KR100233701B1

KR100233701B1 - 신규 거핵구 증폭인자

Info

Publication number: KR100233701B1
Application number: KR1019940702233A
Authority: KR
Inventors: 노조미 야마구찌; 마사요시 오오에다; 구니히로 핫또리
Original assignee: 나가야마 오사무; 쥬가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1991-12-27
Filing date: 1992-12-24
Publication date: 1999-12-01
Also published as: KR940703858A; TW224975B; CN1075148A; CA2126680A1; EP0621285B1; EP0621285A4; AU658040B2; JP3328341B2; ATE221084T1; CA2126680C; WO1993013132A1; DE69232698D1; DE69232698T2; EP0621285A1; AU3172193A; US5498698A; JPH05331200A; ES2180542T3

Abstract

사람 유래의 신규인 거핵구 증폭인자(Meg-POT)가 제공된다. 이 Meg-POT는 SDS-PAGE에 있어서 약 32000의 분자량을 갖는다. 또 분자중에 하기 아미노산 배열을 함유한다.

Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu

이 Meg-POT는 혈소판 감소 또는 혈소판 기능저하등에 기인하는 환자의 치료약으로서 기대된다.

Description

[발명의 명칭]

신규 거핵구 증폭인자

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 다기능성 혈액간세포에서 분화하고 거핵구 콜로니 형성세포(Megakaryocyte Colony-Forming Unit 「CFU-Meg」)에 작용하며, 인터로이킨 3 (IL-3)등의 거핵구 콜로니 자극인자 (Megakaryocyte Colony-Stimulating Factor : Meg-CSF로 약기한다)활성을 갖는 물질의 존재하에 거핵구의 성숙을 촉진하는 사람 유래의 거핵구 증폭인자 (Megakaryocyte Potentiator 「이하 Meg-POT로 약기하는 적이 있음」)에 관한 것이다.

[배경기술]

혈소판은, 생체의 지혈, 혈전 형성에 중요한 의의를 갖는 혈액 유형 성분의 하나이다. 혈소판은, 골수중의 조혈 간세포에서 거핵구계 전구세포를 거쳐 거핵 아구가 되고, 다시 성숙한 거핵구에서 혈액증에 방출된다.

골수세포에서 거핵구 콜로니를 형성시키는 데에는, 2 종류의 상이한 작용을 갖는 인자가 필요하다고 생각되고 있다(Williams, N 등 「J. Cell Physiol.」 110, 101 (1982)). 즉, 단독으로 거핵구 콜로니를 형성하는 Meg-CSF 및 그것만으로는 거핵구 콜로니를 형성시키는 활성은 없지만 Meg-CSF와 함께 가하면 거핵구 콜로니수를 증가하기도 하고, 그 성숙을 촉진하는 작용을 나타내는 Meg-POT이다.

사람에서는 Meg-CSF활성을 갖는 것으로서 IL-3(Teramura, M등 「Exp. Hematol.」 16, 843 (1988)) 및 과립구ㆍ마크로파지 콜로니 자극인자(Teramura, M등 「Exp. Hemaytol」 17, 1011(1989))등이 알려져 있다. 또한, 사람에서 Meg-POT활성을 갖는 것으로서는 인터로이킨 6 (Teramura, M 및 Mizoguchi, H 「Int.J.Cell Cloning」 8, 245(1990)), 인터로이킨 11 (Teramura, M등 「Blood」 79, 327 (1992)), 에리트로포에틴 (Bruno, E등 「Blood」73, 671 (1989))등이 알려져 있다.

그러나, 이들은 거핵구ㆍ혈소판계에 특이적인 인자가 아니고, 오히려 또다른 혈구계나 혈구계 이외의 세포에도 작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이들을 의약품으로서 거핵구ㆍ혈소판계에의 작용을 기대하여 투여할 경우, 이것과는 별개의 작용도 발현되는 것이 우려된다. 이와같은 사릴로부터 거핵구ㆍ혈소판계에 특이적으로 작용하고, 의약품으로서의 유용성이 높은 생리활성 물질이 요구되고 있다.

