KR100374310B1 - 변형된인간염기성섬유아세포성장인자및이의생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자, 이를 코드하는 유전자, 상기 유전자와 유비퀴틴의 결합 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의해 생산된 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는 기존의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 35번째 및 60번째 아미노산이 각각 아르기닌과 발린으로 치환된 것으로서 기존의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자보다 높은 활성을 나타낸다.
Description
본 발명은 생리적 활성도가 높은 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF) 및 이의 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 공지된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 아미노산 서열과 두 개의 아미노산이 다른, 생리적 활성도가 높은 변형된 염기성 섬유아세포 성장인자, 이를 코드하는 유전자, 상기 유전자와 유비퀴틴의 결합 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
세포 성장의 조절 및 세포 분화의 조절에 관여하는 여러 성장인자 중 섬유아세포 성장인자는 소의 뇌와 뇌하수체 조직의 섬유아세포와 내피세포(endothelial cell)에 대한 분열증식 활성(mitogenic activity)를 갖는 단백질로서 처음 보고되었다(Gospodarowicz, et al., Nature 249, 123(1974)). 염기성 섬유아세포 성장인자 이외에도 산성 섬유아세포 성장인자, K-섬유아세포 성장인자(hst 또는 KS3), 섬유아세포 성장인자-5, 섬유아세포 성장인자-6 및 각질세포 성장인자(keratinocyte growth factor, KGF) 등이 섬유아세포 성장인자과(FGF family)에 속하는데, 이들은 헤파린 결합 활성으로 인해 헤파린 결합 성장인자라고 불리기도 한다. 고스포다로빅츠(Gospodarowicz) 등에 의해 최초로 발견된 분열증식 활성을 보이는 두 가지 단백질은 그들의 특성(pI 값의 차이)에 따라서 산성 섬유아세포 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자로 명명되었다.
pI 값 9.6, 분자량 16,500 달톤의 비방화 단백질인 염기성 섬유아세포 성장인자의 아미노산 서열은 최초로 소의 뇌하수체에서 아미노 말단 15개의 아미노산이 보고(Bohlen, et al., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5364(1984))된 후, 에쉬 등이 동일 조직에서 완전한 아미노산 서열을 밝혀냈다(Esch, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6507(1985)). 염기성 섬유아세포 성장인자는 존재하는 부위와 분리 방법에 따라 아미노 말단이 각기 다른 변형된 형태로 존재하는데, 산성 조건하에서 소의 뇌 및 인간의 뇌에서 분리된 염기성 섬유아세포 성장인자는 146개의 아미노산으로 구성되어 있고(Gospodarowicz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6507(1984)), 소의 신장, 고환 등으로부터 분리된 염기성 섬유아세포 성장인자는 아미노 말단의 15개 아미노산이 잘려져 나간 형태로 존재한다(Baird, et al., Regul. Pept. 12, 201(1985); Ueno, et al., Mol. Cell. Endocrinol. 49, 189(1987)).
또한, 아미노 말단이 확장된 형태의 염기성 섬유아세포 성장인자도 존재하는데 염기 조건하에서 인간의 전립선(prostate)으로부터 추출된 염기성 섬유아세포 성장인자는 8개의 아미노산이 확장되었으며(Stroy, et al., Biochemical ＆ Biophysical Research Communications 142, 702(1987)), 인간의 태반을 짧게 산화시킨 후 얻은 염기성 섬유아세포 성장인자는 11개의 아미노산이 확장되었다(Sommer, et al., Biochemical ＆ Biophysical Research Communications 144, 543(1987)).
염기성 섬유아세포 성장인자는 중추 신경 조직에서도 그 존재가 확인되었는데(Gospodarowicz, et al., Endocrine Review 8, 95(1987); Bohlen, et al., FEBS Letter 185, 177(1985)), 이는 염기성 섬유아세포 성장인자가 신경세포 성장 촉진인자로 작용함을 암시한다. 실제로 염기성 섬유아세포 성장인자는 신경돌기(neurite)의 성장을 촉진하고 뉴론에 대해 신경촉진 활성을 나타내었다(Unsicker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 5459(1987); Anderson, et al., Nature 332, 360(1988)). 또한, 염기성 섬유아세포 성장인자는혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 인자로서 상처 회복을 촉진시킨다고 알려져 있다(Fourtanier, et al., J. Inv. Derm. 87, 76(1986); Davidson, et al., J. Cell Biol. 100, 1219(1985)).
