur 10.

Figur 12: er en gengivelse, der viser trin 2 af ekspressionen af murin LIF i gærcellen rekonstruktion af pLIF7,2b-cDNA til insertion i gærekspressions-15 vektoren, Yepsecl. Partiel nukleotidsekvens af pLIF7,2b-cDNA’et og dets indkodede aminosyresekvens er vist på den øverste linie. Nummerering er ifølge figur 10 og 11. Anden og tredje linie viser sekvensen af pLIFmutl henholdsvis pLIFmut2. Stjerner viser stopcodoner. Der er vist restriktionssteder (Bam HI, Hind ill og Eco R1) anvendt til kloning i Yepsed (Baldari, 1987, 20 supra) og pGEX-2T (Smith and Johnson, 1988, supra). Den nederste linie viser partiel sekvens af K. lactis-dræbertoxinsignalsekvensen i Yepsecl. Sekvensen Gly-Ser, der er indkodet ved Barn Hl-restriktionsstedet, genkendes effektivt af signalpeptidase (Baldari et al., 1987, supra).

25 Figur 13: er en grafisk gengivelse, der viser ekspression af murin LIF i gærceller: den biologiske aktivitet af gærafledt rekombinant LIF i kulturer af M1 leukæmiceller. Titrering i M1-kulturer af gærafledt rekombinant LIF (· -) versus oprenset nativ LIF-A (-o-) med lignende koncentrationsafhængig induktion af differentiering i M1-kolonier (panel A) og undertrykkelse af koloni-30 dannelse (panel B). Hvert punkt repræsenterer middelværdien fra dobbeltkulturer.

Figur 14: er en grafisk gengivelse, der viser ekspression af murin LIF i gærceller: evnen hos forskellige fortyndinger af autentisk nativ murin LIF-A (-o-), 35 konditioneret medium fra gærceller indeholdende LlFmutl/Yepsed- 31 DK 174970 B1 rekombinanten induceret med galactose (·· -) og konditioneret medium fra samme gærceller, men ikke induceret med galactose (-+-) til at konkurrere om bindingen af nativ jj| cellulære receptorer på murine bughinde celler.

5

Trin 1

Bestemmelse af aminosvresekvensen ved C-terminalen af murin UF

10 cDNA-Klonen pLIF7,2b i eksempel 4 indeholder en ufuldstændig kopi af murin LIF-mRNA. Ved 5-enden koder cDNA’et for 8-aminosyrerester N-terminalt for den første rest bestemt ved N-terminalaminosyresekvensanalyse (Pro 9 i figur 10). Ved 3'-enden er pLIF7,2b imidlertid ufuldstændig, idet det ikke indeholder et translationelt stopcodon inden for læserammen. Inspektion af to 15 LIF-peptiders aminosyresekvens, som bestemt ved direkte aminosyrese-kventering (eksempel 2), antydede, at pLIF7,2b kun manglede 27 nukleotider af det kodende område ved 3-enden. Som illustreret i figur 11 startede et V8-afledt peptid ved rest Ala 162 af cDNA-sekvensen og strakte sig over den fra cDNA-klonen afledte aminosyresekvens med 9 aminosyrerester. Et inden for 20 V8-peptidet indeholdt tryptisk peptid terminerede ved samme rest, hvilket antyder, at Phe 187 er proteinets C-terminale rest. For at bekræfte denne konklusion isoleredes en LIF-cDNA-klon, der overlapper med pLIF7,2b og strækker sig i retning af 3’, og underkastedes nukleotidsekvensanalyse.

25 For at konstruere og screene et passende cDNA-bibliotek, hvorfra der kan isoleres en sådan klon, screenedes en serie forskellige mRNA-prøver ved Northern blot-hybridisering for at identificere de RNA-prøver, der har den højeste koncentration af LIF mRNA. Cytoplasmatisk polyadenyleret RNA, fremstillet i det væsentlige som beskrevet tidligere (Gough, N.M. J.Mol.Biol. 165:

30 683-699, 1983), fraktioneredes på 1% agarosegeler indeholdende 20 mM

morpholinopropansulfonsyre (MOPS), 5 mM natriumacetat, 1 mM EDTA (pH

7,0) plus 6% volumen/volumen formaldehyd, filtre indeholdende RNA blev udblødt i 2 x SSC indeholdende 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrophosphat, 1 mM ATP, 50 pg/ml de-35 natureret laksesperm-DNA og 50 pg/ml E.coli tRNA ved 67°C i adskillige ti- 32 DK 174970 B1 mer. Hybridisering foregik i samme puffer plus 0,1% SDS ved 67°C. Den anvendte probe til påvisning af LIF-transcriptioner bestod af et ca. 750 bp Eco RI - Hind I Il-fragment indeholdende cDNA-insertionet af pLIF7,2b, underklonet i pSP65. Dette fragment indeholder ikke bare cDNA-sekvensen, men og-5 så G-C-haler og ca. 150 bp pJL3-vektorsekvens. Riboproper på ca. 2 x 109 cpm/pg afledtes ved transcription af denne SP6 subklon under anvendelse af reagenser leveret af BRESA (Adelaide). Proben blev inkluderet i hybridisering ved ca. 2 x 10^ cpm/ml. Filtre vaskedes ekstensivt i 2 x SSC, 2 mM ED-TA, 0,1% SDS ved 67°C og endelig i 0,2 x SSC ved 67°C forud for autora-10 diografi.

Sådan analyse afslørede, at LIF-transcriptioner forekom i lave niveauer i et bredt udvalg af hæmopoietiske cellelinier, og at der var betydelig variation i LIF-mRNA-niveauet i forskellige portioner af Krebs RNA. To portioner af 15 Krebs ascites-tumorcelle-RNA udvalgtes til syntese af to cDNA-biblioteker. cDNA-Biblioteker konstrueredes under anvendelse af reagenser leveret af Amersham (produktnumre RPN.1256 og RPN.1257) og under anvendelse af fremstillerens instruktioner; kloningsvektoren varÅGTIO. Ca. 4 x 10® rekom-binantkloner opnåedes og blev screenet ved hybridisering med et korrespon-20 derende oligonukleotid til en sekvens på 36 rester ved 3-enden af pLIF7,2b-sekvensen: nukleotider 500-535 (inklusive) i figur 10.

Fagplaques, der repræsenterer Krebs cDNA-biblioteket, dyrkedes ved en densitet på ca. 50.000 plaques pr. 10 cm Petri-skål, overførtes in duplo til 25 nitrocellulose og behandledes under anvendelse af standardteknikker (Ma-niatis, T. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, 1982). Forud for hybridisering blev filtre inkuberet i adskillige timer ved 37°C i 6 x SSC (SSC = 0,15 M NaCI, 0,015 M natriumcitrat), 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinyl-pyrollidon, 0,2% bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrophosphat, 1 mM ATP, 50 30 mg/ml denatureret laksesperm-DNA og 50 pg/ml E.coli-tRNA. Hybridisering foregik i samme opløsning indeholdende 0,1% NP40 ved 37°C u 16-18 timer.

Den førnævnte oligonukleotidprobe, radioaktivt mærket under anvendelse af [y.32pj ATp og polynukleotidkinase til specifik aktivitet på ca. 109 cpm/pg og separeret fra uinkorporeret mærke ved ionbytningschromatografi på en 35 NACS-søjle (Bethesda Research Laboratories), inkluderedes i hybridiserin- 33 DK 174970 B1 gen i en koncentration på ca. 20 ng/ml. Efter hybridisering blev filtrene vasket omhyggeligt i 6 x SSC, 0,1% natriumdodecylsulfat ved 60°C. En plaque, der repræsenterer klon ALIFNK1, der var positiv på dobbelte filtre, blev samlet op og screenet igen ved lavere densitet, som før.

5 cDNA-Insertionet på ca. 950 bp i ALIFNK1, der hybridiserede med førnævnte oligonukleotid, blev subklonet i en plasmidvektor (pEMBL8+, Dente, L. et al., Nucl.Acids Res. 11: 1645-1655, 1983) til frembringelse af klon pLIFNKI. Nu-kleotidsekvensanalyse af cDNA-insertionet i pLIFNKI udførtes ved dideoxy-10 kædetermineringsmetoden (Sanger, F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) under anvendelse af alkalidenatureret dobbeltstrenget plasmid-DNA som template (Chen, E.Y. og Seeburg, P.H., DNA 4: 165-170, 1985), et udvalg af komplementære oligonukleotider til begge områder af vektoren, der flankerer cDNA'et og sekvenser inden for cDNA-insertionet 15 som primere og under anvendelse af både Klenow-fragmentet af E.coli DNA-polymerase og AMV reverstranscriptase som polymeraser i sekventerings-reaktionerne. Nukleotidsekvensen af en del af cDNA-insertionet i pLIFNKI vises i figur 11. Aminosyresekvensen, der er specificeret ved pLIFNKI, er identisk med C-terminalen med de 9 aminosyrer, der var forudsagt ved direk-20 te aminosyresekventering, således at den udgør C-terminalen i LIF, og bekræfter, at Phe 187 er den C-terminale rest af LIF, idet i pLIFNK1-cDNA-sekvensen er codonet for denne rest umiddelbart fulgt af et translationelt stopcodon inden for læserammen.

25 Trin 2

Konstruktion af et LIF-codonområde i en gærekspressionsvektor

Initiel produktion af det protein, der er indkodet i LIF-cDNA-klonerne, blev 30 opnået i et eukaryotisk system (gær), således, at det udtrykte produkt ville blive glycosyleret, secerneret og korrekt foldet. Den anvendte ekspressions-vektor, YEPsecl (Baldari, »L et al., EMBO J. 6: 229-234, 1987), tilvejebringer en N-terminal ledersekvens afledt fra dræbertoxingenet af Kluweromvces lactis. der tidligere er vist at dirigere den effektive secernering af interleukin 1 34 DK 174970 B1 (Baldari, C. et al., EMBO J. 6: 229-234,1987), transcriberet fra en galactose-inducerbar GAL-CYC-hybridpromotor.

