JPH01135800A

JPH01135800A - 骨髄細胞分化増殖因子、その産生細胞及びその製法

Info

Publication number: JPH01135800A
Application number: JP62291776A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Arai; 一彦新井; Toshihiko Umeda; 俊彦梅田; Nobuo Sakai; 酒井　伸夫; Shuji Mimura; 三村　修治
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1987-11-20
Publication date: 1989-05-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、哺乳動物の骨髄白血球前駆細胞に作用して、
この細胞の顆粒球又はマクロファージへの分化増殖を促
進する物質（以下Ｃ３Ｆという）に関し、より詳しくは
、動物細胞培養液から純粋に分離された哺乳動物骨髄中
の単球−マクロファージ系幹細胞に作用して、これらの
細胞の単球−マクロファージへの分化増殖を促進する均
質調製物たるＭ−Ｃ３Ｆ及びその製法に関する。

Ｃ３Ｆは抗癌剤、抗生物質、放射線照射による白血球減
少症或いは種々の感染症の治療剤として医薬への応用の
他、白血球減少症、再生不良貧血等の診断剤としての用
途が期待できる。（Ｍｏｔｏｙ。

ｓｈｉ　Ｋ、ｅｔ　ａｌ、Ｊａｐ、Ｊ、Ｍｅｄ、２１巻
、Ｐ２Ｓ５．１９８２年）〔従来の技術〕Ｃ３Ｆは２層軟寒天培養法で骨髄白血球前駆細胞を培養
するとき、その前駆細胞が分化と同時に増殖して好中球
系顆粒球や単球−マクロファージから成るコロニーを形
成するに必要な因子である。

（Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ：Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄ
ｅ＋ａｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　５６巻、Ｐ、４８Ｂ
　、１９６６年、Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、：Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　１巻％、Ｐ、１
８５．１９７３年）Ｃ３Ｆにはさまざまなタイプの活性体が知られており、
顆粒球・Ｃ３Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆ）　、マクロファージ・
Ｃ３Ｆ　（Ｍ−Ｃ３Ｆ）　、顆粒球・マクロファージ・
Ｃ５Ｆ　（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）及び多機能型ＣｓＦなどが挙
げられ、本発明は、特にマウス・Ｍ−Ｃ３Ｆに関するも
のである。

Ｃ３Ｆは種々の動物細胞や組織が産生ずる糖蛋白質であ
るが、Ｃ３Ｆを臨床診断、科学的研究並びに哺乳動物、
より好ましくはヒトにおける特異的治療剤として使用す
るには充分な量及び高純度のＣ３Ｆを容易に供給し得る
哺乳動物のＣ３Ｆ供給源を得ることが望ましい。

マウス・Ｍ−Ｃ３Ｆに関しては、次のような報告がある
。

（１）　　５ｔａｎｌｅｙ、Ｅ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ；　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　５２巻、Ｐ、４３０５．１
９７７年（マウスＬ９２９細胞からのＣ３Ｆ蛋白質を約１×１０
８ユニツト／ｌ１１ｇまで精製を報告、これは主として
マクロファージ生産を刺激した）（２）　　Ｂｕｒｇｅ
ｓｅｓ＋Ａ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、　２５２巻、Ｐ、１９９８．１９７７年）（マウス肺細胞条件化培地からのＣＳＦの部分精製を報
告）（３）　　Ｗａｈａｅｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ；　Ｂｌｏｏ
ｄ、６０巻、Ｐ、２３８．１９８２年（マウスＬ細胞か
らのＭ−Ｃ３Ｆを見掛上均一になるまで精製した）（４）　　Ｔ、０ｈｎｏ＋　Ｍ、５ｈｉｋｉｔａ　；　
Ｃｅ１ｌ　５ｔｒｕｃｔ、　Ｆｕｎｃｔ。