[발명의 개시]

따라서 본 발명은, 사람 유래의 단리된 신규 거핵구증폭인자를 제공하는 것이다.

본 발명은 사람 췌장암종양 세포유래의 주화세포 「HPC-Y5」(nozomi Yamaguchi 등 CANCER RESEARCH 50, 7008(1990)(1991년 12월 27일 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 미공연조기 제 3703호 (FERM BP-3703)으로서 부다페스트 조약에 의거하여 국제기탁)을 배양하고, 그 배양상청에서 거핵구증폭인자 (Meg-POT)를 단리ㆍ정제하는 것에 성공하여, 그 물성을 해명하고, 본 발명을 완성했다.

즉 본 발명은 다음의 성질;

(1) 시험관내에 있어서, IL-3의 존재하에서 용량 의존적으로 거핵구 콜로니를 증식시킨다;

(2) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의한 측정에서 분자량 약 32000에 단일 밴드를 갖는다;

(3) 역상고속액체 크로마토그래피 (HPLC)(컬럼: Vydac Protein C4, 4.6 × 250㎜, 입자사이즈 5㎛, Vydac 사제)에 있어서 0.1% 트리플루오로 초산(TFA)중 아세토니트릴 농도 40~45%의 분획으로 용출한다; 및

(4) 분자중에 하기 아미노산배열

Gly Glu Thr Cly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu를 갖는 거핵구증폭인자를 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 실시예 3에 있어서의 스텝-7의 역상 HPLC(Ⅲ)의 결과를 표시한다.

제2도는 실시예 4에 있어서의 Meg-POT의 SDS-PAGE에 의한 분자량 측정의 결과를 표시한다.

제3도는 실시예 7에 있어서의 거핵구 증폭인자의 Meg-POT 활성의 농도-반응곡선을 표시한다. 각 점 모두 2회의 측정의 평균치이다. 또한, 세로축의 Meg-POT 활성은, 피검 검체첨가시와 비첨가시 (재조합형 마우스 IL-3단독)의 거핵구 콜로니수의 차로 표시했다. 피검검체 비첨가시의 거핵구 콜로니 수는 22 및 25, 평균 23.5였다.

[발명을 실시하기위한 최량의 형태]

[제조방법]

본 발명의 거핵구 증폭인자는, 예를들면 사람 췌장암종양 세포유래의 주화세포 「HPC-Y5」의 배양상청에서, 다음과 같이하여 단리ㆍ정제할 수 있다. 우선, 주화세포 「HPC-Y5」를 후에 나오는 실시예 2에 상세히 설명하는 바와 같이 배양하여 배양상청을 회수한다. 이어서 이 배양상청에서 실시예 3에 상세히 설명하는 순서에 따라 정제 단리한다.

본 발명의 거핵구 증폭인자는 실시예에 나타낸 바와 같이 단리ㆍ정제되었지만, 일단 단리ㆍ정제되어 그 성질이 해명된 후에는, 이들의 성질을 지표로 하여 단백질의 단리ㆍ정제에 사용되는 임의의 상법을 사용하여 본 발명의 거핵구 증폭인자를 단리ㆍ정제할 수 있다는 것은 명백하다.

또한, 본 발명의 거핵구 증폭인자를 유전자 공학적 수단에 의하여 제조하는 것도 가능하다. 예를 들면, 상기 주화세포 「HPC-Y5」에서 상법에 따라서 mRNA를 단리 하고, 그 mRNA에 의거하여 상법에 따라서 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 이 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 DNA 프로브는, 예를들면 본 발명에 의하여 명백해진 거핵구 증폭인자의 부분 아미노산 배열에 의거하여 설계할 수 있다. 혹은 본 발명의 거핵구 증폭인자를 효소적으로 또는 화학적으로 절단하고, 그 단편의 아미노산 배열을 결정한후, 그 아미노산 배열에 의거하여 DNA 프로브를 설계할 수도 있다.