For at udtrykke det protein, der er indkodet af pLIF7,2b i denne vektor var det 5 nødvendigt at modificere cDNA’et på forskellige måder (se figur 12). Ved 5’-enden var det ikke blot nødvendigt at fjerne de få nukleotider, der specifiserer den partielle mammale ledersekvens, men også at inkludere et passende restriktionsendonukleasekløvningssted (Bam Hl) for at tillade insertion inden for samme læseramme som K.lactis-lederen og bibeholde et passende sig-10 nalpeptidasekløvningssted (Gly-Ser). Ved 3-enden blev to versioner af det kodende område for LIF konstrueret. En version (LIFrnutl) konstrueredes således, at et stopcodon umiddelbart fulgte det sidste codon for pLIF7,2b (Gin 178). Den anden version (LIFmut2) konstrueredes for at vedhæfte en sekvens, der koder for de 9 aminosyrerester, der vides at mangle i pL!F7,2b 15 (se ovenfor), fulgt af et translationelt stopcodon inden for læserammen. Et passende restriktionsendonukleasekløvningssted (Hind III) fuldendte begge konstruktioner. Alle disse modifikationer blev opnået ved oligonukleotidme-dieret mutagenese: Eco-RI - Hind III fragmentet med ca. 750 bp, der bærer cDNA-insertionet af pLIF7,2b på 535 bp, begrænset ved G-C-haler og en del 20 af pJL3-vektoren subklonedes ind i plasmid pEMBL8+ (Dente, L. et al., Nucl.Acids Res. 11: 1645-1655, 1983) og enkeltstrenget DNA fremstilledes som beskrevet (Cesarini, G. og Murray, J.A.H. i Setlow, J.K. og Hollaender, A. (eds.), Genetic Engineering: Principles and Methods. Plenum Press, New York, bind 8, 1987 (i trykken)). In vitro mutagenese udførtes som beskrevet 25 (Nisbet, I.T. og Beilharz, M.W. Gene Anal. Techn. 2: 23-29,1985), under anvendelse af oligonukleotider med henholdsvis 35, 51 og 61 baser til modificering af 5-enden og 3’-enden af cDNA'et som beskrevet ovenfor. Barn Hl -Hind III fragmenter indeholdende de modificerede LIF-cDNA-sekvenser lige-redes ind i plasmid YEpsecl og nukleotidsekvensen af insertioneme i de re-30 suiterende rekombinanter bestemtes.

Trin 3: DK 174970 B1

OK

Introduktion af YEpsecl/LIF-rekombinanteme i gærceller 5 S.cerevisiae stamme GY41 (Ieu2 ura3 adel his4 met2 trp5 gall cir+; x 4003-5b fra Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) transformeredes ved polyethy-lenglycolmetoden (Klebe, R.J. et al., Gene 25: 333-341,1983). Transforman-ter selekteredes og vedligeholdtes på syntetisk minimalmedium (2% carbon-kilde, 0,67% gærnitrogenbase (Difco) suppleret med 50 pg/ml af de krævede 10 aminosyrer) under berøvelse af uracil. Ekspression af insertionssekvenser i plasmid YEpsecl opnåedes ved at dyrke transformanter i enten ikke-selektivt fuldstændigt medium (1% gærekstrakt, 2% pepton) eller i syntetisk minimalmedium, hver indeholdende 2% galactose.

15 Trin 4:

Bestemmelse af de biologiske egenskaber af oærafledt LIF

Analyse for differenciering/induceringsaktivitet og leukæmiundertrykkende 20 aktivitet af gærkonditioneret medium udførtes i 1 mi kulturer indeholdede 300 M1 celler (tilvejebragt af dr. M. Hozumi, Saitama Cancer Research Centre,

Japan) i Dulbeccos Modified Eagle's Medium med en slutkoncentration på 20% kalvefosterserum og 0,3% agar. Det materiale, der skulle analyseres, tilsattes i seriefortyndede 0,1 ml volumener til kulturskålen forud for tilsætning 25 af cellesuspensionen i agarmedium. Kulturer blev inkuberet i 7 dage i en fuldstændig fugtet atmosfære ved 10% CO2. Kulturer blev opgjort under anvendelse af et dissektionsmikroskop ved 35 gange forstørrelse, alle kolonier med en corona af dispergerede celler eller bestående fuldstændigt af disper· geret celler blev bedømt som differensierede. Morfologisk undersøgelse af 30 kolonier udførtes ved at fiksere hele kulturen med 1 ml 2,5% glutaraldehyd, herefter farve de tørrede kulturer på mikroskopobjektglas under anvendelse af acetylcholinesterase/Luxol Fast Blue/Haematoxylin.

Analyser for kolonistimulerende aktivitet udførtes under anvendelse af 75.000 35 C57BL knoglemarvceller som beskrevet tidligere (Metcalf, D. The Hemopoie- 36 DK 174970 B1 tic Colony Stimulating Factors Elsevier, Amsterdam, 1984). Analyse for diffe-rensieringsinduceringsaktivitet på WEHI-3B D+ celler udførtes som tidligere beskrevet (Nicola, N. et al., J.Biol.Chem. 258: 9017-9023,1983).

5 Medium fra gærkulturer indeholdende den hele længde af det kodende område (LIFmut2), men ikke fra kulturer af ikke-transformeret gær, gær indeholdende vektoren YEpsecl alene eller gær indeholdende det ufuldstændige kodende område (LlFmutl), var i stand til at inducere typisk macrophagdiffe-rensiering i kulturer af M1-kolonier (figur 13A). Som med oprenset nativ LIF 10 reducerede det gærafledte materiale også progressivt med stigende koncentrationer antallet og størrelsen af M1-kolonier, der udvikles (figur 13B). Sammenligning med oprenset nativ LIF viser, at det gærkonditionerede medium indeholdt op til 16000 enheder/ml (ca. 130 ng/ml) LIF. Gærafledt LIF, som oprenset nativ LIF-A, kunne ikke stimulere kolonidannelse ved normale gra-15 nulocyt-macrophagstamceller eller inducere differensiering i eller undertrykke formering af WEHI-3B D+ leukæmikolonier.

Størrelsesfraktionering på en Sephacryl S-200 søjle viste, at gærafledt LIF elueredes sammen med proteiner med tilsyneladende molekylvægt 67.000 til 20 150.000 Daltons sammenlignet med 58.000 Daltons for LIF afledt fra Krebs celler.

Fravær af LIF-aktivitet i medium, der er kondisioneret af gær indeholdende et ufuldstændig kodende område (LlFmutl), antyder, at de 9 hydrofobe C-25 terminale aminosyrerester, der mangler i denne konstruktion, kan være krævet til LIF-funktion. Idet disse aminosyrerester eventuelt kan interagere med receptoren, kan de også udgøre en del af en hydrofob kerne inden for proteinet og deres fravær kan således forhindre rigtig foldning. Alternativt kan de på en eller anden måde være krævet til effektiv secernering af LIF.

30 37 DK 174970 B1

Trin 5:

Receptorbindinasspecificitet af aærafledt murin LIF og oprenset nativ LIF-A fra Krebs ll-ascitescelle konditioneret medium 5

Oprenset murin LIF-A (eksempel 1) ioderedes som tidligere beskrevet (eksempel 3). Bughindeceller blev høstet ved skyldning fra mus, hvori et højt macrophagniveau var blevet induceret i bughulen med thioglycollat. Disse celler blev vasket og resuspenderet ved 2,5 x 10^/50 μ| i Hepes-puffered 10 RPMI-medium indeholdende 10% kalvefosterserum. Celler i 50 μΙ prøvemængder inkuberedes med 200.000 cpm af 125I-LIF-A (10 μΙ, i samme medium) og 10 μΙ kontrolmedium eller seriedobbeltfortyndinger af umærket ren murin LIF-A eller gærafledt murin LIF. Ved passende koncentrationer konkurrerede supernatant fra galactoseinduceret gær indeholdende LIFmut2 kon-15 struktionen (figur 12) med ^2^I-LIF-A om binding til dens receptorer på bughindeceller, medens uinduceret gærsupematant ikke gjorde det (figur 14). Konkurrencegraden var jig med autentisk nativ LIF-A, hvilket viser, at det gæ-rafledte LIF-A indeholdt hele den krævede information til binding til cellulære LIF-A-receptorer.

20

Eksempel 6 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til at udtrykke rekombinant murin LIF i mammale celler.

25

Ledsagende figur 15 angår trin 1 i nedenfor beskrevne metode: Nukleotidse-kvensen af cDNA-delen af klon pLIFNK3. Nukleotidsekvensen af den mRNA-synonyme streng vises i 5 - til 3-orienteringen med den udledte aminosyre-sekvens af LIF, der er givet ovenfor. Den tidligere bestemte N-terminale ami-30 nosyrerest er vist som +1. Eco R1 stedet ved 5-enden af cDNA'et og Xba I stedet, det spænder over stopcodonet (anvendt i insertion af det LIF-kodende område i pMP-Zen i trin 2) er vist.

Trin 1: 38 DK 174970 B1

Bestemmelse af aminosvresekvensen af den N-terminale ledersekvens af murin LIF 5 cDNA-Kloneme pLIF7,2b og pLIFNKI (se ovenfor) indeholder ufuldstændige kopier af LIF-mRNA’et. Selvom de tilsammen indeholder det fuldstændige kodende område for den modne del af LIF-proteinet indeholder de ikke den fuldstændige hydrofobe ledersekvens, der kræves for secernering af LIF fra 10 mammale celler.

For at isolere en cDNA-klon, der indeholder det område, der koder for den hydrofobe leder, screenedes yderligere 106 cDNA-kloner, der var konstrueret som ovenfor (eksempel 5), under anvendelse af samme portion af Krebs-15 mRNA som en template (som ovenfor) under anvendelse af som prober 2 oligonukleotider, der korresponderer med en sekvens på 35 aminosyrerester ved 5-enden og 36 aminosyrerester ved 3'-enden af pLIF7,2b sekvensen (nukleotider 67-102 og 500-535, incl. i figur 10).

20 To plaques, der repræsenterer kloner ALIFNK2 og ALIFNK3, der er positive på dobbelte filtre, blev samlet op og screenet igen ved lavere densitet, som tidligere. Idet ALIFNK3 vistes at hybridisere med hver af de to anvendte oligonukleotider blev den selekteret for yderligere analyse.

25 cDNA-insertionet på ca. 1400bp i ALIFNK3 blev subklonet i plasmidvektoren pEMBL 8+ (Dente, L. et al., Nucleic Acids Res. H: 1645-1655, 1983) til frembringelse af klonen pLIFNK3. Nukleotidsekvensanalyse af cDNA-insertionet af pLIFNK3 udførtes som for pLIF7,2b og pLIFNKI (ovenfor).

30 Nukleotidsekvensen af cDNA-insertionet i pLIFNK3 vises i figur 15 og det viser, at pLIFNK3 indeholder et fuldstændig LIF-kodende område: der er et initieringscodon (AUG) i position 23-25 i pLIFNK3-sekvensen, der går forud for en sekvens, der koder for en typisk hydrofob ledersekvens på 24 aminosyrerester. Det kodende område strækker sig til samme translationelle stop-35 codon som tidligere defineret ved pLIFNKI (ovenfor).

