JPH05331200A - 新規な巨核球増幅因子 - Google Patents
新規な巨核球増幅因子Info
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- JPH05331200A JPH05331200A JP4342151A JP34215192A JPH05331200A JP H05331200 A JPH05331200 A JP H05331200A JP 4342151 A JP4342151 A JP 4342151A JP 34215192 A JP34215192 A JP 34215192A JP H05331200 A JPH05331200 A JP H05331200A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト由来の新規な巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−
ＰＯＴ）が提供される。このＭｅｇ−ＰＯＴはＳＤＳ−
ＰＡＧＥにおいて約３２０００の分子量を有する。ま
た、分子中に下記アミノ酸配列を含む。 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 【効果】 このＭｅｇ−ＰＯＴは血小板減少あるいは血
小板機能低下等に起因する疾患の治療薬として期待され
る。
ＰＯＴ）が提供される。このＭｅｇ−ＰＯＴはＳＤＳ−
ＰＡＧＥにおいて約３２０００の分子量を有する。ま
た、分子中に下記アミノ酸配列を含む。 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 【効果】 このＭｅｇ−ＰＯＴは血小板減少あるいは血
小板機能低下等に起因する疾患の治療薬として期待され
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多能性血液幹細胞より
分化した巨核球コロニー形成細胞（Ｍｅｇａｋａｒｙｏ
ｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ，
「ＣＦＵ−Ｍｅｇ」）に作用し、インターロイキン−３
（ＩＬ−３）等の巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇａｋ
ａｒｙｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇＦａｃｔｏｒ：Ｍｅｇ−ＣＳＦと略記する）活性を
有する物質の存在下に巨核球の成熟を促進するヒト由来
の巨核球増幅因子（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｐｏ
ｔｅｎｔｉａｔｏｒ「以下Ｍｅｇ−ＰＯＴと略記するこ
とあり」）に関する。
分化した巨核球コロニー形成細胞（Ｍｅｇａｋａｒｙｏ
ｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ，
「ＣＦＵ−Ｍｅｇ」）に作用し、インターロイキン−３
（ＩＬ−３）等の巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇａｋ
ａｒｙｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇＦａｃｔｏｒ：Ｍｅｇ−ＣＳＦと略記する）活性を
有する物質の存在下に巨核球の成熟を促進するヒト由来
の巨核球増幅因子（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｐｏ
ｔｅｎｔｉａｔｏｒ「以下Ｍｅｇ−ＰＯＴと略記するこ
とあり」）に関する。
【０００２】
【従来の技術】血小板は、生体の止血、血栓形成に重要
な意義を持つ血液有形成分の一つである。血小板は、骨
髄中の造血幹細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核芽球
となり、さらに成熟した巨核球から血液中に放出され
る。
な意義を持つ血液有形成分の一つである。血小板は、骨
髄中の造血幹細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核芽球
となり、さらに成熟した巨核球から血液中に放出され
る。
【０００３】骨髄細胞から巨核球コロニーを形成させる
には、２種類の異なった作用を持つ因子が必要であると
考えられている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｎ ｅｔ ａｌ．
「Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」１１０．１０１
（１９８２))。すなわち、単独で巨核球コロニーを形成
するＭｅｇ−ＣＳＦ、およびそれだけでは巨核球コロニ
ーを形成させる活性はないが、Ｍｅｇ−ＣＳＦとともに
加えると巨核球コロニー数を増加したり、その成熟を促
進する作用を示すＭｅｇ−ＰＯＴである。
には、２種類の異なった作用を持つ因子が必要であると
考えられている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｎ ｅｔ ａｌ．
「Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」１１０．１０１
（１９８２))。すなわち、単独で巨核球コロニーを形成
するＭｅｇ−ＣＳＦ、およびそれだけでは巨核球コロニ
ーを形成させる活性はないが、Ｍｅｇ−ＣＳＦとともに
加えると巨核球コロニー数を増加したり、その成熟を促
進する作用を示すＭｅｇ−ＰＯＴである。
【０００４】ヒトではＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有するもの
としてＩＬ−３（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．
「Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．」１６，８４３（１９８
８))や顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（Ｔｅ
ｒａｍｕｒａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ
ｏｌ．」１７，１０１１（１９８９))等が知られてい
る。また、ヒトでＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するものとし
ては、インターロイキン−６（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｍ
ａｎｄ Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｈ「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ」８，２４５（１９９０))、インタ
ーロイキン−１１（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｍ ｅｔ ａ
