KR0161143B1

KR0161143B1 - 효모를 이용한 과립구-군체 자극인자의 제조 방법

Info

Publication number: KR0161143B1
Application number: KR1019950044345A
Authority: KR
Inventors: 양재영; 조중명; 이재형
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1995-11-28
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970027311A

Abstract

본 발명은 천연형 G-CSF 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 아미노 말단의 염기 서열이 다음과 같이 치환된 것을 특징으로 하는 과립구-군체 자극 인자(G-CSF)를 코드하는 재조합 cDNA:

를 포함하는 효모용 발현 벡터로 형질 전환된 효모 세포를 배양하여 천연형 G-CSF를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 천연형 G-CSF 단백질의 생산 방법에 따르면, 과립구-군체 자극 인자를 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

효모를 이용한 과립구-군체 자극인자(G-CSF)의 제조 방법

제1도는 인간 U-937 세포로부터 유래된 G-CSF의 유전자 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 인간 U-937 세포로부터 유래된 G-CSF 유전자를 효모 발현 벡터 pYLBC A/G UB-MetG-CSF3으로 클로닝하는 과정을 도시한 것이고,

제3도는 본 발명의 발현 벡터 pYLBC A/G UB-MetG-CSF3로 형질 전환된 효모 세포를 배양한 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,

제4도는 본 발명에 따라 효모 세포에서 발현된 G-CSF 단백질을 정제하여 아미노 말단을 분석한 결과를 나타낸 것이고,

제5도는 본 발명에 따라 변형된 G-CSF 유전자를 효모 발현 벡터 pYLBC A/G αF-G-CSF4로 클로닝하는 과정을 도시한 것이고,

제6도는 본 발명의 발현 벡터 pYLBC A/G αF-G-CSF4로 형질 전환된 효모 세포를 배양한 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 효모를 이용한 과립구-군체-자극인자(granulocyte-colony stimulating factor; 이하 G-CSF라 함) 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연형 G-CSF의 cDNA 염기 서열 일부를 아미노산 변화 없이 치환하여 이를 유비퀴틴과의 융합 단백질로 발현시키거나 효모의 α-인자와 함께 발현시켜 천연형 G-CSF 단백질을 회수하는 방법에 관한 것이다.

G-CSF는 골수 세포의 분화 증식을 촉진하는 군체 자극 인자(colony stimulating factor) 중 호중구 과립구의 생장 및 분화에 관여하는 것으로 알려진 후(Nicola, et al., J .Biol. Chem. 252, 9017(1983)), 사람의 방광암 세포 유래 G-CSF가 정제되었고(Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 1526(1985)), 그의 cDNA 염기 서열도 쉬게가주 등(Shigekazu et al., Nature, 319, 415(1986))과 수자 등에 의해 밝혀졌다(Souza et al., Science, 232, 61(1986)).

G-CSF의 성숙한 단백질은 분자량 19,600달톤 크기의 당단백질로 호중구 과립구와 결합하여 작용함으로써, 단기간 내에 그 수를 증가시킬 수 있으므로 여러 가지 치료 분야에 응용될 수 있다. 예를 들면 항암 치료 화학 요법 후 파괴된 면역계 세포의 복구에 사용할 수 있고 골수 이식, 심한 화상 및 백혈병의 치료에도 사용될 수 있다.

현재 G-CSF를 생산하는 방법으로는, 대장균을 이용하여 아미노 말단에 메티오닌이 첨가된 G-CSF 단백질을 만드는 미국 암젠사의 방법(미국 특허 제 4,810,643호)과 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 동물 세포를 이용하여 천연형의 당화된 G-CSF 단백질을 만드는 일본의 쥬우가이사의 방법이 알려져 있다(대한 민국 특허 공고 제 92-5752호 및 제 91-5624호). 그러나 암젠사의 방법은 그 발현율이 전체 단백질의 3 내지 5%에 불과하고 천연형 단백질에는 없는 메티오닌이 첨가됨으로써 생체 내에서 항체를 형성할 가능성이 있을 뿐 아니라 대장균을 사용하여 생기는 발열성 물질을 제거하기 위한 정제 단계가 별도로 추가되어야 한다는 문제가 있다. 또한, 동물 세포를 이용하는 쥬우가이사의 방법에 있어서는 천연형 단백질을 얻을 수 있으나, 그 비용면에 있어서 대장균 혹은 효모 등을 이용하는 방법과는 비교할 수 없다는 문제가 있다.