최근 유전자 재조합 기술의 발달로 대장균과 효모에서 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자가 발현되었고 그의 생리학적 활성이 보고되었다(Fox, et al., J. Biol. Chem. 263, 18452(1988); 유럽 특허 제 275204 호, Production of Fibroblast Growth Factor(1988); 미국 특허 제 5155214 호, Basic Fibroblast Growth Factor(1990)).
본 발명자들도 생리적 활성도가 높은 신규의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 공지된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 35번째 아미노산이 라이신(lysine)에서 아르기닌(arginine)으로, 60번째 아미노산이 이소류신(isoleucine)에서 발린(valine)으로 치환된 변형된 염기성 섬유아세포 성장인자를 발견하고, 그의 생리적 활성도를 측정한 결과 기존의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자보다 높은 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 생물학적 활성이 높은 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 코드하는 DNA 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물 및 이 미생물을 배양하여 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 기존의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자에서 35번째 아미노산이 아르기닌으로, 60번째 아미노산이 발린으로 치환된 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자가 제공된다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 코드하는 DNA, 및 이 DNA를 유비퀴틴 유전자와의 결합 유전자로서 포함하는 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 발현 벡터가 제공된다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 발현 벡터로 형질전환된 효모, 및 상기 효모를 재조합 단백질의 발현을 위한 통상의 배지에서 통상적인 조건하에 배양하는 것을 포함하는 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 생산 방법이 제공된다.
이하, 본 발명의 방법을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는 그를 코드하는 유전자의 전체 염기 서열중 104번째 및 178번째 염기인 아데닌(adenine)이 구아닌(guanine)으로 치환되어 그에 의해 코드되는 염기성 섬유아세포 성장인자의 35번째 아미노산이 라이신(lysine)에서 아르기닌(arginine)으로, 60번째 아미노산이 이소류신(isoleucine)에서 발린(valine)으로 치환된 것이며, 그의 아미노산 서열 및 그를 코드하는 DNA의 염기 서열은 제 1도에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는 인간의 콜론 섬유아세포의 mRNA 로부터 역전사반응 및 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자를 클로닝하고,이 유전자를 포함하는 발현 벡터로 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻거나, 공지된 화학적 합성 방법에 의해 제 1도와 같은 아미노산 서열을 갖도록 합성함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는, 예를 들어, 다음과 같이 제조할 수 있다. 우선, 인간의 콜론 섬유아세포인 CCD-18Co 세포(ATCC CRL 1459)로부터 콜로진스키 등의 방법(Cholozynski, P., et al., Anal. Biochem. 162, 156(1987))에 따라 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA 로부터 역전사반응-중합효소 연쇄 반응에 의해 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자를 클로닝한다. 이 유전자를 pUC18 벡터에 삽입하여 제조된 플라스미드로 대장균을 형질전환시킨 후, 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 pUC18-bFGF를 추출하여 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자의 전체 염기서열을 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 확인하고, 이를 공지된 염기성 섬유아세포 성장인자의 염기서열(Prats H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 1836-1840(1989))과 비교함으로써 104번째 염기와 178번째 염기의 아데닌이 구아닌으로 치환되어 35번째 아미노산이 라이신에서 아르기닌으로, 60번째 아미노산이 이소류신에서 발린으로 치환된 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 코드하는 유전자를 확인한다.
변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 효모에서 발현시키기 위해서, 상기에서 확인된 유전자를 효모용 발현벡터 pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC 74071; 본 출원인의 대한민국 특허 공고 제 92-1745 호(공고 일자: 1992년 2월 24일) 참조)의 인간 성장 호르몬(HGH) 유전자와 치환하여 발현벡터 pYLBC-A/G-UB-bFGF를 제조하고, 이 발현 벡터를 이용하여 적당한 효모 숙주세포, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) DC04 를 형질전환시킨다. 형질전환된 효모균주를, 효모에서 재조합 단백질을 생산하기 위해 통상적으로 사용되는 배지에서 통상적인 조건하에 배양하여 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 대량 생산할수 있다. 단백질의 생산여부는 효모 세포를 파괴한 후 효모 추출물을 램리 등의 방법(Laemmli, et al., Nature 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 후 코마시블루(Coomassie brilliant blue R250)로 단백질을 염색하여 확인할 수 있다.