Trin 2: 39 DK 174970 B1

Introduktion af et LIF-kodende område i en mammal ekspressionsvektor 5

Den oprindeligt valgte mammale ekspressionsvektor var retroviruseks-pressionsvektoren pMP-Zen. Vektoren er afledt fra den Moloney-murin-leukæmivirusbaserede vektor pZIPNeo SV(X) (Cepko, C.L. et al., Cell 37:1053-1062, 1984) ved deletion af neoR genet sammen med nærliggende 10 SV40 og plasmidsekvenser, efterladende et Xho I ekspressionssted. 3’-Området af vektoren er også modificeret til at inkorporere enhanceren fra den lange terminale gentagelse (LTR) af de myeloproliferative sarcomavirus (MPSV) (Bowtel, D.D.L. et al., Mol.Biol.Med. 4:229-250,1987). Denne vektor valgtes for det første idet LIF/PMP-Zen rekombinanten kan pakkes ind i 15 hjælperfrie infektiøse retroviruspartikler ved passage gennem Ψ2 celler (Mann, R. et al., Cell. 33:153-159, 1983). Sådanne virale partikler kan herefter anvendes til at effektivt indføre (ved infektion) LIF/pMP-Zen rekombinanten i et bredt udvalg af murine celletyper (Mann, R. et al., Cell 33:153-159.

1983). For det andet er denne bestemte vektor, der gør brug af MPSV LTR'er 20 for ekspression af det fremmede kodende område, blevet vist at dirigere den effektive ekspression af visse andre haemopoietiske vækst- og differentieringsfaktorer, herunder GM-CSF.

Segmentet af pLIFNK3, der er valgt til insertion i pMP-Zen, strakte sig fra 25 stilling 1 (et Eco R1 sted) til stilling 630 (et Xba 1 sted, der spænder over stopcodonet) - se figur 15. Dette segment valgtes, idet det indeholder kun lidt mere end det kodende område af præ-LIF og udelukker hele det ikke-translaterede 3'-område, der kan indeholde sekvenser, der bibringer mRNA instabilitet (f.eks. Shaw, G. og Kamen, R. Cell 46:659-667.1986; Verma, I.M.

30 og Sassone-Corsi, P.. Cell 51:513-514.1987). For at indsætte dette segment i pMP-Zen blev det først indsat mellem Eco R1 og Xba stederne i plC20H (Marsh, J.L. et al. Gene 32:481-485, 1984) ved standardteknikker (Maniatis et al., 1982, ovenfor). cDNA-Insertionet blev herefter genvundet fra polylinke-ren af plC20H-plasmidet ved Sal ·- samt Xho l-fordøjelse, hvorved der frem-35 bringes et LIF-cDNA-fragment med kohæsive ender, der passer til indsættel- 40 DK 174970 B1 se i Xho I kloningsstedet i pMP-Zen. Insertionet af LIF-cDNA-fragmentet i pMP-Zen opnåedes ved standardteknikker (Maniatis et al., 1982, ovenfor).

Trin 3: 5

Introduktion af pMP-Zen/LIF rekombinanten i murine fibroblaster pMP-Zen/LIF-DNA introduceredes i ψ2 fibroblaster ved elektroporation (Potter et al., PNAS 81:7161-7165, 1984). 30 pg pMP-Zen/LIF-DNA samt 3 pg 10 pSV2Neo-DNA (Southern, P.J. og Berg, P. J.Mol.App.Genet. 1:327-341, 1982) blev blandet med 1 x 10® ψ2 fibroblaster i 1 ml DME/10% FCS (Dul-beccos modified Eagles medium indeholdende 10% kalvefosterserum) og underkastet en puls på 500 volt ved en kapacitans på 25 pF (under anvendelse af en BioRad Gene-Pulser model nr. 1652078).

15

Transfektanter udvalgtes initielt på basis af resistens mod antibiotika G418, der bibringes af pSV2Neo DNA. G418-resistente ψ2 celler selekteredes i 400 pg/ml G418 ved standardprocedure (Mann, R. et al., Cell 33:153-159.1983).

Af 19 undersøgte G418-resistente kloner indeholdt 2 også pMP-Zen/LIF-20 konstruktionen som fastsat ved LIF-aktivitet, der er påviselig i ψ2 konditioneret medium.

Trin 4

25 Bestemmelse af biologiske egenskaber af w2-afledt LIF

Analyse for differentieringsinducerende aktivitet og leukæmiundertrykkende aktivitet af konditioneret medium fra pMP-Zen/LIF, der indeholder ψ2 celler, udførtes som tidligere beskrevet. Medium fra kultur af 10® ψ2 celler i 3 ml 30 DME/10% FCS analyseredes for differentieringsinducerende aktivitet. Resul· taterne for 2 positive kulturer vises i følgende tabel: 41 DK 174970 B1 M1 Differentieringsinducerende aktivitet

Klon nr._(enheder/10^ celler/ml C.M.)_ ψ2- kontrol ikke påviselig ψ2-ΙΙθ >16.000 5 ψ2-Μ >16.000

Der kan således i dette ekspressionssystem produceres signifikante niveauer af biologisk aktiv rekombinant murin LIF.

10 Trin 5

Transmission af pMP-Zen/LIF-retrovirus fra m2-celler til hæmopoietiske celler

Infektiøst pMP-Zen/LIF-retrovirus kunne overføres fra forældre ψ2-15 cellelinierne til hæmopoietiske celler af linien FDC-P1 (Dexter, T.M. et al., J.

Exp. Med.. 152:1036-1047. 1980) ved samdyrkning. 106 ψ2-ΟβΙΙβΓ blandedes med 106 FDC-P1-celler i 10 ml DME/10% FCS indeholdende den optimale koncentration af WEHI-3B D’-konditioneret medium til vækst af FDC-P1-cellerne. Efter 2 dages inkubation fjernedes de ikke-vedhængende FDC-20 P1-celler, de blev vasket fri for alle vedhængende i|j2-celler og dyrkedes i 16 timer i 3 ml af samme medium. Konditioneret medium blev høstet og analyseret for differentieringsinducerende og leukæmiundertrykkende aktivitet som tidligere beskrevet. Resultaterne er vist i følgende tabel: 25 FD-Kultur afledt M1 differentieringsinducerende aktivitet fra klon nr. (enheder/10^ FDC-P1-celler) iy2-kontrol Ikke påviselig ij)2-11a ca. 3.000 i|j2-11d ca. 1.500 30

i|»2-Klonerne, ip2-11a og ijj2-11d er således i stand til at overføre biologisk aktiv pMP-Zen/LIF-retrovirus til hæmopoietiske celler. Disse kloner skulle derfor være anvendelige til infektion af normale murine hæmopoietiske stamceller, der kan anvendes til at rekonstituere det hæmopoietiske system af 35 bestrålede mus for at studere effekterne af højniveauekspression af nativ LIF

42 DK 174970 B1 på normal murin hæmopoiese, på en måde, som er analog den, der er anvendt til Zen/GM-CSF virusinfektion.

Eksempel 7 5 Følgende beskriver de anvendte trin til ekspression af rekombinant murin LIF i E. coli-celler.

Medfølgende figur 16 angår trin 1 af nedenfor beskrevne metode: Nukleotid-10 sekvensen ved glutathion S-transferase/thrombinkløvningssted/LIF-forbindelsen i plasmid pGEX-2T/LIF og sekvensen ved forbindelsen af det indkodede fusionsprotein. O-Terminalen af glutathion S-transferase, throm-binkløvningsstedet og N-terminalen af de murine LIF-dele af det tredelte fusionsprotein sammen med den nukleotidsekvens, der koder for denne amino-15 syresekvens, vises. Det forventede kløvningssted med thrombin vises ved en pil.

Trin 1 20 Introduktion af et LIF-kodende område i en E. coli-ekspressionsvektor

Den til ekspression af LIF i E. coli anvendte ekspressionsvektor var GEX-2T (Smith, D.B. og Johnson, K.S., Gene, (i trykning), 1988), der dirigerer syn-tensen af fremmede polypeptider som fusioner med C-terminalen af Sj26, et 25 26kD glutathion S-transferase (E.C. 2.5.1.18), der er indkodet af den parasitiske helminth Schistosoma iaponicum. I hovedparten af tilfældene er fusi-onsproteineme vist at være opløselige i vandige opløsninger og kan oprenses fra rene bakterielysater under ikke-denaturerende betingelser ved affini-tetschromatografi på immobiliseret glutathion. Den pågældende vektor 30 pGEX-2T er blevet konstrueret således, at glutathion S-transferasebæreren kan spaltes fra fusionsproteinet ved fordøjelse med det sted specifikke pro-teasethrombin.

Det fuldstændige kodende område for murin LIF, afledt fra plasmid pLIFmut2 35 (se eksempel 5 og figur 12 ovenfor) blev indført som et BamHI-EcoRI- 43 DK 174970 B1 fragment i det multible kloningssted for pGEX-2T (Smith, D.B. og Johnson, K.S., supra) der dermed anbringer det LIF-kodende område 3' for og i samme translationelle læseramme som det for glutathion S-transferase og thrombinkløvningsstedet. Dermed ville LIF-proteinet blive lokaliseret C-5 terminal for disse elementer i et tredelt glutathion S-transferase/thrombinkløvningssted/LIF-fusionsprotein (se figur 16). Bemærk, at positionen af thrombinkløvningsstedet er således, at to aminosyrerester (Gly-Ser) vil være vedhæftet til N-terminalen af LIF-proteinet efter throm-binkløvning. Konstruktionen af det førnævnte plasmid, pGEX-2T/LIF, opnås 10 ved standardteknik, og plasmidet indførtes i E. coli NM522 (Gough, J.A. og Murray, N.M., J. Mol. Biol.. 166:1-19.1983) ved standardteknikker.