ｌ．「Ｂｌｏｏｄ」７９，３２７（１９９２))、エリス
ロポエチン（Ｂｒｕｎｏ，Ｅ ｅｔ ａｌ．「Ｂｌｏｏ
ｄ」７３，６７１（１９８９)) 等が知られている。
としてＩＬ−３（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．
「Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．」１６，８４３（１９８
８))や顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（Ｔｅ
ｒａｍｕｒａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ
ｏｌ．」１７，１０１１（１９８９))等が知られてい
る。また、ヒトでＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するものとし
ては、インターロイキン−６（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｍ
ａｎｄ Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｈ「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ」８，２４５（１９９０))、インタ
ーロイキン−１１（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｍ ｅｔ ａ
ｌ．「Ｂｌｏｏｄ」７９，３２７（１９９２))、エリス
ロポエチン（Ｂｒｕｎｏ，Ｅ ｅｔ ａｌ．「Ｂｌｏｏ
ｄ」７３，６７１（１９８９)) 等が知られている。
【０００５】しかし、これらのものは巨核球・血小板系
に特異的な因子ではなく、むしろ他の血球系や血球系以
外の細胞にも作用を有していることが知られている。従
って、これらのものを医薬品として巨核球・血小板系へ
の作用を期待して投与した場合、それとは別の作用をも
発現してしまうことが危惧される。このようなことか
ら、巨核球・血小板系に特異的に作用し、医薬品として
の有用性の高い生理活性物質が望まれている。
に特異的な因子ではなく、むしろ他の血球系や血球系以
外の細胞にも作用を有していることが知られている。従
って、これらのものを医薬品として巨核球・血小板系へ
の作用を期待して投与した場合、それとは別の作用をも
発現してしまうことが危惧される。このようなことか
ら、巨核球・血小板系に特異的に作用し、医薬品として
の有用性の高い生理活性物質が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ヒト
由来の単離された新規な巨核球増幅因子を提供するもの
である。
由来の単離された新規な巨核球増幅因子を提供するもの
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者はヒト膵臓癌腫
瘍細胞由来の株化細胞「ＨＰＣ−Ｙ５」（Ｎｏｚｏｍｉ
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ「ＣＡＮＣＥＲ Ｒ
ＥＳＥＡＲＣＨ」５０，７００８（１９９０))（１９９
１年１２月２７日工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第３７０３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７０３）と
してブダペスト条約に基づき国際寄託）を培養し、その
培養上清より巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）を単離
・精製することに成功し、その物性を解明し、本発明を
完成した。
瘍細胞由来の株化細胞「ＨＰＣ−Ｙ５」（Ｎｏｚｏｍｉ
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ「ＣＡＮＣＥＲ Ｒ
ＥＳＥＡＲＣＨ」５０，７００８（１９９０))（１９９
１年１２月２７日工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第３７０３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７０３）と
してブダペスト条約に基づき国際寄託）を培養し、その
培養上清より巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）を単離
・精製することに成功し、その物性を解明し、本発明を
完成した。
【０００８】即ち本発明は、つぎの性質； （１）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＬ−３の存在下で
用量依存的に巨核球コロニーを増殖させる； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
測定で分子量約３２０００に単一バンドを有する； （３）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ)(カ
ラム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４、４．６×２
５０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）において
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリル
濃度４０〜４５％の画分に溶出する；および （４）分子中に下記アミノ酸配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する巨核球増幅因子を提供する。
用量依存的に巨核球コロニーを増殖させる； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
測定で分子量約３２０００に単一バンドを有する； （３）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ)(カ
ラム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４、４．６×２
５０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）において
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリル
濃度４０〜４５％の画分に溶出する；および （４）分子中に下記アミノ酸配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する巨核球増幅因子を提供する。
【０００９】
【具体的説明】製造方法 本発明の巨核球増幅因子は、例えばヒト膵臓癌腫瘍細胞
由来の株化細胞「ＨＰＣ−Ｙ５」の培養上清から、次の
ようにして単離精製することができる。先ず、株化細胞
「ＨＰＣ−Ｙ５」を後出実施例２に詳細に示すとおり培
