KR100205078B1 - 염기성 섬유 아세포 성장인자 및 이의 생산방법 - Google Patents
염기성 섬유 아세포 성장인자 및 이의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 천연의 사람 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자의 3위치의 알라닌과 5위치의 세린이 글루탐산으로 대체된 신규의 키메라 섬유아세포 성장인자(FGF)에 관한 것이다. 본 발명의 키메라 FGF의 N-말단서열은 사람의 산성 섬유아세포 성장인자의 것과 상동인 것으로 확인된다. 천연의 사람 재조합 염기성 FGF의 유사분열촉진성질은 본 발명의 키메라 FGF에 의해 나타내며, 이들은 이전에 보고된 수율보다 상당히 큰 수율로 이. 콜리에서 효율적으로 발현된다. 시스테인 78과 시스테인 96이, 예컨대, 세린 또는 다른 아미노산으로 대체되어 glu3,5염기성 FGF의 안정된 변형물을 생성하고 이설파이드 스크램블링된 형태를 제거한 것과 같은 이 새로운 glu3,5염기성 섬유아세포 성장인자의 신규 변형물이 또한 기재된다.
Description
제1도는 Glu3,5, Ser78,96hbFGF cDNA의 구성이다.
제2도는 천연hbFGF 의 헤파린 HPLC이다.
제3도는 환원된 재조합 hbFGF의 헤파린 HPLC이다.
제4도는 Glu3,5, Ser78,96hbFGF의 역상 HPLC이다.
제5도는 천연 bFGF와 재조합bFGF의 생물정량법 비교이다.
제6도는 천연bFGF 와 키메라 bFGF의 생물정량법 비교이다.
본 발명은 신규의 키메라성 염기성 섬유아세포 성장 인자(chimeric basic fibroblast growth factor) 및 상기 인자(bFGF)의 증진된 생산에 관한 것이다.
폴리펩티드 성장인자는 세포 증식 및 분화의 호르몬 유사 조절제이다. 성장인자는 발생, 재생 및 상처수복을 포함하는 여러 가지 생리적 과정의 조절에 책임이 있다.
이들 인자를 연구하는 동안에, 배양된 세포의 유사분열을 자극하는, 뇌, 뇌하수체 및 시상하부 같은 여러 조직으로 부터의 추출물의 능력을 기초로하여 다수가 확인되었다. 표피성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 신경 성장인자, 조혈 성장인자 및 섬유아세포 성장인자를 포함하는, 이들 추출물내의 활성인자에 수많은 속기명이 적용되었다.
섬유아세포와 내피세포를 위한 유사분열촉진 인자인, 소의 뇌 또는 뇌하수체조직으로부터 유래된 섬유아세포 성장인자(FGF)는 처음에 1974년 Gospodarowicz (Nature 249: 123-127)에 의해 기술되었다. 뇌로 부터의 주요한 유사분열촉진인자는 뇌하수체로부터 분리된 것과 다름을 후에 알았다. 이들은 동일하지 않다면 유사한 생물학적 활성을 가지나 등전점이 다르기 때문에, 이들 두 인자는 산성 및 염기성 FGF도 명명했다. 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자(Burgess, W.H., and Maciag, T.Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606(1989)에서 최근에 개관됨)는 내피세포, 평활근 세포, 부신피질 세포, 전립선 및 망막상피 세포, 과돌기신경교세포, 성상세포, 크론도사이트(chrondocyte), 근원세포 및 조골세포를 포함하는 다수의 중배엽- 및 신경외배열- 유래세포(Gospodarowicz, D., 일동, Nat. Cancer Inst. Mon. 48: 109-130(1978))의 일반적인 증식 능력에 영향을 미치는 일족의 헤파린 결합 성장인자의 정규 일원인 것으로 보인다(Burgess and Maciag, 상기 인용 p584). 사람흑혈구는 염기성 섬유아세포 성장인자의 유사분열촉진 영향에 반응하나 산성FGF에는 반응하지 않지만, 대부분의 조류 및 포유동물세포유형은 두 폴리펩티드에 반응한다(같은 책에).
섬유아세포 성장인자는 세포증식을 자극하는유사분열촉진 반응을 유도할 뿐 아니라, 대다수의 세포 유형을 자극하여 비유사분열촉진 방식으로 반응하도록 할 수 있다. 이들 활성은 상처부위로의 세포이동 촉진(화학주성), 새로운 혈관 형성의 개시(맥관형성), 신경 재생의 조절(향신경성), 및 특정 세포 단백질 발현, 세포외 간질생성 및 치유 과정에서 중요한 세포 생존의 자극 또는 억제를 포함한다(Burgess and Maciag, 상기 인용, pp584-588).
세포 성장 촉진작용과 함께 이들 성질은, 상처 치유를 촉진하기 위한 치료법에서 및 혈전증, 동맥경화증 등에 대한 치료 작용에서, 섬유아세포 성장인자 사용에 관한 근거를 제공한다. 따라서, 섬유아세포 성장인자는 외상을 입은 조직의 치유를 촉진하기 위해서(Davidson, J. M., 일동, J. Cell Bio. 100: 1219-1227(1985)), 심장 질환 및 외과수술에서 심근층 손상을 최소화하기 위해서(Franco의 미합중국 특허 제 4,296, 00호 및 제4,378,347호), 및 신경단위 생존 및 축색 확대를 증가시키기 위해서(Walicke, P., 일동, Proc. Nat. Acad. Sci. 미합중국 83:3012-3016(1986))제시되었다.
사람의 산성 및 사람과 소의 염기성 섬유아세포 성장인자를 암호하는 상보 DNA클론을 분리하고 서열화하여, 상보 DNA로부터 유래된 예상 아미노산 서열은 단백질 서열조사에 의해 결정된 구조와 일치한다(Burgess and Maciag, 상기 인용, pp580-581에서 요약함). 데이터는 155 아미노산을 갖는 산성 섬유아세포 성장인자(이후에는 aFGF라함)를 예상케 한다 (같은 책에서).
또는 염기성 섬아세포 성장인자(이후에는bFGF라함)에 관한 유전자는 155 잔기의 단백질을 암호한다. 최초에 분리하고 서열화한 146 아미노산의bFGF (Esch, F., 일동, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 6507-6511(1985))과 131-아미노산 형태를 포하는, 완전한 생물학적 활성을 나타내는 aFGF 와 bFGF N-말단 절단 형태가 존재한다. 그 구조물의 분석은 aFGF와 bFGF사이에 55% 동일성을 증명한다(Burgess and Maciag, 상기 인용, p581).
염기성 섬아세포 성장인자는 포유동물 조직으로부터 추출될수 있으나, 이것은 헤파린 연결 친화 크로마토그래피가 사용될 때에도 수단계를 필요로하고(Gospodarowicz 일동의 미합중국 특허 제 4,785,079호 및 제 4,902,782호), 추출이 프로테아제 억제인자의 부재하에서 수행되면 일반적으로 146 아미노산 종류 얻어진다(같은 책에서, 9단, 29-32행). 소와 살람의 염기성 섬유아세포 성장인자 cDNA는 이. 콜리(Iwane, M., 일동, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 470-477(1987) 및 Squires, C.H.,일동, J. Biol. Chem. 263: 16297-16302 (1988))와 에스.세트비시아(S. cervisiae) (Barr, P.J., 일동, J. Biol. Chem. 263:16471-16478(1988))에서 발현되었다. 그러나, 보고된 생성물의 수율은 낮고 (참고, Esch일동의 유럽특허출원 공개제 228,449호 p18), 재조합 인자는 이설파이드가 스크램블된 종류의 형성을 초래하는 단백질내 유리 티올기에 의해 촉진되는 티올-이설파이드 상호교환되는 뚜렷한 경향을 나타낸다(Iwane, 상기 인용).
많은 염기성 섬유아세포 성장인자 유사체가 제시되었다.