Trin 2 15 Ekspression oa oprensning af glutathion S-transferase/LIF-fusionsprotein

For at inducere ekspressionen af glutathion S-transferase/LIF-fusions-proteinet dyrkedes 10 ml kultur af E. coli NM522-celler indeholdende pGEX-T2/LIF til logaritmisk fase i Luria-afkog og isopropyl β-D-thiogalactopyranosid 20 tilsattes til en koncentration på 0,1 mM. Efter yderligere 4 timers vækst, hvorunder glutathion S-transferase/LIF-genet udtrykkes, høstedes cellerne ved centrifugering og de resuspenderedes i 1 ml musetonicitet phosphatpufferet saltopløsning (MTPBS: 150 mM NaCI, 16 mM Na2HPC>4, 4 mM ΝβΙ-^ΡΟψ pH 7,3). Cellerne lyseredes på is ved mild sonikering og efter tilsætning af 25 Triton X-100 til 1% fjernedes cellerester ved centrifugering (10.000 g, 5 min, 4°C). Den klare supernatant blandedes ved stuetemperatur i et 50 ml polpro-pylenrør på en roterende platform med 200 pi 50% glutathion-agaroseperler (svovlbinding, Sigma). (Før anvendelse blev perlerne forsvulmet i MTPBS, vasket to gange i samme puffer og opbevaret i MTPBS ved 4°C som en 50% 30 opløsning volumen/volumen). Efter absorption (5 min) samledes perlerne ved centrifugering (500 g, 1 min) og. vaskedes tre gange i MTPBS/Triton X-100. Glutathion S-transferase/LIF-fusionsproteinet elueredes herefter ved konkurrence med fri glutathion: perler inkuberedes med 100 μΙ 50 mM Tris. HCI, 5 mM reduceret glutathion (pH 7,5) i 2 min ved stuetemperatur og perterne fjer 44 DK 174970 B1 fjernedes ved centrifugering. Elueringstrinet udførtes to gange og de to 100 μΙ prøvemængder af eluat forenedes.

100 μΙ Af glutathion S-transferase/LIF-fusionsproteinet behandledes med 5 thrombin som beskrevet (Smith, D.B. og Johnson, K.S., supra).

1 μΙ Prøvemængder af de ukløvede og thrombinkløvede glutathion S-transferase LIF-fusionproteiner elektroforeredes på en Pharmacia Phast Gel (8-25% polyacrylamidgradientgel). Efter farvning med Coomassie Blue afslø-10 redes en enkelt større proteinart med relativ molekylvægt på ca. 46 kDa i den ukløvede præparation og i den thrombinkløvede præparation to større bånd på ca. 26 kDa og ca. 20 kDa (svarende til de forventede størrelser af fusionsproteinet (46 kDa), glutathion S-transferasen (26 kDa) og LIF-proteineme (20 kDa). Ved estimering af massen af Coomassie-farvede bånd på denne 15 gel estimeredes udbyttet af glutathion S-transferase/LIF-pratein for den oprindelige 10 ml E. coli-kultur at være ca. 1,5 pg.

Analyser for differentieringsinducerende aktivitet og leukæmiundertrykkende aktivitet af både glutathion S-transferase/LIF-fusionsproteinet og den throm-20 binkløvede LIF-præparation udførtes under anvendelse af murine M1 -celler (som beskrevet tidligere). Begge præparationer af LIF blev bestemt at være biologiske aktive med specifikke aktiviteter i overskud af 7 x 10® enheder/mg.

Eksempel 8 25 Følgende beskriver de anvendte trin til bestemmelse af om det murine genom indeholder nogle andre nært beslægtede gener med det gen, der koder for den sekvens, der forekommer i klon pLIF7,2b (eksempel 4) og afledningen af et kort for lokaliseringen med restriktionsendonukleasekløvningssteder 30 omkring LIF-genet.

Ledsagende figurer angår forskellige trin af den nedenfor beskrevne metode.

Figur 17: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 1: hybridisering af muse 35 DNA med en pLIF7,2b-afledt probe under høj- og lavstringensbetingelser.

45 DK 174970 B1 BALB/c lever-DNA fordøjet med de angivne restriktionsenzymer blev probet for LIF-gensekvenser, som beskrevet i eksempel 8. trin 1.1 det venstre panel foregik hybridisering ved 65 °C i 2 x SSC, og slutvask ved 65°C i 0,2 x SSC. I det højre panel foregik både hybridisering og vask i 6 x SSC ved 65°C. I det 5 venstre panel medtoges lineær pLIF7,2b-plasmid DNA (5,6 kb) i en mængde, der er ækvivalent med 10 og 1 kopier pr. haploid musegenom (400 pg henholdsvis 40 pg), idet der antages en molekylvægt for det haploide musegen på 3 x 10^ bp (Laird, 1971, supra). Størrelserne aide hybridiserende ge-nomfragmenter er vist.

10

Figur 18: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 2: hybridisering af muse DNA kløvet med forskellige restriktionsendonukleaser, alene og i parvise kombinationer, med en muse LIF-probe. Fordøjede DNA'er blev elektroforer-et på 0,8% w/v agarosegeler og hybridiseret med pLIF7,2b cDNA-fragmentet 15 som beskrevet i eksempel 8, trin 1, under højstringensbetingelser.

Figur 19: er en skematisk gengivelse, der viser trin 2: restriktionsendo-nukleasekløvningskort af det murine LIF-gen. Det kromosomale DNA-område, der indeholder korresponderende sekvenser til cDNA-klonen 20 pLIF7,2b er angivet ved indramning. De oven for (Eco R5) og neden for (Xba I, Barn Hl, Pst I og Stu I) centrallinien angivne restriktionssteder er blevet orienteret i forhold til centrallinien. Den relative lokalisering af steder inden for komplekset under linien er som vist.

25 Figur 20: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 3: kromosomal fastlæggelse af det murine LIF-gen. I spor 1 blev BALB/c museembryo-DNA elektro-foreret, i spor 2, DNA fra ovarieceller fra kinesisk hamster, og i spor 3-8 DNA fra de hybridiserede kloner I-18A HAT, l-18A-2a-8AG; EBS 58; EBS 18; EBS 4; og l-13A-1a-8AG (Cory et al., 1983, supra). Indholdet af murint kromosom 30 i disse hybrider er angivet i Cory et al, 1983, supra. Alle DNA’er blev fordøjet med Barn Hl. Positionen af 3 kbp Barn Hl-fragmentet, der bærer det murine LIF-gen, er vist.

DK 174970 B1 46

Trin 1

Bestemmelse af antallet af LIF-relaterede gener i det murine oenom 5 I lyset af dataene (eksempel 1) at medium, der er konditioneret med Krebs Ilceller, indeholder to biokemisk adskillige, men funktionelt lignende faktorer, der er i stand til at inducere differentieringen af M1-celler (LIF-A og LIF-B), ønskedes det at bestemme, hvor mange gener der findes i det murine genom, der er forbundet med de arter, der er oprenset og klonet. Southern 10 Blots af murin genomt DNA, der er fordøjet med forskellige restriktionsendo-nukleaser, hybridiseredes derfor med en probe, der er afledt fra pLIF7,2b under betingelser med både høj og lav stringens.

20 pg Prøvemængder af højmolekylvægtgenomt DNA fra BALB/c-15 muselevere fordøjedes til fuldstændighed med forskellige restriktionsendo-nukleaser, fraktioneredes ved elektroforese i 0,8% agarosegeler og overførtes til nitrocelluloser. Forud for hybridisering blev filtrene inkuberet i adskillige timer ved 65°C i enten 6 x SSC (lavstringens) eller 2 x SSC (højstringens) (SSC = 0,15 M NaCI, 0,015 M natriumcitrat), 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyr-20 rolidon, 0,2% bovin serumalbumin, 2 mM natriumpyrophosphat, 1 mM ATP, 50 pg/ml denatureret laksesperm DNA og 50 pg/ml E. coli tRNA. Hybridisering foregik i samme opløsning indeholdende 0,1% SDS ved 65°C i 16-18 timer. Filtrene blev herefter vasket i enten 6 x SSC, 0,1% SDS ved 65°C (lavstringens) eller i 2 x SSC, 0,1% SDS ved 65°C fulgt af 0,2 x SSC, 65°C 25 (højstringens) som det er beskrevet detaljeret i figurteksten til figur 17. Den anvendte hybridiseringsprobe var som tidligere beskrevet Eco Ri-Hind III-fragmentet, med ca. 750 bp, der spænder over cDNA-indsættelsen af pLIF7,2b, der er radioaktivt mærket til en specifik aktivitet på ca. 4x10® cpm/pg ved nick-translation og medtaget i hybridiseringen i en koncentration 30 på ca. 2x10^ cpm/ml.

I muselever DNA (figur 17) såvel som i DNA fra Krebs Il-celler, LB3-T-celler og WEHI265 monocyt-celler (ikke vist) påvistes der med LIF-proben unikke Eco RI, Barn Hl og Hind lll-fragmenter på ca. 11,3 henholdsvis 13 kbp. Det 35 samme hybridiseringsmønster var tydeligt ved både høj- (0,2 x SSC, 65 °C) 47 DK 174970 B1 og lavstringens (6 x SSC, 65°C) (figur 17); under lavstringenshybridiserings-og vaskebetingelser var der ikke tegn på yderligere bånd. På samme måde påviste også unikke hybridiseringsfragmenter i Pst I, Stu I. Sac I, Eco R5 og Bal ll-fordøjet genomt DNA (figur 17). Desuden medtoges pLIF7,2b-plasmid 5 DNA i det i figur 17 beskrevne eksperiment, i en koncentration, der er ækvivalent med 10 og 1 kopier pr. haploid musegenorn (spor 1 og 2); hybridise-ringsintensiteten af den genome LIF-sekvens var ikke signifikant forskellig fra intensiteten af den unikke genstandard (spor 2).

10 Taget sammen viser de foregående data, at LIF-genet er Unikt i det murine genom uden nære slægtninge. Det er dermed ikke sandsynligt, at de to LIF-arter er produkter af forskellige gener, men de er snarere sandsynligvis respræsentanter for post-transkriptionelle eller post-translationelle varianter af det samme genprodukt.

15

Trin 2

Udledning af et kort over restriktionsendonukleasekløvnina af det murine LIF-qen 20

Til bestemmelse af dispositionen af restriktionsendonukleasekløvningssteder i og omkring det murine LIF-gen, og dermed tilvejebringe et molekylært fingeraftryk af dette gen fordøjedes, DNA fra muselever eller fra Krebs asci-testumorceller med forskellige restriktionsendonukleaser og underkastedes 25 Southern Blot-analyse som beskrevet i trin 1 (under højstringenshybridise-rings- og vaskebetingelser). Eksempler på sådanne eksperimenter vistes i figur 18. Analyse af størrelsen af fordøjelsesprodukterne muliggør frembringelse af et kort over lokaliseringen af hvert kløvningssted omkring LIF-genet (figur 19).