養して培養上清を回収する。次いでこの培養上清より実
施例３に詳細に示す手順により精製し単離する。
由来の株化細胞「ＨＰＣ−Ｙ５」の培養上清から、次の
ようにして単離精製することができる。先ず、株化細胞
「ＨＰＣ−Ｙ５」を後出実施例２に詳細に示すとおり培
養して培養上清を回収する。次いでこの培養上清より実
施例３に詳細に示す手順により精製し単離する。
【００１０】本発明の巨核球増幅因子は実施例に示す如
くして単離・精製されたが、一旦単離・精製され、その
性質が解明された後は、それらの性質を指標として蛋白
質の単離・精製に用いられる任意の常法を用いて本発明
の巨核球増幅因子を単離・精製することができることは
明らかである。
くして単離・精製されたが、一旦単離・精製され、その
性質が解明された後は、それらの性質を指標として蛋白
質の単離・精製に用いられる任意の常法を用いて本発明
の巨核球増幅因子を単離・精製することができることは
明らかである。
【００１１】さらに、本発明の巨核球増幅因子を遺伝子
工学的手段により製造することも可能である。例えば上
記株化細胞「ＨＰＣ−Ｙ５」から常法に従ってｍＲＮＡ
を単離し、そのｍＲＮＡに基づき常法に従ってｃＤＮＡ
ライブラリーを作製することができる。このｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブ
は、例えば本発明によって明らかにされた巨核球増幅因
子の部分アミノ酸配列に基づいて設計することができ
る。あるいは本発明の巨核球増幅因子を酵素的にまたは
化学的に切断し、その断片のアミノ酸配列を決定したの
ち、そのアミノ酸配列に基づいてＤＮＡプローブを設計
することもできる。
工学的手段により製造することも可能である。例えば上
記株化細胞「ＨＰＣ−Ｙ５」から常法に従ってｍＲＮＡ
を単離し、そのｍＲＮＡに基づき常法に従ってｃＤＮＡ
ライブラリーを作製することができる。このｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブ
は、例えば本発明によって明らかにされた巨核球増幅因
子の部分アミノ酸配列に基づいて設計することができ
る。あるいは本発明の巨核球増幅因子を酵素的にまたは
化学的に切断し、その断片のアミノ酸配列を決定したの
ち、そのアミノ酸配列に基づいてＤＮＡプローブを設計
することもできる。
【００１２】次に、こうして得られた巨核球増幅因子を
コードするｃＤＮＡを適当なベクターに挿入したのち、
この発現ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転
換体を培養することにより本発明の巨核球増幅因子を製
造することがでる。このための宿主としては、大腸菌の
ごとき原核細胞、酵母のごとき下等真核細胞、哺乳動物
細胞のごとき高等真核細胞等、常用の宿主を用いること
ができる。
コードするｃＤＮＡを適当なベクターに挿入したのち、
この発現ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転
換体を培養することにより本発明の巨核球増幅因子を製
造することがでる。このための宿主としては、大腸菌の
ごとき原核細胞、酵母のごとき下等真核細胞、哺乳動物
細胞のごとき高等真核細胞等、常用の宿主を用いること
ができる。
【００１３】本発明の巨核球増幅因子の性質を以下に示
す。 （１）分子量 本発明の巨核球増幅因子はＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による測定で分子量約３２０００（３１０
００〜３３０００）に単一バンドを有する。
す。 （１）分子量 本発明の巨核球増幅因子はＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による測定で分子量約３２０００（３１０
００〜３３０００）に単一バンドを有する。
【００１４】（２）部分アミノ酸配列 本発明の巨核球増幅因子、あるいは本因子をプロテアー
ゼで消化した後、逆相ＨＰＬＣにより得られたペプチド
断片を気相式プロテインシークエンサー４７００Ａ型
（ＡＢＩ社製）を用いてエドマン（Ｅｄｏｍａｎ）分解
し、得られたＰＴＨ−アミノ酸をＰＴＨ−アナライザー
１２０型（ＡＢＩ社）にて同定した場合、分子中に次の
アミノ酸配列（配列番号：１）；Gly Glu Thr Gly Gln
Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する。この
配列はＰＩＲ蛋白質データベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐ
ｒｏｔ蛋白質データベースで検索した結果、同一の配列
は見いだされなかった。
ゼで消化した後、逆相ＨＰＬＣにより得られたペプチド
断片を気相式プロテインシークエンサー４７００Ａ型
（ＡＢＩ社製）を用いてエドマン（Ｅｄｏｍａｎ）分解
し、得られたＰＴＨ−アミノ酸をＰＴＨ−アナライザー
１２０型（ＡＢＩ社）にて同定した場合、分子中に次の
アミノ酸配列（配列番号：１）；Gly Glu Thr Gly Gln
Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する。この
配列はＰＩＲ蛋白質データベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐ
ｒｏｔ蛋白質データベースで検索した結果、同一の配列
は見いだされなかった。
【００１５】（３）巨核球増幅因子活性 本発明の巨核球増幅因子は、逆相クロマトグラフィー
（カラム：ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎ Ｃ４、４．６×
２５０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）におい
て０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル濃度４０〜４５％の
画分に巨核球増幅因子活性が認められる。なお、巨核球
増幅因子活性は次記の方法で測定した。
（カラム：ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎ Ｃ４、４．６×
２５０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）におい
て０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル濃度４０〜４５％の
画分に巨核球増幅因子活性が認められる。なお、巨核球
増幅因子活性は次記の方法で測定した。
【００１６】巨核球増幅因子活性の測定方法 マウス骨髄細胞を用い、単層軟寒天培養法により行う。
即ち、ウマ血清（５６℃３０分処理、Ｂｉｏｃｅｌｌ社
製）０．２ｍｌ、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雄性、６
〜１２週齢）大髄骨骨髄細胞０．１ｍｌ（２ｘ１０5 有
核細胞）、組換え型マウスＩＬ−３を５ｎｇ／ｍｌ含む