아미노 또는 카르복실 말단 아미노산이 삭제된, 아미노산이 첨가된, 시스레인이 세린 같은 중성 아미노산 또는 아스파르트산으로 치환된, 아르기닌, 글리신, 세린, 또는 발린이 다른 산으로 치환된 bFGF 뮤레인(mutein)은 증진된 안정성을 갖는것으로 제시되었다(Seno 일동의 유럽특허출원 공개 제 281,822호, p4, 1-3행 및 p6, 29행 내지 p7의 19행). 뮤테인은 둘 또는 세 개의 첨가, 삭제 또는 치환을 포함하며, 시스테인을 세린으로 치환하는 것이 가장 적절한 치환이다(p7, 18-23행).Arakawa 및 Fox(유럽특허출원 공개 제320,148)는 천연 bFGF에서 발견된 시스테인 중 적어도 한 개, 및 보다 바람직하게는 두 개를 서로 다른 아미노산 잔기로 치환하여 보다 안정한 유사체를 생성함을 제안하였고(4페이지, 44-47행), 세린이 실시예에서 예시되었으나 (13페이지, 22-23행), 알라닌, 아스파르트산 및 아스파라긴 또한 제시되었다(5페이지, 26행과 13페이지, 25행).
유사하게, 증진된 또는 개선된 생물학적 활성을 갖는 인자를 생성하는, 세린으로 대체된 외부 결합 형성 시스테인, 및 알라닌, 발린, 로이신 또는 이소로이신으로 대체된산화 경향 시스테인, 메티오닌 및 트립토판을 갖는 재조함 aFGF가 또한 제시되었다(Thomas Jnr and Linemeyer 의 유럽특허출원 공개 제 319,052호, 17페이지, 8-20행).
카르복실 말단에서 7내지 46아미노산이 결여되고, 임의로, 아미노산 대체물을 갖는 bFGF뮤레인은 개선된 안정성을 가지는 한편 활성을 보유함을 Seno 일동의 유럽특허출원공개 제 326,907호(2페이지, 50행 내지 3페이지, 4행)에서 제시하였다.
Fiddes 일동(유럽특허출원공개 제 298,723호)은 잔기 128내지 138을 포함하는 헤파린 결합영역내의 염기성 또는 양전하 잔기를 중성 또는 음전하 아미노산으로 대체시켜 감소된 헤파린 결합능력과 증진된 효능을 갖는 FGF형태를 생성함을 제시한다(5페이지,45행과 5페이지, 54행 내지 6페이지, 16행). Bergonzoni 일동은 6개의 유사체를 제시했다: 잔기 27 내지 32가 결여된 M1-bFGF; 잔기 54내지 58이 결여된 M2-bFGF; 잔기 70내지 75가 결여된 M3-bFGF; 잔기 78내지 83이 결여된 M4-bFGF; 잔기 110내지 120이 결여된 M5-bFGF; 128위치의 리신과 129위치의 아르기닌이 글루타민 잔기로 대체된 M5a-bFGF; 및 119와 128위치의 리신 및 118과 129위치의 아르기닌이 글루타민 잔기로 대체된 M6b-bFGF(유럽특허출원 공개 제 363,675호, 6단 48행 내지 7단 13행).
그러나, 새로운 안정하고 활성이 있는 섬유아세포 성장인자 형태가 상기에서 나타낸 치료법에서 사용하기 위해 더욱 더 탐구된다.
본 발명은 천연 bFGF의 3위치의 알라닌 잔기와 5위치의 세린 잔기가 글루탐산으로 대체된 신규의, 완전한 길이 (155아미노산을 암호)의 사람의 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자 및 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 Glu3,5hbFGF는 N말단의 8개 아미노산에서 사람의 산성 FGF와 서열 동일성을 가지므로 키메라 FGF라고 할수 있다. 보다 상세하게는, 이들 인자가 사람FGF와 같으나 다른 포유동물종의 FGF가 본 발명을 통해 이용가능하다.
glu3,5키메라 섬유아세포 성장인자는 조직 유래 bFGF의 유사분열촉진 성질을 가지나, 이. 콜리에서의 발현이 천연 서열보다 상당히 크다. 따라서, 본 발명은 신규의, 생물학적 활성이 있는 FGF 및 이를 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.
동일한 발견이 신규의 glu3,5hbFGF변이체에 관해 존재한다. 예컨대, 성장인자의 안정화된 변형물은 시스테인 78과 스테인 96을, 티올-이설파이드 상호교환 (이설파이드 스크램블링)을 제거하는, 세린같은 아미노산으로 대체시킴으로써 제조된다. 따라서, 본 발명은 hbFGF(1-155)를 변형시켜 이. 콜리에서 발현되는 인자의 수율을 유의 증가시킬 뿐 아니라, 정제를 용이하게 하고 안정성을 증진시키는 것이다.
그러므로, 본 발명은 신규의, 생물학적 활성이 있는 섬유아세포 성장인자 및 이들을 분취 규모로 제조하는 방법을 제공한다.
적절한 구체예로, 본 발명의 신규 FGF를 암호하는 DNA를 플라스미드 또는 벡터에 삽입하고, 원하면 편리하고 효율적으로 보존하고, 보관하거나 운반할 수 있다. 그런다음 플라스미드 또는 벡터를 사용하여, 마찬가지로, 원하면 본 발명의 신규FGF를 암호하는 유전물질을 보존하거나, 보관하거나 운반하기 위해 사용될 수 있는 미생물, 예컨대 이. 콜리를 형질전환 하거나 트랜스펙팅한다. 인자를 발현하는 조건하에서 이들 미생물의 배양은 폴리펩티드를 풍부하게 생산한다.
전술한 바와 같이, 외상을 입은 영역으로 방출된 성장인자는 보통의 치유과정을 촉진하므로, 본 발명의 신규 섬유아세포 성장인자는 화상, 외과 수술의 절개부, 및 다른 상처를 위하여; 욕창 등을 포함하는 피부궤양을 치료하기 위하여; 손상된 조직을 혈관재생함으로써 심장 마비후 심장혈관 갱생 및 혈류 재출발을 위하여; 뼈수복을 증진시키고 근골격 상처를 치료하기 위하여; 및 신경변성 및 다른질병상태에서 치료 용도를 가진다.
제1도 : 주형으로서 실시예 2에서 제조되는 발현 플라스미드 pT7 glu3,5, hbFG F를 사용하여, Cys78의 Ser78로 및 Cys96의 Ser96으로의 돌연변이는 하기 폴리머라제 연쇄 반응 혼합물을 사용하여 조종된다 : (1) T7센스 플러스 Cys78의 항센스 프라이머(T7sense plus ser78antisense primer); 및 (2) T7항센스 플러스 ser96센스 프라이머, 그런다음 폴리머라제 연쇄반응은 실시예 3에서 설명되는 바와 같이 T7센스 및 T7항센스 프라이머를 사용하여 (1)과 (2)로부터 수행된다.
제2도 : 결합된 hbFGF(154 아미노산 함유)는 직선 0.6 내지 3.0N NaCl 구배를 0.7㎖/분으로 사용하여 헤파린 세파로오즈 컬럼으로부터 용리하고 실시예 5에서 설명되는 바와 같이 280nm에서 검사한다.
제3도 : 실시예 6에서 설명하는 바와 같이 디티오쓰레이톨로 환원된 헤파린 세파로오즈 크로마토그래피로부터, 모은 물질의 일부에 관한 헤파린 HPLC로 부터의 용리분포.
제4도 : 헤파린 HPLC로 부터의 시료(8㎍)를 0.45×25㎝ Vydac C4컬럼 위에 투입하고 실시예 6에서 설명하는 바와 같이 0.1% 삼플루오로아세트산/아세토니트릴 용매 시스템(15분내에 0 내지 28% 아세토니트릴, 99분 내에 28 내지 60%, 및 10분 내에 60 내지 80%)을 사용하여 0.7㎖/분으로 용리한다.
제5도 : 소의 뇌로부터 분리된 bFGF의 유사분열촉진 활성은 실시예 7에서 설명하는 바와 같이 소의 대동맥궁 혈관내피세포의 증식에 관해 사람의 재조합 bFGF와 비교한다. 세포는 서로다른 양의 소의 뇌 bFGF (10-155)(_▲_); 천연서열 재조합 hbFGF(_●_); 및 나타낸 바의 glu3,5hbFGF (_○_) (아미노산 분석으로 결정됨)의 존재하에 증식된다. 4일 후, 조사한 세포밀도범위를 덮는 세포수와 동일한 산포스파타제 활성을 405nm에서 측정한다.
