JPS62223126A

JPS62223126A - 血液幹細胞成長因子

Info

Publication number: JPS62223126A
Application number: JP61066316A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Harigaya; 張ケ谷　健一; Takafumi Furuhama; 古浜　孝文
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1986-03-25
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1987-10-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕本発明はヒト骨髄細胞の血液幹細胞（Ｈｓｍａｔｏｐｏ
ｉｅｔｉｃｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌ　）の増殖分化？刺激し
て各種成熟血球を造らせ、他方では一部白血病細胞株の
コロニー形成を抑制する因子であるヒト血液幹細胞成長
因子（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌ
ｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　：　Ｈ８’）Ｆ　）
に関するものである。

骨髄細胞の血液幹細胞は生体にとって生命の維持や活動
に不可欠のリンパ球、顆粒球、単球、血小板および赤血
球などに増烟分化し、重要な生理的役割を演じている。

この血液幹細胞がそれぞれに増殖分化していくには、種
々の成長因子が関与するといわれている。

特ニ、マウスの造血機構においてはコロニー刺激因子（
ｃｏｌｏｎｙ　５１ｔｉｍｕｌａＺ１ｎｇ　ｆａｃｔｏ
ｒｓ　（Ｃ８Ｆｇ　）　：例えばＣ）Ｍ−Ｃ８Ｆ　、　
Ｇ−Ｃ’ＳＦ　、　Ｍ−Ｃ８Ｆなど〕、インターロイキ
ン３（ＩＬ３）などの数種類の成長因子が良く知られて
おり［Ｎａｔｕｒｅ　３８９　、７４６−７４１（１９
８４）ｌ、これらの成長因子が複雑に関与して造血を制
御しているものと考えられる。史に、これらの成長因子
のうち、いくつかは造血微小環境を構成している骨髄間
質細胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅ
ｌｌりで産生されることも知られている（Ｐｒｏ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　７８　、６９８３　（１
９８１）　、　Ｎａｔｕｒｅ　３６１　。

５３３　（１９８５）］。

しかし、ヒトにおける造血機構の実態は現在はとんど不
明である。その最大の原因は骨髄由来の細胞が産生ずる
成長因子、特にマウスに２けるＩＬ３の様に未分化の血
液幹細胞に働き増殖分化を促す血液幹細胞成長因子、の
実体をつかみ得なかったことにあると考えられる。

従って、ヒト血液幹細胞成長因子の実体が明らかになり
、更に遺伝子操作等によりこの成長因子ヲ曾産できれば
、造血の＠作の解明はもとより、血液疾患の病態の把握
および治療等に極めて大きな効果をもたらすことは明ら
かである。

本発明者らはヒト血液幹ａ胞成長因子について鋭意研究
の結果１本発明を完成した。

本発明はヒト血液幹細胞成長因子に関する。

即ち１本発明によりヒト骨髄間質細胞株［ｋｒｉｇａｙ
ａ　Ｋ、ａｎｄ　Ｈａｎｄａ　［（、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８２　。

３４７７　（１９８５，ｌ　］　　の坩接養上から各植
クロマトグラフィーを用いてヒト血液幹細胞成長因子が
分離精φシして得られ比。

〔発明の構成〕

得られたヒト血液幹細胞成長因子（以下、「本因子」と
いうつの性質は次の通シである。

１、　物理化学的性質（１）熱安定性６０°Ｃ２３０分処理にて安定である。

（２）酸安定性ｐＨ２−０＊　’℃で一夜処理にて安定である。

（３）　　分子量約４５，０００である〔ゲル濾過高速孜体クロマトグラ
フィーでｓｗ　−３ｏｏｏカラム（来年曹達工業■社製
）を使用〕。

（４）等電点約４．９である［Ｃｈｒｏｍａｔｏ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ
　Ｍｏｎｏ　Ｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　？ｆ　Ｈ
＋スウエーテン）を使用］。