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ培養液（ＩＭＤＭ）０．２ｍｌ、寒天を０．７５
％含む改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液０．４ｍｌおよび
被検検体（１０％ウマ血清を含むＩＭＤＭで希釈したも
の）０．１ｍｌを混合して、直径３５mmの組織培養プラ
スティックディッシュに入れて固まらせたのち、３７
℃、５％炭酸ガス／９５％空気、１００％湿度の条件で
培養を行う。
即ち、ウマ血清（５６℃３０分処理、Ｂｉｏｃｅｌｌ社
製）０．２ｍｌ、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雄性、６
〜１２週齢）大髄骨骨髄細胞０．１ｍｌ（２ｘ１０5 有
核細胞）、組換え型マウスＩＬ−３を５ｎｇ／ｍｌ含む
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ培養液（ＩＭＤＭ）０．２ｍｌ、寒天を０．７５
％含む改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液０．４ｍｌおよび
被検検体（１０％ウマ血清を含むＩＭＤＭで希釈したも
の）０．１ｍｌを混合して、直径３５mmの組織培養プラ
スティックディッシュに入れて固まらせたのち、３７
℃、５％炭酸ガス／９５％空気、１００％湿度の条件で
培養を行う。
【００１７】培養６日目に寒天層ごとスライドガラス上
に取出し乾燥させ、フィルム状標本としたものを５％グ
ルタルアルデヒドで固定し、Ｎａｋｅｆｆらの方法（Ｐ
ｒｏｓ．Ｓｃｏ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１５１,
５８７（１９７６))により、アセチルコリンエステラー
ゼ染色および巨核球コロニー数の算定を行う。この際、
アセチルコリンエステラーゼ染色陽性細胞を４個以上含
む集塊を巨核球コロニーとする。検鏡の倍率は２００倍
である。なお、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は、被検検体を添加
して生じた巨核球コロニー数と被検検体を添加せずに
（１０％ウマ血清を含むＩＭＤＭのみ溶媒として添加）
組換え型ＩＬ−３単独で生じた巨核球コロニー数との差
を指標とする。
に取出し乾燥させ、フィルム状標本としたものを５％グ
ルタルアルデヒドで固定し、Ｎａｋｅｆｆらの方法（Ｐ
ｒｏｓ．Ｓｃｏ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１５１,
５８７（１９７６))により、アセチルコリンエステラー
ゼ染色および巨核球コロニー数の算定を行う。この際、
アセチルコリンエステラーゼ染色陽性細胞を４個以上含
む集塊を巨核球コロニーとする。検鏡の倍率は２００倍
である。なお、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は、被検検体を添加
して生じた巨核球コロニー数と被検検体を添加せずに
（１０％ウマ血清を含むＩＭＤＭのみ溶媒として添加）
組換え型ＩＬ−３単独で生じた巨核球コロニー数との差
を指標とする。
【００１８】なお、本発明の巨核球増幅因子は糖蛋白質
であるが、常法で得られる脱糖鎖体も巨核球増幅因子活
性を有することが考えられることから、本発明に含まれ
ることは明白である。
であるが、常法で得られる脱糖鎖体も巨核球増幅因子活
性を有することが考えられることから、本発明に含まれ
ることは明白である。
【００１９】
【効果】本発明の巨核球増幅因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
においてＩＬ−３の存在下、用量依存的に巨核球コロニ
ーを増殖させる作用を有することから、例えば血小板減
少あるいは血小板の機能低下を伴う疾患に対する治療剤
としての有用性が期待される。
においてＩＬ−３の存在下、用量依存的に巨核球コロニ
ーを増殖させる作用を有することから、例えば血小板減
少あるいは血小板の機能低下を伴う疾患に対する治療剤
としての有用性が期待される。
【００２０】以下に実施例によって本発明を詳細に説明
するが、この実施例によって本発明が限定されるもので
はない。実施例１ ．Ｍｅｇ−ＰＯＴ産生細胞株ＨＰＣ−Ｙ５の樹
立 膵臓癌患者のリンパ節より得られた腫瘍を１０％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％、湿度１
００％）中にて培養することにより樹立した。この細胞
株を１％ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０培地に順化さ
せ、さらにＦＢＳ濃度を徐々に低下させ、最終的に蛋白
不含のＨａｍ’ｓ Ｆ１０培地中にても増殖し得るまで
順化させた。本細胞株はプラスティックディッシュ上で
単層状に増殖し、倍化時間は約３３時間であった。（Ｎ
ｏｚｏｍｉ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ ＣＡＮ
ＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ５０，７００８（１９９
０）参照）
するが、この実施例によって本発明が限定されるもので
はない。実施例１ ．Ｍｅｇ−ＰＯＴ産生細胞株ＨＰＣ−Ｙ５の樹
立 膵臓癌患者のリンパ節より得られた腫瘍を１０％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％、湿度１
００％）中にて培養することにより樹立した。この細胞
株を１％ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０培地に順化さ
せ、さらにＦＢＳ濃度を徐々に低下させ、最終的に蛋白
不含のＨａｍ’ｓ Ｆ１０培地中にても増殖し得るまで
順化させた。本細胞株はプラスティックディッシュ上で
単層状に増殖し、倍化時間は約３３時間であった。（Ｎ
ｏｚｏｍｉ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ ＣＡＮ
ＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ５０，７００８（１９９
０）参照）
【００２１】実施例２．ＨＰＣ−Ｙ５の継代培養および
ローラーボルトによる大量培養 実施例１で述べたＨＰＣ−Ｙ５細胞の継代培養は以下に
示す如く行った。プラスチック培養フラスコ（１５０cm
2 、コーニング社製）を用い、１０-8Ｍ亜セレン酸ナト
リウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧカリウムおよび１
００μｍ／ｍｌ硫酸カナマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｎ
ｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２培養液５０ｍ
ｌ中でＨＰＣ−Ｙ５細胞を培養し、４日毎に培養液を交
換した。
ローラーボルトによる大量培養 実施例１で述べたＨＰＣ−Ｙ５細胞の継代培養は以下に
