JPH02227089A

JPH02227089A - 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法

Info

Publication number: JPH02227089A
Application number: JP1046420A
Authority: JP
Inventors: Shuji Mimura; 三村　修治; Kazuhiko Arai; 一彦新井; Nobuo Sakai; 酒井　伸夫; Toshihiko Umeda; 俊彦梅田; Atsushi Asakura; 淳朝倉; Akiyo Nakada; 中田　晃世; Hiroyasu Suzuki; 弘康鈴木
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1989-03-01
Filing date: 1989-03-01
Publication date: 1990-09-10
Anticipated expiration: 2014-01-13
Also published as: JP2846331B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、哺乳動物の骨髄白血球前駆細胞に作用して、
マクロファージへの分化増殖を促進する新規な物質（以
下、Ｍ　−Ｃ８Ｆという）に関し、Ｍ　−Ｃ８Ｆ産生細
胞の大量培養によるＭ　−０８Ｆ工業的量産法を確立し
、それによって得られ′ｉｉ′／ｃＳＦヲ抗癌剤、放射
線照射等による白血球減少症あるいは檀々の感染症の治
療剤としての医薬への応用ならびに白血球減少症、再生
不良性貧血等の疾病の診断に応用することを目的とする
。

〔技術的背景〕

Ｃ８Ｆは、２層軟寒天培養法で骨髄白血球前駆細胞を培
養するとき、その前駆細胞を分化および増殖せしめ、成
熟血液細胞（好中球系顆粒や単球−マクロファージ）か
らなるコロニーを形成するのに必要な因子である（　Ｉ
ｃｈｉｋａｖｒａ　Ｙ、　ａｔ、　　ａｌ　：Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　５
６巻、ｐ−４４８，１９６６年、Ｍｅｔｃａｌｆ　Ｄ、
　　：　Ｒｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　　１巻、ｐ、１
８５．１９７３年）。

０８Ｆには、さ１ざ１なタイプの活性体が知られており
、顆粒球コロニー形成を誘導するＧ　−０８Ｆ’、単球
／マクロファージコロニー形成ｔ−誘導するＭ−Ｃ８Ｆ
、両方のコロニー形成を誘導するＧＭ−１８Ｆ、好酸球
、肥満細胞、巨核球、赤芽球を含むさ１ざ！な細胞から
なるコロニー形成ｔＳ導するＭＵＬＴＩ　−Ｃ８Ｆ　（
多機能型Ｃ８Ｆ　）などがあげられ、本発明は、ヒ）　
Ｍ　−０８Ｆに関するものである。

ヒトＭ　−０８Ｆは、すい臓癌細胞（ＭＩＡ　ＰａＣａ
　）、肺癌細胞、腎癌細胞等の培養液や人尿にその活性
が認められ、現在、ＭＩＡ　ＰａＣａ細胞及び人尿より
分離されたＭ　−０８Ｆが研究に用いられている。ヒト
尿Ｍ　−０８Ｆの研究によれば、ヒト末梢血卓球をＭ　
−０８Ｆで前処理することによｆｉ、Ｇ−０８ＦやＧ　
Ｍ　−０８Ｆの産生を誘導する作用を持つことが認めら
れる（元吉：日本血液学会雑誌５０巻、ｐ。

１５５７　１９８７年）。一方、ヒト末梢血単球’Ｉｒ
−インターフエａン、Ｇ　Ｍ　−０８Ｆ　、　Ｔｕｍｏ
ｒＮｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＴＮＦ　）やＰ
ｈｏｒｂｏｌ　ＭｙｒｉｓｔａｔｅＡｃｅｔａｔｅ　（
ＰＭＡ　）で処理するとＭ　−Ｃ８Ｆ　ｔ−産生するこ
とも認められている（　Ｊ、　Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ　ｅ
ｔ、　ａｌ。

：　Ｂｌｏｏｄ　　６９巻、ｐ、　１２５９．１９８７
年、Ｗ、　０ａｔｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、　：　Ｂｌｏｏ
ｄ　　７　Ｑ巻、ｐ、１７００．１９８７年、Ａ、　Ｒ
ａｍｂａｌｄｉ　ｅｔ、　ａｌ、　：　Ｂｌｏｏｄ　６
９巻、ｐ、１４０９．１９８７年）。

１九、癌化学療法や骨髄移植後の顆粒球減少症に対して
、ヒト尿Ｍ　−０８Ｆ投与により、顆粒球数の回復の促
進も認められ始めている（元吉：　ＭａｄＩｍｍｕｎｏ
ｌ、　　１２巻、ｐ、３６　１９８６年）。−方、Ｍ　
−０８Ｆは、単球やマクロファージの長期生存と機能維
持に努めているとも報告されている（　５ｕａａｎｎｅ
　Ｂｅｃｋｅｒ　：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３
９巻、ｐ−３７０３１９８７年）。妊娠中に、子宮内の
Ｍ　−０８Ｆ　ｆｉ度が、１，０００倍以上にも上昇し
ていること（Ｂａｒｔｏｃｃｉ　Ａ、　：　Ｊ、　Ｅｘ
ｐ、　Ｍｅｄ、　　１６４巻、ｐ、　９５６．１９８６
年）及び妊婦において、血清中Ｍ　−Ｃ８Ｆ　＠が上昇
していることから（Ｔ。

Ｈａｍａｍｕｒａ　ｅｔ、　ａｌ、　：　Ｂｌ−ｏｏｄ
　　７２巻、ｐ、８８６．１９８８年）、胎盤発達や胎
児発育過程に何らかの役割上演すると思われ（Ｐｏ１ｌ
ａｒｄ　Ｊ、　ｅｔ、　ａｌ、　：Ｎａｔｕｒｅ　、　
　３３０巻、ｐ−４８４，１９８７年）、新しい生理作
用を持つことも予想される。