（５）　　糖蛋白である［Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ
セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、スウェーデン
）に成層される〕。

λ　生物学的性質（１）　　ＣＰＵ−Ｇ　、　ＣＦＵ−Ｍ　、　ＣＦＵ−
ＧＭ　、　ＣＦＵ−Ｎｏ　。

ＢＦＵ−ｅ（それぞれ顆粒球、マクロファージ、和粒球
・マクロファージ、好酸球、赤血球に分化することを決
定づけられた血液幹細胞）およびＣＦＵ−ｍｉｘ　（多
軸の血球に分化する能力を有する血液幹細胞）に対し影
４に全与え、その維持、増殖および分化を促す。

（２）　　よシ未分化な血液幹細胞であるＣＦＵ−ｍｉ
ｘおよびＢＦＵ−ｅに対して、他の血液幹細゛胞におけ
るよりも低濃度（１１５以下）で刺激効果を有する。

（３）　　ヒト骨髄細胞の液体培養において、Ｎｏｎａ
ｄｈｅｒｅｎｉ　ｃｅｌｌ　　（器壁に付層しないａ＊
ｉもち、かつ増殖分化し、白血球や赤血球やリンパ球等
となる細胞〕中のＣ［ｔ’Ｕ−ｃの維持および数の増加
を引き起こす。

（４）　　白血病細胞株ＷＥＨＩ　−３の軟摩天培地中
でのコロニー形成全阻害する。

以上の本因子の性質は虜に一定であり、本因子は性格の
異なつ九谷撞クロマトグラフィーによｐ分離することは
できない。しかも、最も精製し北本因子は０．４ｎ、ｊ
ｉ’／ゴの低濃度で生物活性を有していることから、単
一物質が本因子の生物活性ヲ有していると推定される。

〔発明の効果〕

次に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明する。

実施例１、　本因子の精製（１）　　［（８Ｃ）Ｆの活性測定法下記の方法により、Ｈ８ＣＦの存在を以下の精製各段階
で測定した。

５×１０個の正常ヒト骨髄細胞を直径３５關のベトリ皿
（Ｌｕｘ社製、米国〕にまき、８日後にエリｘｏポイエ
テン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）ｆ　添加するＢ
ＦＵ−ｅのコロニー形成法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃ１−ｍ旦、　１４７７　（１９８５））にて培養し
、１６ｉ日後に赤く呈色したＢＦＵ−ｅおよびＣＦＵ−
ｍｉ工由来のコロニー数を算定した。

（２）精製材料ヒト骨髄細胞株培養上清は、ヒト骨髄間質細胞株（ＫＭ
　１０１〜ＫＭ　１０５　：前記Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＊
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　８２　、３４７７　（１９８５）参照）ｉ
２０％ウシ胎児血清を含む培地（１ｓｃｏｖｅｓ　ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭＥＭ　。

Ｆｌｃｎｖ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製、米国〕　で培
養し、コン７レント後血清を含まない同培地と交換し３
日間培養して各々の上清を得た。

（３）精製法 ■　硫安分画による精製（２）で得られたヒト骨髄間質細胞株ＫＭ１０３の無血
清培養上清６−ｅｉペリコンラボカセット（限外濾過膜
としてＵ　Ｆ　ＩＤｅｍｂｒａｎｅ　ＮＭＷＬ　１００
００使用、ミ１１ボア社製、米国）で１０倍濃縮後、硫
安を加えた。次いで、８０チ飽相誠安土清を３３ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐ！（７，２）で透析し、脱塩
後、更に６０−１で濃縮し皮。