８巻、Ｐ、１３７．１９８３年（マウス吉田肉腫細胞及びマウスＬ−Ｐ３細胞から得ら
れたＣ３Ｆの分子的特性を報告）（５）　　Ｂｅｎ−Ａ
ｖｒａ＋＊、　Ｃ０Ｍ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８２巻、Ｐ、４４８６．１９８５年（マウス
Ｌ細胞からのＭ−Ｃ３Ｆの最初の２５アミノ酸配列を報
告）（６１Ｂｏｏｓｍａｎ＋　　八、　　ｅｔ　　ａｌ；　
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｎ＋ｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎｓ　１４４巻、Ｎｏ、１ｐ、７４．１９８７年
（マウスＬ細胞からのＭ−Ｃ３Ｆ（７）ＣＤＮＡ及びそ
れに基づくアミノ酸配列、さらに分子的特性を報告）（７１Ｃｈｏｗｌ）１．５１ｅｔ　ａｌＨＪ、Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　ＲｅｓｐｏｎｓｅＭｏｄｉｆｉｅｒｓ　
６巻、ｐ、４４６１９８７年（マウス白血病細胞とマウ
ス線維芽細胞とのハイブリッド細胞からのＭ−Ｃ３Ｆの
報告゛）（８）　　特開昭６２−５０１６０７号公報（
マウスＬ９２９細胞のｃＤＮＡ及び遺伝子組換体による
マウス・Ｍ−Ｃ３Ｆの製造を報告）Ｍ−Ｃ５Ｆを研究目
的、診断用及び治療用として大量かつ高純度で取得する
ためには、無血清、無蛋白及び無脂質の培養条件下で長
期間にわたり高濃度でＭ−Ｃ３Ｆを産生ずる細胞株がも
っとも望ましいが、マウスＬ９２９細胞やマウス白血病
細胞では工業的ＣＳＦ生産方法としては不十分であった
。

更に、前記（８）のように遺伝子組換体を用いる場合、
高濃度でＣ３Ｆが生産できるため有利であるが、大腸菌
に組込んだ場合、天然のＣ３Ｆの重要な特徴である糖鎖
が欠如しており、また遺伝子組換体動物細胞を用いた場
合、天然のＣ３Ｆとは異なる糖鎖が結合したＣ５Ｆが生
じることになる。

そこで、天然由来のＣ３Ｆと同一の生理作用を有するＣ
３Ｆを高い濃度で産生ずる細胞株の開発が強く望まれて
いた。

〔問題解決の手段〕

本発明者らは、天然型Ｍ−ＣＳＦを大量に産生ずる動物
細胞株を種々検索した結果、マウス線維芽細胞を長期間
にわたり継代培養可能になるように馴化し、さらに無血
清培地条件下でも継代培養可能になるように馴化した細
胞株が無血清条件下、長時間にわたり大量のＭ−Ｃ３Ｆ
を産生ずることを見出し、さらにこの細胞をクローニン
グし、もっともＣ５Ｆ産生量が高い新規なりローニング
株を得てＤＫ−１と命名した（徽工研寄託番号第１５６
８号）。

このＤＫ−１の産生ずるＣ３Ｆの精製につき研究した結
果、慣用的蛋白質精製操作に加えて改良的精製法を組合
わせることにより、哺乳動物の骨髄細胞に作用してコロ
ニーを形成させる純粋のＭ・Ｃ３Ｆを高収率で精製純化
して均質調製物を得る方法を見出した。

更に、得られた天然型Ｍ−ＣＳＦの構造的特性及び理化
学的特性を解明し、この物質を同定することに成功し、
かつこの物質が従来にない構造的特性をもち、きわめて
高水準のＣ３Ｆ活性を有することを解明し本発明を完成
するに至った。

・　したマウス　　　　　の本発明で用いたマウス線維芽細胞由来のＭ−Ｃ３Ｆ産生
細胞（ＤＫ−１と命名）は下記手順で樹立されたもので
あり、微工研条寄第１５６８号である。

マウス結合組織から株化されたマウス線維芽細胞Ｌ９２
９　（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を、１０Ｖ八％ＦＣ３
を含むＤＭ−１７０培地（極東薬品工業社製）に分散し
、（第１回から第４回のサブカルチャーはローラーチュ
ーブ式培養器を用い、第５回以後のサブカルチャーは静
置式培養器を用いた）ＣＯｔ含有インキュベーター中で
培養した。

培地は１週間に２度定期的に交換した。約９ケ月間の連
続培養後、第４回のサブカルチャーの段階で突然活発に
増殖が始まり、それ以後活発な増殖を持続した。これを
親株としてさらに継代培養後、上記培地中で限界希釈法
により細胞のクローン化を行い培養液中に高いＣ５Ｆ活
性を示す株を選択して株化細胞ＤＫ−１を得た。

員股ヱ煎立血このようにして樹立したＣ３Ｆ産生細胞（ＤＫ−１）の
細胞学的特性は下記の如くである。

■　細胞の形態：上皮細胞様 ■　染色体数：低３倍体域である染色体数６４本のモー
ダルナンバーを示すことを特徴とする染色体、数の分布
モード ■　継代培養：無限な継代培養可能 ■　機能的特徴：Ｍ−Ｃ５Ｆ産生 ■　細胞増殖性：単層シート状の増殖性を示し、ポピユ
レーション・ダブリングタイムは３３．４時間である。