将来、Ｍ　−０８Ｆとモノクロナール抗体との併用によ
りマクロファージを活性化し、抗体依存性細胞障害作用
（ＡＤＣＣ）　ｔ−患者の体内に再現する幅広いガン治
療の可能性、Ｍ　−０８Ｆのガンに対する直接効果、肺
炎などの感染症治療に期待がかけられている。以上のよ
うに、と）　Ｍ　−Ｃ８Ｆの医薬品や診断剤としての価
値がかなり注目される。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕しかしな
がら、現在、公知のＭ　−Ｃ８Ｆ産生細胞の生産性は、
ヒト胃癌細胞では、培養液１）当９３００単位（特公昭
６３−１４９４７号公報）、ヒト肺癌組繊細胞では、培
養液１ＷＬｔ当り３５０単位（特公昭６３−１８４７０
号公報）、ヒト白血病Ｔ細胞由来株化細胞では、培養液
１）当９３０７単位である＜Ｂ＃開昭５９−１６９４８
９号公報）。

このように、細胞培養でのＭ　−Ｃ８Ｆの生産性は、極
めて低く、工業的生産は、難しいのが現状である。１几
、ヒト尿全原料として、Ｍ　−Ｃ８Ｆが単離されている
（特開昭６３−１９８７００号公報、特開昭６３−２５
０４００号公報）が、凍原中のＭ　−Ｃ８Ｆ量は約３０
単位／１！Ｌｔと低く、そのうえ原料に制限があシ、常
に一定のＭ　−０８Ｆ活性を有する標品全安定的に大量
製造することは、困難である。

正常人中に存在する天然型Ｍ　−０８Ｆ　（元吉二組織
培養、１４巻、ｐ、２４２．１９８８年、Ｔ。

Ｈａｎａｍｕｒａ　ｅｔ、　ａｌ、　：　Ｂ１００（１
７２巻、ｐ、８８６．１９８８年）の増得手段として、
尿以外に正常単球から生産させることも考えられるが、
末梢血よシ正常単球を大量採取し、天然型Ｍ　−ＣＢＦ
　ｔ−得ることは、尿から得るよりさらに固唾である。

大量にＭ　−Ｃ８Ｆ　’に産生させる方法として、遺伝
子組換え技術による生産が行われているが、メチオニン
付加や天然のＭ　−０８Ｆとは、異な、る糖鎖が結合し
７’（０８Ｆが生じることから、抗原性等の問題が生じ
る可能性がある。

そこで天然由来のＭ　−Ｃ８Ｆと同一の生理作用を有す
るＭ　−Ｃ８Ｆ　ｉ−高い濃度で産生ずる細胞株及び産
生方法の開発が強く望ｌれている。

〔課題ｔ−解決する几めの手段〕

本発明は、骨髄細胞に作用して単球−マクロファージの
分化増殖を促進させる糖蛋白質からなり、下記理化学性
質を有する骨髄細胞分化増殖因子である。

（ａ）　　分子量が、非還元条件下で８Ｄ８ポリアクリ
ルアミドｒル電気泳動により測定すると３８０００±５
０００ダルトンであシ、非還元条件下ゲルロ過法で測定
すると５６０００±９０００ダルトンであり、（ｂ）　　逆相ＨＰＬＣにおいて単一のピークとして移
動し、（ｃ）　　比活性が少なくともｌＸ１０８単位／ｌｌ５
ｉ＋蛋白質であシ、（ｄ）　　蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
８ｏｒ−Ｈｌｓ−Ｍｅｔ−工ｌｅ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−８ｏｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ｒｌｅ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｇｌｎ
−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｃｙｓ＋−Ｇｌｎ
（ｌｅ−’ｒｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｊ
ｕｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−（
以下、アミノ酸配列〔Ａ〕とする。）およびＧｌｕ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−８
ｅｒ−Ｈｌｓ−Ｍｅｔ−ｒｌｅ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−
Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−工
１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ’−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−（以下、アミノ酸配列ＣＢ）とする。）である。

ｌｔ、本発明は、ヒト骨髄性白血病細胞から分離され几
細胞のクローンであって、血清を含む組織培養培地で増
殖し、化学試薬により誘導後、無血清培地、または無蛋
白培地中に多量の骨髄細胞分化増殖因子を長時間産生す
る性質を有すること’に％徴とする上記の骨髄細胞分化
増殖因子産生細胞である。

さらに、本発明は、下記特徴を有する本発明細胞由来Ｍ
　−０８Ｆ　Ｆ）製法である。

■　上記のヒト骨髄性白血病細胞上無蛋白（または無血
清）条件下で培養し、 ■　■の培養上清を濃縮後、ｐＨ２，５〜５．０の条件
下で前処理し、不溶画分を分離し、 ■　■の処理液をｐＨ５．０〜７．５の条件下で陰イオ
ン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交換体に吸着
させた後、０．０５〜０．３Ｍ無機塩溶液にて溶出され
る分画を集め、 ■　■の分画ヲ１．０〜１．５Ｍの無機塩濃度に調整し
、Ｐ）（６，０〜８．０の条件下で疎水性吸着体に吸〜
させた後、０．１〜０．５Ｍの無機塩溶液により溶出さ
れる分画を集め、 ■　■の分画濃縮液をゲルロ過剤と接触させ、相対溶出
液量が１．５〜１．８の分画を取得し、■　■の溶出液
を逆相イオンクロマトグラフィー操作を行う。