본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 생리활성도는 리지노 등의 방법(Rizzino, et al., Cancer Res. 48, 4266(1988))에 따라, 본 발명의 성장인자로 처리된 3T3 섬유아세포주의3H-타이미딘(thymidine) 흡수율에 의해 측정한다. 그 결과, 본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는 표준 염기성 섬유아세포 성장인자의 ED50값인 0.08ng/㎖보다 세배 이상 낮은 0.025ng/㎖의 값을 나타내므로 표준 염기성 섬유아세포 성장인자보다 상대적으로 높은 생리적 활성도를 가짐을 알 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 효모에서 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 발현
(단계1) 인간 섬유아세포 유전자의 분리
인간의 콜론 섬유아세포인 CCD-18Co 세포(ATCC CRL 1459)로부터 콜로진스키 등의 방법(Cholozynski, P., et al., Anal. Biochem. 162, 156(1987))에 따라 다음과 같이 RNA를 추출하였다. 5x106개의 CCD-18Co 세포에 1㎖의 RNA 추출액(4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 시트르산 나트륨, pH 7.0, 0.5% 사르코실, 0.1M 2-머캅토에탄올)을 가하고 진탕하여 세포막을 파괴시킨 다음, 0.8㎖의 2M 아세트산 나트륨(pH 4.0), 0.8㎖의 페놀, 1.6㎖의 클로로포름-이소아밀알콜(49:1, v/v)을 가하여 잘 혼합하였다. 혼합액을 4℃에서 12,000g로 15분간 원심분리한 후 상층액을 동일 부피의 이소프로판올이 있는 새용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 방치한 다음, 4℃에서 12,000g로 20분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75% 에탄올로 세척한 뒤 진공 건조시키고 20㎕의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.
(단계 2) 염기성 섬유아세포 유전자의 증폭
상기에서 추출한 RNA로부터 cDNA 단선을 합성하기 위해, 위에서 얻은 CCD-18Co 세포 RNA 용액 10㎕에 2㎕의 0.1M 메틸수은(CH3HgOH)을 가하고 상온에서 10분간 방치하여 RNA의 2차 구조를 풀어준 후, 2㎕의 1M 2-머캅토에탄올을 가하여 5분간 반응시켰다. 여기에 5㎕의 10배 농축 역전사효소 반응용액(500mM Tris-HCl, pH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)), 2.5㎕의 10mM dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 10mM), 24㎕의 디에틸피로카보네이트(DEPC, diethylprocarbonate)가 처리된 증류수, 1.0㎕의 RNase 억제제(RNasin, 1U/㎕, Promega, U.S.A.) 및 1㎕의 올리고(dT)12-18프라이머(oligo(dT)12-18primer, Gibco BRL, U.S.A.)를 가한다음 상온에서 10분간 방치시켜 RNA 주형과 프라이머가 잘 붙게 하였다. 그 후, 2.5㎕의 역전사효소(18U/㎕, Superscript RNase H-Reverse transcriptase, BRL, U.S.A.)를 반응액에 가하고 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA 단선을 합성하였다.
중합효소 연쇄반응에 의해 상기 cDNA로부터 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자를 제조하기 위해 DNA 합성기(DNA Synthesizer, Applied Bioxysterms Inc., U.S.A.)를 이용하여 하기 서열을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
프라이머 T2bFGF: 5'-ATTATCCGCGGTGGTATGGCAGCCGG-GAGCATCAC-3'
(Sac II 인지 부위(밑출친 부분)를 갖고, 16번째 염기부터 염기성 섬유아세포 성장인자의 아미노 말단을 코드하는 염기 서열과 동일한 염기서열을 갖도록 고안됨).
프라이머 bFGFSal: 5'-CTGAAGTCGACTATCAGCTCTTAGC-AGACATTG-3'
(Sal I 인지 부위(밑줄친 부분)를 갖고, 14번째 염기부터 염기성 섬유아세포 성장인자의 카복시 말단을 코드하는 염기 서열과 상보적인 서열을 갖도록 고안됨).
상기에서 합성한 cDNA 주형 2㎕, 10㎕의 10배 농축 반응완충용액(100mM Tris-HCl, pH 9.0, 500mM KCl, 1% Triton X-100), 6㎕의 25mM MgCl2, 2㎕의 10mM dNTP(dGTP dATP, dTTP, dCTP가 각각 10mM), 3㎕의 0.75㎍ T2bFGF 프라이머, 3㎕의 0.75㎍ bFGFSal 프라이머 및 Taq 중합효소 0.4㎕(5U/㎖, Promega, U.S.A.)에 75㎕의 증류수를 넣어 반응액을 만들었다. 온도 순환기(thermocycler, Perkin-Elmer, U.S.A.)를 이용하였으며, 94℃, 1분 30초; 50℃, 1분; 72℃, 1분 30초의 PCR 반응을 40회 반복하여 499 염기쌍의 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자를 증폭하였다.