다음에, 이렇게 하여 얻어진 거핵구증폭인자를 코드하는 cDNA를 적당한 벡터에 삽입한 후, 이 발현벡터에 의하여 숙주를 형질 전환하고, 이 형질전화체를 배양함으로써 본 발명의 거핵구증폭인자를 제조할 수 있다. 이를 위한 숙주로서는, 대장균과 같은 원핵세포, 효모와 같은 하등 진핵세포, 포유동물 세포와 같은 고등 진핵세포 등, 사용의 숙주를 사용할 수 있다.

본 발명의 거핵구 증폭인자의 성질을 하기에 나타낸다.

[(1) 분자량]

본 발명의 거핵구증폭인자는 SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기영동에 의한 측정에서 분자량 약 32000(31000~33000)에 단일 밴드를 갖는다.

[(2) 부분 아미노산 배열]

본 발명의 거핵구증폭인자, 혹은 본인자를 프로테아제로 소화한 후, 역상 HPLC에 의하여 얻어진 펩티드 단편을 기상식 프로테인 시퀀서 470A형(ABI 사제)를 사용하여 에도만(Edoman)분해하고, 얻어진 PTH-아미노산을 PTH-애널라이저 120형(ABI 사제)으로 동정한 경우, 분자증에 다음의 아미노산 배열(배열번호 : 1);

Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu을 갖는다. 이 배열은 PIR 단백질 데이터 베이스 및 Swiss Prot 단백질 데이터 베이스로 탐색한 결과, 동일한 배열은 발견되지 않았다.

[(3) 거핵구 증폭인자 활성]

본 발명의 거핵구 증폭인자는, 역상 크로마토그래피 (컬럼 : Vydac Protein C4, 4.6× 250㎜, 입자사이즈 5㎛, Vydac 사제)에 있어서, 0.1% TFA중 아세토니트릴 농도 40~45%의 분획에 거핵구 증폭인자 활성이 인정된다.

또한, 거핵구 증폭인자활성은 하기의 방법으로 측정했다.

[거핵구 증폭인자활성의 측정방법]

마우스 골수세포를 사용하여, 단층연 한천 배양법에 의해 실행한다. 즉, 말혈청 (56℃ 30분처리, Biocell 사제) 0.2ml, 마우스 (C57 BL/6N 계웅성, 6~12주령)대퇴골 골수세포 0.1ml (2×10⁵유핵세포), 제조합 마우스 IL-3을 5ng/ml를 함유하는 Iscove's Modified Dulbecco's 배양액(IMDM) 0.2ml, 한천을 0.75% 함유하는 개변 McCoy's 5A 배양액 0.4ml 및 피검검체 (10% 말혈청을 함유하는 IMDM로 희석한 것) 0.1ml를 혼합하여, 직경 35㎜의 조직배양 플라스틱 디시에 넣어 고화시킨뒤에, 37℃, 5% 탄산가스/95% 공기, 100% 온도의 조건에서 배양한다. 배양 6일째에 한천층마다 슬라이드 유리상에 취출건조시키고, 필름상 표본으로 한 것을 5% 글루탈알데히드로 고정하고, Nakeff들의 방법(Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 151 587 (1976년))에 의하여 아세틸 콜린 에스테라제 염색 및 거핵구 콜로니 수의 산정을 한다. 이때, 아세틸콜린 에스테라제 염색 양성세포를 4개이상 함유하는 집괴를 거핵구 콜로니로한다. 검경의 배율은 200배이다. 또한, Meg-POT 활성은, 피검검체를 첨가하여 생긴 거핵구 콜로니수와 피검검체를 첨가하지 않고 (10% 말혈정을 함유하는 IMDM만 용매로하여 첨가) 재조합형 IL-3단독으로 생긴 거핵구 콜로니 수와의 차를 지표로 한다.