本発明者等は、天然型Ｍ　−Ｃ８Ｆ　’ｉ大量かつ容易
に取得するための手段について、検討金かさね、骨髄性
白血病細胞から１つたくアルブミン等の蛋白を含まない
無蛋白培地１−培養液歯ル、約１０．０００単位のＭ’
−ＣＢＦｆｃ長時間産生ずる細胞の取得に成功した。こ
の細胞ｔ−ＤＫ−２と命名し７？−ＯこのＤＫ−２細胞の大きな特徴は、誘導後、Ｍ　−Ｃ８
Ｆ　ｉ産生さゼる場合、産生培地中に血清が含１れると
、Ｍ　−Ｃ８’Ｆの産生がないか、或は産生されても弱
く、血清を含１ない培地においてＭ　−０８Ｆの高産生
が持続し九。誘導剤は、Ｍ−Ｃ８Ｆ産生培地、即ち無蛋
白（或は無血清）培地存在下で、数日間培養することに
より、安全に大量の細胞金取シ扱うことができ、かつ高
生産のＭ　−０８Ｆｔ取得でき、数日後は、誘導剤非存
在下の新しい無蛋白培地で培養しても、Ｍ　−Ｃ８Ｆの
高生産が続き、数日間毎の培地交換で数回産生させるこ
とを可能としｔｏこの培養液２５リツトルは、３×１０
８単位のＭ　−Ｃ８Ｆ量を含有し、これは、尿の約１０
トン分に相当する。

このように天然型Ｍ　−Ｃ８Ｆ　ｉ均質な状態で、安価
に大量生産することを可能とし、得られ几天然型Ｍ　−
Ｃ８Ｆの構造的特性及び理化学的特性全解明し、この物
質を同定することに成功し、かつ、こ成するに至り九。

以下、本発明細胞の樹立及び細胞学的特性につの検索に
つき種々の研究を重ねる過程において、ヒト骨髄性白血
病患者よシ株化された細胞に、他の検索細胞よシ高、？
ｃｓＦ’活性が認められるのを見いだし、更に選別培養
を繰シ返し文結果、１−０８Ｆ産生能を有する細胞全所
ｔに単離することに成功し、これを培養株化細胞として
確立し、ＤＫ−２と命名し、この細胞を微工研に寄託し
ｔ（嗜工研条寄第２２７７号）。

細胞株の樹立急性骨髄性白血病患者の末梢血から、ヘパリン加デイス
ポーデブル注射器にて採血し、遠心し、白血球を分取し
、赤血球除去用トリス緩衝液を添加し、遠心し友。ＲＰ
ＭＩ　１６４０　（ＧＩＢＣ！Ｏ社）で洗浄後、５０μ
９／Ｒｔカナマイシン（シグマ社）及び２０　（ｖ／ｖ
　）　１牛脂児血清（Ｆｅ２　）　を含むＲＰＭＩ　１
６４０に懸濁し、２４ウエルプレート（ファルコン社）
で３７℃、５嗟炭酸ガス及び９５憾空気のインキュベー
ター内で培養する。２−３日毎に半分培地交換を行う。

約７ケ月後、親株として、１０４　Ｆｅ２を含むＲＰＭ
Ｉ　１６４０で、を示す株を選択して、株化細胞Ｄｘ−
２に得る。

細胞学的特性このようにして、樹立したＣ８Ｆ産生細胞（ＤＫ−２）
の細胞学的特性は、下記のとおシである。

１）細胞の形態：はぼ球形、卓球細胞様２）染色体数　
：染色体数７５本のモーダル・ナンバーを示すこと全特
徴とする染色体数の分布モード３）継代培養　：無限な継代培養可能４）機能的特徴：誘導後、マクロ７アージ様（付着細胞
）に変わシ、無蛋白及び無血清培地中に持続してＭ−Ｃ８Ｆの高生産がある。

５）細胞増殖性：懸濁状態で良（増殖する。世代倍加時
間は２１．１時間である。

６）血清の要求性＝１０俤のＦｅ２　ｔ″含むＲＰＭＩ
１６４０培地で増殖。

本発明では、上記のＭ　−Ｃ８Ｆ産生細胞株ＤＫ−２１
−血清培地中で増殖させ、細胞を回収し、血清除去を行
い、誘導剤添加無蛋白培地又は無血清培地中で培養する
ことにより、Ｍ−Ｃ８Ｆを産生ずる。

Ｍ　−０８Ｆ竜生用無蛋白培地としては、ＲＰＭＩ　１
６４０培地やｇ　−ＲＤＦ培地（極東製薬社）がのぞま
しい。

！７ｔｊ、Ｍ−Ｃ８Ｆｉ生用無血清培地としては、Ａ８
Ｆ培地（味の素社）やセルグロッサ−Ｈ（住友製薬社）
等が市販されて利用できるが、ＲＰＭ１）６４０培地や
Ｅ　−ＲＤＦ培地を基本培地とし、これに牛血清アルブ
ミン１０〜１００Ｑ／ｌ、インシュリン５ｒｎｙ／Ｉｓ
　　）ランスフェリン５ダ／Ｉｔ、エタノールアミン１
．５３＃／ノ、亜セレン酸ナトリウム０．００４３ダ／
ｌ、　カナマイシン５０μｇ／Ｉｔ−含む無血清培地が
望ましい。

次に、本発明細胞からのＭ　−Ｃ８Ｆの産生方法につい
て述べる。

Ｍ　−Ｃ８Ｆ高産生株ＤＫ−２のＭ　−０８Ｆの誘導剤
トシテ、ホルボール１２−ミリステート１３アセテート
（ＰＭＡ　）やメゼレイン等のホルボールエステル類、
レテノイツクアシツド（ＲＡ）、ジメチルスルホキサイ
ド（ＤＭＳＯ）　ｔ−使用できるが、ＰＭＡが誘導能が
高く好適に使用できる。

通常、細胞濃度は、０．５〜２Ｘ１０’個／―筐で増殖
させることができ、細胞を遠心分離法により回収して、
カルシウム・マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食
塩水ＣＰＢＳ　）で洗浄し、除血清を行い、細胞濃度１
〜２Ｘ１０’個／ＩＩＬｔに調製し、誘導剤であるＰＭ
Ａ　？直接、産生培地に添加し２４〜９６時間培養し、
Ｍ　−０８Ｆ産生工程とする。