■　血清の要求性：１０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）を
含むＤＭ−１７０培地中で増殖可能。Ｆｅ２を含まない
ＤＭ−１７０培地中で生存可能。

本発明においては、上記のマウス線維芽細胞由来のＣ３
Ｆ産生細胞株ＤＫ−１を血清培地及び／又は無血清合成
培地中で培養することによりＣＳＦを生産する。血清を
使用する場合は、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、ウマ
血清等が使用できるが、ウシ胎児血清が好ましい。また
、合成培地としてはイーグル最少必須培地（Ｅａｇｌｅ
’　ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　）、フィッシャーの培地、ダルウ
ェッコ改変イーグル培地、ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地
、ＤＭ−１６０、ＤＭ−１７０培地等を使用できるが、
好ましくはＤＭ−１６０やＤＭ−１７０培地が用いられ
る。更には、細胞増殖後のＣ３Ｆの生産に際しては、血
清成分を除いた無血清培地においても本細胞は生存可能
であり、かつ安定的にＣ５Ｆを産生ずる。

本発明に係る細胞株の培養条件は特に制限はなく、通常
の炭酸ガス培養法等と同様に実施できる。

すなわち、一般には３０〜４０℃程度、好ましくは約３
７℃で上記細胞株を血清を含有する培地中で培養し、培
養開始後２〜４日毎に新鮮な培地と交換しながら培養を
継続し、細胞がコンフルエントに達したとき、無血清培
地と交換し培養を継続するとＣ３Ｆが培養液に産生され
て（る。Ｃ３Ｆの産生は２日〜４日の培養で最大となり
、より長く培養すると細胞寿命が短くなり、ＣＳＦ産生
能も低下する６で、２〜４日毎に新鮮な無血清培地と交
換することにより、長期間にわたりＣ３Ｆを効率的に産
生させることができる。

本発明に係る細胞株は付着性細胞であるため、培養容器
からの培養上清の分離は容易である。

旦盈工至豆皿猪里培養上清の精製方法としては下記の手段が用いられる。

■　細胞培養上清を０．２２μ無菌フイルターで処理し
、限外口過膜方式で約１００倍に濃縮し、それを１０％
のリン酸によりｐ　Ｈ４，０〜５．０に調整し低温静置
により析出する析出物を遠心分離機で分離した培養ｔ！
縮凍原液調製する。

■　■で得られた溶出液のｐＨを５．０〜７．５に調整
し、同じｐＨ領域の緩衝液で緩衝化した陰イオン交換体
、例えばＤＥＡＥ−セルロースと接触させ、吸着物をＯ
から０．５Ｍの無機塩ζ例えば塩化ナトリウムを含む緩
衝液（ｐＨ６〜８）を用いて塩濃度を連続的に高めてい
く直線濃度勾配溶出法により溶出させ、０．０５〜０．
３Ｍの塩濃度の緩衝液により溶出される分画を集める。

■　■の分画液に無機塩、例えば硫酸アンモニウムを０
．６〜１．５Ｍ、好ましくは１．０〜１．２Ｍになるよ
うに添加し、ｐＨを６〜８に調整してから、あらかじめ
１．０〜１．５Ｍの無機塩、例えば硫酸アンモニウムを
含む緩衝液で緩衝化された疎水性クロマトグラフィー用
樹脂、例えばフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ、または
オクチルセファロースなどに接触させ、次いで、吸着物
をＩＭから０．１Ｍの無機塩、例えば硫酸アンモニウム
を含む緩衝液（ｐＨ６〜８）を用いて高い塩濃度から低
い塩濃度へと塩濃度を変化させる直線濃度勾配溶出法に
より溶出させ、０．９Ｍから０．５　Ｍの塩濃度の緩衝
液により溶出される分画を集める。

■　■の溶出液を分子篩クロマトグラフィーの目的でゲ
ルロ過剤、例えばセファデックスＧ−１５０、バイオゲ
ルＰ−１００または無機系ゲルロ過剤などを充填したカ
ラムに通液して溶液中のＣ３Ｆを充填剤に吸着させた後
、０，０１〜０．１５Ｍの無機塩緩衝液にて溶出せしめ
て相対溶出液量が１．０〜１．７、好ましくは１．２〜
１．５である分画を集め、脱塩、濃縮する。