30 48 DK 174970 B1

Trin 3

Kromosomfastlægaelse af det murine LIF-aen 5 Til bestemmelse af det kromosom, hvorpå muse-LIF-genet er lokaliseret, undersøgtes DNA fra seks somatiske muse-kinesisk hamsterovarie-cellehybridcellelinier, der bibeholdt forskellige musekromosomer (Cory, S. et al., EMBO J.. 2:213-216, 1983: Francke, U. et al., Cvtooenet. Cell. Genet..

19: 57-84, 1977). Southern blot-analyse udført som beskrevet i trin 1 (under 10 anvendelse af højstringenshybridiserings- og vaskebetingelser) viste, at Barn Hl-fragmentet på 3 kbp indeholdende det murine LIF-gen manglede i alle hybriderne (figur 20). Idet kromosom 11 er det eneste musekromosom, der ikke er indeholdt i nogen af disse linier (Cory, S. et al., EMBO J. 2: 213-216, 1983), et karaktertræk hos mus-kinesisk hamster-hybrider (Francke, U. et al., 15 Cvtooenet. Cell. Genet. 19: 57-84, 1977), er det sandsynligt, at LIF-genet findes på dette kromosom. På samme basis er det murine GM-CSF-gen (Barlow, D.P. et al., EMBO J. 6: 617-623, 1987) og Multi-CSF-genet (Ihle, J.N. og Kozak, C.A., National Cancer Institute. Frederick Cancer Research Facility. Annual Report. 1984) også blevet fastlagt til kromosom 11, en fast-20 læggelse, der er blevet bekræftet ved genetiske bindingsstudier (Barlow, D.P. et al., EMBO J. 6: 617-623, 1987).

Eksempel 9 25 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til fastlæggelse af betingelser, hvorunder det klonede murine LIF cDNA kan anvendes til identifikation ved hybridisering af et humant gen eller mRNA eller rekombinante DNA-kloner, der indeholder humane LIF-kodende sekvenser.

30 Den ledsagende (figur 21) angår trin 2 af den nedenfor beskrevne metode: hybridisering af ^^p.mærket fragment af cDNA fra klon pLIF7,2b under forskellige betingelser til genomt DNA af både murin og human oprindelse. I hvert tilfælde indeholder spor 1 15 pg murin (LB3) DNA, og spor 2 og 3 indeholder 15 pg human DNA (fra cellelinierne Raji henholdsvis Ramos). De til 35 hvert filter anvendte hybridiserings- og vaskebetingelser er beskrevet i trin 2.

49 DK 174970 B1

Eco Rl-fragmentet på ca. 10 kbp indeholdende det murine LIF-gen og Eco Rl-fragmentet på ca. 9 kbp indeholdende den humane homolog er angivet ved pile. Molekylvægtstandarder angives til venstre. To forskellige autoradio· grafiske eksponeringer (16 timer og 62 timer) er vist.

5

Trin 2

Fremstilling oq radioaktiv mærkning af et cDNA-fraqment fra pLIF7,2b 10 pLIF7,2b-Plasmid DNA forstærkedes ved dyrkning i E. coli MC1061 (Casa-daban, M. og Cohen, S., J. Mol, Biol. 138:179-207,1980), ekstraheredes fra E. coli-celleme ved standardprocedurer (Maniatis, J. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, New York, 1982) og oprensedes ved CsCI-' gradientcentrifugeringer. Således oprenset pLIF7,2b-plasmid DNA kløvedes 15 med restriktionsendonukleaserne Eco RI og Hind III til frigørelse af et cDNA-indeholdende fragment på ca. 770 bp fra vektoren (pJL3), hvilket adskiltes fra vektorsekvenser ved elektroforese gennem en 1,5% agarosegel.

200 ng af således oprenset pLIF7,2 cDNA-fragment blev mærket radioaktivt 20 til en specifik aktivitet på ca. 3 x 10^ cpm/pg ved nick-translation (Rigby, P.W.J., Dieckmann, M., Rhodes, C. og Berg, P., J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) i en reaktion indeholdende 100 pCi [a^2P]-dATP. Det radioaktivt mærkede cDNA-fragment oprensedes fra uinkorporeret mærkning ved præcipita-tion i nærvær af 1M natriumperchlorat og 33% isopropanol.

25

Trin 2

HvbridiserinQ af Southern blots af muse- oq humant oenomt DNA med en pL.IF7.2b cDNA-probe 30 Høj molekylvægt-genomt DNA (15 pg) fra den murine T-cellelinie LB3 (spor 1) og fra to humane B-cellelinier (Raji og Ramos, spor 2 og 3) kløvet med restriktionsendonucleasen Eco RI blev elektroforeret gennem en 0,8% agarosegel og overført til nitrocellulose under anvendelse af standardteknikker 35 (Southern, E.M., J Mol. Biol. 98: 503-517, 1975). Der blev fremstillet fem 50 DK 174970 B1 identiske Southern blots, der indeholdt hver af disse tre DNA'er. Før hybridi-sering inkuberedes filtrene i adskillige timer ved 55°C i enten 0,9M NaCI, 0.09M natriumcitrat, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% bovint serumalbumin, 50 pg/ml varmedenatureret laksesperm-DNA, 50 pg/50 ml E.

5 coH tRNA, 0,1 mM ATP og 2 mM natriumpyrophosphat (filtrene a, b, c, d) el· ler i 0,3M NaCI, 0.03M natriumcitrat med samme yderligere bestanddele (filter e). Hybridisering med det 32P-mærkede pLIF7,2b cDNA, der var fremstillet i trin 1, udførtes i samme opløsninger som præhybridisering, indeholdende yderligere 0,1% natriumdodecylsulfat, ved 55°C (filtrene a, b, c) eller 65°C 10 (filtrene d, e) i 16 timer. Det 32P-mærkede cDNA denatureredes ved kogning forud for hybridisering og medtoges i hybridiseringsreaktionen med ca. 107 cpm/ml.

Efter hybridisering vaskedes filtrene i enten 0,9M NaCI, 0,09M natriumcitrat, 15 0,1 % natriumdodecylsulfat ved 55 °C (filter a), 60°C (filter b) eller 65°C (filtre ne c, d) eller i 0,3M NaCI, 0,03M natriumcitrat, 0,1% natriumdodecylsulfat ved 65°C (filter e). Efter indgående vask autoradiograferedes filtrene ved -70°C under anvendelse af Kodak XAR-5-film og to forstærkende skærme.

Figur 21 viser resultaterne af et sådant eksperiment, hvor to af de beskrevne 20 hybridiserings/vaskeregimer (filtrene d og e) tillod både det murine LIF-gen (forekom på et ca. 10 kbp Eco Rl-fragment) og det humane LIF-gen (forekom på et ca. 9 kbp Eco Rl-fragment) at blive påvist over restbaggrunds-ikke-specifik-hybridisering. Alle andre afprøvede betingelser medførte et uacceptabelt højt niveau af baggrundshybridisering (filtrene a, b. c).

25

Eksempel 10 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til opnåelse af en klonet human genhomolog til murin UF.

30

De ledsagende figurer angår forskellige trin af den nedenfor beskrevne metode. I figurerne:

Figur 22: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 1 af kloningen af det hu-35 mane LIF-gen: påvisning af LIF-genet ved Southern blot-hybridisering under 51 DK 174970 B1 anvendelse af en muse LIF-cDNA-probe. Genomisk DNA fra den humane cellelinie RAMOS blev fordøjet med de viste restriktionsendonukleaser og hybridiseret under de i eksempel 19, trin 1, beskrevne betingelser med et muse cDNA-fragment afledt fra pLIF7,2b.

5

Figur 23: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 1 af kloningen af det humane LIF-gen: påvisning af LIF-genet ved Southern blot-hybridisering under anvendelse af en muse-LIF cDNA-probe under et udvalg af hybridiserings-betingelser. Genomisk DNA fra den humane cellelinie RAMOS (H) eller mu-10 selever DNA (M) fordøjet med restriktionsendonuklease Barn Hl blev hybridiseret med en murin LIF cDNA-probe (pLIF7,2b) under et udvalg af hybridise-rings- og vaskebetingelser. De til hybridisering anvendte temperaturer og SSC-koncentrationer er vist på den øverste linie, og vaskebetingelserne på den anden linie (se eksempel 10, trin 1).

15

Figur 24: er en fotografisk gengivelse, der viser trin 2 af kloningen af det humane LIF-gen: restriktionsendonukleasekløvning af tre mulige LIF-genkloner.

1 pg DNA fra λ-fag af klonerne AHGLIF1, AHGLIF2 og AHGLIF3 blev fordøjet med Sal I, Barn Hl eller Pst I, elektroforeret på 0,8% w/v agarosegel (venstre 20 panel), overført til nitrocellulose og hybridiseret (som tidligere beskrevet) med pLIF7,2b cDNA. De hybridiserende fragmenters omtrentlige størrelser er vist.

Figur 25A-25C: er gengivelser, der viser trin 3 af kloningen af det humane LIF-gen: nukleotidsekvensen af den mRNA-synonyme streng af et 1,3 kbp-25 segment af AHGLIF1, der spænder over det humane LIF-gen (H), er præsenteret i 5'- til 3'-orientering. Den korresponderende nukleotidsekvens af det murine LIF-mRNA (M) afledt fra cDNA-klonerne pLIF7,2b, pLIFNKI og pLIFNK3, er opstillet neden under det humane gen og angivet med små bogstaver. Identitet mellem muse- og humansekvenserne er vist ved stjerner.

30 Den formodede N-terminale rest af moden human LIF, ved analogi med muse-LIF, er betegnet som +1.

Figur 26A oo 26B: er gengivelser, der viser trin 3 af kloningen af det humane LIF-gen: aminosyresekvens af human LIF og sammenligning med muse-LIF.

35 Aminosyresekvensen af moden murin UF (M) som bestemt ved direkte ami- 52 DK 174970 B1 nosyresekventering og analyse af cDNA-klonerne pLIF7,2b, pLIFNKI og pLIFNK3 er anført på den øverste linie med den korresponderende sekvens af human LIF (H), som afledt fra sekvensen af AHGLIF1 anført nedenunder. Identiteter er vist med stiplinger, forskelle er vist ved angivelse af amino-5 syren.

Figur 27: er en skematisk gengivelse, der viser trin 4 af kloningen af det humane LIF-gen: restriktionsendonukleasekløvningskort af det humane LIF-gen. Exonerne af det med pLIF7,2b (figur 25) homologe humane gen er vist 10 som indramninger. Genets transkriptionsretning er vist med pilen under linien.