後は、一定時間毎に培地全交換すればよい。誘導剤は、
最初の数日間のみ添加するだけでよいが、その後の産生
培地にも添加してもよい。

このようにして、回収され九培養上清は、補助的蛋白質
が含１れないため、製造コストが安価であり、かつ精製
コストも経済的である。

本発明に係わる細胞株は、誘導後、付着性細胞となる几
め培養容器から培養上清の分離は、容易である。

更に、本発明細胞衆生Ｍ　−ｆ：！８Ｆの分離精製につ
いて、詳記する。

Ｍ　−Ｃ８Ｆの分離精製培養上清の精製方法としては下記の手段が用いられる。

■　細胞培養上清ｔ−０，２２μ無菌フイルターで処理
し、限外口過膜方式で濃縮し、それｔ−ｐＨ２，５〜５
．０に調整し低温静置により析出物を遠心分離機で分離
し九培養濃縮原液金調製する。

■　ので得られ几溶出液のＦＪ′Ｉｔ−調製し、同じ一
領域の緩衝液で緩衝化し几陰イオン交換体、例えばＤＥ
ＡＥ−セルロースと接触させ、吸着物を無機塩、例えば
塩化す）　ＩＪウムを含む緩衝液（ｆＪ′１６〜８）全
周いて塩濃度全連続的に高めてい（直線濃度勾配溶出法
により溶出させ、塩濃度の緩衝液により溶出される分画
を集める。

■　■の分画液に無機塩、例えば硫酸アンモニウムを添
加し、ｐＨ４−，１）製してから、あらかじめ無機塩、
例えば硫酸アンモニウムを含む緩衝液で緩衝化させ丸線
本性クロマトグラフィー用樹脂、例Ｌ　Ｉｄフェニルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ、！７ｔｊはオクチルセファロー
スなどに接触させ、次いで、吸着物ｔ−ＩＭから０．１
Ｍの無機塩、例えば硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐ
Ｈ６−８）を用いて高い塩濃度から低い塩濃度へと塩濃
度を変化させる直線濃度勾配溶出法により溶出させ、塩
濃度の緩衝液により溶出される分画を集める。

■　■の溶出液を分子篩クロマトグラフィーの目的でゲ
ルロ過剤、例えばセファデックスＧ−１５０、バイオゲ
ルＰ−１００または無磯系デルロ過剤などを充填し九カ
ラムに通液して溶液中紙ｓｐ　２充填剤に吸着させた後
、無機塩緩衝液にて溶出せしめて相対溶出液量が１．５
〜１．８である分画を集め、脱塩、濃縮する。

なお、相対溶出液量とはＶｅ　／　ｖｏで表される数値
である（　Ｗｅはカラムに通液する試料液がカラムから
溶出する液量を示し、ｖＯはカラム内のゲル粒子外部の
溶液量を示す）。

また、この操作は以下の高速液体クロマドグデフイー（
Ｅ（ＰＬＯ）システムを用いても冥施できる。

１ず前工程からの濃縮液上０．１５Ｍの無機塩を含む緩
衝液（ｐＨ７，４）で平衡化する。これをＦＩＰＬＣ用
ゲルロ過カツム、例えばスーハーロー、ｌ”１２カラム
（ファルマシア社）１７’ｔは’Ｉ’８Ｋ　−Ｇ３００
０８Ｗ（東洋曹達社）或はこれらに相当する充填カラム
に通液し、Ｍ−０８Ｆ活性を有する分画を集める。

■　■の分画を１逆相型イオンクロマトグラフイ充填剤
に、対イオンを含む溶離液を用いて、イオン成分を中性
物質と交換し、分配平衡の差を利用して分離する高速液
体クロマトグラフィーの１種であシ、この目的のための
充填剤として！Ｘ、Ｔ８ＫｒルＯＤ８−１２　ＯＡ　（
東洋曹達社）、日立デル３０５０（日立社）、マイクロ
　ボンダパック０１８、Ｃ４（クオーターズ社）、ゾル
ボックス、０Ｄ８（デュポン社）等が知られている。

例えば、マイクロボンダパックＣ１８カラを有する分画を通液して吸着後、０−１））リフルオロ
酢酸を含む０チから１００俤のアセトニトリルによる直
線濃度勾配溶出法により溶出さ以上の精製法において本
発明物質の確認追跡は、ｌ’１−Ｃ３Ｆ活性をマーカー
として行う。

Ｍ　−Ｃ８Ｆの理化学的特性かくして得られｆＩ：、Ｍ−Ｃ８Ｆ活性物質は、分子ｔ
５６０００±９０００ダルトンであシ、２−メルカプト
エタノール処理によ！り２３０００±５０００ダルトン
になる。蛋白質部分のアミノ酸構成はモル優で、アスパラギン酸（Ａｓｐ　）及びアスパラギ：ｙ　（Ａｓｎ　）　　　　　　　　　　６
．９４グルタミン酸（（）ｌｕ　）及びグルタミン（（）ｉｎ　）　　　　　　　　　１５．６
２セリン（Ｓｅｔ　）　　　　　　　　　　　　８−１
４グリシン（Ｇｌｙ）　　　　　　　　　　　　　１．
９７ヒステジン（Ｈｌｓ　）　　　　　　　　　　　２
−７２アルギニン（Ａｒｇ　）　　　　　　　　　　　
　２．９８スレオ＝ン（Ｔｂｒ）　　　　　　　　　　
　５−１５アラニン（Ａｌａ　）　　　　　　　　　　
　　　３−７１プロリン（Ｐｒｏ　）　　　　　　　　
　　　　　２．６３チロシン（ＴＹｒ　）　　　　　　
　　　　　　　３．３６パリン（Ｍａｌ　）　　　　　
　　　　　　　６−８４メチオｓ−＞　（Ｍｅｔ　）　
　　　　　　　　　　１−２０システイン（Ｃ７８）　
　　　　　　　　　　　１．２１イソロイシン（ｒｌｅ
）　　　　　　　　　　　６．２３０イシン（Ｌｅｕ　
）　　　　　　　　　　　　１３．５０フエニルアラ＝
ン（Ｐｈｅ　）　　　　　　　　７−６８リジン（ＬＹ
ａ　）　　　　　　　　　　　　　１０．１５である。