なお、相対溶出液量とはＶ　ｅ　／　Ｖ　ｏで表される
数値である。（Ｖｅはカラムに通液する試料液がカラム
から溶出する液量を示し、Ｖｏはカラム内のゲル粒子外
部の溶液量を示す）また、この操作は以下の高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）システムを用いても実施できる。

まず前工程からの濃縮液を０．１５Ｍの無機塩を含む緩
衝液（ｐＨ７，４）で平衡化する。これをＨＰＬＣ用ゲ
ルロ過カラム、例えば５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム（
ファルマシア社製）またはＴ　Ｓ　Ｋ　−３０００ＳＷ
（東洋曹達社製）或いはこれらに相当する充填カラムに
通液し、ＣＳＦ活性を有する分画を集める。

■　■の分画を、逆相型イオンクロマトグラフィー操作
を行うことにより実質的に不純物を含まない純粋なＣＳ
Ｆを取得できる。これは非極性の充填剤に、対イオンを
含む溶離液を用いて、イオン成分を中性物質と交換し、
分配平衡の差を利用して分離する高速液体クロマトグラ
フィーの１種であり、この目的のための充填剤としては
、ＴＳＫｇｅｌ　０ＤＳ−１２０Ａ　（東洋曹達社製）
、日立ゲル３０５０　（日立社製）　、ｐ　Ｂｏｎｄａ
ｐａｋ　Ｃ１８、Ｃ４（Ｗａｔｅｒｓ社製）　、Ｚｏｒ
ｂｏｘ　　ＯＤ　Ｓ　（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ社製）などが知
られている。

例えば、ｐ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１Ｂカラムの場合、
カラムを０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化しておき、
これに■工程で得たＣ３Ｆ活性を有する分画を通液して
吸着後、０６１％トリフルオロ酢酸を含む０％から１０
０％のアセトニトリルによる直線濃度勾配溶出法により
溶出させ、Ｃ３Ｆ活性を有する分画を中和後、透析する
ことにより、純Ｃ３Ｆを得ることができる。

以上の精製法において本発明物質の確認追跡は、Ｃ３Ｆ
活性をマーカーとして行う。

Ｍ−Ｃ３Ｆの　　　・　− かくして得られたＭ−Ｃ３Ｆ活性物質は、分子量１００
，０００±１０．０００ダルトンであり、２−メルカプ
トエタノール処理により５０．０００±１０，０００ダ
ルトンになる。蛋白質部分のアミノ酸構成はモル％で、
アスパラギン酸及びアスパラギン（Ａｓｘ）　　　　１１〜１２グルタミン
酸及びグルタミン（Ｇｌｘ）　　　　　　７．８〜８．８セリ
ン（Ｓｅｔ）　　　　　　　　　７〜８グリシン（Ｇｌ
ｙ）　　　　　　　　　３〜４ヒスチジン（Ｈｉｓ）　
　　　　　　　２〜２．８アルギニン（Ａｒｇ）　　　
　　　　　３〜３．８スレオニン（Ｔｈｒ）　　　　　
　５．３Ｎ６．３アラニン（Ａｌａ）　　　　　　　５
．７〜６．８プロリン（Ｐｒｏ）　　　　　　　　７．
５〜８゜５チロシン（Ｔｙ、ｒ）　　　　　　　１．２
〜２．２バリン（Ｖａ　ｌ）　　　　　　　　４〜５メ
チオニン（Ｍｅｔ）　　　　　　０．８〜１．８システ
イン（ｃ）７３）　　　　　　　５．５〜６．５イソロ
イシン（Ｉ　Ｌ　ｅ　）　　　　　３．３〜４．３０イ
シン（Ｌｅｕ）　　　　　　　　９．３〜１０．３フエ
ニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　４．５〜５．５リジン（
Ｌｙｓ）　　　　　　　１１．１〜１２．１の範囲にあ
る。シ！ＩＩ！密度勾配等電点電気泳動法により測定し
た等電点はｐＨ３，５±０．５であり、Ｎ末端のアミノ
酸配列は、（１１ＱＩＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｑｌ）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　（２ΦＩＬｅ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＩＬｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−・・・・・
・である。

以上の特性から、本発明により得られるＣ３Ｆは新規物
質であり、生化学用、薬理学用試薬として用いてもよく
、また医薬品として用いる場合には医薬品製造の慣用的
技術に従って製剤化できる。