임상 연구 결과, 대장균 유래 G-CSF와 동물 세포 유래 G-CSF는 안정성 및 효능성 면에서 동일한 것으로 평가(Asano S., et al., Bohring Inst. Mitl. 83, 222(1988))되고 있다는 점을 감안하여, 본 발명자들은 발열성 물질이 없는 효모를 이용하여 비당화, 천연형 G-CSF를 대량 생산하는 방법을 계속 연구하던 중, G-CSF 유전자의 아미노 말단 염기 서열 중 일부를 아미노산의 변화 없이 치환 변형시키고, 그의 아미노 말단에 메티오닌을 첨가하여 효모의 유비퀴틴 유전자 다음에 융합시켜 발현시킬 때 천연형 단일 크기의 G-CSF 단백질을 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 효모 세포를 이용한 천연형 G-CSF 단백질의 개선된 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 효모 세포로부터 천연형 G-CSF 단백질을 생산하는데 사용되는 G-CSF의 변형된 재조합 cDNA, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 아미노 말단의 염기 서열이 다음과 같이 치환된 것을 특징으로 하는 과립구-군체 자극인자(G-CSF)를 코드하는 재조합 cDNA:

상기 cDNA를 포함하는 효모용 G-CSF 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질 전환된 효모 세포주를 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 효모 세포를 배양하여 천연형 G-CSF를 회수하는 것을 포함하는 G-CSF 단백질의 제조 방법을 제공한다.

천연형의 G-CSF 유전자를 효모 발현 벡터에 클로닝하여 이를 효모에 형질 전환시켜 발현시킬 경우 G-CSF 단백질의 발현 정도는 전체 단백질의 5% 미만으로 매우 낮다.

본 발명에서는 G-CSF의 cDNA 아미노 말단의 염기 서열 중 일부를 아미노산 서열에는 변화가 없도록 다음과 같이 치환함으로써 G-CSF 단백질 발현율을 크게 증가시킬 수 있다.

상기와 같이 변형된 G-CSF 유전자를 효모 세포 내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현되도록 한 후, 효모 세포 내에서 절단되어 천연형 G-CSF 단백질로 생산되도록 할 수 있다. 즉, 변형된 G-CSF 유전자를 효모의 유비퀴틴 유전자 다음에 융합시키면, 이로 인해 형질 전환된 효모 세포에서는 유비퀴틴 절단 효소에 의해 유비퀴틴 단백질과 절단된 G-CSF 단백질로 발현될 수 있다. 이때 아미노 말단이 절단된 보다 작은 크기의 G-CSF 단백질로 생성되는데, 이러한 현상을 없애기 위해 변형된 G-CSF 유전자의 아미노 말단에 메티오닌 코돈을 첨가한 다음 위와 같이 유비퀴틴 유전자와 융합시킨다. 이와 같이 제조된 발현 벡터로 형질 전환된 효모 세포에서는 단일한 크기의 G-CSF 단백질을 전체 단백질의 20 내지 25% 정도 생산할 수 있다. 또한 이때 발현된 단백질을 정제하여 아미노 말단 서열을 분석한 결과, 메티오닌이 제거된 천연형 G-CSF 단백질을 얻을 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기와 같이 변형된 G-CSF 유전자를 효모 세포 분비체계를 이용하여 천연형 G-CSF 단백질로 세포 외 분비되도록 할 수 있다. 즉, 변형된 G-CSF 유전자를 단백질 분비에 관여하는 α-인자 전구 서열과 융합, 발현시키면 천연형 G-CSF 단백질이 세포 외 분비된다.