ショ糖密度勾配等電点電気泳動法により測定し次等電点
は４．４〜４．８であシ、Ｎ末熾のアミノ酸配列は、〔
Ａ〕およびＣＢ）である。

以上の特性から、本発明により得られるＭ−０８Ｆは新
規物質であシ、生化学用、薬理学用試薬として用いても
よく、１次医薬品として用いる場合には医薬品製造の慣
用的技術に従って製剤化できる。

Ｍ−０８Ｆ活性の測定はＢｒａｄｌｅｙ等の方法で行う
（Ｔ。

Ｒ，Ｂｒａｄｌｅｙ　ｅｔ、　ａｌ、　：　Ａｕ５ｔ、
　Ｊ、　Ｂｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

１Ｘ１０ＩＳ個のマウス骨髄細胞を含むＭｃＣｏｙ’ｓ
　５Ａ培値１継を加え７日間３７℃で５幅Ｃｏ２を含む
飽和水蒸気下で培養する。培養後、倒立顕ａＢ下で検鏡
し、５０個以上の細胞集塊をコロニーの数とする。

ｌ九、降Ｃ８Ｆの活性はコロニーを１個形成させる活性
ｔ−ｉ単位（Ｕ）とし、比活性を次式により算出する。

なお蛋白質の定量はブラッドホールド法（Ｍ。

Ｍ、　Ｂｒａｄｆｏｌｄ　：　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　、　　７２巻、１９７６年）による。

［実施例］実施例中、特に断わらない限シ憾は重量１ｔ−表わす。

実施例１（１）　ＤＫ−２細胞の樹立急性骨髄性白血病患者の末梢血１０１ｔ−あらかじめフ
ィコール・パック液（ファルマシア社）１０就入れた試
験管に重層し、４００ｇで３０分、遠心し、中間層の白
血球液１）＋１ｊｔ−得九。これを、シグマコート（７
７１社）処理した小ガラス試験管に移し、Ｐ８８５ｍＺ
ｔ−入れ、４００．９，５分遠心し、その上清を捨て、
細胞沈渣にＰ８８５ｍ加え、混和後、遠心し九〇次に、
この細胞沈渣に０．８７チ塩化アンモニウムを含むトリ
ス緩衝液３１）Ｌｔ入れ、よく混和し、溶血操作を行つ
文。遠心後、ＲＰＭ１）６４０培地５１）Ｌｌで２回遠
心操作により、洗浄し、最後にＲＰＭＩ　１６４０　＋
　２０１　ＦＣＢ培地１財に細胞を懸濁し、細胞敷金ト
リパンブルー染色で、顕微鏡下、カウントシ九。細胞数
は２Ｘ１０’個であシ、培地を加え、２Ｘ１０６個／１
とし、２４−ウェル−プレートに１）１Ｌｔ／ウエルで
１き、３７°Ｃ３ｅｓ炭酸がスインキュベーター内で静
置培養し友。

最初の１週間は毎日、培養液０．５１４　ｅ静かに抜取
シ、同量のＲＰＭＩ　１６４０　＋　２０憾ＦＣ８培地
を加え几。その後は、２〜３日毎に半分培地交換を行い
、培地交換時に顕微鏡での観察を続けた。

１力月後１０ウェル中１ウェルに持続的な細胞の増殖が
認められ九が、増殖が極めて悪（、さらに、培地交換を
１カ月行った。後に直径３５ａｍのシャーレ（ファルコ
ン社）にスケールアラ７’？し、凍結保存をし九。１ケ
月後、その凍結保存チューブ１本を解凍し、２０係ＦＣ
８含有ＲＰＭＩ　１６４０培地で増殖することを確かめ
、２ケ月ヲ要し、２５α２の５０祷フラスコ（ファルコ
ン社）で１０−の継代培養全可能とし友。次に、１０憾
ＦＯＢ含有ＲＰＭＩ　１６４０培地で馴化を行つ九。

１０４　ＦＣ８含有ＲＰＭＩ　１６４０培地馴化株につ
き、限界希釈法により、クローニングを行つ九。

即ち、９６−ウェル・プレート（ファルコン社）を用い
、０．５個／ウェル入るように培地で希釈し、フィーダ
ー細胞として、マイトマイシンｃ＜協和発酵社）２５μ
ｌ／ｙＬｔで３０分処理し几馴化株５Ｘ１０’個／ウェ
ルとなるように入れ、０．２＋１ｊ／ウエルずつ１い２
．　ＣＯ２インキュベーターで培養開始後、２０日１に
クローン株が出現し、２４−ウェル−プレートへ移し、
増殖させ、５０ｎｇし、０．５１）Ｌｔの固定液で細胞
を懸濁し、その液２滴をスライドガラスに落し、乾燥さ
せ、ギムデ染色を行って、本細胞の分裂中期における核
染色体数ｔ−１００個の細胞について計数し九〇その結
果、各細胞の核染色体数は、第１表に示す通シロ９〜８
２の間に分布し、−一りは約７５にあり几。