Ｃ３Ｆ活性の測定方法は、直径３５龍のプラスチック培
養皿に２０％馬血清、各濃度のＣ３Ｆ試料、０．３％の
寒天および１×１０Ｓ個のマウス骨髄細胞を含むＭｃＣ
ｏｙ’ｓ　５　Ａ培地１爪ｌを加え７日間３７℃で５％
ＣＯ２を含む飽和水蒸気下で培養した。培養後、倒立顕
微鏡下で検鏡し、５０個以上の細胞集塊をコロニーの数
とした。

また、Ｃ３Ｆの活性はコロニーを１個形成させる活性を
１単位（Ｕ）とし、比活性を次式により算出した。

なお蛋白質の定量はブラッドホールド法（Ｍ、Ｍ。

Ｂｒａｄｆｏｌｄ　　；　　八ｎａｌｙｔｉｃａｌ　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　　７２巻、　１９７６年
）によった。

〔発明の効果〕

本発明物質は、従来報告されているマウス細胞由来の天
然型Ｃ３Ｆとは次の点で明確な区別がなされ、明らかに
異なる物質である。

１．３ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による
測定により分子ｉｔ　１００，０００±ｉｏ、ｏｏｏダ
ルトンを示す巨大な糖蛋白質であり従来報告されている
Ｃ３Ｆとは異なる。

２、蛋白質部分のアミノ酸配列に関しては、本発明物質
はＮ末端がリジンであり、ヒト細胞由来のＭ−Ｃ３Ｆと
して従来報告されているものとは異なり、マウス細胞由
来のＭ−Ｃ３Ｆとして従来報告されていものと相同性が
あるものの、Ｃ３Ｆ分子のアミノ酸組成分析結果が従来
報告さている物質と異なる。すなわち、本発明物質はシ
スティン含量が５．５〜６．５モル％と多く、従来報告
されているＣ３Ｆとは異なる高次元構造を有する糖蛋白
質である。

本発明により上記の特性を有するＣ３Ｆを大量に取得す
ることができる。

〔実施例〕

１、細胞培養５Ｘ１０’個／ｍｌのＤＫ−１細胞を５％牛脂児血清含
有ＤＭ−１６０培地（極東製薬ａｌ製、増殖培地）５０
０ｍｌと共に、ローラーボトル（ファルコン社製、培養
表面積８５０ｃｆｆｌ）に植込んだ。

３７℃にて５日間培養することによりｃｏｎｆｌｕｅｎ
ｔｍｏｎｏｌａｙｅｒ　　（細胞数２〜３Ｘ１０”個／
ローラーボトル）を形成させた。このｍｏｎｏｌａｙｅ
ｒの培養上清を捨て、２５０ｍ１のリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ、ｐ　Ｈ７，２）で２回洗浄し、完全に牛胎児血
清を除去した。

洗浄後、１ｍＭ塩化リチウム及び０．１％炭酸水素ナト
リウム含有ＤＭ−１６０培地（産生培地）をローラーボ
ルト１本当たり５００ｍ１加え、３７℃で３日間培養し
た。１回の培養終了後培養上清を回収し、同じローラー
ボルトに前記産生培地５００ｍ１を入れ、２回目の培養
を３日間行った。２０本のローラーボルトを用いてこの
操作を繰返し、合計５０１の培養上清を回収した。

得られた培養上清のＣ３Ｆ力価は３５００単位／ｍｌで
あった。

２、ＣＳＦの精製上記工程で回収した培養上清５（ｌ全量を濃縮装置（ペ
リコンカセット、ＰＭＩＯ膜使用、ミリボア社製）によ
り５００ｍ１に濃縮した。この濃縮液をｐ　Ｈ４，５に
調整し、４℃で１晩静置した。生成した沈澱を遠心分離
器で分別し、上清を回収しｐＨ７，５に調整した。（第
一工程）次に、この液全量を、０．０２．Ｍ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）で平衡化したＤＥ５２（ワットマン社製）カ
ラム（直径５　ｃｍ　Ｘ高さ４５Ｃ１ｍ）に通液し、吸
着後０．０１５Ｍと０．５　Ｍの食塩を含む０．０２　
Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ）（７，４）を用いて塩濃度を
連続的に高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ
、０、０８　Ｍ〜０．１５Ｍの塩濃度で溶出した分画６
６０ｍ１を集めた（第二工程）。