또한, 본 발명의 거핵구 증폭인자는 당단백이지만, 상법에서 얻어지는 탈당쇄체도 거핵구 증폭인자 활성을 갖는 것으로 생각할 수 있으므로, 본 발명에 포함되는 것은 명확하다.

이하에 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하지만 이 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[Meg-POT 신생세포주 HPC-Y5의 수립]

췌장암환자의 임파절에서 얻어진 종양을 10% 소태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 1640배지를 사용하여, 탄산가스 인큐베이터(탄산가스 농도 5%, 온도 100%)에서 배양함으로써 수립했다. 이 세포주를 1% FBS함유 Ham's F 10 배지에 순화시키고, 다시 FBS 농도를 서서히 저하시키고, 최종적으로 단백을 함유하지 않은 Ham's F 10 배지 중에서도 증식할 수 있을 때까지 순화시켰다. 본 세포주는 플라스틱 디시상에서 단층상으로 증식 하고, 두배로 되는 시간은 약 33시간이었다. (Nozomi Yamaguchi 등 「CANCER RESEARCH」50, 7008 (1990) 참조)

[실시예 2]

[HPC-Y5의 계대배양 및 롤러바틀에 의한 대량배양]

실시예 1에서 설명한 HPC-Y5세포의 계대배양은 이하 설명과 같이 실행했다. 플라스틱 배양 프라스코 (150㎠, 코닝사제)를 사용하여, 10^8-M 아세렌산나트륨, 100U/ml 페니실린 G 칼륨 및 100㎍/ml 황산 카나마이신을 함유하는 Ham's Nutrient Mixture F12 배양액 50ml 중에서 HPC-Y5세포를 배양하고, 4일 마다 배양액을 교환했다.

세포계대시에 배양액을 제거하고, 사전에 37℃로 가온한 0.125% 트립신 (GIBCO 사제), 0.01% EDTA (와꼬순약사제)를 함유하며 Ca, Mg를 함유하지 않은 Dulbeco's PBS 용액을 가하고 37℃에서 5분간 가온했다.

피베팅 조작에 의하여 세포를 박리하고, 15ml 용량의 플라스틱제 원심관에 세포를 옮기고, 1500회전/분, 5분간의 원심에 의하여 세포를 회수했다. 세포를 상기 배양액에 현탁하고, 새로운 플라스크 4~5개에 계대 했다.

하루밤 정치후, 배양액을 비부착성 세포와 함께 제거하고, 새로 상기 배양액을 가하여 배양을 계속했다. 이후 4일마다 배양액을 교환했다.

또, 실시예 3에서 설명하는 Meg-POT의 정제에 공여하기 위한 HPC-Y5 세포의 롤러바틀에 의한 대량배양을 이하와 같이 실시했다.

상기와 같이 계대된 HPC-Y5 세포가 완전히 빽빽하게 증식한 150㎠의 플라스틱 배양 플라스크에서 상기와 같이 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 회수하고, 이것을 0.2% 소태아혈청 (Hyclone 사제)를 함유하는 상기 배양액 250ml에 부유시키고, 1700㎠의 플라스틱제 롤러바틀(코닝사제)로 옮기고, 0.5회전/분의 속도로 회전배양을 했다. 7일 후에 배양액을 혈청을 함유하지 않는 상기 배양액으로 교환하고, 이후 4일 마다 상기 무혈청 배양액의 교환을 실행함으로써, 정제용 무혈청 배양상청을 회수했다.

[실시예 3]

[HPC-Y5주 배양 상청에서의 Meg-POT의 정제]

실시예 2에서 설명한 방법에 따라서 얻은 HPC-Y5 세포의 배양상청(27.3 l)에 Tween 20을 최종농도 0.01%가 되도록 가한 후, 인공신장 PAN 1200(아사히 메티카 사제)을 사용하여, 약 200배로 농축했다. 농축액을 0.01% Tween 20을 함유하는 10mM 초산 완충액(pH 5.0)에 대해서, 4℃에서 하루밤 투석했다. 투석내액에 원심조작 (10000 × g, 60분)을 실시하고 불용물을 제거하고 상청을 이하의 정제에 사용했다.