제6도 : 소뇌의 bFGF (10-155)(_○_)과 glu3,5, ser78,96hbFGF (_●_)의 분열촉진활성은 표시된 성장인자 서로다른 양 (아미노산 분석으로 결정)의 존재하에서 5일동안 유지한 세포를 사용하여 비교하고 세포수는 실시예 7에서 설명하는 바와 같이 측정한다.
본 발명은 약 155 아미노산을 갖는 신규의 염기성 섬유아세포의 성장인자의 증진된 생산 및 안정성에 관한 것이다. 사람 제조합체의 예가 본 명세서에 제공되지만, 본 발명의 FGF는 다른 포유동물 등에 사용될 수 있다. 본 발명의 신규 재조합 hbFGF는 완전한 길이의 사람 염기성 섬유아세포 성장인자에서 알라닌 3과 세린5을 글루탐산으로 대체시켜 제조된다. Glu3,5hbFGF는 N-말단의 8개 아미노산에서 사람 aFGF와 서열 동일성을 가지므로 haFGF와 hbFGF의 키메라 유사체로 생각된다. 이 돌연변이는 천연서열 bFGF에 비해 에쉐리시아 콜리에서 발현되는 단백질 수율을 유의 증가시킨다.
제조합 천연 bFGF와 glu3,5hbFGF는 모두 헤파린- 및 역상- 고성능 액체크로마토그래피 상에서 미소한 상이성을 나타낸다. 어떤 이론에 얽매이기를 원하지 않는 한편, 이 미소한 상이성은, 크로마토그래피 전에 환원제로 성장인자를 처리하여 제거할 수 있기 때문에 티올-이설파이드 상호교환(이설파이드 스크램블링)으로 기인되는 것으로 보인다. 성장인자의 안정된 변형물의 생성 및 이설파이드가 스크램블링된 형태의 제거는 시스테인 78과 시스테인 96을, 부위 조종 돌연변이에 의해서 세린으로 대체시켜 실현된다.
단백질이 시험관에서 및 생체내 분석으로 FGF 활성을 나타내고(Burgess 및 Maciag, 상기 인용, 584 내지 586페이지에서 요약); 헤파린에 결합하여; 1.5-1.7M NaCl에서 헤파린 세파로오즈로 부터 용리하고; 사람 또는 소의 염기성 FGF 또는 그의 합성 또는 천연 펩티드를 사용하여 제조한 항체와 면역학적으로 반응하거나, 소혈청 알부민에 접합된 bFGF 서열의 합성 유사체에 결합하면, 여기에서 염기성 FGF로서 정의된다. 단백질이 시험관에서 및 생체내 분석에서 FGF 활성을 나타내고; 헤파린에 결합하고; 1.0-1.2M NaCl에서 헤파린 세파토오즈로 부터 용리되며; 사람 또는 소의 aFGF 또는 의 합성 또는 천연 펩티드에 대해 제조된 항체와 면역학적으로 반응하면 여기에서 산성 FGF로서 정의된다. 키메라 섬유아세포 성장인자는 두 유형의 서열을 공유한다. 임의 유형의 포유동물 섬유아세포 성장인자는 본 발명에, 특히 사람의 섬유아세포 성장인자에 포함된다.
본 발명의 키메라 섬유아세포 성장인자는 약 155 아미노산을 갖는, glu3,5hbFGF 및 glu3,5, ser78,96hbFGF를 포함하고, 절단된 형태는 약 154 아미노산(, N-말단의 메티오닌을 갖지 않는 것; 참조 실시예6(b))을 갖는다. 또한 본 발명은 78 및 96 위치의 시스테인 잔기가 예컨대 알라닌, 글리신, 아르기닌, 트립토판, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 발린, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 세린, 쓰레오닌 또는 프롤린 같은 다른 아미노산으로 대체된 glu3,5hbFGF를 포함한다. 더욱이, 본 발명의 FGF 유도체는 종에 특이적이지 않고, 예컨대 소의 FGF 대응물 및 hbFGF와 유사한 서열 상동성을 갖는 다른 것을 포함한다. 본 발명의 신규한 섬유아세포 성장인자는 성분 아미노산으로 부터, 또는 아미노산 또는 펩티드 및 폴리펩티드로 부터, 당분야의 당업자에게 알려진 화학적 또는 생화학적 방법에 의해서, 예컨대, 아미노산을 서열순서로 더 짧은 섬유아세포 형태의 N 말단에 부가함으로써 폴리펩티드를 조립하여 제조할 수 있다. 대안적으로 본 발명의 신규 섬유 아세포 성장인자는 키메라 FGF를 암호화는 DNA의 제조, DNA의 벡터로의 삽입, 숙주세포에서 벡터의 발현, 및 이에 의해 생산된 재조합 FGF의 분리에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 FGF를 암호하는 DNA는 표준 방법을 사용하여 생성되는 뉴클레오티드 삭제, 뉴클레오티드 첨가, 또는 포인트 돌연변이에 의해 사람 또는 소의염기성 섬유아세포 성장인자의 유전자를 변형시켜 제조할 수 있다. 예시는 실시예 1에서 상술된다.
유전암호의 축퇴때문에, 여러가지 코든 변화 조합물을 선택하여 본 발명의 FGF를 암호하는 DNA를 형성할 수 있으므로, 키메라 FGF를 암호하는 DNA를 생성하는 임의의 뉴클레오티드 삭제, 첨가, 또는 포인트 돌연변이가 본 발명에 포함된다. 특정한 코돈은 특정한 유형의 생물에서 폴리펩티드 발현에 보다 효율적이므로, 본 발명의 FGF를 암호하는 DNA 물질을 생성하는 섬유 아세포 유전자 변형물의 선택은, 바람직하게는 제조합 벡터의 숙주로서 공급되는 생물의 유형에서 가장 효율적인 발현을 나타내는 것들이다. 변형된 코돈 선택은 또한 벡터 구성 항목에 죄우될 수 있다.
변형되어 키메라 DNA를 형성할 수 있는 섬유아세포 성장인자 DNA 출발물질은 천연, 재조합 또는 합성일 수 있다. 따라서, DNA 출발 물질은 조직 또는 조직 배양물로 부터 분리되고, 상업적으로 얻거나, 섬유아세포로부터 bFGF를 암호하는 RNA를 분리하고 이 RNA를 주형으로서 사용하여 상응하는 이중가닥 DNA를 합성할 수 있는 단일가닥 cDNA를 합성하여 제조할 수 있다.
본 발명을 설명하는 것은 실시예 2와 3에서 구성된 것과 같은 키메라 섬유아세포 폴리펩티드 서열을 한정하는 클론된 상보 DNA 서열이다. 또한 여기에서 셜명된 상보 DNA에 상동이거나 밀접하게 관련된 DNA 서열, 즉, 특히 엄격한 조건하에서 키메라 섬유아세포 cDNA에 교잡하는 DNA 서열 및, 이에 상응하는 RNA가 포함된다. 키메라 FGF 암호서열뿐 아니라, 본 발명에 포함되는 DNA는 벡터 구성 서열에 따라, 유전자 발현을 용이하게 하는 부가 서열을 함유할 수 있다.
그런다음 본 발명의 키메라 성장인자를 암호하는 DNA, 또는 이에 상응하는 RNA는 벡터, 예컨대 pBR, pUC, pUB 또는 pET 시리즈의 플라스미드에 삽입하고, 재조합 벡터를 사용하여 미생물 숙주를 형질전환시킨다. 숙주 생물은 세균(예컨대, 이. 콜리 또는 비. 섭틸리스), 효모(예컨대, 에스. 세르비시아) 또는 포유동물(예, 생쥐 섬유아세포)일 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 표준방법에 의해 생성된 키메라 성장인자를 설명하는 RNA와 DNA 서열을 갑이시킨, 신규의 생물학적으로 기능적인 비루스 및 원형 플라스미드 RNA 및 DNA 벡터를 제공한다. 외인성, 벡터-보유 DNA 또는 RNA 서열의 대량발현을 용이하게하는 조건하에서 상기 벡터로 적당하게 형질전환된 또는 트랜스펙트된 숙주 생물의 생물의 배양, 및 증식배지, 세포 응해질, 또는 세포막 단편으로 부터의 적절한 폴리펩티드의 분리는 원하는 생성물을 산출한다. 이. 콜리에서 hbFGF 돌연변이체의 발현에는 실시예 4에 나타낸다.