본 발명에서의 효모 균주로는 사카로마이세스 세레비지애가 바람직하다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[G-CSF 단백질의 효모 세포내 발현]

(단계 1) 인간 U-937 세포로부터 G-CSF 유전자의 분리

콜로진스키 등의 방법(Cholozynski, P., et al., Anal. Biochem. 162, 156(1987))에 따라 인간의 U-937 세포(ATCC CRL 1593)로부터 RNA 추출은 다음과 같이 수행하였다. 5×10⁶세포에 RNA 추출액(4M Guanidinum thiocyanate, 25mM Sodium Citrate, pH 7.0, 0.5% Sarcosyl, 0.1M 2-Mercaptoethanol) 1㎖을 가하고 진탕하여 세포막을 파괴시킨 다음, 2M 아세트산 나트륨(pH 4.0) 0.8㎖, 페놀 0.8㎖, 클로로포름-이소아밀알콜(49:1, v/v) 1.6㎖을 가하여 잘 혼합하고 12,000G, 4℃에서 원심 분리하였다. 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 들어 있는 새 용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 동안 방치한 다음, 12,000G, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75% 에탄올로 세척한 뒤 진공 건조시키고 20㎕의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.

cDNA 단일 가닥을 합성하기 위해서, 상기에서 얻은 RNA 용액 10㎕를 취하여 0.1M 메틸머큐리(CH₃HgOH) 20㎕를 가한 다음 상온에서 10분간 방치하여 RNA의 2차 구조를 풀어준 후 1M의 2-머갑토 에탄올 2㎕를 가하여 5분간 반응시켰다. 여기에 10배 농축 역전사 효소 반응 용액(500mM Tris-HCl, pH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl₂, 10mM Dithiothreitol) 5㎕, 10mM dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP 각각 10mM) 24㎕, 디에틸피로카보네이트(DEPC: Diethyl-pyrocarbonate) 24㎕가 처리된 증류수, RNase 억제제(RNasin, IU/㎕, Promega, U.S.A.) 1.0㎖, 올리고(dT)_12-18시발체(oligo(dT)_12-18primer, GibcoBRL, U.S.A.) 1㎕를 가하고 상온에서 10분간 방치하여 RNA 주형과 시발체가 잘 붙게 한 다음 2.5㎕의 역전사 효소(18U/㎕, Superscript RNase H^-Reverse trascriptase, BRL, U.S.A.)를 가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다. G-CSF 유전자를 중합 효소 연쇄 반응을 이용해 cDNA로부터 얻기 위해 두개의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 핵산 합성기(DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 합성하였다.

T2G-CSF 프라이머(36-mer: 5'-ATTATCCGCGGTGGTACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3')는 SacII 인지 부위(밑줄)를 포함하고 16번째 핵산부터 G-CSF 유전자와 동일한 염기 서열을 갖도록 고안되었고, G-CSFSal 프라이머(37-mer: 5'-ATCATGTCGACTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG-3')는 SalI 인지 부위(밑줄)와 두개의 종료 코돈을 갖고 있으며 17번째 핵산부터 G-CSF 카복시 말단 염기와 상보적인 서열을 갖도록 고안하였다.

cDNA 가닥을 주형으로 하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하는데, 상기에서 합성한 cDNA 주형 2㎕, 10배 농축 반응 완충 용액 10㎕, 25mM의 MgCl₂6㎕, 10mM dNTP 2㎕, 0.75㎍ T2G-CSF 프라이머 3㎕, 0.75㎍ G-CSFSal 프라이머 3㎕, Taq 중합 효소 0.4㎕(5U/㎖, Promega, U.S.A.)에 75㎕의 증류수를 넣어 반응액을 만들었다. 94℃, 1분 30초; 50℃, 1분; 72℃, 1분 30초의 반응을 40회 반복하여 553염기쌍의 G-CSF 유전자를 증폭하였다.

클레나우 중합 효소(Klenow polymerase)와 T7 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase, BRL, U.S.A.)를 처리하여 유전자의 양말단을 평활 말단(blunt end)으로 만들어, HincII 제한 효소로 절단된 pUC18 벡터에 접합하였다(pUC18-G-CSF). 대장균 JM105(ATCC47016) 컴피턴트 세포에 접합 반응액을 첨가하여 주고 하나한의 방법(J. Mol. Biol., 116, 557(1983))에 따라 상기 벡터로 형질 전환시킨 후, LB-엠피실린(50㎍/㎕ 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 플레이트에 평판 배양하여 대장균 형질 전환체를 선별하였다. 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 G-CSF 유전자의 전체 핵산 염기 서열을 확인하여 잘 알려진 G-CSF의 염기 서열(Souza L. M. et al., Science, 232, 61(1986))과 비교하였다.