第二工程で得た分画濃縮液１５０ｍ１に粉末状硫酸アン
モニウムをＩＭｔＪ１度になるように添加し、ｐ　Ｈ７
，４に調整した後、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化されたフヱニルセフ
ァロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社ｑ）カラム（直径
’ｌ、　５　ｃ＋ａ　Ｘ高さ６０ｃｍ）に通液し吸着後
、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）及び硫酸アンモニウムを含まない０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）を用いて塩濃度を連
続的に下げていく直線濃度勾配溶出法により溶出させ０
．９　Ｍ〜０．７５Ｍの塩濃度の緩衝液により溶出した
分画３００ｍ１を集めた。（第三工程）上記第三工程溶出液を限外口過法（ＰＭＩＯ膜−アミコ
ン社製）を用いて：ａ縮し１ｍｌとした。その中の２０
０μｌを、０．１５Ｍ食塩、０．０５％ＰＥＧ及び０．
０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、０．０２　Ｍ　ＩＪン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したセファロース１２（
ファルマシア社製）カラム（直径１ｃ１１×高さ６０ｃ
＋ｍ）に通液し相対溶出液量が１．２５〜１．４５の分
画２．　Ｑ　ｍ　Ｉ！を得た。この工程を繰返し、同分
画１０ｍ１分を集めた。（第四工程）上記溶出液全量をＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製
）に装着し、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化した逆
相分配クロマト用０４カラム（山村化学社製、直径４．
６　鶴Ｘ高さ２５ＣＩＡ）に通液し吸着後０．１％トリ
フルオロ酢酸を含む０％〜６５％のアセトニトリルによ
る直線濃度勾配溶出法により溶出させ、アセトニトリル
濃度５３〜５８％で溶出する分画４．０ｍｌを集めた。

（第五工程）次に、この分画を中和後、透析し、凍結乾
燥を行い、比活性１．０Ｘ１０１′単位／■蛋白質の本
発明物質Ｍ−Ｃ３Ｆを得た。

この物質を用いてマウス骨髄細胞を培養した際ｐこ形成
されたコロニーは単球マクロファージ系コロニーであっ
た。

なお、この工程でのＣ３Ｆの溶出パターンを図１に示し
た。また、Ｃ３Ｆの活性ピークに一致して蛋白質の溶出
が認められた。

得られた本発明物質の理化学的性質に関しては、以下に
述べる方法を用いて解析した。

（１）ＳＤＳ−電気泳動法による分子量測定本発明物質
３μｇをそのまま、及び２−メルカプトエタノール（２
−ＭＥ）で処理した後、０．１％ＳＤＳを含む１０％ポ
リアクリルアミドゲルに付与し、０．１％ＳＤＳを含む
２５ｍＭ）リス／１９ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８，３
）でそれぞれ電気泳動を行った。ファルマシア社製標準
分子量キット（ホスホリラーゼｂ５分子量９４．０００
　：アルブミン、分子量６７．０００　ニオブアルブミ
ン、分子量４３，０００　：カルボニックアンヒドラー
ゼ、分子１３０．０００　：　）リプシンインヒビター
、分子１２０．１００　：α−ラクトアルブミン、分子
量１４．４００　）を用いて分子量検量線を作成し、活
性評価と銀染色（バイオランド社製キット）により分子
量を測定した。（第２図、第３図参照）本発明物質の分子量は１００．０００±１０，０００ダ
ルトンで電気泳動的に単一であり、また２−ＭＥ処理に
より分子量５０．０００±１０．０００ダルトンのサブ
ユニットが得られた。

（２）ゲルｂ適法による分子量測定以下の条件でゲルロ過のＨＰＬＣを行った。

カラム：　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２、直径１ｃｍＸ６０
ｃｍ（ファルマシア社製）溶離液：Ｏ，ＯＳ％ＰＥＧ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ　２
０及び０．１５％ＮａＣ１含有０．０２Ｍナトリウムリ
ン酸緩衝液！ｐＨ７，４）流速：０．５ｍｊ２／分フラクション容積：０．５ｍｌ！／チューブ／分得られ
た結果を第４図に示した。

また、第４図には分子量マーカーとして、Ｔ　−グロブ
リン（１５８，０００）　、フォスフォリラーゼｂ（９
４，０００）　、牛血清アルブミン（６７，０００）　
、オブアルブミン（４３，０００）を用いて同様に処理
した場合の分子量値を各々矢印を付して示した。