본 발명은 78과 96 위치의 시스테인을 이설파이드 스크램블링을 제거하는 다른 아미노산으로 대체시키고, 선택된 포유동물아닌 숙주에 의한 발현에 적절한 코돈의 가입, 엔도뉴클레아제효소에 의한 제한에 의해 절개부위의 제공, 및 쉽게 발현되는 벡터의 구성을 용이하게 하는 부가의 초기, 말단 또는 중간 DNA 서열을 제공과 같은 유익한 특성을 포함하는 glu3,5hbFGF, glu3,5, ser78,96hbFGF, 및 다른 glu3,5hbFGF를 암호하는 DNA 서열의 전체 및/또는 부분 제조를 제공한다. 상당하게는, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 잔기의 동일성 또는 위치면에서 여기에서 상세히 설명한 형태와 다른(즉, hbFGF에 관해 지정된 모든 잔기보다 적게 함유하는 삭제 유사체, 및/또는 하나이상의 잔기가 대체된 치환 유사체 및/또는 하나이상의 잔기가 폴리펩티드의 말단 또는 중간 부분에 첨가되는 첨가 유사체), 그리고 glu3,5hbFGF와 glu3,5, ser78,96hbFGF의 생물학적 성질을 공유하는 키메라 섬유아세포 성장인자의 미생물 발현을 암호하는 DNA 서열의 제조( 및 cDNA와 게늠 DNA의 부위 특이적 돌연변이에 의해 개발)를 제공한다.
본 발명의 DNA(및 RNA)서열은 적어도 일부의 일차 구조배열, 및 하기(a)-(c)로 이해되는 키메라 섬유아세포 성장인자의 생물학적 성질이나 이상을 갖는 폴리펩티드 생성물의 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서의 발현을 확실케하는데 유용한 모든 서열을 암호한다 : (a) 본 명세서에서 설명된 glu3,5hbFGF 및 glu3,5, ser78,96hbFGF를 암호화하는 DNA 서열 또는 상보가닥; (b) (a)에서 한정한 DNA 서열 또는 그의 단편에 교잡하는(여기에서 설명된 교잡 조건 또는 보다 엄격한 조건하에서) DNA 서열; 및 (c) 유전암호의 축퇴를 제외하고 상기 (a) 및 (b)에서 한정한 DNA 서열에 교합하는 DNA 서열.
상세하게는 여기에 포함된 키메라 섬유아세포 성장인자의 대립형질 변형 형태를 암호하는 게놈 DNA 서열, 및 키메라 섬유 아세포 성장인자 RNA를 암호하는 서열, 이의 단편, 및 서열화된 RNA 또는 DNA가 무척추동물 숙주에서 전령 RNA의 전사 또는 RNA 복제를 용이하게 하는 코돈을 가입시킬 수 있는 유사체가 포함된다.
본 발명에 의해 제공된, 미생물로 발현된 폴리펩티드의 분리 및 정제는 예컨대, 제2도 및 제3도에서 나타낸 것과 같은 분취 크로마토그래피 및, 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체제조를 포함하는 면역학적 분리 즉, 예시적 정제가 실시예 5에서 나타내는 것을 포함하는 통상의 방법에 의할 수 있다.
상기에서 요약하고 하기 실시예에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 예시적 키메라 섬유 아세포 성장인자는 이. 콜리에서, T7RNA 폴리머라제 발현시스템을 사용하여, 알라닌 3과 세린 5를 글루탐산으로 대체시킨 완전한 길이(155 아미노산)의 사람의 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자가 발현된다. (여기에서 채택한 bFGF에 관한 번호 매김은 Arbaham 일동(1986)에서 설명된 155 아미노산 형태에 해당하고 메티오닌 코돈을 1위치라한다). 재조합 천연 bFGF와 glu3,5hbFGF 모두는, 크로마토그래피(제3도)전에 성장인자를 디티오쓰레이톨 같은 환원제로 처리하여 제거되는, 헤파린 - 과 RP - PHLC 상에서 광범위한 미소이질성을 나타낸다. 성장인자의 안정된 변형물의 생성 및 이설파이드가 스크램블링된 형태의 제거는 부위조종 돌연변이 유발에 의해서 시스테인 78과 시스테인 96을 세린으로 대체시킴으로써 실현된다(실시예 3).
aFGA cDNA처럼, 이 발현시스템에서 glu3,5hbFGF와 glu3,5, ser78,96hbFGF 모두의 수율은 모(母) bFGF cDNA 보다 10배 높다. glu3,5hbFGF와 glu3,5, ser78,96hbFGF는 N-말단의 8개 아미노산에서 bFGF와 서열 상동성을 공유한다. 따라서, 이들 유도체는 키메라이다.
본 발명의 폴리펩티드는 섬유아세포 성장인자로서 생물학적 활성을 보유한다. 예컨대 재조합 hbFGF와 돌연변이 단백질의 분열촉진 성질을 소뇌로부터 처음에 분리된 bFGF(10-155)와 비교할 때(실시예 7), 사람의 재조합 bFGF와 glu3,5hbFGF는 소뇌의 bFGF와 필수적으로 동일한, 투여량-의존적인 내피세포 성장 자극을 나타낸다. 시스테인 78과 96을 세린으로 대체시켜 glu3,5,ser78,96hbFGF를 얻은 것은 분열촉진 능력에 어떠한 영향도 미치지 못하며, 조직-유래 소의 bFGF에 대해 측정한 것과 구별할 수 없는 투여량-반응 곡선을 나타내었다(제6도).
여기에서 설명된 hbFGF로의 변형은 발현되는 성장인자의 수율을 유의 증가시키고, 그의 정제를 용이하게하고, 이설파이드 스크램블링으로 기인되는 미소이질성을 제거하고, 안정성을 증진시키는 한편 완전한 생물학적 활성을 보유한다.
[실시예]
하기 실시예는 본 발명 및 사용된 특성결정 기술을 상세히 설명하고 기술하기 위해 제시되며 임의의 사항에서 제한하는 것으로 취해서는 안된다. 다른 표시가 없으면, 모든 부와 백분율은 중량에 의하며, 설명되는 특정한 처리 단계에서 중량을 기준으로 한다.
[실시예 1]
[발현 플라스미드의 구성]
pUC18 내로 클론되는 사람 bFGF의 155 아미노산 형태 (Abraham, J.A., 일동, EMBO J. 5: 2523-2528(1986))를 암호하는 합성 유전자는 영국의 Bio-technology(Oxford, 영국)로 부터 구입했다. bFGF cDNA의 N-말단 메티오닌 코돈을 포함하는-2 내지 3위치에서 내부의 Nco1 제한부위의 파괴, 및 유일한 Nde1 부위의 도입은 하기와 같다. 변화될 뉴클레오티드 서열(-12 내지 36) (a, 하기)은 Hind Ⅲ와 BspM Ⅱ로 pUC18로부터 자르고 내부 Nde1 부위를 갖는 합성단편(b, 하기)은 pUC 18 내로 클로닝된다. 이 클로닝은 원래의 구조물과 비교해서 업스트림(upstream)의 비암호구역에서 4개 뉴클레오리드 삭제를 갖는 구조물을 생성한다(하기 참조). 이 삭제는 후술되는 발현 시스템을 사용하는 bFGF의 상대적 단백질 수율에 어떠한 영향도 미치지 않는다.
센스 가닥 만이 각각 원래(a) 및 변형된 (b) 단편을 나타낸다. 밑줄친 코돈은 메리오닌 출발코돈의 위치를 나타낸다.
그런다음 bFGF를 암호하는 cDNA는 Nde1과 BamH1으로 pUC 18로부터 자르고, RNA 폴리머라제를 위한 T7프로모터를 갖는 pET-3a(박테리오파지 T7에 의한 발현을 위한 플라스미드, Rosenberg, A., 일동, Gene 56: 125-135(1987), p128에서 정의됨)인 발현벡터 pT7Kan 5의 Nde1 및 BamH1 부위내로 클로닝한다.