증폭된 유전자를 클리나우 중합효소(Klenow polymerase) 및 T7 폴리뉴클레오티드 카이네이즈(polynucleotide kinase, BRL, U.S.A.)로 처리하여 그의 양 말단을 평활말단(blunt end)으로 만든 후, Hinc II 제한효소로 절단된 pUC18 벡터에 접합시켰다. 대장균 JM105(ATCC 47016) 컴피턴트 세포에 접합 반응액을 첨가하고 하나한의 방법(J. Mol. Biol. 116, 557(1983))에 따라 대장균을 형질전환시킨 후, LB-엠피실린(50㎍/㎖ 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 평판에 도말하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 형질전환체로부터 단일가닥 플라스미드 pUC18-bFGF 를 추출한 후 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자의 전체 염기서열을 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 확인하고, 이를 공지된 염기성 섬유아세포 성장인자의 염기서열(Prats H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 1836-1840(1989))과 비교하여 104번째 염기와 178번째 염기의 아데닌이 구아닌으로 치환됨으로써 35번째 아미노산이 라이신(lysine)에서 아르기닌(arginine)으로, 60번째 아미노산이 이소류신(isoleucine)에서 발린(valine)으로 치환된 변형된 염기성 섬유아세포 성장인자를 코드하는 유전자를 확인하였다(제 1 도).
(단계 3) 변형된 FGF 발현 벡터의 제조 및 효모의 형질전환
효모용 발현벡터 pYLBC-A/C-UB-HGH(ATCC 74071; 본 출원인의 대한민국 특허 공고 제 92-1745 호 참조) 2㎍을 제한효소 Pst I과 Sal I으로 완전 절단하고, 한편으로 동일 플라스미드 2㎍을 제한효소 Pst I과 Sac II으로 완전 절단한 다음 0.7% 아가로스 젤에서 각각 전기영동하여 9.8Kb와 3.4Kb 핵산 절편을 각각 얻었다. 이하, 이들 절편을 각각 절편 PL 및 절편 PT라 한다.
한편, 상기 (단계 2)에서 염기서열이 확인된 pUC18-bFGF를 제한 효소 Sac II와 Sal I으로 완전 절단하고, 7% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 480 염기쌍의 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자 DNA 절편을 분리하였다. 염기성 섬유아세포 성장인자 DNA 절편과 절편 PL, PT를 다음과 같이 연결시켰다. 100ng의 절편 PL, 100ng의 절편 PT, 100ng의 염기성 섬유아세포 성장인자 DNA 절편, 2㎕의 10배 농도 연결반응 완충용액(500mM Tris-HCl, pH 7.8, 100mM MgCl2, 100mM DTT, 10mM ATP, 250㎍/㎖ BSA), 10 단위의 T4 핵산 라이게이즈(ligase)를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 반응액을 대장균 HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 대장균을 형질전환시킨 후, LB-엠피실린(50㎍/㎖ 엠피실린을 포함하는 LB배지) 평판에 도말하여 플라스미드 pYLBC-A/G-bFGF 를 포함하는 대장균 형질전환체를 선별하였다. 플라스미드 pYLBC-A/G-bFGF 의 제작 과정을 제 2 도에 도시하였다.
재조합 플라스미드 pYLBC-A/G-bFGF를 알칼라인 용해방법(Alkaline lysis method; Ish, Horowicz. C. et al., Nucleic Acid Res. 9, 2989(1981))으로 대량 추출한 후, 이를 이용하여 베그스의 방법(Beggs, Nature 275, 104(1978)) 및 힌넨 등의 방법(Hinnen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929(1978))에 따라 다음과 같이 효모를 형질전환시켰다.
밤새 배양한 효모(S. cerevisiae DC-4, Yeast Genetic Stoock Center, Univ. of California, Berkeley CA., U.S.A.) 12㎖를 50㎖의 YEPD배지(펩톤 2%, 효모추출물 1%, 글루코스 2%)에 접종하여 650nm 파장에서의 흡광도가 0.8-1.0이 될 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 20㎖의 증류수에 녹인 후 다시 원심분리하고, 세포 침전물을 20㎖의 1M 솔비톨 용액으로 현탁시킨 후 다시 원심분리하였다.