■　ＤＥＡＩＥ−Ｔｏｙｏ　ｐｅａｒｌ　６５０カラム
クロマトグラフイーによる精製３３　ｍＭ　＋１７　酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２
）で平衡化したＤＥＡＲ−Ｔｏｙｏ　ｐｅａｒｌ　６５
０　　（東洋曹達工業−社製）をカラム（φ２６　Ｘ　
４Ｇ０　ｒｍ）に充填し１次いで■で得られた濃縮サン
プルをこれば添加し７食塩濃度をＯＭから０．５Ｍのリ
ニアグラジェント（全１ｔｌＡ）にて溶出し友。

本因子は０．２５〜０．３Ｍ食塩濃度の間に溶出され友
。このフラクションヲ集め、ＰＢＩＩＩ　（Ｐｈｏａｐ
−ｈａｔｅ　ｂｕｆｆｓｒｅｄ　５ｅｒｉｎｅ　、　Ｓ
ｉｇｍａ社製、米国）で透析後、４０−に濃縮し友。

■　Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌａｃｔｉｎセファロース　カラム
クロマトグラフィーによる精製ＰＢＳで平衡化した８ｒｎｌ！のＬｌｉｌｒｌｔｉｌ　
Ｌｅｃｔｔｎ　　セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製、スウェーデン）′！ｉ−カラムに充填し、欠いで■
で得られた濃縮サンプルをこれに添加しＰＢＳで非成層
蛋白金浴出した後、０．３Ｍα−メチル−〇−マンノシ
ド（α−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｓ、）　
ｆ含むＰＢＳで溶出した。カラムに板層したフラクショ
ン全セントリコン−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製、米国）を
用いて２．５−まで濃縮した。

■　ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーによる精製 ■で得られｆｃｌｌ１１縮サンプルｉ　０．３　Ｍ食塩
お！ヒｏ、１％ポリエチレングリコール金含んだ３３ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩；ｔｘｔｇ（ｐ［（６，４）で平
衡化し７’５　ｓｗ　−３０００カラム（東洋曹達工粟
（掬社製〕に０．５ゴづつ添加し、同緩衝液で溶出しｔ
０本因子は分子量約４５，０００前後のフラクションに
溶出された。

■　逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 ■で得られた活性フラクション金セントリコ−／−１０
′ｊｔ用いて０．５　ｆｎｔまで濃縮した。次いで０．
０５％リン酸緩衝液で平衡化したＰｒｏ　ＲＰＣ＋（Ｒ
５／ｌｏカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、ｔｔ製、スウ
ェーデンノに添加し、浴出液のアセトニトリル濃度全０
チから６０％まで変化させて浴出した。本因子はアセト
ニトリル濃度３８％から４２チの間に溶出された。この
段階まで精製しｔ本因子は０．４　ｎｇ／ｍｌの濃度で
十分活性を有していた。

２、　本因子がヒト骨髄細胞の血液幹細胞に対して種々
の生物活性を有していることの確認。

（１）ＣＦＵ−ｃおよびＢＦＵ−ｅの増殖分化における
本因子の影響。

■　ＣＦＵ−ｃの増殖分化の測定は正常ヒト骨髄細胞を
標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｓｌｌ）として軟寒天（０
，３％）コロニー形成法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、、　７８　。

６９６３　（１９＋１１）　］にてコロニー形成を行い
、１４日目に形成されたコロ＝−（ＳＯ個以上の細胞の
集まり）数を算定する拳によ９行つ尺。

更に寒天培地を乾燥固定後、染色してコロニーを形成す
る細胞種の同定全行った。

■　ＢＦＵ−ｅの増殖分化の測定は８８目にエリスロボ
イエチンを添加するＢＦＵ−ｅコロニー形成法［Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８２　、３４７
７　（１９８５）：］でメチルセルロース（Ｏ，ａ％）
中テコロニー形成金行い、赤く呈色するＢ［ｉ’Ｕ−ｅ
およびＣＦ’Ｕ−ｍｉｘ由来のコロニー数ヲ算定する手
によって行った。