し几りローン株について、さらにクローニングを実施し
、ｆｉ−０８Ｆ産生及び増殖性が良い株ｔ−選択し、Ｄ
Ｋ−２と命名し友。

（２１ＤＫ−２細胞の細胞学的性質１）染色体数本細胞培養フラスコ（４Ｘ１０ＩＳ個／ｄ）１０−に１
００　ｎｇ／ｄａ度の’：２にセミド金入れ、５悌炭酸
ガスインキユベーターで６時間培養した後、低張液（０
，（１７５Ｍ塩化カリウム）で３７℃下に１５分間処理
し、固定液（酢酸：エタノール−１：３）で室温下に固
定し九後遠心し、細胞を回収２）細胞化学染色本細胞株は、ペルオキシダーゼ及びスーダンブラック已
に対し陰性であり、α−ナフチルブチレートエステラー
ゼに対し陽性であった。

３）ロゼツト形成未感作ヒツジ赤血球、１ｇＧ抗体感作ヒツジ赤血球及び
ＩｇＭ抗体ヒト補体感作ヒツジ赤血球（ＥＡＣ）におけ
るロゼツト形成音調べ次結果、１）１以下、約２０係及
び約１０係が陽性であった。

４）細胞表面マーカー本細胞浮遊液０．２１を小試験管にとシ、リン酸緩衝食
塩水（ｐ）１７．２　）　ｔ−加え４００．！ｉ’、５
分間遠心分間遠心洋行丸。下記のモノクロナール抗体０
．１ＷＬｔｔ−加え、時々撹拌しながら３０分間水中に
放置し友。次に４００ｇ、５分間の遠心により２回、リ
ン酸緩衝食塩水で洗浄し、Ｆ工ＴＣ標識抗マウス免疫グ
ロブリン抗体０．１．１ｄ　ｋ加え、水中で６０分間放
置し友。その後、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、細胞
ｔスライドグラスに載せ、螢元顕微境で観察し九。その
結果、抗末梢Ｔ　ＩＪンバ球抗体（０ＫＴ３　）　、に
対しては陰性、抗ＨＬＡ　−ＤＲ抗体Ｃ０ＫＩａｌ〕に
対して陽性であつ九。使用したモノクロナール抗体は、
０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　。

Ｒａｒｉｔａｎ　、　Ｎ　Ｊ社から得た。

実施例２　大量培養骨髄性白血病細胞ＤＫ−２をＲＰＭＩ　１６４０　＋１
０幅ＦＣ８培地にて、約ｌＸ１０５個／Ｍの細胞濃度に
調製し、その１０Ｊを１４１ジャーファーメンタ−（Ｎ
、　Ｂ、　Ｓ、社〕にて、３７℃で培養し、約ｌＸ１０
’個／ｒＩＬｔの細胞ｍＷに到達する萱で約５日間培養
した。その時の増殖変化を第２表に示し九〇第２表実施例３　培養液の大量調製骨髄性白血病細胞ＤＫ−２ｔ−１）０優ＦＣ８を含むＲ
ＰＭＩ培地にて、ｌＸ１０５個／ＦＩＬｔの細胞濃度に
調製し、その１）Ｊｔ、１４１ジャーファーメンタ−（
Ｎ、　Ｂ、　８．社）に６７℃で培養し、１．６×１０
６個／就ｌで培養した。

次いで、培養され−ｆｃ１）Ｊ？容の細胞を連続遠心機
（ＩＥＣ社）にて回収し、ＰＢ８１５Ｊで細胞を洗浄し
、血清全完全に除去し九０回収し次細胞のうち、Ｉ　Ｘ
　１０’個とＲＰＭＩ　１６４０培地（無蛋白培地）５
００祷を培養表面積８５０Ｃ７Ｊ１２のローラーボトル
（ファルコン社）に入れ、１７本のローラーボトルを仕
込んだ。各々のローラーボトルに誘導剤、ＰＭＡ　１ｋ
　５０　ｎ！？　／　ｍＡとなるように添加し、回転数
１／２Ｒ，Ｐ、Ｍ、　、３７℃で培養し、３８目に、誘
導剤無添加のＲＰＭＩ　１６４０培地ｔ−１０−ラーボ
トル当！＋　５０　Ｑａｔｊの割合で交換し、培養液を
合計８．５７回収した。同様の操作金繰り返し、合計３
回の回収を行い、合計ＦＪ２５１の回収液を得几。

その回収時の活性値を第６表示し九。

位／ｄであり九。

第　　３表実施例４Ｍ−Ｃ８Ｆの分離・精製（１）　　第１工程上記工程で回収しｔ培養上清２５ノ全ｔを濃縮装置（ペ
リコンカセット、ＰＭ１０膜使用、ミリポア社）により
２５０ｍ１ＶＣ＠縮し九。この濃縮液をｐＨ４．５に調
整し、４℃で１晩静置し友。生成し几沈澱を遠心分離器
で分別し、上清を回収し−７，５に調整した。

（２）　　第２工程次に、この液全ｆ’！ｉ？、０．０２　Ｍ　−ＩＪン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化し九ＤＥ５２（ワットマ
ン社）カラム（直径５　ｃｍ　Ｘ高さ４５ｃｒｎ）に通
液し、吸着後０．０１５Ｍと０．５Ｍの食塩金倉む０．
０２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて塩濃度全
連続的に高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ
、０．１０〜０．１８Ｍの塩濃度で溶出しｔ分画６６０
ｍ１を集めた。溶出部の結果全第１図に示す。

（３）第６エ程第２工程で得た分画濃縮液１５０ＷＬｔに粉末状硫酸ア
ンモニウムを１Ｍ濃度になるように添加し、ｐＨ７，４
に調整し友後、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ　リン
酸緩衝液（−７，４）で平衡化されたフェニルセファロ
ース０Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社）カラム（直径２．６
ｃ！ＩＬＸ高さ６０ｃＭｌ）に通液し吸着後、１Ｍ硫酸
アンモニウムを含む０．０１　Ｍリン酸ｉ夏樹液（Ｊ　
７．４　）及び硫酸アンモニウムを含１ない０、［］　
Ｉ　Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．４　）を用いて塩濃度
を連続的に下げてい（直線濃度勾配溶出法により溶出さ
せ０．５〜０．２Ｍの塩濃度の緩衝液により溶出し九分
画６００嶋を集め次。この溶出部の結果全第２図に示す
。