[실시예 2]
[Glu3,5hbFGF의 구성]
염기성 FGF(c)의 처음 5-말단 아미노산을 암호하는 영역이 산성 FGF(d)의 것을 암호하도록 변하는 것을 제외하고는, glu3,5hbFGF의 구성을 위한 입안은 Nde1 제한부위의 도입에 관해 전술한 것과 동일하다 :
센스가닥만이 각각 원래(c)와 변형된(d) 단편을 나타낸다. 밑줄친 코돈은 3과 5위치에서 글루탐산을 암호하도록 변화된 것을 나타낸다.
[실시예 3]
발현 플라스미드 pT7glu3,5hbFGF는 올리고뉴클레오티드 부위-조종 돌연변이 유발을 위한 주형으로서 사용된다. 두 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드 프라이머는 78과 96위치의 시스테인 코돈을 세린 코돈으로 변화시키도록 고안된다. 96위치의 세린을 위한 프라이머는 센서 가각(60-mer; 238-297)에 대한 반면, 78위치의 세린을 위한 것은 항센스 가닥(30-mer; 251-222)에 대한 것이다. 이들 돌연변이유발프라이머뿐만아니라, T7 프로모터(뉴클레오티드-12 내지 +13) 및 터미네이터 영역(뉴클레오티드-75 내지 -54)에 대한 프라이머가 고안된다(19).
변형된 FGF 유전자의 돌연변이는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)의 이용에 의해 실현된다. Hind III 절단 플라스미드 DNA를 함유하는 두 반응혼합물은 제1도에서 개략적으로 나타낸 바와 같이 제조된다 : (ⅰ) 예상되는 319염기쌍 생성물을 산출하는 T7센스 플러스 ser78항센스 프라이머, 및 (ⅱ) 예상되는 294 염기쌍 생성물을 생성하는 T7항센스 플러스 ser96센스 프라이머, PCR 혼합물은 제조업자의 지시(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)에 따라 제조한다. PCR은 각각 1분 동안 92℃, 5초 동안 50℃ 및 1분 동안 72℃의 30증폭사이클을 위한 Taq 폴리머라제를 사용하여 수행하고, 생성물은 아가로스겔 전기영동에 의해 분석한다.
초과프라이머는 증폭된 DNA 단편으로부터, 30,000 분자량의 밀리포어(Millipore)미세농축기를 사용하여 농축 및 투석의 3회 연속으로 분리한다. 잔류물 부분을 합하고, 사용되는 프라이머가가 T7프로모터(센스) 및 T7터미네이터(항센서)영역에 상응하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같은 PCR을 사용하여 증폭한다. 제1도 참조. 그런다음 599 염기쌍의 PCR 생성물을 Nde1과 BamH1으로 처리하고 아가로스 겔 전기영동로 정제한다. 그런다음 정제한 단편을 T7발현벡터인, pET-3a(M 13), pET-3a의 유도체에 클로닝한다.
[실시예 4]
[천연서열 hbFGF와 hbFGF 돌연변이체의 발현]
서열 변이에 따라서(Sanger, F., 일동, Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 5463-5467(1977)), bFGF 돌연변이체를 암호하는 유전자를 수용 BL 21 pLys S 세포내로 형질전환한다. 플라스미드를 포함한 이. 콜리 세포는 플라스미드 glu3,5ser78,96hbFGF를 위해 가나마이신 설페이트(50㎍/㎖) 또는 암피실린(100㎍/㎖), 및 클로르암페니콜(34㎍/㎖)를 함유하는 Luria 배양액에서 37℃로, 600nm에서 홉광단위 약0.6이 될때까지 증식시킨다. bFGF 합성은 이소프로필-배타-D-티오갈락토피란노시드(1mM) 첨가에 의해 유발된다. 2시간의 유발후, 세포를 4℃에서 원심분리하여 수확한다.
[실시예 5]
[hbFGF 돌연변이체의 정제]
1리터 배양물로 부터의 세포 펠렛을 30㎖의 50mM Tris, 0.1mM EDTA 완충액, pH 7.6에 재현탁시키고, 3회의 급냉각/해빙 사이클로 용해한다. 그런다음 용해물을 5mM의 MgCl2존재하에서 20분 동안 4℃에서 DNase Ⅰ(20㎍/㎖)으로 처리하고 10,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. bFGF 활성은 펠렛과 상징액 분류물에 동일하게 분포되는 것으로 밝혀졌다.
bFGF는 Gospodarowicz, D., 일동, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 6963-6967 (1984)에서 설명된 헤파린-세파로오즈 컬럼 크로마토그래피하고, 0.6 내지 3.0M NaCl의 직선염 구배로 용리하여 상징액으로 부터 정제한다. 성장인자를 함유하는 분류물을 모으고 10mM, pH 7.6의 Tris 완충액으로 희석하여 약 0.6M의 최종 NaCl 농도를 제공한다.
이것을 10mM, pH 7.6의 Tris, 0.6M NaCl로 평형화한 0.75×7.5㎝ TSK 헤파린-5PW 컬럼(TosoHaas, Philadelphia, PA)상에 투입한다. 결합된 물질의 용리는 280nm에서 검사하고 직선 염구배(0.6 내지 3.0M NaCl 60분내에)를 유속 0.7㎖/분으로 사용하여 수행한다.
실시예 4에서 설명한 T7발현 시스템을 사용하여, 천연 서열 haFGF(2-155)의 수율은 약 0.8㎎/ℓ 세균 배양물이다. 천연 서열 hbFGF로는, 수율 6 내지 8㎎/리터가 얻어진다. 동일한 시스템에서 발현된 Glu3,5hbFGF는 8 내지 10㎎/정제된 인자의 리터를 제공한다.
플라스미드 pT7glu3,5, ser78,96을 함유하는 이. 콜리의 대량 발효(10리터)는 세포 페이스트 g당 정제된 성장인자 약 1㎎을 제공한다. 키메라 ser78,96변형물의 단백질 수율 및, 세균 추출물의 상징 및 펠렛 분류물내 단백질의 분포는 glu3,5hbFGF에 관해 관찰한 것과 유사하다.
[실시예 6]
[hbFGF 및 hbFGF 돌연변이체의 특성결정]
(a) 크로마토그래피 양태
헤파린 HPLC로 정제된 bFGF는 0.1% 삼플루오로아세트산/아세토니트릴 구배(15분내에 0 내지 28% CH3CN, 99분내에 28-60%, 및 10분내에 60 내지 30%)를 유속 0.7㎖/분의 속도로 이용하여 역상 고성능 액체크로마토그래피인 (C4, Vydac, the separations Group, Hesperia, CA)에 의해 분석한다. 결합된 물질의 용리는 210nm에서 검사한다.
천연 서열 hbFGF (2-155)를 함유하는 조세포 균등질의 헤파린 세파로오즈 크로마토그래피로 부터의 용리분포는 둘다 유사분열촉진활성을 가지며 황산나트륨 도데실 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해서 Mr 17,000의 주요 분자량 종류를 함유하는 두개의 주요한 단백질 피크를 나타낸다. 헤파린 세파로오즈 단계후 용해된 성분의 N-말단 서열분석으로 부터 얻은 두개의 피크 각각으로 부터의 물질의 C4역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 적어도 3개의 별개 형태 bFGF를 나타낸다.
이 명백한 미소 이질성을 조사하기 위한 첫번째 방법으로서, 크로마토그래피에 의한 별개 종류의 생성에서 티올-이설파이드 상호교환(이설파이드 스크램블링)의 작용은 환원제로 처리하여 평가한다.
헤파린 세파로오즈의 정제된 bFGF 일부를 디티오쓰레이톨(2mM)로 37℃에서 10분 동안 정치한 후 RP-HPLC 분석하여, bFGF 종류로서 앞서 확인된 피크는 필수적으로 단일 피크로서 크로마토그래피됨을 나타낸다.