[(스텝1) S-Sepharose 이온교환 크로마토 그래피]

상술한 원심상청을 0.01% Tween 20을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 5.0)으로 평형화한 S-Sepharose Fast Flow (팔마시아사제) 칼럼(5 × 10㎝)에 첨가했다. 동완충액으로 칼럼을 세정한 후, 동완충액중에, NaCl의 농도를 0.15M, 0.3M 및 1.0M으로 순차적으로 올리고 흡착단백을 용출했다. 그냥 지나간 분획, 세정분획 및 각 염농도에 있어서의 용출분획에 대해서 앞에 설명한 방법에 따라서 활성을 측정한 결과, 0.15M-NaCl 용출 분획에 Meg-POT활성이 인정되었다.

[(스텝2) DEAE-Sepharose 이온교환 크로마토크래피]

스텝에서 얻은 활성분획을 0.01% Tween 20을 함유하는 10mM 트리스-염산완충액 (pH 7.4)에 대해서 4℃에서 하루밤 투석했다. 투석내액을 동완충액으로 평형화한 DEAE-Sepharose Fast Flow (팔마시아사제)칼럼 (2.2 × 13㎝)에 첨가하고, 동완충액으로 칼럼을 세정했다. 동완충액 중 NaCl의 농도를 0.15M, 0.3M 및 1.0M로 순차로 올려서 흡착단백을 용출했다. 그냥 지난 분획, 세정분획 및 각 염 농도에 있어서의 용출분획에 대해서 앞서 설명한 방법에 따라서 활성을 측정한 결과, 0.15M-NaCl 용출분획에 Meg-POT 활성이 인정되었다.

[(스텝3) 역상 HPLC (Ⅰ)]

스텝 2에서 얻어진 활성분획에 5% 트리플루오로초산(TFA)를 가하여 pH를 약 2로 조정하고, 0.1% TFA를 함유하는 5% 아세토니트릴로 평형화한 역상 HPLC 칼럼 (Vydac Protein C4, 10 × 250㎜, 입자사이즈 5㎛, Vydac 사제)에 유속 1.0ml/분으로 첨가했다. 흡착단백은 아세토니트릴의 직선농도기울기 (5%→65%, 120분, 0.5% 아세토니트릴/분)에 의하여 유속 1ml/분으로 용출했다. 용출단백의 검출은 220㎚ 및 280㎚에 있어서의 흡광도를 추적함으로써 행하고, 1ml씩 분획화 했다. 각 분획에 대해서 활성측정을 한 결과 아세토니트릴 농도 40~45%의 분획에서 Meg-POT 활성이 인정되었다.

[(스텝4) 역상 HPLC (Ⅱ)]

스텝 3에서 얻어진 활성분획을 0.1% TFA로 2배 희석하고, 0.1% TFA를 함유하는 35% 아세토니트릴로 평형화한 역상 HPLC 칼럼 (Vydac Protein C4, 4.6 × 250㎜, 입자사이즈 5㎛, Vydac 사제)에 유속 1.0ml/분으로 첨가했다. 흡착단백은 아세토니트릴의 직선농도기울기 (35%→50%, 75분, 0.2%아세토니트릴/분)에 의하여 유속 1ml분으로 용출했다. 용출단백의 검출은 220㎚ 및 280㎚에 있어서의 흡광도를 추적함으로써 실시하고, 1ml씩 분획화했다. 각분획에 대해서 활성을 측정한 결과, 아세토니트릴 농도 40~45%의 분획에서 Meg-POT 활성이 인정되었다.

[(스텝5) DEAEㆍ이온교환 HPLC]

스텝 4에서 얻은 활성분획을 동결건조한 후, 0.01% Tween 20을 함유하는 10 mM 트리스-염산완충액(pH 8.0)으로 용해하고, 동 완충액으로 평형화한 Protein Pak G-DEAE칼럼 (Waters 사제, 8.2 × 75㎜)에 유속 0.7ml/분으로 첨가했다.