結果から明らかの如く、精製し九本因子であるヒト血液
幹細胞成長因子はＣＦＵ−ｃアッセイおよびＢＦＵ−ｅ
アッセイのいずれの方法においてもコロニーを形成させ
た。そして、ＢＦＵ−ｅアッセイの方がＣＦＵ−ｃアッ
セイに比べて５倍以上の低濃度でもコロニーの形既が認
められた。

また、ＣＦＵ−ｃアッセイの染色結果より頼粒球、マク
ロファージ、好ν球およびそれらの混合コロニーが形成
されておｐ％ＢＦＵ−１）アッセイでは常にＣＦＵ−ｍ
ｉｘ由米のコロニーが見られた。

（２）正常ヒト骨髄細胞の液体培養における本因子の各
種血液幹細胞に対する影響。

正常ヒト骨髄細胞（１〜３　Ｘ　１０５個）を各種濃度
のヒト骨髄間質細胞株ＫＭ　１０２　（この細胞株は生
に本因子を産生じており、他のＣ８Ｆ産生は見うけられ
ない）のｃｏｎｄｌｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍを含む
７ゴの培Ｍ！（ｌ５Ｔｃｏｖｓ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ
　Ｄｕｌｂｅｃｃａ’、ｓ　鮒。

Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製、米国）で３７℃
で培養した。

１週間後に細胞数を算定し、また血液幹細胞の数をＣＦ
Ｕ−ｃ測定により算定した。

結果全第１図および第２図に示す。

結果から明らかの如く、ヒト骨髄間）Ｘ細胞株ＫＭ１０
２のｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍはその添加
鼠に従い細胞数を増加させｆｃが、それ以上に血液幹細
胞数を約２倍に増加させるという特注を示した。本因子
も同様の結果であった。

３、　本因子が白血病細胞株の増殖に対して影響を与え
ることの確認。

（１）不因子のＷＥＨＩ−３のコロニー形成に対する影
響マウス骨髄性白血病細胞株ＷＥＨＩ−３（５００ｉ固）
ｆ　２４　ｗｅｌｌｓ　ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ　（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社製、米国）にまき、０．３チ寒天培地中で
コロニー金形成させ穴。このときに本因子およびヒト骨
髄間質細胞株ＫＭ１０２のｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍ
ｅｄｉｕｍ　ｆ添加した。

結果を表３に示す。

表３　本因子の白血病細胞株ｗｇＨｚ−３ＮＵ胞のコロ
ニー形成に対する影響（注２　）　　ＫＭ１０２　ｃａｎｄｉｔｉｏｎｓｄ　
ｍｅｄｉｕｍ　ｆ　１０　％濃度で添加した場合（注３
）精製本因子を各濃度で添加した場合（注４）　５チの
危険率で有意差あり（注５）　１チの危険率で有意差あり結果から明らかの如く、本因子を１０％添加した場合お
よびヒト骨髄間質細胞株ＫＭ１０２のｃｏｎｄｌｔｉｏ
ｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　　ｆ添加した場合に有意にコロ
ニー形成を阻害した。

【図面の簡単な説明】

第１因は正蕗ヒト骨髄細胞の液体培養における細胞数の
変化に対する本因子の影ｖｔ−示す。図中、縦軸は細胞数（ｘｔｏ、’フフスコ）を示し、横
軸はＫＭ　１Ｇ２　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｄ　ｍｅｄｉｕ
ｍの添加濃度（％）’ｅ示す。第２図は正常ヒト骨髄細胞の液体培養における血液幹細
胞数（ＣＦＵ−ｃ）の変化に対する不因子の影響を示す
。図中、縦軸は血液幹細胞数（ＸＩＯ５／フラスコ）を示
し、横軸はＫＭ　１０２　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍ
ｅｄｉｕｍ　　の添加濃度（％）を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

ヒト骨髄細胞の血液幹細胞の増殖分化を刺激し、他方で
白血病細胞株のコロニー形成を抑制する因子であるヒト
血液幹細胞成長因子。