헤파린 세파로오즈 단계로 부터의 FGF를 함유하는 2개의 단백질 피크의 고분해능 TSK 헤파린 HPLC는 1.6 내지 2.3M NaCl 범위에서 용리하는 4개의 주요 단백질 성분을 나타낸다. SDS-PAGE에 의한 이들 피크의 분석은 P-I, P-Ⅲ 및 P-Ⅳ가 그 hbFGF(2-155)와 일치하는 Mr 17,000을 따라 이동하는 단일한 단백질 밴드를 함유함을 나타내는 반면, PⅡ는 약 22,000의 Mr을 나타내고 N-말단 서열분석에 의해 오염물로서 확인된다. 헤라핀 세파로오즈 크로마토그래피로 부터 모은 물질의 일부를 디티오쓰레이톨(5mM)로 실온에서 10분 동안 처리한 후 헤파린 HPLC 하여 P-I 양의 증가, P-Ⅲ 양의 감소 및 P-Ⅳ의 소멸을 나타내며, Mr 22,000 불순물을 함유하는 P-Ⅱ의 위치 및 강도는 이 처리에 의해 영향을 받지 않는다(제3도).
헤파린 및 RP-HPLC 상에서 디티오쓰레이톨의 존재 및 부재하에서 glu3,5hbFGF의 크로마토그래피 양태는 천연서열 hbFGF에 관해 관찰된 것과 유사하다. 시스테인의 세린으로의 돌연변이는 헤라핀 및 C4RP-HPLC 상에서 단일 종류로서 나타나므로(제4도) 정제동안 디티오쓰레이톨 처리를 없애므로 이 유사체의 정제를 크게 용이하게 한다.
(b) 서열 분석
역상으로 정제된 단백질의 N-말단 서열분석은 온라인 페닐티 오히단토인-아미노산 분석기 (모델 120A, Applied Biosystems, CA)가 장치된 모델 477A 펄스된 액상 서열기(Applied Biosystems, CA) 상에서 수행한다. 온라인 모델 130A 분리시스템 (Applied Biosystems, CA)을 장치한 모델420A 페닐이소티오시아네이트-유도기를 사용하여 HCl 기체상 가수분해(5.7M HCl/0.1% 페놀; 110℃에서 24시간)한 후 아미노산 조성을 측정한다.
헤파린 HPLC로 부터 분리된 물질의 N-말단 서열 분석은 glu3,5hbFGF(2-155)와 일치하는 단일 서열을 제공하여 N-말단 메티오닌의 완전한 제거를 나탄내다.
(c) 분자량
분자량 측정은 은염색 검출시스템(Phastgel System, Pharmacia/LKB)을 사용하여, 나트륨 도데실 설페이트(SDS-PAGE)의 존재하에서 10 내지 15%를 구배 및 20% 균등질 폴리아크릴아미드겔 상에서 수행한다.
hbFGF (2-155)는 glu3,5hbFGF에 대한 Mr 값 약 Mr 19,000에 비해 Mr 17,000으로 이동한다. hbFGF와 키메라 변형물에 관한 아미노산 서열 데이타로 부터 계산된 분자량은 각각, 17, 124와 17,224이다. 명백한 분자량 불일치를 해결하기 위해서, glu3,5hbFGF 시료는 액체-이차 이온 질량 부광계로 분석하여 질량 17,365의 분자이온을 제공한다. 이 값은 실험적 오차 내에서, 서열 데이타로 부터 예상된 것과 일치한다. 임의의 이론에 얽매이기를 원하지 않는 한편, 변성 조건하에서 폴리아크릴아미드겔 상에서 glu3,5의 파격적 이동은 3과 5위치의 글루타밀 부사슬로 부터 단백질- SDS 상호작용의 방해로 기인되기가 가장 쉽다.
또한 SDS-PAGE 상에서 glu3,5ser78,96hbFGF는 Mr 19,000 단백질과 같이 이동하고 예상된 Mr 17,000 종류와 같이 이동하지 않는다. 이 관찰은 glu3,5hbFGF에 관해 나타난 탈선 이동과 일치한다.
[실시예 7]
[천연 및 돌연변이 hbFGF 유도체의 생물정량법]
천연 서열 hbFGF와 돌연변이체의 유사분열촉진 작용은 Esch, 일동, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 6507-6511(1985)에 의해 설명된 바와 같이 성체 대동맥궁으로 부터 유래된 소의 맥관 내피세포를 이용하여 결정하였다. 세포는 페니실린(100 유니트/㎖), 스트랩토마이신(100㎍/㎖) 및 L-글루타민(2mM)이 보충된 10% 송아지 혈청(Hyclone, Logan, UT)을 함유하는 0.5㎖의 Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지 (DMEM)에서 24 웰 플레이트 당 0.8×104세포의 초기밀도로 파종한다. 평판배양 2시간 후, 0.5% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 DMEM에서 bFGF의 적절한 희석물(0.001 내지 100ng/㎖) 20㎕ 부분표본을 첨가한다. 5일 배양 후, 한쌍의 평판을 트립신화하고 세포밀도는 Coulter 계수기에서 세포 계수하여 측정한다.
대안적으로, bFGF의 존재 및 부재하에서 성장곡선은, 기질로서 P-니트로페닐 포스페이트를 사용하는 세포용해 후 산 포스파타제 양을 측정함으로써 결정된다(Connolly, D.T., 일동, Anal. Biochem. 152: 136-140 (1986), p137). 세포는 10% 송아지 혈청, 항생물질 및 L-글루타민을 함유하는 0.25㎖ DMEM에서 웰(0.32㎠, 0.64㎝ 직경의 평편바닥 96웰 평판)당 초기 세포밀도 1000 내지 1200 세포로 파종한다. 평판배양 후, 0.5% BSA를 함유하는 DMEM에서 성장인자의 적절한 희석물 (0.001 내지 100ng/㎖) 10㎕ 부분표본을 첨가한다.
4 내지 5일 배양 후, 각가의 웰을 세척하고 0.1M 아세트산 나트륨, 0.1% Triton X-100 및 10mM p-니트로페닐 포스페이트 (Sigma 104포스파타제 기질)를 함유하는 100㎕ pH 5.5 완충액을 각 웰에 첨가한다. 평판을 37℃에서 2시간동안 배양하고, 반응은 1N 수산화나트륨 10㎕를 첨가함으로써 정지시키고, 발색은 UV 최대 동역학 미세평판 핀독기(Molecular Devices, CA)를 사용하여 세포없이 배양된 완충액 블랭크에 대해 405nm에서 측정한다.
측정은 삼중으로 수행한다. 두 방법은 구별불가능한 투여량-반응곡선을 제공한다.
재조합 hbFGF와 돌연변이 단백질이 유사분열촉진 성질을 소뇌로 부터 원래 분리된 bFGF(10-155)의 성질과 비교할때, 사람 재조합 bFGF와 glu3,5hbFGF는 소뇌의 bFGF에 관한 것과 필수적으로 동일하고(제5도) 0.3 내지 1.0ng/㎖의 중간-최대 자극(중간 유효 투여량, ED50) 및 3 내지 10ng/㎖의 최대 자극을 위한 투여량을 나타내는 내피세포 성장의 투여량 의존적 자극을 나타낸다.
glu3,5, ser78,96hbFGF를 제공하는, 시스테인 78과 96을 세린으로 대체하는 것은 분열촉진 능력에 어떠한 영향도 미치지 않으며 조직-유래된 소의 bFGF에 관해 측정한 것과 구별불가능한 투여량-반응곡선을 제공한다(제6도).
상기 설명은 본 발명을 실행하는 방법을 당분야의 당업자에게 가르칠 목적이고 설명을 읽을 때 당업자에게 명백하게 될 그것의 모든 명백한 변형물 및 변이물을 상술하려는 것은 아니다. 그러나, 모든 상기의 명백한 변형 및 변이는 첨부되는 특허청구의 범위에서 한정한 바의 본 발명의 법위내에 포함된다.
본 특허출원과 관련되어 기탁된 DNA 서열, 플라스미드 및/또는 미생물은, 반대로 상술하는 것을 제외하고는, New York, Pearl River에 소재한 American Cyanamid Company의 컬쳐 콜렉슨(culture collection)에 기탁되며, 그렇게 하는 것이 법적으로 적절할 때 공중에게 이용가능하다. 또한, 하기는 표시된 ATCC 기탁번호와 함께 표시된 날짜에, American Type culture Collection(ATCC; Rockville, Maryland 20952, U.S.A)에 부가적으로 기탁된다 : ATCC 번호 68478을 갖는, 1990년 11월 13일에 기탁된 BL21 lysS/pET glu3,5ser78,96hbFGF. ATCC 번호 68477을 갖는 1990년 11월 13일에 기탁된 BL21 lys-S/pET glu3,5hbFGF.