흡착단백은 NaCl의 직선농도 기울기 (0.0M→0.2M, 40분, 5mM NaCl/분)에 의하여 유속 0.7ml/분으로 용출했다. 용출단백은 220㎜으로 검출하고, 0.7ml씩 분획화했다. 각 분획에 대해서 활성을 측정한 결과, NaCl 농도 75mM 이하의 분획에서 Meg-POT 활성이 인정되었다.

[(스텝6) TSKgel G 3000 SW 겔여과]

스텝 5에서 얻은 활성분획을, 0.01% Tween 20 및 0.15 NaCl을 함유하는 50mM 트리스-염산완충액(pH7.4)로 평형화한 TSKgel G 3000 SW 칼럼(도소사제 21.5 × 600㎚, 가드칼럼 21.5 × 75㎚)에 유속 3ml/분으로 유출시키고, 그리고 용출단백은 220㎚으로 검출했다. 3ml식 분획화한 각 분획에 대해서, 활성측정 결과, Meg-POT 활성은 용출시간 49~54분의 분획에 인정되었으므로, 그 분획을 회수했다.

[(스텝7) 역상 HPLC (Ⅲ)]

스텝 6에서 얻은 활성분획을 5% TFA를 가하고 pH를 약 2로 조정하고, 스텝 4의 역상 HPLC (Ⅱ)와 동일한 조건하에 크로마토그래피를 실시했다. 각 분획에 대해서 활성을 측정한 결과, 주 피크(아세토니트릴 농도 40%-45%)에 Meg-POT 활성이 인정되었다. 이결과를 제1도에 표시한다. 제1도에 있어서 가로막대로 표시하는 피크분획을 정제 Meg-POT로서 회수했다.

[실시예 4]

[거핵구 증폭인자(Meg-POT)의 분자량]

실시예 3에서 정제한 거핵구 증폭인자의 분자량을 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의하여 측정했다. 분리겔 농도는 12%, 농축겔 농도는 4%로 했다. 이들의 시료를 원심 농축기(토미정공사제)를 사용하여 건조하고, 5% 2-메르갑토에탄올 및 2% SDS를 함유하는 시료용환충액(pH 6.8)에 용해하고, 3분간 자비했다. 영동은 100V에서 30분, 140V에서 1시간하고, 겔은 메탄올:초산:물=3:1:6으로 고정하고, 은염색시약(제일화학 약품사제)에 의하여 단백질을 염색했다.

분자량 마커는 바이오랫드사제 저분자량마커[포스포릴라제 b (92.5 kd), 소 혈청 알부민(66.2 kd), 오브알부민(45.0 kd), 카르보닉 안히드라제(31.0 kd), 대두 트립신 저해제 (21.5 kd), 라이소자임(14.4 kd)]를 사용했다.

이 결과를 제2도에 표시한다. 제2도에서 명백한 바와 같이 본 발명의 거핵구 증폭인자(Meg-POT)는 분자량 약 32000 (31000~33000)에 단일밴드를 나타냈다.

[실시예 5]

[거핵구증폭인자(Meg-POT)의 아미노산 조성]

실시예 3에서 얻은 정제 Meg-POT 시료를 1% 페놀을 함유하는 6NHCl로 110℃, 24시간, 감압하 가수분해 했다. 유리한 아미노산에 페놀이소티오시아네이트를 가하고, 실온에서 25분간 반응시키고, 페닐티오카르바모일(PTC)유도체로 했다. 얻어진 PTC 유도체를 Pico-Tag 아미노산 자동분석 시스템(Waters 사제)를 사용하여 정량했다. 정량 결과 및 Ala를 24개 혹은 Glx를 29개로 한때의 아미노산 조성을 표1에 표시한다.