示す如く行った。プラスチック培養フラスコ（１５０cm
2 、コーニング社製）を用い、１０-8Ｍ亜セレン酸ナト
リウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧカリウムおよび１
００μｍ／ｍｌ硫酸カナマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｎ
ｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２培養液５０ｍ
ｌ中でＨＰＣ−Ｙ５細胞を培養し、４日毎に培養液を交
換した。
【００２２】細胞継代時に培養液を除去し、あらかじめ
３７℃に加温した０．１２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ
社製）、０．０１％ＥＤＴＡ（和光純薬社製）を含むＣ
ａ、Ｍｇ不含Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ ＰＢＳ溶液を加え３
７℃で５分間加温した。ピペッティング操作により細胞
を剥離し、１５ｍｌ容量のプラスチィック製遠心管に細
胞を移し、１５００回転／分、５分間の遠心により細胞
を回収した。細胞を上記培養液に懸濁し、新しいフラス
コ４〜５本に継代した。一晩静置後、培養液を非付着性
細胞と共に除去し、新たに上記培養液を加えて培養を継
続した。以後４日毎に培養液を交換した。
３７℃に加温した０．１２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ
社製）、０．０１％ＥＤＴＡ（和光純薬社製）を含むＣ
ａ、Ｍｇ不含Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ ＰＢＳ溶液を加え３
７℃で５分間加温した。ピペッティング操作により細胞
を剥離し、１５ｍｌ容量のプラスチィック製遠心管に細
胞を移し、１５００回転／分、５分間の遠心により細胞
を回収した。細胞を上記培養液に懸濁し、新しいフラス
コ４〜５本に継代した。一晩静置後、培養液を非付着性
細胞と共に除去し、新たに上記培養液を加えて培養を継
続した。以後４日毎に培養液を交換した。
【００２３】また、実施例３で述べるＭｅｇ−ＰＯＴの
精製に供するためのＨＰＣ−Ｙ５細胞のローラーボルト
による大量培養を以下の如く実施した。上記の如く継代
されたＨＰＣ−Ｙ５細胞が完全に密に増殖した１５０cm
2 のプラスチィック培養フラスコより上記の如くトリプ
シン−ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、これを０．２％
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含有する上記培
地２５０ｍｌに浮遊させ、１７００cm2 のプラスチィッ
ク製ローラーボルト（コーニング社製）に移し、０．５
回転／分の速度で回転培養を行った。７日後に培養液を
血清を含まない上記培養液に交換し、以後４日毎に上記
無血清培養液の交換を行うことにより、精製用無血清培
養上清を回収した。
精製に供するためのＨＰＣ−Ｙ５細胞のローラーボルト
による大量培養を以下の如く実施した。上記の如く継代
されたＨＰＣ−Ｙ５細胞が完全に密に増殖した１５０cm
2 のプラスチィック培養フラスコより上記の如くトリプ
シン−ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、これを０．２％
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含有する上記培
地２５０ｍｌに浮遊させ、１７００cm2 のプラスチィッ
ク製ローラーボルト（コーニング社製）に移し、０．５
回転／分の速度で回転培養を行った。７日後に培養液を
血清を含まない上記培養液に交換し、以後４日毎に上記
無血清培養液の交換を行うことにより、精製用無血清培
養上清を回収した。
【００２４】実施例３．ＨＰＣ−Ｙ５株培養上清からＭ
ｅｇ−ＰＯＴの精製 実施例２で述べた方法に従って得たＨＰＣ−Ｙ５細胞の
培養上清（２７．３リットル）にＴｗｅｅｎ２０を終濃
度０．０１％となるように加えた後、人工腎臓ＰＡＮ１
２００（旭メディカ社製）を用いて、約２００倍に濃縮
した。濃縮液を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（pH５．０）に対し、４℃で一晩透析し
た。透析内液に遠心操作（１００００ｘｇ、６０分）を
施し不溶物を除去し上清を以下の精製に用いた。
ｅｇ−ＰＯＴの精製 実施例２で述べた方法に従って得たＨＰＣ−Ｙ５細胞の
培養上清（２７．３リットル）にＴｗｅｅｎ２０を終濃
度０．０１％となるように加えた後、人工腎臓ＰＡＮ１
２００（旭メディカ社製）を用いて、約２００倍に濃縮
した。濃縮液を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（pH５．０）に対し、４℃で一晩透析し
た。透析内液に遠心操作（１００００ｘｇ、６０分）を
施し不溶物を除去し上清を以下の精製に用いた。
【００２５】（ステップ−１）Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
イオン交換クロマトグラフィー 上述の遠心上清を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０
ｍＭ酢酸緩衝液（pH５．０）で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）
カラム（５ｘ１０cm）に添加した。同緩衝液でカラムを
洗浄した後、同緩衝液中、ＮａＣｌの濃度を０．１５
Ｍ、０．５Ｍ及び１．０Ｍと順次上げて吸着蛋白を溶出
した。素通り画分、洗浄画分および各塩濃度における溶
出画分について先に述べた方法に従って活性を測定した
結果、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ溶出画分にＭｅｇ−ＰＯＴ
活性が認められた。
イオン交換クロマトグラフィー 上述の遠心上清を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０
ｍＭ酢酸緩衝液（pH５．０）で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）
カラム（５ｘ１０cm）に添加した。同緩衝液でカラムを
洗浄した後、同緩衝液中、ＮａＣｌの濃度を０．１５
Ｍ、０．５Ｍ及び１．０Ｍと順次上げて吸着蛋白を溶出
した。素通り画分、洗浄画分および各塩濃度における溶
出画分について先に述べた方法に従って活性を測定した
結果、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ溶出画分にＭｅｇ−ＰＯＴ
活性が認められた。
【００２６】（ステップ−２）ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅイオン交換クロマトグラフィー ステップ−１で得た活性画分を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）に対