上記マーカーの分子量を基準とすれば、本発明物質は分
子量１５０．０００±１０．０００ダルトンであった。

（３）　　等電点ショ糖密度勾配等電点電気泳動法により等電点を測定し
た。すなわち、４０％両性担体ファルマライト３−１０
（ファルマシア社製：　ｐＨ３〜１０）を３．８％含む
５０Ｗ／Ｖ％シヨ糖溶液と同１％を含む水溶液とを用い
て、冷却用ジャケットを装着した内径１ｃｍ、長さ２５
．６　ｃｍのガラスカラム内に段階的な密度勾配を作製
したところ本発明物質２０μｇはこの密度勾配のほぼ中
央にあった。

陽極側に１％リン酸−５０％ショ糖溶液、陰極側に１．
６％エチレンジアミン溶液を用い、４℃の冷却水を循環
させなから５００Ｖで２２時間泳動させた。泳動終了後
０．５ｍｌずつ分取し、氷水冷却下でｐＨを測定した後
、各分画を０．０５％ＰＥＧを含む緩衝生理食塩水に対
して透析し、各分画について活性を評価した。

本発明物質の等電点はｐ　Ｈ３，５±０．５であった。

（３）アミノ酸組成Ｐ　Ｉ　Ｇｏ・ＴＡＧＴＩ″アミノ酸分析システム（ウ
ォーターズ社製）により蛋白質部分のアミノ酸組成を分
析した。本発明物質２０μｇを７０℃、窒素ガス流通下
で乾固し、６Ｎ塩酸により１１０℃で２１時間Ｐｉｃｏ
・ＴＡＧ”法により加水分解を行った。加水分解物にフ
ェニルイソチオシアン酸塩を加えてフェニルチオカルバ
ミルアミノ酸を生成させ、内径３．９謳、長さ１５ｃｍ
のＰＩＣＯ・ＴＡＧ”Ｍアミノ酸分析カラムを用いて、
酢酸ナトリウム／アセトニトリル／トリエチルアミン及
び水／アセトニトリル／トリエチルアミンを溶離液とし
たクロマトグラフィーによりフェニルチオカルバミルア
ミノ酸を分離分析した。

また、アミノ酸標準液（ピアス社製：Ｔｙｐｅ　　Ｈ）
を同様にフェニルチオカルバミル化して分析して作成し
た検量線トより蛋白質部分のアミノ酸組成を求めた。

得られた結果をモル％で示すと下記の通りであった。

アスパラギン酸及びアスパラギン（Ａｓｘ）　　　　　　　　　１１．４グ
ルタミン酸及びグルタミン（Ｇｉｎ）　　　　　　　　　　　　８．３
セリン（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　　　　７．５グリ
シン（Ｇｌｙ）　　　　　　　　　　　　３．４ヒスチ
ジン（Ｈｉｓ）　　　　　　　　　　　２．３アルギニ
ン（Ａｒｇ）　　　　　　　　　　　　３．４スレオニ
ン（Ｔｈｒ）　　　　　　　　　　　５．８アラニン（
Ａｌａ）　　　　　　　　　　　　６．３プロリン（Ｐ
ｒｏ）　　　　　　　　　　　　　８．０チロシン（Ｔ
ｙｒ）　　　　　　　　　　　　１．６バリン（Ｖａｌ
）　　　　　　　　　　　　４．５メチオニン（Ｍｅｔ
）　　　　　　　　　　　　１．３システイン（ｃｙａ
）　　　　　　　　　　　　５．９イソロイシン（Ｉ　
Ｌ　ｅ　）　　　　　　　　　　　３．８０イシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　　　　　　　９．８フエニルアラ
ニン（ｐｈｅ）　　　　　　　　　５．０リジン＜Ｌｉ
３＞　　　　　　　　　　　　１１．６トリプトフアン
（Ｔｒｐ）　　　　　　　　）レースなお、一般に上記
分析条件下においては、システィン及びトリプトファン
の分解回収率が低いことが知られている。

（５）Ｎ末端アミノ酸配列本発明物質の純度検定及び部分構造解明のため、本発明
物質約２０μｇを用い、気相式プロティンシーケンサ−
（４７７Ａ型、ＡＢＩ社製）にかけ得られたＰＴＨ（フ
ェニルヒダントイン）アミノ酸をＨＰＬＣ（１２０Ａ型
、ＡＢ１社製）にて分析し、アミノ酸を同定定量した。

その結果２００番目でアミノ酸配列を決定することがで
きた。又、Ｎ末端アミノ酸として確認できたのは１種類
であり、電気泳動の結果（第２図）とも合わせて純度は
ほぼ１００％である事を確認した。