침전된 세포를 5㎖의 SP 완충용액(1M 솔비톨, 50mM 인산칼륨, pH 7.5), 5㎕의 1M DTT에 잘 녹인 후, 50㎕의 자이몰라제(zymolase, 10mg/㎖ in 50% 글리세롤/50% SP 완충용액)를 넣고 30℃에서 완만한 진탕조건(150rpm)으로 약 30분 동안 반응시켰다. 수시로 세포액을 추출하여 1/10 부피의 0.1% 소디움도데실설페이트(SDS)를 처리한 후, 광학 현미경으로 관찰하여 스피로플라스트(spheroplast)의 형성정도를 조사하였다. 약 90% 이상의 효모세포가 스피로플라스트가 되면(약 30분 후), 반응액을 원심분리(7,000rpm, 3분)하여 스피로플라스트를 얻은 후, 5㎖의 1M 솔비톨 및 5㎖의 STC 완충용액(1M 솔비톨, 10mM Tris-Cl, pH 7.5)로 2회 세척한 후최종 1㎖의 STC 완충용액에 녹이고 이를 형질 전환에 사용하였다.
12.5㎕의 10㎍ 재조합 플라스미드 pYLBC-A/G-UB-bFGF와 12.5㎕의 2xSTC(STC의 2배 농축액)를 잘 섞은 후, 상기의 스피로플라스트를 50㎕ 첨가하고, 상온에서 10분간 배양하였다. 500㎕의 PEG/TC 용액(40% PEG-4000, 10mM CaCl2, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)을 첨가하여 10분 더 방치시킨 뒤 원심분리(1500rpm, 3분)하여 스피로플라스트 침전을 얻었고, 이것을 200㎕의 1M 솔비톨에 잘 녹였다. 이 용액을 7㎖의 재생아가(Regeneration Agar; 100㎖당 3g 박토아가, 50㎖의 2M 솔비톨, 0.07g의 아미노산 결핍 효모 질소기질, 루이신이 결핍된 0.1g의 아미노산 혼합물, 0.4㎖의 50% 글루코스, 45㎖의 물)와 혼합하여 Leu-/솔비톨 평판(루이신이 결핍된 평판)에 도포한 후, 30℃에서 5일간 배양하여 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 효모 콜로니를 얻었다.
플라스미드 pYLBC-A/G-UB-bFGF 로 형질전환된 효모 사카로마이세스 세레비지애 DC04 는 1995년 2월 6일자로 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0148BP호로서 기탁되었다.
(단계 4) 인간 섬유아세포 성장인자의 발현
상기 (단계 3)에서 얻은 형질전환된 효모 균주를 3㎖의 루이신이 결핍된 배양액(배양액 1 리터당 아미노산 결핍 효모 질소 기질(yeast nitrogen base without amiono acids, Difco, U.S.A.) 6.7g, 루이신이 결핍된 아미노산 혼합물 0.25g 및 5% 글루코스)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을원심분리(15,000rpm, 3분)하여 효모 세포 농축액을 얻은 다음, 2% 글루코스가 함유된 YEP 배지(펩톤 2%, 효모추출물 1%)에 현탁시켜 48시간 동안 배양한 후 배양액을 원심분리하여 얻은 세포침전물을 400㎕의 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 8M 요소)에 현탁시켰다. 현탁액에 직경 0.4mm의 유리구슬을 동일 부피로 첨가하고 강하게 진탕시켜 세포가 파괴된 효모 추출물을 얻었다. 10㎕의 효모 추출물을 램리 등의 방법(Laemmli, et al., Nature 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 후 코마시블루(Coomassie brilliant blue R250)로 단백질을 염색한 결과, 제 3 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질전환된 균주에서 18,000달톤 크기의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자가 대량 생산된 것을 확인하였다.
제 3 도에서, 제 1 열은 벡터를 함유하지 않는 효모의 추출액으로서 음성 대조 시료이고, 제 2 열은 타 유전자(G-CSF)를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 효모의 추출액으로서 음성 대조 시료이고, 제 3 열 및 제 4 열은 플라스미드 pYLBC-A/G-UB-bFGF로 형질전환된 두 개의 서로 다른 효모클론의 추출액이고, 제 5 열은 표준 단백질 분자량 표지이다.