し４℃で一晩透析した。透析内液を同緩衝液で平衡化し
たＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（ファルマシア社製）カラム（２．２ｘ１３cm）に添加
し、同緩衝液でカラムを洗浄した。同緩衝液中ＮａＣｌ
の濃度を０．１５Ｍ、０．３Ｍおよび１．０Ｍと順次上
げて吸着蛋白を溶出した。素通り画分、洗浄画分および
各塩濃度における溶出画分について先に述べた方法に従
って活性を測定した結果、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ溶出画
分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。
ｏｓｅイオン交換クロマトグラフィー ステップ−１で得た活性画分を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）に対
し４℃で一晩透析した。透析内液を同緩衝液で平衡化し
たＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（ファルマシア社製）カラム（２．２ｘ１３cm）に添加
し、同緩衝液でカラムを洗浄した。同緩衝液中ＮａＣｌ
の濃度を０．１５Ｍ、０．３Ｍおよび１．０Ｍと順次上
げて吸着蛋白を溶出した。素通り画分、洗浄画分および
各塩濃度における溶出画分について先に述べた方法に従
って活性を測定した結果、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ溶出画
分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。
【００２７】（ステップ−３）逆相ＨＰＬＣ（Ｉ） ステップ−２で得た活性画分に５％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）を加えてpHを約２に調整し、０．１％ＴＦＡ
を含む５％アセトニトリルで平衡化した逆相ＨＰＬＣカ
ラム（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４、１０×２５
０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）に流速１．
０ｍｌ／分で添加した。吸着蛋白はアセトニトリルの直
線濃度勾配（５％→６５％、１２０分、０．５％アセト
ニトリル／分）により流速１ｍｌ／分で溶出した。溶出
蛋白の検出は２２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光
度を追跡することにより行い、１ｍｌずつ分画した。各
画分について活性測定を行った結果、アセトニトリル濃
度４０−４５％の画分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められ
た。
（ＴＦＡ）を加えてpHを約２に調整し、０．１％ＴＦＡ
を含む５％アセトニトリルで平衡化した逆相ＨＰＬＣカ
ラム（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４、１０×２５
０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）に流速１．
０ｍｌ／分で添加した。吸着蛋白はアセトニトリルの直
線濃度勾配（５％→６５％、１２０分、０．５％アセト
ニトリル／分）により流速１ｍｌ／分で溶出した。溶出
蛋白の検出は２２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光
度を追跡することにより行い、１ｍｌずつ分画した。各
画分について活性測定を行った結果、アセトニトリル濃
度４０−４５％の画分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められ
た。
【００２８】（ステップ−４）逆相ＨＰＬＣ（II） ステップ−３で得た活性画分に０．１％ＴＦＡで２倍希
釈し、０．１％ＴＦＡを含む３５％アセトニトリルで平
衡化した逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｃ４、４．６×２５０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖ
ｙｄａｃ社製）に流速１．０ｍｌ／分で添加した。吸着
蛋白はアセトニトリルの直線濃度勾配（３５％→５０
％、７５分、０．２％アセトニトリル／分）により流速
１ｍｌ／分で溶出した。溶出蛋白の検出は２２０ｎｍお
よび２８０ｎｍの吸光度を追跡することにより行い、１
ｍｌずつ分画した。各画分について活性測定を行った結
果、アセトニトリル濃度４０−４５％の画分にＭｅｇ−
ＰＯＴ活性が認められた。
釈し、０．１％ＴＦＡを含む３５％アセトニトリルで平
衡化した逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｃ４、４．６×２５０mm、粒子サイズ５μｍ、Ｖ
ｙｄａｃ社製）に流速１．０ｍｌ／分で添加した。吸着
蛋白はアセトニトリルの直線濃度勾配（３５％→５０
％、７５分、０．２％アセトニトリル／分）により流速
１ｍｌ／分で溶出した。溶出蛋白の検出は２２０ｎｍお
よび２８０ｎｍの吸光度を追跡することにより行い、１
ｍｌずつ分画した。各画分について活性測定を行った結
果、アセトニトリル濃度４０−４５％の画分にＭｅｇ−
ＰＯＴ活性が認められた。
【００２９】（ステップ−５）ＤＥＡＥ・イオン交換Ｈ
ＰＬＣ ステップ−４で得た活性画分を凍結乾燥した後、０．０
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH８．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｐａｋ Ｇ−ＤＥＡＥカラム（Ｗａｔｅｒｓ社
製、８．２ｘ７５mm）に流速０．７ｍｌ／分で添加し
た。吸着蛋白はＮａＣｌの直線濃度勾配（０．０Ｍ→
０．２Ｍ、４０分、５ｍＭ ＮａＣｌ／分）により流速
０．７ｍｌ／分で溶出した。溶出蛋白は２２０ｎｍで検
出し、０．７ｍｌずつ分画した。各画分について活性を
測定した結果、ＮａＣｌ濃度７５ｍＭ以下の画分にＭｅ
ｇ−ＰＯＴ活性が認められた。
ＰＬＣ ステップ−４で得た活性画分を凍結乾燥した後、０．０
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH８．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｐａｋ Ｇ−ＤＥＡＥカラム（Ｗａｔｅｒｓ社
製、８．２ｘ７５mm）に流速０．７ｍｌ／分で添加し
た。吸着蛋白はＮａＣｌの直線濃度勾配（０．０Ｍ→
０．２Ｍ、４０分、５ｍＭ ＮａＣｌ／分）により流速
０．７ｍｌ／分で溶出した。溶出蛋白は２２０ｎｍで検
出し、０．７ｍｌずつ分画した。各画分について活性を
測定した結果、ＮａＣｌ濃度７５ｍＭ以下の画分にＭｅ