Trin 1 15 Påvisning af det humane LIF-aen med en museprobe

Der er tidligere blevet beskrevet en metode til anvendelse af et radioaktivt mærket fragment af muse-LIF cDNA-klon pLIF7,2b som en hybridise-ringsprobe til påvisning af det humane LIF-gen. Figur 22 viser, at denne me-20 tode tillader, at det humane LIF-gen påvises i humant genomt DNA, der er fordøjet med et udvalg af restriktionsendonukleaser. Analyser som denne og andre geler, der ikke er vist, afslørede størrelserne af DNA-fragmenter, der er frembragt ved en udvalg af restriktionsendonukleaser, hvorpå det humane LIF-gen er lokaliseret. Sådanne data er af vigtighed i efterfølgende trin i dette 25 eksempel, ikke bare til fastlæggelse af betingelser, hvorunder museproben kan anvendes som en hybrid iseringsprobe til påvisning af det humane, men også til tilvejebringelse af diagnostiske restriktionskortlægningsdata til at hjælpe ved identificering af humane genome LIF-kloner.

30 En høj grad af homologi mellem muse- og humane LIF-sekvenser var åben-bår, når muse- og human genomt DNA fordøjet med Barn Hl hybridiseredes med en muse-LIF cDNA-probe under et udvalg af hybridiserings- og vaskebetingelser (figur 23). Idet hybridiserings- og vaskestringensen hævedes, således at baggrundspletter reduceredes, afsløredes et unikt fragment på ca.

53 DK 174970 B1 3 kbp, der hybridiserede med museproben. Det er signifikant, at det humane gen bibeholdt væsentlig hybridisering selv ved 65°C i 0,2 x SSC.

Trin 2 5

Screening af et humant oenombibliotek oa isolering af en klon indeholdende LIF-qenet

Et bibliotek af humant genomt DNA, delvis fordøjet med Sau 3A og ligeret ind 10 i lambdafag-kloningsvektor EMBL3A, screenedes for LIF-genindeholdende kloner ved hybridisering med muse-cDNA’et som probe. LIF cDNA-fragmentet blev radioaktivt mærket, og hybridiseringsbetingelserne var som tidligere beskrevet (eksempel 4). I korthed blev fagplaques, der repræsenterer genombiblioteket, dyrket ved en densitet på ca. 50.000 plaques pr. 10 cm 15 Petri-skål og overført til nitrocellulose som beskrevet (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, 1982). Forud for hybridisering inkuberedes filtrene i adskillige timer ved 65°C i 6 x SSC (SSC = 0,15M NaCI, 0,015M natriumcitrat), 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% bovint serumalbumin, 2 mM natriumpyrophosphat, 1 mM ATP, 50 pg/ml denatureres 20 laksesperm-DNA og 50 pg/ml E. coli-tRNA. Hybridisering var i samme opløsning indeholdende 0,1% SDS ved 65 °C i 16-18 timer. LIF cDNA-fragmentet, der var radioaktivt mærket ved nick-translation under anvendelse af [a^P] dATP til en specifik aktivitet på ca. 2 x 10® cpm/pg, medtoges i hybridiserin-gen i en koncentration på ca. 2x10® cpm/ml. Efter hybridisering vaskedes 25 filtrene omhyggeligt i 6 x SSC, 0,1% natriumdodecylsulfat ved 65°C og blev derefter autoradiograferet. Positive plaques på dobbelte filtre samledes op og genscreenedes ved lavere densitet som før.

Der blev således identificeret og oprenset tre kloner: AHGLIF1, -2 og -3. For 30 at bestemme forholdet mellem disse kloner og bestemme hvilken, om nogen, der indeholder det humane LIF-gen, fremstilledes DNA for hver klon og fordøjedes med disse restriktionsendonukleasér: Sal I, der frigør det fulde segment af klonet genomt DNA, og Barn Hl og Pst I, der kløver i og omkring LIF-genet til frembringelse af karakteristiske fragmenter på ca. 3 kbp og 1,8 kbp 35 henholdsvis 0,6 kbp (som bestemt ovenfor). Efter fordøjelse af de rekombi- 54 DK 174970 B1 nante fag-DNA'er og adskillelse ved elektroforese på agarosegeler (figur 24, venstre panel) overførtes DNA til nitrocellulose og hybridiseredes med muse* LIF cDNA-proben (under de ovenfor skitserede betingelser) for at afsløre de fragmenter, der indeholder LIF-genet (firug 24, højre panel). Denne analyse 5 afslørede, at (a) alle tre kloner forekom at være identiske, (b) alle indeholder et ca. 9 kbp genomt DNA-segment, der indeholder en homolog region med muse-LIF-proben, 10 (c) homologiområdet med muse-cDNA'et forekommer på et 3 kbp-Bam Hl- fragment og på 1,8 og 0,6 kbp Pst l-fragmenter, der er karakteristiske for det humane LIF-gen (se ovenfor).

Det blev således konkluderet, at alle tre kloner indeholder et segment af 15 kromosomal DNA, der omfatter det humane LIF-gen.

Trin 3

Bestemmelse af nukleotidsekvensen af det humane LIF-aen 20

Barn Hl-fragmentet af AHGLIF1 på ca. 3 kbp, der er vist ovenfor at hybridise-re med muse-LIF cDNA-proben, genklonedes i plasmidvektoren pEMBL8+, hvilket gav klonen pHGLlFBaml, og underkastedes nukleotidsekvensanalyse. Nukleotidsekventering udførtes ved dideoxykædetermineringsmetoden (San-25 ger, F. et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 74; 5463-5467, 1977) under anvendelse af alkalidenatureret dobbeltstrenget plasmid-DNA som template, et udvalg af komplementære oligonukleotider til sekvenser inden for genet som primere og under anvendelse af både Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase og fuglemyeloblastosisvirus-reverstranscriptase som polymera-30 ser i sekventeringsreaktionen.

Den fuldstændige nukleotidsekvens af Barn Hl-fragmentet, der spænder over LIF-genet (2840bp), bestemtes, hvoraf 1297 bp vises i figur 25. Linieopstilling af denne sekvens med den murine LIF mRNA-sekvens afslørede, at sekven-35 seme, der koder for det modne humane LIF-protein forekommer på to exo- 55 DK 174970 B1 ner, der er adskilt ved en intran på 693bp (figur 25). For det område, der koder for det modne protein, er der en høj grad af homologi mellem de to arter på både nukleotid- og aminosyresekvensen. Inden for exon 1 er der 88% nukleinsyresekvenshomologi (114/129 rester sammenlignet) og 91% amino-5 syresekvenshomologi (39/43) for det område, der koder for det modne protein (position 58-186). Exon 2 er noget mindre homolog, 77% på nukleotidni-veauet (318/411) og 74% på aminosyreniveauet (101/136) inden for det kodende område. Når det modne protein betragtes som en helhed, er muse- og humane LIF-sekvenser, som her bestemt, identiske i 140 af 179 positioner 10 (78%) uden insertioner eller deletioner (figur 26). Desuden er mange af for skellene stærkt konservative substitutioner (Lys:Arg, Glu:Asp og Leu:Val:Ala).

5' af codonet for den N-terminale prolinrest af moden LIF (position 58 i figur 15 25) er det humane gen homologt med den murine LIF mRNA-sekvens igen nem et område, der koder for det meste af den hydrofobe leder. Men den fuldstændige leder er ikke indkodet på dette exon, idet mRNA’et og gensekvenser divergerer ved et typisk RNA-splejsested (TCCCCAG) (Mount, S.M.,

Nucleic Acids Res. 10:459-472. 1982). Den exon, der specificerer det 5'-20 utranslaterede område og de første rester af lederen, forekommer ikke inden for 1097bp 5’ for dette splejsested. I muse-LIF-genet er den exon, der specificerer de første seks aminosyrerester af den hydrofobe leder, lokaliseret ca.

1,5kbp 5' for det analoge splejsested.

25 Trin 4

Aflednino af et kort over restriktionsendonukleasekløvning for det humane LIF-aen 30 Til bestemmelse af dispositionen af restriktionsendonukleasekløvningssteder i og omkring det humane LIF-gen og dermed tilvejebringelse af et molekylært fingeraftryk af dette gen, fordøjedes humant genomt DNA (fra RAMOS-cellelinien) med forskellige restriktionsendonukleaser enkeltvis og i parvise kombinationer og underkastedes Southern blotanalyse som beskrevet i ek-35 sempel 8 med den undtagelse, at den anvendte probe var 3 kbp Barn Hl- 56 DK 174970 B1 fragmentet afledt fra pHGLlFBaml beskrevet i trin 3 ovenfor og radioaktivt mærket ved nicktranslation. Analyse af de således afledte data (ikke vist), såvel som det i figur 22 viste og afledt fra analyse af XHGLIF1 og PHGLlFBaml, bevirkede det i figur 27 viste restriktionsendonukleasekløvningskort.

5

Eksempel 11 Følgende eksempel viser detaljerede modifikationer, der er foretaget på det klonede humane LIF-gen, for at tillade ekspression i gærceller og bestem-10 melse af de biologiske og biokemiske egenskaber ved det således afledte rekombinante humane LIF.

I figurerne, 15 Figur 28: er en gengivelse, der viser trin 1: oligonukleotider anvendt til modifikation af det humane LIF-gen til inkorporering i Yepsecl. Oligonukleotid (a) svarer til 5-enden af det kodende område (rester 31 - 69 i figur 25). Oligonukleotid (b) svarer til midten af det kodende område (rester 16 -186 og 880 - 903 i figur 25). Den del af dette oligonukleotid, der er komplementær med 20 exon 1, er understreget med stiplinger og den, der er komplementær med exon 2, med prikker. Oligonukleotid (c) svarer til 3-enden af det kodende område (fra position 1279 i figur 25). Oligonukleotideme (a) og (b) introducerer de viste restriktionsendonukleasekløvningssteder.

25 Figur 29A οα 29B: er gengivelser, der viser a trin 1: nukleotidsekvens af og aminosyresekvens indkodet af det syntetiske humane LIF cDNA afledt ved mutagenese af det klonede humane LIF-gen. Barn Hl- og Hind lll-kløvnings-stederne, der er introduceret af oligonukleotideme (a) og (c) (figur 28) er vist.

Den formodede N-terminale aminosyre af moden LIF (ved analogi med mu-30 sen) betegnes som+1.