（４）第４工穆上記第３工程溶出液を限外口過法（ＰＭＩＯ膜、アミコ
ン社）を用いて濃縮し１Ｎとした。その中の２００μｌ
會、［１，１５Ｍ食塩、０．０５４ｐＥＧ及び０−０２
　％　Ｔｗｅｅｎ　２０　ｋ含む、０．０２Ｍリン酸緩
衝液（ｐ）１７．４　）で平衡化したスーパーローズ１
２（ファルマシア社）カラム（直径１０×高１６０ｃｍ
）に通液し相対溶出液量がｉ、ｓ　−ｉ、ｓの分画２．
０ＷＬｔｔ−得友。この工程を繰シ返し、同分画１０ｍ
１ｔ集め友。このｒルロ過パターン′１に第３図に示す
。

（５）　　第５工程上記溶出液全量ｉ　ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社
）に装着し、０．１　％　）リフルオロ酢酸で平衡化し
九逆相分配クロマト用０４カラム（直径４．６１）ＩＩ
×高さ２！Ｍ７１．山村化学社）に通液し吸着後０．１
％トリフルオロ酢酸會含む０チ〜１００４のアセトニト
リルによる直線濃度勾配溶出法により溶出させ、アセト
ニトリル濃度５３〜５８係で溶出する分画４．ＯＭを集
めた。

次に、この分画全中和後、透析し、凍結乾燥を行い、比
活性１．０Ｘ１０８単位／ダ蛋白質の本発明物質Ｍ　−
Ｃ８Ｆ　ｔ−得た。

この物質を用いてマウス骨髄細胞を培養しｔ際に形成さ
れたコロニーは単球／マクロファージ系コロニーであっ
た。この工程での溶出部の結果金第４図に示す。

実施例５Ｍ−Ｃ８Ｆの理化学的性質（１）５ＤＳ−電気泳動法による分子量測定本発明物質
６μｇｔその１）、及び２−メルカプトエタノール（２
−ＭＥ）で処理した後、０．１）８Ｄ８　ｔ−含む１０
係ポリアクリルアミドデルに付与し、０．１％８Ｄ８１
ｆｔ含む２５　ｍＭ　）リス／１９２蜆グリシン緩衝液
（−８，３）でそれぞれ電気泳動全行った。ファルマシ
ア社標準分子量キット（ホスホリラーゼ６１分子７９４
，０００：アルブミン、分子［６７，０００ニオブアル
ブミン、分子量４３．０００：カルボニツクアンヒド２
−ゼ、分子量３０．０００：）リプシンインヒビター、
分子量２０，１００　：α−ラクトアルブミン、分子量
１４．４００）ｔ−用いて分子量検量線全作成し、活性
評価と銀染色（バイオラッド社キット）により分子量を
測定し穴。

本発明物質の分子量は３８０００±５０００ダルトンで
あり、また２−ＭＥ処理により分子量２３０００±５０
００ダルトンであり几。

（２）ゲルロ過法による分子量測定以下の条件でゲルロ過のＨＰＬＣｔ−行った。

カラム：スーパーローズ１２、直径１ｃｍＸ６０ｃｒＩ
Ｌ（ファルマシア社）溶離液：　０．０５　％　ＰＥ０％　０．０２　％　Ｔ
ｗｅｅｎ　２０及び含有０．０２　Ｍナトリウムリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）流速＝０．５酊／分７ラクシヨン容積：０．５ｄ／チユ一ブ／分１友、分子
量マーカーとして、ｒ−グロブリン（１５８，００ＯＬ
　フォス７オリラーゼｂ（９４，０００）、牛血清アル
ブミン（６７，０００）、オプアルブミン（４３，００
０）　ｔ−用い几。

上記マーカーの分子ｔｔ−基準とすれば、本発明物質は
分子量５６０００±９０００ダルトンであり友。

（３）　　等電点シヨ糖密度勾配等電点電気泳動法により等電点を測定し
几。すなわち、４０幅両性担体ファルマライト３−１０
（ファルマシア社：ｐＨ３〜１０）ｔ　５．８　％含む
５０　ｗ／ｖ　嗟ショ糖溶液と同１憾を含む水溶液とを
用いて、冷却用ジャケット全装着した内径１ｃｍ、長さ
２５．６ｃｍのガラスカラム内に段階的毛密度勾配を作
製し友ところ本発明物質２０μＩはこの密度勾配のほぼ
中央にあった。

陽極側に１幅リン酸−５０係シヨ糖溶液、陰極側に１．
６係エチレンジアミン溶液金用い、４℃の冷却水を循環
させなから５００ｖで２２時間泳動δゼ友。泳動終了後
０．５−ずつ分取し、氷水冷却下でｐＨｔ−測定し次後
、各分画を０．０５優ＰＥＧ　ｔ−含む緩衝生理食塩水
に対して透析し、各分画について活性を評価し穴。

本発明物質の等電点はｐＨ４，４〜４．８であつ友。

（４）アミノ酸組成ＰＩＣＯ・ＴＡＧＴＭアミノ酸分析シ酸分ムシステムタ
ーズ社）により蛋白質部分のアミノ酸組成金分析し几。

本発明物質２０μ、９？７０℃、９累がス流通下で乾固
し、６Ｎ塩酸により１）０℃で２１時間ＰＩＣＯ−ＴＡ
Ｇ”法により加水分解を行つ几。

加水分解物にフェニルインチオシアン酸塩を加えてフェ
ニルチオカルバミルアミノ酸１４Ｅ成させ、内径６．９
Ｂ、長さ１５ｃｒｎのＰＩＣＯ−ＴＡＧＴＭアミノ酸分
析カ酸分全カラム、酢酸ナトリウム／アセトニトリル／
トリエチルアミン及び水／アセトニトリル／トリエチル
アミンを溶離液としたクロマトグラフィーによジフェニ
ルチオカルバミルアミノ酸を分離分析し次。