ｇ−ＰＯＴ活性が認められた。
【００３０】（ステップ−６）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３００
０ＳＷゲル濾過 ステップ−５で得た活性画分を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ
２０及び０．１５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３
０００ＳＷカラム（東ソー社製 ２１．５×６００ｎ
ｍ、ガードカラム２１．５×７５ｎｍ）に流速３ｍｌ／
分で流出させ、そして溶出蛋白は２２０ｎｍで検出し
た。３ｍｌずつ分画した各画分について、活性測定した
結果、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は溶出時間４９〜５４分の画
分に認められたので、その画分を回収した。
０ＳＷゲル濾過 ステップ−５で得た活性画分を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ
２０及び０．１５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３
０００ＳＷカラム（東ソー社製 ２１．５×６００ｎ
ｍ、ガードカラム２１．５×７５ｎｍ）に流速３ｍｌ／
分で流出させ、そして溶出蛋白は２２０ｎｍで検出し
た。３ｍｌずつ分画した各画分について、活性測定した
結果、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は溶出時間４９〜５４分の画
分に認められたので、その画分を回収した。
【００３１】（ステップ−７）逆相ＨＰＬＣ（III) ステップ６で得た活性画分を５％ＴＦＡを加えてpHを約
２に調整し、ステップ４の逆相ＨＰＬＣ（II）と同一条
件下にクロマトグラフィーを行った。各画分について活
性を測定した結果、主ピーク（アセトニトリル濃度４０
％−４５％）にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。この
結果を図１に示す。図１において横棒で示すピーク画分
を精製Ｍｅｇ−ＰＯＴとして回収した。
２に調整し、ステップ４の逆相ＨＰＬＣ（II）と同一条
件下にクロマトグラフィーを行った。各画分について活
性を測定した結果、主ピーク（アセトニトリル濃度４０
％−４５％）にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。この
結果を図１に示す。図１において横棒で示すピーク画分
を精製Ｍｅｇ−ＰＯＴとして回収した。
【００３２】実施例４．巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔ）の分子量 実施例３で精製した巨核球増幅因子の分子量をドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した。分離ゲル濃度は１２
％、濃縮ゲル濃度は４％とした。これらの試料を遠心濃
縮器（トミー精工社製）を用いて乾燥し、５％２−メル
カプトエタノールおよび２％ＳＤＳを含む試料用緩衝液
（pH６．８）に溶解し、３分間煮沸した。泳動は１００
Ｖで３０分、１４０Ｖで１時間行い、ゲルはメタノー
ル：酢酸：水＝３：１：６で固定し、銀染色試薬（第一
化学薬品社製）により蛋白質を染色した。
Ｔ）の分子量 実施例３で精製した巨核球増幅因子の分子量をドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した。分離ゲル濃度は１２
％、濃縮ゲル濃度は４％とした。これらの試料を遠心濃
縮器（トミー精工社製）を用いて乾燥し、５％２−メル
カプトエタノールおよび２％ＳＤＳを含む試料用緩衝液
（pH６．８）に溶解し、３分間煮沸した。泳動は１００
Ｖで３０分、１４０Ｖで１時間行い、ゲルはメタノー
ル：酢酸：水＝３：１：６で固定し、銀染色試薬（第一
化学薬品社製）により蛋白質を染色した。
【００３３】分子量マーカーはバイオラッド社製低分子
量マーカー〔Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（９２．
５ｋｄ）、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ
（６６．２ｋｄ）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４５．０ｋ
ｄ）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（３１．
０ｋｄ）、Ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（２１．５ｋｄ）、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１
４．４ｋｄ）〕を用いた。この結果を図２に示す。図２
から明らかなとおり、本発明の巨核球増幅因子（Ｍｅｇ
−ＰＯＴ）は分子量約３２０００（３１０００〜３３０
００）に単一バンドを示した。
量マーカー〔Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（９２．
５ｋｄ）、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ
（６６．２ｋｄ）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４５．０ｋ
ｄ）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（３１．
０ｋｄ）、Ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（２１．５ｋｄ）、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１
４．４ｋｄ）〕を用いた。この結果を図２に示す。図２
から明らかなとおり、本発明の巨核球増幅因子（Ｍｅｇ
−ＰＯＴ）は分子量約３２０００（３１０００〜３３０
００）に単一バンドを示した。
【００３４】実施例５．巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔ）のアミノ酸組成 実施例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料を１％フェノー
ルを含む６ＮＨＣｌで、１１０℃、２４時間、減圧加下
水分解した。遊離したアミノ酸にフェニルイソチオシア
ネートを加え、室温で２５分間反応させ、フェニルチオ
カルバモイル（ＰＴＣ）誘導体とした。得られたＰＴＣ
誘導体をＰｉｃｏ−Ｔａｇアミノ酸自動分析システム
（ウォーターズ社製）を用いて定量した。定量結果及び
Ａｌａを２４個あるいはＧｌｘを２９個とした時のアミ
ノ酸組成を第１表に示す。
Ｔ）のアミノ酸組成 実施例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料を１％フェノー