(단계 2) 효모 발현 벡터 pYLBC A/G UB-GCSF1의 제조 및 효모 세포 내에서 G-CSF 단백질의 발현

본 출원인의 선출원(대한 민국 특허 출원 제 89-20200호)에서의 효모용 발현 벡터 pYLBC A/G UB-HGH(ATCC 74071) 2㎍을 제한 효소 PstI과 SalI으로 완전 절단하고, 또한 동일 플라스미드 2㎍을 제한 효소 PstI과 SacII으로 완전 절단한 다음 0.7% 아가로즈 겔로 전기 영동 분리하여 각각 9.8kb와 4.5kb의 핵산 절편을 얻었다. 이하, 이들 절편을 각각 절편 PL 및 절편 PT라 칭한다. 한편 단계 1에서 염기 서열이 확인된 pUC18-G-CSF1를 제한 효소 SacII와 SalI으로 완전 절단하고 7% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하여 533염기쌍의 G-CSF1 유전자 핵산 절편을 분리하였다. G-CSF1 핵산 절편과 절편 PL 및 PT을 다음과 같이 연결 반응시켰다. 100ng의 절편 PL, 100ng의 절편 PT, 100ng의 G-CSF1 유전자 절편, 2㎕의 10배 농도 연결 반응 완충 용액(500mM Tris-HCl, pH 7.8, 100mM MgCl₂, 100mM DTT, 10mM ATP, 250㎍/㎖ BSA), 10단위의 T4 핵산 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 반응액을 대장균 HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 형질 전환시킨 후, LB-엠피실린(50㎍/㎖ 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 플레이트에 평판 배양하여 대장균 형질 전환체를 선별하였다. 재조합 플라스미드 pYLBC-A/G UB-G-CSF1는 알칼리 용해 방법(Alkaline lysis method; Ish, Horowicz,. C. et al., Nucleic Acid Res. 9, 2989(1981))으로 대량 추출하여 효모 형질 전환에 이용하였다.

이어서, 베그(Beggs et al., Nature, 275, 104(1978))와 힌넨 등의 방법(Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929(1978))을 기본으로 하여 다음과 같이 효모를 형질 전환시켰다. 즉, 밤새 배양한 효모(Saccharomyces cerevesiae DC04, Yeast Genetic Stock Center, Univ. of California, Berkeley. CA., U.S.A.)12㎖을 50㎖의 YEPD 배지(펩톤 2% 효모 추출물 1% 글루코스 2%)에 접종하여 650nm 파장에서 흡광도가 0.8 내지 1.0이 될 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 5,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 얻은 세포 침전물을 20㎖의 물에 녹인 후 다시 원심 분리 하였다. 20㎖의 1M 솔비톨 용액으로 다시 세포 침전물을 녹인 후 재원심분리하였다. 침전된 세포를 5㎖의 SP 완충 용액(1M 솔비톨, 50mM 인산 칼륨, pH 7.5), 5㎕의 1M 디티오스레이톨(DTT)에 잘 녹인 후, 50㎕의 자이몰라제(Zymolase, 10㎍/㎖ in 50% 글리세롤/50% SP 완충 용액)를 넣어 주고 30℃의 완만한 진탕 조건(150rpm)에서 30분 정도 반응시키면서, 수시로 세포액을 추출하여 1/10 부피의 0.1% 소디움도데실설페이트(SDS)로 처리하여 광학 현미경 관찰하에서 스페로플라스트(spheroplast)의 형성 정도를 조사하였다. 약 90% 이상의 효모 세포가 스페로플라스트가 되도록 한 후(보통 30분 정도), 원심 분리(7,000rpm, 3분)하여 스페로플라스트를 얻어 5㎖의 1M 솔비톨 및 5㎖의 STC 완충 용액(1M 솔비톨, 10mM Tris-Cl, pH 7.5)으로 두차례 씻어준 후 최종 1㎖의 STC 완충 용액에 녹이고 이를 형질 전환에 사용하였다. 12.5㎕의 10㎍ 재조합 플라스미드 pYLBC A/G UB-G-CSF1과 12.5㎕의 2×STC(STC의 2배 농축액)를 잘 섞은 후 상기의 스페로플라스트 50㎕를 첨가하여 상온에서 10분간 배양하였다. 500㎕의 PEG/TC 용액(40% PEG-4000, 10mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)을 첨가하여 10분을 더 방치시킨 후 15,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 스페로플라스트 침전을 얻었고, 이것을 200㎕의 1M 솔비톨에 잘 녹였다. 7㎖의 재생아가(Regeneration Agar: 100㎖ 당 3g 박토아가, 50㎖의 2M 솔비톨, 0.07g의 아미노산 없는 효모 질소 기질, 루이신이 결핍된 0.1g의 아미노산 혼합물, 0.4㎖의 50% 글루코스, 45㎖의 물)와 혼합하여 솔비톨 플레이트(루이신이 결핍된 플레이트)에 도포한 후 30℃에서 5일간 배양하여 재조합 플라스미드에 의해 형질 전환된 효모 콜로니를 얻었다.