Figur 30: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3: induktion af differentiering i kolonier af M1-leukæmiceller ved fortyndinger af oprenset nativ murin LIF (o-----o) og konditioneret medium fra gærceller indeholdende Yep- 35 sec1/HLIF-rekombinanten induceret med galactose ^_· ). Medium fra 57 DK 174970 B1 uinducerede gærkulturer indeholdende Yepsec1/HLIF-rekomblnanten (o_o) var inaktivt. Der vises gennemsnitsdata fra gentagne 7-dages kulturer.

5 Figur 31: er en grafisk gengivelse, der viser trin 4: konkurrence mellem gærafledt HLIF og nativ murin 125I-LIF om binding til specifikke receptorer på murine M1-celler. Fortyndinger af autentisk nativ murin LIF-A (eksempel 1) (o_o), rekombinant murin LIF ^_· )og konditioneret medium fra gærceller indeholdende Yepsec1/HLIF-konstruktionen, uinduceret 10 (_) og induceret med galactose (□_□) blev afprøvet for evne til at konkurrere om binding af nativ 125I-LIF-A til cellulære receptorer på murine M1-celler ved 37°C, som tidligere beskrevet.

Trin 1 15

Modifikation af det humane LIF-qen for ekspression i gær

Isoleringen af en rekombinant DNA-klon, der indeholder det humane LIF-gen og nukleotidsekvensen af førnævnte gen, er tidligere blevet beskrevet (ek-20 sempel 10). Nukleotidsekvensen af 1297bp af DNA, der spænder over de to exoner, der koder for det modne humane LIF-protein, vises i figur 25.

Murin rekombinant LIF er tidligere blevet produceret i gærceller under anvendelse af gærekspressionsvektoren YEpsecl (eksempel 5). Med denne 25 vektor tilvejebringes en N-terminal ledersekvens, der er afledt fra dræberto-xingenet af Kluweromvces lactis. transcriberet fra en galactose-inducerbar GAL-CYC-hybridpromoter.

For at udtrykke det protein, der er indkodet af det humane LIF-gen i denne 30 vektor, var det nødvendigt at modificere genet på forskellige måder. Ved 5’-enden af det område, der koder for det modne protein, introduceredes et kløvningssted for restriktionsendonucleasen Bam Hl for at tillade insertion inden for læserammen med K. lactis-lederen og bibeholde et passende signal peptidasekløvningssted (Gly-Ser). Den samme modifikation som tidligere 35 anvendt på muse cDNA (pLIF7,2b) udførtes her. I midten fjernedes den mel- 58 DK 174970 B1 lemliggende sekvens på 693bp, hvorved de to exoner i samme translationelle læseramme sammensmeltede. Ved 3'-enden introduceredes et andet translationelt stopcodon umiddelbart 3' for det naturlige stopcodon fugt af et Hind I Il-sted til insertion i YEpsecl. Alle modifikationerne blev opnået ved oli-5 gonukleotidmedieret mutagenese: ca. 3kbp Barn Hl-fragmentet, der spænder over LIF-genet. subklonedes ind i plasmidet pEMBL8+, (Dente, L. et al.,

Nucleic Acids Res. 11:1645-1655, 1983) og enkeltstrenget DNA fremstillet ved F1 superinfektion. In vitro mutagenese udførtes som beskrevet (Nisbet, I.T. og Beilharz, M.W. Gene Anal. Techn. 2:23-29, 1985) under anvendelse 10 af oligonukleotider på 39, 48 henholdsvis 39 baser til modifikation af 5-enden, midten og 3'-enden af genet som beskrevet ovenfor (se figur 28). Nu-kleotidsekvensen af det modificerede humane LIF-kodende område er angivet i figur 29.

15 Trin 2

Introduktion af YEpscel/HUF-rekombinanten i gærceller S. cerevisiae stamme GY1+ (Ieu2, ura3 ade2 trp1 cir+; fra G. Cesareni, 20 EMBL Heidelberg) transformeredes ved polyethylenglycolmetoden (Klebe, R.J. et al., Gene 25: 333-341, 1983). Transformanter selekteredes og vedligeholdtes på syntetisk minimalt medium (2% carbonkilde, 0,67% gæmitro-genbasis (Difco) tilsat 50 pg/ml af de krævede aminosyrer) under berøvelse af uracil. Rekombinant HLIF blev produceret ved én af to metoder. Enten (1) 25 dyrkedes Ura+-transformanter til stationær fase i ikke-selektivt medium indeholdende 2% galactose, og mediummet analyseredes for LIF-aktivitet, eller (2) der dyrkedes Ura+-transformanter til stationær fase i selektivt minimalt medium indeholdende 2% glucose. Cellerne vaskedes herefter og resuspen-deredes i samme volumen af selektivt minimalt medium indeholdende 2% 30 ethanol og dyrkedes i 8 timer til overkommelse af glucoserepression. Transcription af HLIF-insertionet induceredes herefter ved fortynding af cellerne (1:10) i syntetisk minimalmedium indeholdende 2% galactose. Der fjernedes prøvemængder af kultursupematant på forskellige tidspunkter efter induktion, filtreredes gennem Millipore-filtre (0,2 pm) og analyseredes direkte 35 for LIF-aktivitet.

59 DK 174970 B1

Trin 3

Bestemmelse af de biologiske egenskaber ved qærafledt HLIF

5 I lyset af den høje grad af sekvenslighed mellem muse- og human LIF analyseredes aktiviteten af gærafledt human LIF på murine M1-celler. Analyser for differentieringsaktivitet og leukæmisuppresiv aktivitet af gærkonditioneret medium udførtes i 1 ml kulturer indeholdende 300 murine M1 -celler (tilvejebragt af Dr. M. Hozumi, Saitama Cancer Research Centre, Japan) i Dulbec-10 co's Modified Eagle's medium med en slutkoncentration på 20% kalvefoster-serum og 0,3% agar. Materiale, der skal analyseres, tilsattes i seriefortynde-de 0,1 ml volumener til kulturskålen forud for tilsætning af cellesuspensionen i agarmedium. Kulturerne inkuberedes i 7 dage i helt befugtet atmosfære med 10% CO2 i luften. Kulturerne blev bedømt under anvendelse af et dis- 15 sektionsmikroskop ved 35 x forstørrelse, hvor alle kolonier med en corona af dispergerede celler eller bestående fuldstændigt af dispergerede celler bedømtes som differentierede. Morfologisk undersøgelse af kolonier udførtes ved fiksering af den fuldstændige kultur med 1 ml 2,5% glutaraldehyd. herefter farvning af de tørrede kulturer på mikroskopobjektglas under anvendelse 20 af acetylcholinesterase/Luxol Fast Blue/Haematoxylin.

Medium fra galactoseinducerede kulturer af gær indeholdende det humane kodende område i YEpsecl, men ikke fra uinducerede kulturer af samme gærceller, fra kulturer af ikke-transformeret gær eller gær indeholdende vek-25 toren YEpsecl alene, var i stand til at inducere typisk makrofag differentiering i kulturer af M1-kolonier (figur 30). Som med murin LIF reducerede det gærafledte humane materiale også progressivt med stigende koncentrationer antallet og størrelsen af udviklende M1-kolonier. Sammenligning med oprenset nativ murin LIF viste, at det gærkonditionerede medium indeholdt op mod 30 50.000 enheder/ml human LIF.

60 DK 174970 B1

Trin 4

Receptorbindinosspecificitet af aærafledt human LIF

5 Oprenset murin LIF-A (eksempel 1) ioderedes som tidligere beskrevet. Mi-Celler vaskedes og resuspenderedes ved 2,5 x 10®/50 μΙ i Hepes-pufret RPMI-medium indeholdende 10% kalvefosterserum. Celler i 50 μΙ prøvemængder inkuberedes med 200.000 cpm af ^^^I-LIF-A (10 μΙ i samme medium) og 10 μΙ kontrolmedium eller serie-togangsfortyndinger af umærket ren 10 murin LIF-A eller konditioneret medium fra galactoseinducerede eller uindu-cerede kulturer af gærtransformanter indeholdende YEpsecl/HLIF-konstruktionen.

Medium konditioneret ved galactoseinducerede gærceller indeholdende 15 YEpsecl/HLIF-rekombinanten var i stand til at konkurrere med nativ murin

125I-LIF-A om binding til specifikke cellulære receptorer på murine M1 -celler I

i samme udstrækning som nativ eller rekombinant murin LIF-A ved 37°C (figur 31) og ved 0°C (ikke vist). Medium fra uinducerede gærceller og fra gærceller indeholdende vektoren YEpsecl alene gjorde ikke. Der forekommer 20 således at være en stærk konservering af receptorbindingsdomænet i murine og humane LI Fer, der er kompatibel med den høje grad af primær aminosy-resekvenslighed.

Trin 5 25

Oprensning, sekventerinq og iodering af aærafledt human LIF

Human LIF i medium, der er konditioneret ved galactoseinducerede gærceller indeholdende YEpsec 1/HLIF-rekombinanten oprensedes under anven-30 delse af trin 2 og 4 i eksempel 1 med den undtagelse, at den LIF-aktivitet, der binder til DEAE-Sepharose CL-6B-søjlen og elueredes med saltgradienten forenedes i trin 2. Oprenset gærafledt human LIF blev behandlet med radioaktivt iod ved inkubering af 1 pg human LIF i 50 μΙ 0,2 M natriumphosphat-puffer, pH 7,2, med 1mCi Na 125I-LIF og 5 μΙ 0,2 mM ICI i 2M NaCI i 60 se-35 kunder. 12®I-LIF separeredes fra uinkorporeres 125l ved passage af reakti- 61 DK 174970 B1 onsblandingen gennem en søjle af Sephadex G-25M (Pharmacia) ækvilibre-ret i phosphatpufret (20 mM, pH 7,4) saltopløsning (0,15 M) indeholdende 0,02% Tween 20 og 0,02% natriumazid. Human 125I-LIF elektroforeredes på en 8-25% gradient natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel som et enkelt bredt 5 bånd med tilsyneladende molekylvægt på 170.000. Human ^2^I-LIF bandtes specifikt til murine M1-celler og knoglemarvsceller, hvilket bekræftede evnen hos human LIF til at binde til murine UF-receptorer. Oprenset gærafledt human LIF (ca. 10 pg) underkastedes aminoterminal aminosyresekventering som beskrevet i eksempel 2 og gav en enkelt sekvens på: 10

Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala...............

Dette er identisk med den forudsagte aminosyresekvens af human LIF (figur 26) med den undtagelse, at sekvensen begynder ved den fjerde aminosyre 15 sammenlignet med starten af den murine sekvens (eksempel 2), der er:

Pro-Leu-Pro-lle-Thr-Pro-Val-Asn-Ala...........