상기 둘은 여기에서 설명한 glu3,5se78,96hbFGF와 glu3,5hbFGF DNA를 함유한다.
[실시예 8]
[mEo-peg 화합물과의 유도체]
glu3,5hbFGF(2-155)는 전술한 바와 같이 제조된다. 폴리에틸렌 글리콜 요도아세테이트(meO-PEG-O2-CCH2I; MW = 200과 5000)와 요도 아세트아미드(MeO-PEG-NHCDCH2I; MW = 5000)는 전술한 바와 같이 제조된다.
2mM EDTA를 함유하는 0.1M Tris 완충액 pH 8.6 내의 glu3,5hbFGF(5㎎/㎖)은 디티오쓰레이톨(5mM) 첨가에 의해 환원되고 아르곤 분위기 하에 실온에서 1시간동안 정치한다. MeO-PEG-O2-CCH2I (MW = 200 또는 = 5000) MeO-PEG-NHCDCH2I (MW = 5000)을 첨가하여 최종농도 25-50mM을 제공하고 그런다음 반응혼합물은 4℃에서 12시간동안 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 대해 투석한다.
[실시예 9]
[유도체화된 FGF]
1.5M NaCl을 함유하는 10mM Tris 완충액 pH 7.4 내의 glu3,5hbFGF(5㎎/㎖)를 디티오쓰레이톨(5mM) 첨가로 환원시키고 아르곤 분위기하의 실온에서 0.5-1 시간 동안 정치시킨다. 그런다음 요도아세트산(1M Tris 완충액 pH 8.5에서 0.4M)를 첨가하여 50mM의 최종농도를 얻고 반응 혼합물을 어둠속에서 2시간동안 실온으로 정치한다. 그런다음 용액안 0.5M NaCl을 함유하는 10mM Tris 완충액(pH 7.0)에 대해서 12시간동안 투석한다.
bFGF와 카르복시메틸화 bFGF의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 전술한 바와 같이 분석한다.
[실시예 10]
[카르복시메틸화 FGF]
카르복시메틸화 bFGF : 불변성 조건 하에서 요도아세트산으로 glu3,5hbFGF (2-155)를 처리하여 bFGF의 4개 시스테인 잔기중 2개를 카르복시메틸화한다. 변형된 시스테인의 위치는14C-표지카르복시메틸화 bFGF의 엔도프로테인나제 Glu-C 소화의 페티드 지도화에 의해서 시스테인 78과 96으로서 확인된다.
시스테인 78과 96의 변형은 헤파린에 대한 bFGF의 친화에 어떠한 영향도 미치지 않는다. Glu3,5CMCys78,96hbFGF의 유사분열촉진활성 및 수용기 결합성질을 Glu3.5hbFGF의 것과 분별불가능한 반면(제1도) 완전히 카르복시메틸화된 bFGF는 활성이 없는 것으로 보인다. 변형안된 bFGF와 대조적으로, Glu3,5hbFGF는 P4에서 약 5분의 반감기를 갖는 반면, Glu3,5CMCys78,96hbFGF에 대해서는 60분 이상이다(제2도 참조).
bFGF의 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 : Glu3,5hbFGF의 PEG-2000 및-5000 유도체는 소의 내피세포 유사분열촉진 분석에서 완전한 활성이 있고(제3도) 헤파린에 결합한다. 에스테르 유도체는 가수분해되어, 안정되고 완전한 활성의 유사체인 카르복시메틸화 bFGF를 제공하고(실시예 28참조), 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드겔 상에서 18Kd 단백질(glu3,5CMCys78,96hbFGF)의 출연에 의해서 검사할 수 있다.
bFGF의 폴리에틸렌 글리콜 아미드 : PEG 에스테르와 대조적으로 glu3,5hbFGF의 PEG-5000 유도체는 안정하다. 이들은 Balbc3T3 섬유아세포 유사분열촉진 분석에서 완전한 활성이 있고, FGF 수용기 결합분석에서 변형안된 glu3,5hbFGF 만큼 효과적으로 수용한다.
[참고목록]
[서열 리스팅]
Claims (28)
- 하기 (a)-(c)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 염기성 섬유아세포 성장 인자 :(a) 3위치의 알라닌과 5위치의 세린이 그루탐산으로 대체된 약 155 아미노산을 갖는 염기성 섬유아세포 성장인자; (b) 3위치의 알라닌과 5위치의 세린이 그루탐산으로 대체되고, 78과 96위치의 시스테인은 이설파이드 스크램블링을 제거하는 아미노산으로 대체된 약 1555 아미노산을 갖는 염기성 섬유아세포 성장인자; 및 (c) N-말단 메티오닌이 없는 (a) 와 (b)의 절단 형태.
- 제1항에 있어서, 상기 염기성 섬유아세포 성장인자는 재조합체인 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제2항에 있어서, 78과 96위치의 시스테인은 세린, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 발린, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 쓰레오닌, 프롤린, 알라닌, 글리신, 아르기닌 또는 트립토판으로 대체되는, 재조합체인 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제3항에 있어서, 78과 96위치의 시스테인은 세린으로 대체되는 재조합체인 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제2항에 있어서, glu3,5hbFGF를 포함하는 제조합체인 염기성 섬유아세포 성장인자
- 제4항에 있어서, glu3,5, ser78,96hbFGF를 포함하는 제조합체인 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제2항에 따른 성장인자를 암호하는 DNA 서열을 포함하는 생물학적 기능이 있는 원형 플라스미드 또는 비루스 DNA 벡터.
- 제7항에 있어서, pET-3a 유도체를 포함하는 벡터.
- 제8항에 있어서, RNA 폴리머라제로부터의 T7프로포터를 함유하는 pT7 Kan 5와 pET-3a(M13)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 벡터.
- 숙주세포가 상기 인자를 발현 하도록 하는 방식으로 제7항의 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙트된 원형생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
- 제10항에 있어서, 이. 콜리를 포함하는 세포.
- 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 DNA 서열 :(a) 3위치의 알라닌과 5위치의 세린이 글루탐산으로 대체된 약 155 아미노산을 갖는 염기성 섬유아세포 성장인자를 암호하는 DNA 서열; 및 (b) 3위치의 알라닌과 5위치의 세린을 글루탐산으로 대체시키고, 78과 96 위치의 시스테인을 이설파이드 스크램블링을 제거하는 아미노산으로 대체시킨, 약 155 아미노산을 갖는 재조합 사람 섬유아세포 성장인자를 암호하는 DNA 서열.
- 제12항에 따른 DNA 서열을 포함하는 생물학적으로 기능이있는 원형 플라스미드 또는 비루스 DNA 벡터.
- 제13항에 있어서, RNA 폴리머라제에 대한 T7 프로모터를 함유하는 pT7 Kan 5와 pET-3a(ml3)으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 pET-3a 유도체인 벡터
- 섬유 아세포 성장인자를 발현하도록 하는 방식으로 제12항에 따른 DNA 서열로 형질전환된 또는 트랜스펙트된 원핵생물 또는 진행생물 숙주세포.
- 섬유아세포 성장인자를 발현하도록 하는 방식으로 제13항에 따른 벡터내에 암호된 DNA로 형질전환된 이. 콜리 세포.
- 3위치의 알라닌과 5위치의 세린을 글루탐산으로 대체시킨 154(1번 메티오닌 뺌) 또는 155 아미노산을 갖는 재조합 사람 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 3위치의 알라닌과 5위치의 세린을 글루탐산으로 대체하고, 78과 96 위치의 시스테인을 세린, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 발린, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 쓰레오닌, 프롤린, 알라닌, 글리신, 아르기닌 또는 트립토판으로 대체시킨, 154(1번 메티오닌 뺌) 또는 155 아미노산을 갖는 재조합 사람 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 3위치의 알라닌과 5위치의 세린을 글루탐산으로 대체하고, 78과 96위치의 시스테인을 세린으로 대체한 154 또는 155 아미노산을 갖는 재조합 사람 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제2항에 따른 FGF를 암호하는 정제 및 분리된 DNA 서열로 형질전환 또는 트랜스펙트된 숙주세포를, 배양 배지에서 상기 숙주세포가 재조합 사람 염기성 아세포 성장인자를 발현하기에 충분한 시간동안 및 조건하에서 증식시키고, 그후 상기 배양 배지, 상기 숙주 세포 용해질, 및 상기 숙주세포의 막 분류물로 구성되는 군으로부터 선택되는 재료로부터 성장인자를 회수함으로 구성되는, 재조합 사람 연기성 섬유아세포 성장인자의 생산방법.