형질 전환된 효모 균주를 3㎖의 루이신(leucine)이 결핍된 배양액(배양액 1ℓ당 아미노산이 없는 효모 질소 기질(yeast nitrogen base without amino acids, Difco, U.S.A.) 6.7g과 루이신이 결핍된 아미노산 혼합물 0.25g 및 5% 글루코스)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하고 15,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 효모 세포 농축액을 얻은 다음, 2% 글루코스가 함유된 YEP 배지(펩톤 2%, 효모 추출물 1%)에 현탁시켜 48시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액을 원심 분리하여 400㎕의 완충 용액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride), 8M Urea)에 현탁하고 직경 0.4mm의 유리 구슬을 같은 부피로 첨가하여 강하게 진탕시켜 세포가 파괴된 효모 추출물을 얻었다. 10㎕의 효모 추출물을 램리의 방법(Laemmli, et al., Nature, 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시킨 후, 코마시블루(Coomassie Brilliant blue R250)로 단백질을 염색하여 약 18,000달톤 크기에서 인간 G-CSF 단백질이 5% 미만으로 발현됨을 확인하였다.

(단계 3) 효모 발현 벡터 pYLBC A/G UB-GCSF2의 제조 및 효모 세포 내에서 G-CSF 단백질의 발현

G/C가 많은 G-CSF1 유전자의 아미노 말단 일부의 염기 서열을 아미노산의 변화가 없도록 아래와 같이 치환하였다.

종합 효소 연쇄 반응을 이용하여 염기 서열을 치환시키고자 올리고뉴클레오티드 T2GCSF2 프라이머(40mer; 5'-ATTATCCGCGGTGGTACTCCTTTAGGTCCTGCTAGCTCCC-3')를 합성하였다. 효모 발현 벡터 pYLBC-A/G-UB-GCSF1을 주형으로 하고 상기 프라이머로 T2GCSF2와 단계 1에서 제조한 GCSFSal를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 94℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 1분의 반응을 25회 반복하여 553염기쌍의 G-CSF2 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 SacII 및 SalI 제한 효소로 절단하여 단계 2에서와 같이 효모 발현 벡터에 클로닝하였다. 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 G-CSF 유전자의 아미노 말단 염기 서열 일부가 치환된 것을 확인하였고 전체 G-CSF2의 염기 서열을 제1도에 나타내었다. 이렇게 하여 얻은 재조합 플라스미드 pYLBC A/G-UB-GCSF2를 앞과 동일한 방법으로 효모에 형질 전환시켰다.