決定したアミノ酸配列は次の通りであった。

（１）　　　　　　　　　　　　　　　　　　αのＬｙ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｘ　−
５ｅｒ−旧ｓ−Ｍｅｔ−Ｑυ　　　　　　　　　　　　
　　　　　（２１１１Ｌｅ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−ＩＬｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−なお、７番目の未同定の
アミノ酸に関しては、本発明物質をＧｒｅＳｔｆｉｅｌ
ｄらの方法（ＡｏＭ、Ｇｒｅｓｔｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、＋２３８．６２２（
１９６３）　）を用いてカルボキシメチル化し、得られ
た約２０μｇ分をプロティンシーケンサ−にかけ、シス
ティンであることを確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図は第五工程で本発明物質を逆相クロマトグラフィ
ー（ｃ，、山村化学社製）にかけた際の蛋白質溶出パタ
ーン、ＣＳＦ活性及びアセトニトリルによる直線濃度勾
配溶出法により溶出させた場合のアセトニトリル濃度と
保持時間との関係を示す。第２図は、本発明物質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ
ルを用いた電気泳動を行った際の分子量測定を示し、（
Ａ）はそのまま、（Ｂ）は還元剤、２−ＭＥで処理した
場合である。第３図は電気泳動法による分子量測定図であり、（Ａ）
は本発明Ｃ３Ｆをそのまま、（Ｂ）は還元剤、２−ＭＥ
で処理した場合である。第４図は、本発明物質のゲルロ過法による分子量測定の
際の蛋白質溶出パターン及びＣ３Ｆ活性を示す。特許出願人　電気化学工業株式会社代理人　弁理士　　鈴　木　定　子馬１図保持時間（分）馬２図（Ａ）（Ｂ）馬３図（Ａ）　　　　　　　　（Ｂ）も４図保持時間け）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）分子量が、非還元条件下でＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定すると１００，０００±１
０，０００ダルトンであり、非還元条件下ゲルロ過法で
測定すると１５０，０００±１０，０００ダルトンであ
り、（ｂ）逆相ＨＰＬＣにおいて単一のピークとして移
動し、（ｃ）比活性が少なくとも１×１０＾８単位／ｍｇ蛋白
質であり、（ｄ）蛋白質部分のアミノ酸構成がシステイン４．０％
以上であり、（ｅ）蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、【遺伝子配
列があります】・・・・・・であり、哺乳動物の骨髄細胞に作用して単
球−マクロファージの分化増殖を促進させる糖蛋白質か
らなる骨髄細胞分化増殖因子。
（２）微工研寄託第１５６８号の骨髄細胞分化増殖因子
産生細胞。
（３）［１］微工研寄託第１５６８号の自発増殖性を有するマ
ウス線維芽細胞を無血清条件下で培養し、［２］［１］
の培養上清を濃縮後、ｐＨ４．０〜５．０の条件下で処
理し、不溶分を分離し、［３］［２］の処理液をｐＨ５．０〜７．５の条件下で
陰イオン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交換体
に吸着させた後、０．０５〜０．３Ｍの無機塩溶液にて
溶出される分画を集め、［４］［３］の分画を０．６〜１．５Ｍの無機塩濃度に
調整し、ｐＨ６．０〜８．０の条件下で疎水性吸着体に
吸着させた後、０．９〜０．５Ｍの無機塩溶液により溶
出される分画を集め、［５］［４］の分画濃縮液をゲルロ過剤と接触させ、相
対溶出液量が１．０〜１．７の分画を取得し、［６］［
５］の溶出液を逆相イオンクロマトグラフィー操作を行
うことにより、（ａ）分子量が、非還元条件下でＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定すると１００，０００±１
０，０００ダルトンであり、非還元条件下ゲルロ過法で
測定すると１５０，０００±１０，０００ダルトンであ
り、（ｂ）逆相ＨＰＬＣにおいて単一のピークとして移
動し、（ｃ）比活性が少なくとも１×１０＾８単位／ｍｇ蛋白
質であり、（ｄ）蛋白質部分のアミノ酸構成がシステイン４．０％
以上であり、（ｅ）蛋白質部分のＮ末端アミノ酸配列が、【遺伝子配
列があります】・・・・・・である、哺乳動物の骨髄細胞に作用して単
球−マクロファージの分化増殖を促進させる糖蛋白質か
らなる骨髄細胞分化増殖因子の製法。