[표 1]

[실시예 6]

[거핵구 증폭인자(Meg-POT)의 아미노산 배열]

실시예 3에서 얻은 정제 Meg-POT 시료를 기상식 프로테인시퀀서 470A형 (어플라이드 바이오시스템즈ㆍ잉크사제)를 사용하여 에도만 분해를 실시하고, 얻어진 PTH-아미노산을 PTH 애널라이저 120형(어플라이드 바이오 시스템즈ㆍ잉크사제)를 사용하여 동정했다. 그 결과, N 말단 근방의 아미노산 배열(배열-1~3)은 이하에 표시하는 3종이 인정되었다.

또한, 실시예 3에서 얻은 정제 Meg-POT 시료를 V8 프로테아제로 소화하고, 역상 HPLC로 단리한 펩티드 단편을 사용하여, 동일한 조작에 의하여 동정된 아미노산 배열을 배열 4로 표시한다. Xaa는 미동정의 아미노산 잔기를 표시한다.

(배열상에 표시하는 숫자는 에도만 분해시의 사이클수이다)

상기의 배열 1~3의 아미노산배열에 있어서 이하의 아미노산 배열이 공통되어 있는 것이 인정되었다.

[실시예 7]

[거핵구 증폭인자(Meg-POT)의 거핵구 증폭인자 활성]

실시예 3에서 정제한 거핵구 증폭인자의 마우스 골수세포에 대한 거핵구 증폭인자 활성을 앞서 설명한 방법으로 측정했다. 즉 정제 Meg-POT를 10% 말혈청을 함유하는 IMDM로 10배 희석했다. 이것을 다시 말혈청을 함유하는 상기 IMDM으로 2, 4, 8, 16, 32 및 64배로 희석한 것을 조제하고, 이들을 피검검체로서 활성의 측정을 한 결과, 제3도에 표시한 바와같은 농도-반응곡선이 얻어 졌다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 거핵구 증폭인자는, IL-3의 존재하, 용량 의존적으로 거핵구 콜로니를 증식시키는 작용을 가짐으로써, 예를 들면 혈소판 감소 혹은 혈소판의 기능저하를 수반하는 질환에 대한 지료제로서와 유용성이 기대된다.

[규칙 제13 규칙의 2의 기탁된 미생물에의 언급]

기탁기관 : 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소

주 소 : 일본국 이바라끼껭 쓰구바시 히가시 1 쪼메 1방 3고,

기탁번호 및 기탁일자 :

1. 미공연조기 제3703호, 1991년 12월 27일

[배열표]

배열번호 : 1

배열의 길이 : 14

배열의 형 : 아미노산

토폴로지 : 직선상

배열의 종류 : 펩티드

배열

배열번호 : 2

배열의 길이 : 26

배열의 형 : 아미노산

토폴로지 : 직선상

배열의 종류 : 펩티드

배열

배열번호 : 3

배열의 길이 : 16

배열의 형 : 아미노산

토폴로지 : 직선상

배열의 종류 : 펩티드

배열

배열번호 : 4

배열의 길이 : 16

배열의 형 : 아미노산

토폴로지 : 직선상

배열의 종류 : 펩티드

배열

배열번호 : 5

배열의 길이 : 16

배열의 형 : 아미노산

토폴로지 : 직선상

배열의 종류 : 펩티드

배열

Claims

하기의 설정 : (1) 시험관내에 있어서, IL-3의 존재하에서 거핵구 콜로니를 용량 의존적으로 증식시키고; (2) SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기영동에 의한 측정에서 분자량 약 32000에 단일 밴드를 가지며; (3) 역상 고속 액체 크로마토그래피 (컬럼 : Vydac Protein C4, 4.6 × 250㎜, 입자사이즈 5㎛, Vydac 사제)에 있어서 0.1% 트리플루오로 초산중 아세토니트릴 농도 40~45%의 분획으로 용출하고; (4) 분자중에 하기 아미노산 배열 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu를 갖는 거핵구 증폭인자.