실시예 2: 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 생리 활성도 측정
효모에서 발현된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 노에르저 등의 방법(Knoerzer, et al., Gene 75, 21(1989))에 따라 순수 정제하였다. 정제된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 생리 활성도는 리지노 등의 방법(Rizzino, et al., Cancer Res, 48, 4266(1988))을 참조하여 3T3 섬유아세포주(ATCC CCL-92)를 이용한3H-타이미딘(thymidine)의 흡수율로 측정하였다. 3T3 섬유아세포주를 250㎖ 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 100% 우태아 혈청이 함유된 얼 최소배지(Earle's minimal essential media, EMEM, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 3T3 섬유아세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모은다. 이를 우태아혈청이 함유되지 않은 EMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 24웰 조직 배양용 평판에 각 웰당 2 x 104세포/0.3㎖ 배양액이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 7% CO2조건 하에서 배양하였다. 미국의 R＆D사에서 구입한 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자와 상기에서 정제된 본 발명의 염기성 섬유아세포 성장인자를 각각 0.2% 소 혈청 알부민(w/v)이 함유된 EMEM 배양액으로 2ng/㎖ 농도로부터 두배씩 연속적으로 희석하여 각 웰에 0.3㎖씩 첨가한 후 37℃, 7% CO2조건하에서 6시간 더 배양하였다. 그 후, 각 웰에 0.5μCi의3H-타이미딘(Amersham, TRK 686, 68Ci/mmol)을 넣고 밤새 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 인산염 완충 생리 식염수로 1회 세척하였다. 각 웰에 0.25% 트립신 용액 0.1㎖ 씩을 넣고 37℃에서 5분간 방치하여 세포들을 배양판에서 분리하였다. 10% 우태아혈청이 함유된 EMEM 배양액 0.5㎖씩을 각 웰에 첨가하고, 세포 포집기(12 well cell harvester, Milipore, U.S.A.)를 사용하여 세포를 유리섬유 필터에 부착시켰다. 필터를 1㎖의 증류수로 1회 그리고 1㎖의 에탄올로 1회 세척한 후 60℃에서 30분간 방치하여 건조시켰다. 건조된 필터를 2㎖의 신틸레이션 칵테일과 함께 신틸레이션 바이알에 넣고 30분간 상온에서 방치시킨 후, 신틸레이션 카운터(scintillation counter, Packard, U.S.A)로 세포내에 흡수된 방사능양을 측정하여 그 결과를 제 4 도에 나타내었다. ED50값은 R＆D 사의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(제 4 도의 a)가 약 0.08ng/㎖, 본 발명의 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(제 4 도의 b)가 약 0.025ng/㎖로서, 본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자가 3배 정도의 낮은 농도에서도 동일한 활성을 보이는 것으로 나타났다.
제 1 도는 본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 아미노산 서열 및 그를 코드하는 염기 서열을 나타낸 것이고,
제 2 도는 플라스미드 pYLBC-A/G-UB-bFGF 의 제작 과정을 나타낸 것이고,
제 3 도는 형질전환된 효모세포로부터 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자가 발현된 것을 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이고,
제 4 도는 본 발명의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 생리적 활성도를 시판되는 인간 염기성 섬유아세포 성장인자와 비교하여 나타낸 것이다.
Claims (9)
- 인간 염기성 섬유아세포 성장인자에서, 35번째 아미노산이 아르기닌으로, 60번째 아미노산이 발린으로 치환된 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자.
- 하기의 아미노산 서열을 갖는 인간 염기성 섬유아세포 성장인자:(상기에서, 각 아미노산은 표준 단일 약자로 나타냄)
- 제 1 항 또는 제 2 항의 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자를 코드하는 DNA.
- 제 3 항에 있어서,하기의 염기 서열을 갖는 DNA:
- 제 3 항 또는 제 4 항의 DNA를 포함하는 발현벡터.
- 제 5 항에 있어서,플라스미드 pYLBC-A/G-UB-bFGF(기탁번호: KCTC 0148BP).
- 제 5 항 또는 제 6 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 제 7 항에 있어서,플라스미드 pYLBC-A/G-UB-bFGF 로 형질전환된 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) DC04(기탁번호: KCTC 0148BP).
- 제 7 항 또는 제 8 항의 미생물을 재조합 단백질의 생산을 위한 통상의 배지에서 통상적인 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 변형된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 생산 방법.
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