ルを含む６ＮＨＣｌで、１１０℃、２４時間、減圧加下
水分解した。遊離したアミノ酸にフェニルイソチオシア
ネートを加え、室温で２５分間反応させ、フェニルチオ
カルバモイル（ＰＴＣ）誘導体とした。得られたＰＴＣ
誘導体をＰｉｃｏ−Ｔａｇアミノ酸自動分析システム
（ウォーターズ社製）を用いて定量した。定量結果及び
Ａｌａを２４個あるいはＧｌｘを２９個とした時のアミ
ノ酸組成を第１表に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】実施例６．巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔ）のアミノ酸配列 実施例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料を気相式プロテ
インシークエンサー４７０Ａ型（アプライドバイオシス
テムズ・インク社製）を用いてエドマン分解を行い、得
られたＰＴＨ−アミノ酸をＰＴＨアナライザー１２０型
（アプライドバイオシステムズ・インク社製）を用いて
同定した。その結果、Ｎ末端近傍のアミノ酸配列（配列
−１〜３）は以下に示す３種が認められた。また、実施
例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料をＶ８プロテアーゼ
で消化し、逆相ＨＰＬＣで単離したペプチド断片を用
い、同様の処理操作によって同定されたアミノ酸配列を
配列４として示す。なおＸａａは未同定のアミノ酸残基
を示す。
Ｔ）のアミノ酸配列 実施例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料を気相式プロテ
インシークエンサー４７０Ａ型（アプライドバイオシス
テムズ・インク社製）を用いてエドマン分解を行い、得
られたＰＴＨ−アミノ酸をＰＴＨアナライザー１２０型
（アプライドバイオシステムズ・インク社製）を用いて
同定した。その結果、Ｎ末端近傍のアミノ酸配列（配列
−１〜３）は以下に示す３種が認められた。また、実施
例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料をＶ８プロテアーゼ
で消化し、逆相ＨＰＬＣで単離したペプチド断片を用
い、同様の処理操作によって同定されたアミノ酸配列を
配列４として示す。なおＸａａは未同定のアミノ酸残基
を示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】上記の配列１〜３のアミノ酸配列において
以下のアミノ酸配列が共通していることが認められた。 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu(配列番号：１）
以下のアミノ酸配列が共通していることが認められた。 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu(配列番号：１）
【００３９】実施例７．巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔ）の巨核球増幅因子活性 実施例３で精製した糖鎖を有する巨核球増幅因子のマウ
ス骨髄細胞に対する巨核球増幅因子活性を先に述べた方
法に従って測定した。即ち、精製Ｍｅｇ−ＰＯＴを１０
％ウマ血清を含むＩＭＤＭで１０倍希釈した。これをさ
らにウマ血清を含む上記ＩＭＤＭで２，４，８，１６，
３２および６４倍に希釈したものを調製し、これらを被
検検体として活性の測定を行った結果、図３に示すよう
な濃度−反応曲線が得られた。
Ｔ）の巨核球増幅因子活性 実施例３で精製した糖鎖を有する巨核球増幅因子のマウ
ス骨髄細胞に対する巨核球増幅因子活性を先に述べた方
法に従って測定した。即ち、精製Ｍｅｇ−ＰＯＴを１０
％ウマ血清を含むＩＭＤＭで１０倍希釈した。これをさ
らにウマ血清を含む上記ＩＭＤＭで２，４，８，１６，
３２および６４倍に希釈したものを調製し、これらを被
検検体として活性の測定を行った結果、図３に示すよう
な濃度−反応曲線が得られた。
【００４０】
配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10
【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Xaa Ile Ser Ser 1 5 10 15 Leu Xaa Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro 20 25
【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn 1 5 10 15
【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala 1 5 10 15
【００４４】配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10 15
【図１】図１は実施例３におけるステップ−７の逆相Ｈ
ＰＬＣ（III)の結果を示す。
ＰＬＣ（III)の結果を示す。
【図２】図２は実施例４におけるＭｅｇ−ＰＯＴのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示す。
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示す。
【図３】図３は実施例７における巨核球増幅因子のＭｅ
ｇ−ＰＯＴ活性の濃度−反応曲線を示す。各点とも２回
の測定の平均値である。なお、縦軸のＭｅｇ−ＰＯＴ活
性は被検検体添加時と非添加時（組換え型マウスＩＬ−
３単独）の巨核球コロニー数の差で示した。被検検体非
添加時の巨核球コロニー数は２２および２５、平均２
３．５であった。
ｇ−ＰＯＴ活性の濃度−反応曲線を示す。各点とも２回
の測定の平均値である。なお、縦軸のＭｅｇ−ＰＯＴ活
性は被検検体添加時と非添加時（組換え型マウスＩＬ−
３単独）の巨核球コロニー数の差で示した。被検検体非
添加時の巨核球コロニー数は２２および２５、平均２
３．５であった。
Claims (1)
- 【請求項１】 次の性質； （１）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＬ−３の存在下で
巨核球コロニーを用量依存的に増殖させる； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
測定で分子量約３２０００に単一バンドを有する； （３）逆相高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｖｙ
ｄａｃ ＰｒｏｔｅｉｎＣ４、４．６×２５０mm、粒子
サイズ５μｍ、Ｖｙｄａｃ社製）において０．１％トリ
フルオロ酢酸中アセトニトリル濃度４０〜４５％の画分
に溶出する；および （４）分子中に下記アミノ酸配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する巨核球増幅因子。
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