ｌ友、アミノ酸標準液（ピアス社：　Ｔｙｐｅ　Ｈ）ｔ
−同様にフェニルチオカルバミル化して分析して作成し
九検量線により蛋白質部分のアミノ酸組成を求め九〇得られ友結果ｔモル幅で示すと下記の通シであつ７２−
Ｏアスパラギン酸（ＡＳｐ）及びアスパラギン（Ａｓｎ　）グルタミン酸（Ｇｌｕ　）及びグルタミン（Ｇｉｎ　）セリン（８ｅｒ　）グリシン（Ｇｌｙ　）ヒスチジン（Ｈｌｄ　）アルギニン（Ａｒｇ　）スレオニン（’ｒｈｒ　）アラニン（Ａｌａ　）プロリン（Ｐｒｏ　）チロシン（Ｔｙｒ　）バリン（Ｖａｌ　）メチオニン（Ｍｅｔ　）システィン（Ｃｙａ　）インロイクン（ｒｌｅ　）ロイシン（Ｌｅｕ　）フェニルアラニン（Ｐｈｅ　）リジン（Ｌｙｓ　）６．９４１　５．６　２８．１４１．９７２．７２２．９８５．１３６．７１２．６３３．３６６．８４１．２０１．２１６．２３１３．５０７．６８１　０．１　５なお、一般に上記分析条件下においては、システィン及
びトリプトファンの分解回収率が低いことが知られてい
る。

（５）Ｎ末端アミノ酸配列本発明物質の純度検定及び部分構造解明の次め、本発明
物質約２０μｇｔ−用い、気相式プロティンシーケンサ
−（４７７Ａ型、ＡＢＩ社）にかけ得られ九ＰＴＨ（フ
ェニルヒダントイン）アミノ酸をＨＰＬＣ（１２０Ａ型
、ＡＢＩ社）にて分析し、アミノ酸金同定定量しｔｏそ
の結果５０番目１でアミノ酸配列を決定することができ
た。’！　友、Ｎ末端アミノ酸として確認でき友のは２
棟類であり、電気泳動の結果とも合わせて純度はほぼ１
００幅である事を確認しｔｏ決定しｔアミノ酸配列は［Ａ］および〔Ｂ〕であつ九〇〔発明の効果〕（１）本発明のヒト細胞は、血清を含まない無蛋白培地
で、Ｍ　−Ｃ８Ｆ’の高産生が持続する。

（２）本発明のヒト細胞は、天然型Ｍ　−Ｃ８Ｆの生産
性が高く、臨床応用可能量の高純度Ｍ　−Ｃ’ＳＦ　’
に取得できる。本発明の方法によって得られ次新規Ｍ　
−Ｃ８Ｆは、白血球減少症治療剤、制癌剤等医薬品又は
診断薬としての用途が期待される。

（３）工業的製造が可能であり、製造コストが安価であ
る。

【図面の簡単な説明】第１図〜第４図は、各々実施例による方法でのイオン交
換クロマトグラフィーの溶出部の結果、フェニルセファ
ロースクロマトグラフィーの溶出部の結果、スーパーロ
ーズ１２によるゲルロ過の結果、逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＦＩＰＬＣ）の結果を示すものであ
る。特許出頗入　電気化学工業株式会社第１図第３図フラクションＮｏ。第２図第４図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）骨髄細胞に作用して単球−マクロファージの分化
増殖を促進させる糖蛋白質からなり、下記理化学的性質
を有する骨髄細胞分化増殖因子。（ａ）分子量が、非還元条件下でＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定すると３８０００±５００
０ダルトンであり、非還元条件下ゲルロ過法で測定する
と５６０００±９０００ダルトンであり、（ｂ）逆相ＨＰＬＣにおいて単一のピークとして移動し
、（ｃ）比活性が少なくとも１×１０＾８単位／ｍｇ蛋白
質であり、（ｄ）蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、１）【遺伝子配列があります】および２）【遺伝子配列があります】である。
（２）ヒト骨髄性白血病細胞から分離された細胞のクロ
ーンであつて、血清を含む組織培養培地で増殖し、化学
試薬により誘導後、無血清培地、または無蛋白培地中に
多量の骨髄細胞分化増殖因子を長時間産生する性質を有
することを特徴とする請求項（１）記載の骨髄細胞分化
増殖因子産生細胞。
（３）［１］請求項（２）記載のヒト骨髄性白血病細胞
を無蛋白（または無血清）条件下で培養し、［２］［１］の培養上清を濃縮後、ｐＨ２．５〜５．０
の条件下で前処理し、不溶画分を分離し、［３］［２］の処理液をｐＨ５．０〜７．５の条件下で
陰イオン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交換体
に吸着させた後、０．０５〜０．３Ｍ無機塩溶液にて溶
出される分画を集め、［４］［３］の分画を１．０〜１．５Ｍの無機塩濃度に
調整し、ｐＨ６．０〜８．０の条件下で疎水性吸着体に
吸着させた後、０．１〜０．５Ｍの無機塩溶液により溶
出される分画を集め、［５］［４］の分画濃縮液をゲルロ過剤と接触させ、相
対溶出液量が１．５〜１．８の分画を取得し、［６］［
５］の溶出液を逆相イオンクロマトグラフィー操作を行
うことにより、得ることを特徴とする請求項（１）記載
の骨髄細胞分化増殖因子の製法。