Dette viser, at den oprensede gærafledte humane LIF mangler de korre-20 sponderende første tre aminosyrer af musesekvensen, men stadig er biologisk aktiv og stadig er i stand til at bindes til den murine LIF-receptor. De første tre aminosyrer forekommer således at være uundværlige for den biologiske aktivitet af LIF.

25 Eksempel 12 Følgende eksempel beskriver de anvendte trin til identifikation og delvis oprensning af formodet nativt humant LIF-molekyle.

30 De ledsagende figurer angår forskellige trin af den nedenfor beskrevne metode. I figurerne:

Fiaur 32: er en grafisk gengivelse, der viser trin 2 af identifikationen af en formodet human LIF: evnen hos forskellige fortyndinger af medium kondition-35 eret med den humane blærecarcinomacellelinie 5637 (ATCC nr. HTB9) 62 DK 174970 B1 (- □ -) rå eller (- + -) ikke-bindende DEAE-fraktion eller af nativ murin LIF-A (- o -) til at konkurrere om bindingen af murin 12^I-LIF-A til cellulære receptorer på murine bughindeceller. Den manglende evne hos human G-SCF (- -) til at konkurrere om binding er også vist (ufortyndet = 5 pg/ml).

5

Figur 33: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3 af identifikationen af en formodet human LIF: fraktioneringen af medium konditioneret med den humane blærecarcinomacellelinie 5637 på en DEAE-Sepharose CL-6B-søjle, elueret nøjagtigt som for den tidligere beskrevne fraktionering af murin LIF-A 10 (eksempel 1), og evnen hos individuelle fraktioner fra denne fraktionering til at inducere dannelsen af differentierede murine M1 -cellekolonier. Panel A viser saltgradienten: Panel B viser fraktioneringen af 5637-konditioneret medium; Panel C viser fraktioneringen af Krebs ll-celle-konditioneret medium til sammenligning.

15

Fia. 34: er en grafisk gengivelse, der viser trin 3 af identifikationen af en formodet human LIF: Fraktioneringen af medium konditioneret med den humane blærecarcinomacellelinie 5637 på en søjle af linse-lectin-Sepharose 4B; elueret som tidligere beskrevet for fraktioneringen af murin LIF-A (eksempel 20 1), og evnen hos individuelle fraktioner fra denne fraktionering til at inducere dannelse af differentierede kolonier af murine M1-cellekolonier. Panel A viser gradienten af α-methyl-DO-mannopyrannosid; Panel B viser fraktioneringen af 5637-konditioneret medium; og Panel C viser fraktioneringen af Krebs ll-celle-konditioneret medium til sammenligning.

25

Trin 1

Medium, der er konditioneret med adskillige humane cellelinier, blev undersøgt for deres evne til at inducere differentieringen og inhibere formeringen af 30 M1 murine myeloide leukæmiceller i semifaste agarkulturer (som beskrevet i eksempel 5, trin 4 af den foreliggende ansøgning). Adskillige cellelinier producerede en sådan aktivitet, hvoraf blærecarcinomacellelinien 5637 producerede de højeste niveauer, men 5637-cellelinien er tidligere vist at producere human G-CSF (Nicola, N.A. et al., Nature 314: 625-628, 1985; Welte, K. et 35 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1526-1530, 1985), som også er aktiv ved 63 DK 174970 B1 induktion af differentiering af M1-celler (Tomida, M. et al., FEBS Lett. 207: 271-275, 1986; Neckers, L.M. og Pluznik, D.H. Exp. Hematol. 15: 700-703, 1987). For at bekræfte, at 5637-celler producerede autentisk human LIF (foruden G-CSF), underkastedes 5637-konditioneret medium yderligere trinnene 5 2 og 3 nedenfor.

Trin 2

Medium, der er konditioneret med 5637-celler, koncentreredes 20 gange og 10 afprøvedes for dets evne til at konkurrere med nativ murin 125I-LIF-A om binding til specifikke cellulære receptorer på murine bughindeceller. Denne konkurrencebindingsanalyse var som beskrevet i trin 5 i eksempel 5 i den foreliggende ansøgning. 5637-Cellekonditioneret medium indeholdt aktivitet, der var i stand til at konkurrere med murin 12^I-LIF-A om binding til cellulære 15 receptorer, og denne aktivitet var koncentreret i den ikke-bindende DEAE-fraktion af 5637 CM (LIF-A) (figur 32). Idet human og murin G-CSF ikke, selv i meget høje koncentrationer, konkurrerer om ^^l-LIF-A-bindingssteder, fastlægger dette forekomsten i 5637-konditioneret medium af en homolog human LIF-aktivitet, der er i stand til specifikt at genkende den murine LIF-20 receptor. Dette antyder stærk konservering af de murine og humane LIF'er i deres receptorbindingsdomæne i overensstemmelse med den høje grad af primær aminosyresekvenshomologi.

Trin 3 25

Medium, der er konditioneret med human blærecarcinoma 5637-celler (2 liter i 10% volumen/volumen kalvefosterserum), koncentreredes til 40 ml og chromatograferedes sekventielt på DEAE-Sepharose CI-6B og linse-lectin-Sepharose 4B som tidligere beskrevet for murin LIF fra Krebs II-30 ascitescellekonditioneret medium. M1-Differentierinsinduceringsaktivitet fra 5637-celler (formodet human LIF) chromatograferet på en meget lignende måde til murin LIF på DEAE-Sepharose med nogen aktivitet, der ikke bandt til søjlen (LIF-A), medens det resterende bandtes og elueredes under salt-gradienten (LIF-B) (figur 33). På lignende måde opførte den formodede hu-35 mane LIF sig som murin LIF ved linse-lectin-Sepharose-chromatografi med 64 DK 174970 B1 en andel af aktivitet, der bindes til søjlen, hvilket antyder forekomsten af man-noseholdige kulhydrater på glycoproteinet (figur 34). Ved sin krydsreaktivitet i induktion af murin M1 -celledifferentiering, sin evne til specifikt at genkende den murine LIF-cellulære receptor og sine biokemiske fraktioneringska-5 rakteristika opfylder den humane aktivitet i 5637-cellekonditionerede medier således kriterierne for den native humane analog af murin LIF.

Nativ human LIF fra 5637-cellekonditioneret medium oprensedes ved trinnene 2 og 4 i eksempel 1, forening af den ikke-bindende LIF-aktivitet fra trin 2 10 og den bindende LIF-aktivitet fra trin 4. Denne forenede LIF-aktivitet fraktioneredes ved modfase-HPLC som for trin 5 i eksempel 1 med den undtagelse, at der to gange anvendtes en Brownlee RP300 C8-søjle, først under anvendelse af en gradient fra 0-60% CH3CN i 0,1% TFA og derefter under anvendelse af en gradient fra 45-55% CH3CN i 0,1% TFA. I den anden gradient 15 elueredes human LIF ved med 50% CH3CN, og ved elektroforese på 8-25% gradient natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgeler vistes et større sølvfarvende bånd på tilsyneladende molekylvægt 73.000. Nativ oprenset human LIF blev behandlet med radioaktivt iod som beskrevet i trin 5 i eksempel 10 og bandtes specifikt til murine M1-celler og museknoglemarvceller som beskrevet for 20 gærafledt human 125-mærket l-LIF (trin 5 i eksempel 11).

Claims (18)

1. 65 DK 174970 B1
2. 1. Polypeptid med leukæmi-hæmmende faktor (LIF)-aktivitet kendetegnet ved, at det er i stand til at undertrykke proliferationen af M1 mye- 5 loide leukæmi celler, at det helt eller delvist omfatter aminosyrese- kvensen vist i figur 15, 26 eller 29 samt at det er i stand til at konkurrere med et polypeptid med nævnte sekvens om binding til specifikke cellulære receptorer på M1 celler eller murine eller humane makrofager. 10
3. 2. Rekombinant DNA-molekyle kendetegnet ved, at det omfatter en nu-kleotidsekvens, der efter ekspression i en passende værtscelle koder for et polypeptid ifølge krav 1.
4. 3. Rekombinant DNA-molekyle kendetegnet ved, at det omfatter en nu- kleotidsekvens, der koder for et polypeptid ifølge krav 1 med aminosy-resekvens udvalgt blandt de i figurerne 15, 26 og 29 fremviste.
5. 4. DNA-molekyle ifølge krav 2 kendetegnet ved, at nukleotidsekvensen 20 hybridiserer med en nukleinsyreprobe, der korresponderer med en undersekvens af en LIF-kodende insertion, der er valgt blandt LIF-kodende insertioner fra kloner pLIF7, pLIFNK2, pLIFNK3 og pHGLIF-Baml.
6. 5. DNA-molekyle ifølge krav 2, kendetegnet ved, at nukleotidet efter eks pression koder for et polypeptid, der er bundet af cellulære receptorer, der binder LIF, hvor bindingen er kompetitivt inhiberet med nativ murin eller human LIF. 66 DK 174970 B1
7. 6. DNA-molekyle ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et replikationsorigin, hvorved molekylet gøres egnet til anvendelse som kloningsvektor.
8. 7. DNA-molekyle ifølge krav 6 kendetegnet ved, at det yderligere omfat ter en promotersekvens, der er operativt forbundet med nukleotidse-kvensen, hvorved molekylet gøres egnet til anvendelse som ekspressionsvektor. 10 8. Værtscelle transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 7, kendetegnet ved, at celleekspressionen er et polypeptid med LIF, der faktisk er under styring af promoteren.
9. 9. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ifølge krav 1, kende- 15 tegnet ved, at den omfatter (a) at værtsceller ifølge krav 8 tilvejebrin ges. (b) at cellerne dyrkes under betingelser, der fremmer ekspression af et polypeptid med LIF-aktivitet, og (c) at polypeptidet genvindes.
10. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at polypeptidet er 20 glycosyleret af værtscellen.
11. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at værtscellen er en gærcelle.
12. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at værtscellen er en mammal celle.
13. 13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at værtscellerne er hæmopoietiske celler. 30 67 DK 174970 B1
14. 14. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at værtscellerne er E. coli-celler.
15. 15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at vektoren er en 5 vektor, der dirigerer ekspressionen af et glutathion-S-transferase/LIF- fusionsprotein.
16. 16. Polypeptid med LIF-aktivitet, kendetegnet ved, at det kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge krav 9. 10
17. 17. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har en aminosyrese-kvens, der omfatter aminosyrerester 179-187 af naturlig murin LIF.
18. 18. Polypeptid ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det har en N-terminal, 15 der mangler mindst de tre første aminosyrerester af naturlig murin LIF.