- 제20항에 있어서, 상기 숙주세포는 이. 콜리 세포인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 FGF glu3,5hbFGF와 glu3,5, ser78,96hbFGF로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 원핵 생물 또는 진핵생물 숙주세포를 제2항에 따른 FGF를 암호하는 DNA서열로, 상기 숙주 세포가 상기 DNA에 의해 암호된 폴리펩티드를 발현하도록 하는 방식으로 형질전환하거나 트랜스펙팅함으로 구성되는, 재조합 사람 염기성 섬유아세포 성장인자를 발현할 수 있는 원핵생물 또는 진핵생물 세포의 생산 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 세포는 이.콜리세포인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 FGF는 glu3,5hbFGF와 glu3,5, Ser78,96hbFGF로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제2항에 있어서, 4개의 시스테인 잔기중 2개이상은 (CH2COOH); [CH(CO2H) (CH2)xCO2H], (CH2CONR3R4), (R5), [(CH2)nSO3], (CHCH2CONR3CO[(CH2)mNR3R24], (CH2OCOCH2R5) 또는 (SR6) (식에서 R3및 R4는 각각 H, [(CH2)xCO2H], [(CH(CO2H)(CH2)xCO2H] 0 내지 2개의 히드록실기로 치환되거나 치환되지않은 C1-C4알킬, 폴리에틸렌 글리콜이고, R5는 C1-C6알킬, C1-C4알콕시메틸이고, R6은 C1-C6알킬, 폴리에틸렌 글리콜 또는 하나 또는 두 개의 카르복실산 또는 황산기로 치환되거나 치환되지않은 페닐이고; m은 2 내지 4의 정수이고; n은 0 내지 4의 정수이고; x는 1 내지 3의 정수임)로부터 선택된 치환체로 유도체화된 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제26항에 있어서, 상기 염기성 섬유아세포 성장인자는 카르복시메틸화된 섬유아세포 성장인자의 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 제27항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장인자는 glu3,5hbFGF인 염기성 섬유아세포 성장인자.
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Families Citing this family (41)
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| US7252929B2 (en) | 1989-02-09 | 2007-08-07 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept Of Health & Human Services | Methods for identifying alpha PDGFR agonists and antagonists |
| US5951972A (en) * | 1990-05-04 | 1999-09-14 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues |
| DK0486862T3 (da) * | 1990-11-23 | 1996-06-24 | American Cyanamid Co | Kimær fibrolast-vækstfaktor |
| US5206354A (en) * | 1990-11-23 | 1993-04-27 | American Cyanamid Company | Dna sequence encoding active fragment of fibroblast growth factor, hbf-2 |
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| EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| IL125756A (en) | 1996-02-15 | 2003-05-29 | Biosense Inc | Catheter for use in surgery |
| US6927287B1 (en) * | 1996-06-03 | 2005-08-09 | United States Surgical Corporation | Nucleic acid encoding extracellular matrix protein or fragment thereof |
| US6492508B1 (en) * | 1996-06-03 | 2002-12-10 | United States Surgical Corp. A Division Of Tyco Healthcare Group | Nucleic acids encoding extracellular matrix proteins |
| US6443974B1 (en) * | 1996-07-28 | 2002-09-03 | Biosense, Inc. | Electromagnetic cardiac biostimulation |
| US20030144202A1 (en) * | 1996-10-15 | 2003-07-31 | Amgen Inc. | Uses of keratinocyte growth factor-2 |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| US6274712B1 (en) * | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
| ES2255155T3 (es) | 1998-02-05 | 2006-06-16 | Biosense Webster, Inc. | Dispositivo para la administracion intracardiaca de farmacos. |
| US20030129750A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-07-10 | Yitzhack Schwartz | Homing of donor cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
| US20030113303A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-06-19 | Yitzhack Schwartz | Homing of embryonic stem cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
| AU760664B2 (en) * | 1998-04-17 | 2003-05-22 | Angiogenix, Inc. | Therapeutic angiogenic factors and methods for their use |
| US6313103B1 (en) | 1998-05-13 | 2001-11-06 | Carrington Laboratories, Inc. | Pectic substance as a growth factor stabilizer |
| US7022683B1 (en) * | 1998-05-13 | 2006-04-04 | Carrington Laboratories, Inc. | Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation |
| US5929051A (en) * | 1998-05-13 | 1999-07-27 | Carrington Laboratories, Inc. | Aloe pectins |
| US20030166550A1 (en) | 1999-08-27 | 2003-09-04 | Chiron Corporation | Angiogenically effective unit dose of FGF-2 and method of use |
| US6440934B1 (en) | 1998-10-13 | 2002-08-27 | Chiron Corporation | Angiogenically effective unit dose of FGF-2 and method of use |
| US20020072489A1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-06-13 | Whitehouse Martha J. | Angiogenically effective unit dose of FGF-2 and method of use |
| US6451303B1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Method of treating coronary artery disease by administering a recombinant FGF |
| US8618052B2 (en) | 1998-10-13 | 2013-12-31 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Method of treating coronary artery disease by administering FGF-5 |
| AU6634400A (en) * | 1999-08-13 | 2001-03-13 | Chiron Corporation | Dose of an angiogenic factor and method of administering to improve myocardial blood flow |
| US7494669B2 (en) | 2001-02-28 | 2009-02-24 | Carrington Laboratories, Inc. | Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides |
| IL149562A0 (en) | 2002-05-09 | 2002-11-10 | Prochon Ltd | Fgf variants and methods for use thereof |
| US7067123B2 (en) * | 2003-04-29 | 2006-06-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Glue for cartilage repair |
| US7901457B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-03-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage allograft plug |
| US7837740B2 (en) | 2007-01-24 | 2010-11-23 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Two piece cancellous construct for cartilage repair |
| US7815926B2 (en) | 2005-07-11 | 2010-10-19 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Implant for articular cartilage repair |
| JP2009508596A (ja) | 2005-09-19 | 2009-03-05 | ヒストジェニックス コーポレイション | 細胞支持基材及びその調製方法 |
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| US8685107B2 (en) | 2007-07-03 | 2014-04-01 | Histogenics Corporation | Double-structured tissue implant and a method for preparation and use thereof |
| US20090054984A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Histogenics Corporation | Method For Use Of A Double-Structured Tissue Implant For Treatment Of Tissue Defects |
| CA2717725A1 (en) | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles |
| CA2723276A1 (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | University Of Western Ontario | Fgf-9 and its use relating to blood vessels |
| US9169309B2 (en) * | 2011-03-01 | 2015-10-27 | Humanzyme Inc. | Thermostable variants of fibroblast growth factors |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| CN105859892A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-08-17 | 浙江大学 | 一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4378347A (en) * | 1980-06-30 | 1983-03-29 | Franco Wayne P | Composition for treating the heart for myocardial infarction |
| US4296100A (en) * | 1980-06-30 | 1981-10-20 | Franco Wayne P | Method of treating the heart for myocardial infarction |
| US4588585A (en) * | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4956455A (en) * | 1984-03-05 | 1990-09-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Bovine fibroblast growth factor |
| US4785079A (en) * | 1984-11-09 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| WO1989000198A1 (en) * | 1987-07-07 | 1989-01-12 | Biotechnology Research Associates, J.V. | Recombinant fibroblast growth factors |
| US4902782A (en) * | 1986-12-10 | 1990-02-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| KR890701607A (ko) * | 1987-11-24 | 1989-12-21 | 원본미기재 | 섬유아세포 성장 인자의 유사체 |
| US5130418A (en) * | 1989-05-02 | 1992-07-14 | California Biotechnology Inc. | Method to stabilize basic fibroblast growth factor |
| DK0486862T3 (da) * | 1990-11-23 | 1996-06-24 | American Cyanamid Co | Kimær fibrolast-vækstfaktor |
| WO1998000198A1 (de) * | 1996-06-29 | 1998-01-08 | Mueller Dieter | Pharmazeutische darreichungsform |
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