형질 전환된 효모 균주를 3㎖의 루이신이 결핍된 배양액에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하고 15,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 효모 세포 농축액을 얻은 다음, 2% 글루코스가 함유된 YEP 배지에 현탁시켜 48시간 배양하였다. 세포를 파괴하고 10㎕의 효모 추출물을 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시킨 후 코마시블루(Coomassie brilliant blue R250)로 단백질을 염색한 결과, 약 18,000달톤 크기의 G-CSF 단백질과 그보다 작은 크기를 갖는 G-CSF 단백질 유래의 물질이 바로 밑에서 나타남을 알 수 있었다. 유비퀴틴 융합 단백질로 발현되었다가 효모 내의 유비퀴틴 분해 효소에 의해 절단된 후 아미노 말단 규칙(N-end rule; Gonda. D. K. et al., J. Biol. Chem., 264, 16700(1989))에 의해 G-CSF 단백질의 아미노 말단 일부가 더 절단된 형태로 나타난 것으로 확인되었다.

(단계 4) 효모 발현 벡터 pYLBC A/G UB-MetG-CSF3의 제조 및 효모 세포 내에서 G-CSF 단백질의 발현

(단계 3)에서의 아미노 말단 일부가 잘려 나가는 현상을 제거하기 위해 다음과 같이 G-CSF 단백질의 -1 위치에 메티오닌을 하나 첨가하였다. 즉, ATG 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 T2MGCSF3(39-mer; 5'-ATTATCCGCGGTGGTATGACTCCTTTAGGTCCTGCTAGC-3')를 합성하였다. 효모 발현 벡터 pYLBC A/G-UB-GCSF2을 주형으로 하고 프라이머로 T2MGCSF3 및 GCSFSal를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 94℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 1분의 반응을 25회 반복하여 553염기쌍의 G-CSF3 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 SacII 및 SalI 제한 효소로 절단하여 단계 2에서와 같이 효모 발현용 벡터에 클로닝하였다. 제2도는 인간 U-937 세포로부터 유래된 G-CSF 유전자를 효모 발현 벡터 pYLBC A/G-UB-MetG-CSF3으로 클로닝하는 상기 과정을 도시한 것이다. 이렇게하여 얻은 재조합 플라스미드 pYLBC A/G UB-MetG-CSF3을 전과 동일한 방법으로 사카로마이세스 세레비지애 DC04에 형질 전환시켰다.

형질 전환된 효모 균주를 YEP 배지에 현탁시켜 48시간 배양한 후 세포를 파괴하고 효모 추출물의 일부를 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시킨 후 코마시블루(Coomassie brilliant blue R250)로 단백질을 염색하였다. 제3도는 발현 벡터 pYLBC A/G UB-MetG-CSF3로 형질 전환된 효모를 배양한 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동한 결과를 나타낸 것이다. 제1열은 벡터를 함유하지 않는 효모의 추출액으로 음성 조건 시료이고, 제2열 내지 제6열은 본 발명의 발현 벡터 pYLBC A/G UB-MetG-CSF3으로 형질 전환된 다섯개의 서로 다른 효모 클론의 추출액 시료이고, 제7열은 표준 단백질 분자량을 표시하는 것이다. 여기에서 보는 바와 같이, 약 18,000달톤 크기에서 단일한 인간 G-CSF 단백질이 전체 단백질의 20 내지 25% 정도 생성되고, 단계 3에서와는 달리 단일 크기의 G-CSF 단백질이 형성되었음을 확인할 수 있었다.

상기 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지애 DC04/pYLBC A/G UB-MetG-CSF를 1995년 10월 6일자로 한국 과학 기술 연구원 생명 공학 연구소 부설 유전자 은행에 기탁 번호 제 KCTC 8691P호로서 기탁하였다.

(단계 5) G-CSF 단백질의 N-말단 아미노산 분석

효모 세포에서 발현된 재조합 G-CSF 단백질을 슈자 등의 방법(Souza, et al., Science, 232, 61(1986))에 따라 소디움 라우레이트(sodium laurate)를 이용하여 용해시킨 후, 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC, Beckman Instruments사)로 정제하여 95% 이상의 재조합 G-CSF 단백질을 얻었다. 이 단백질을 기상식 시퀀서(Applied Biosystems사)로 에드만 분해하여 얻은 PTH 아미노산을 HPLC 및 울트라 스피어-ODS 칼럼(Beckman Instruments사)을 사용하여 통상적인 방법으로 분석하였다. 칼럼(5㎛; 4.6mm×250nm)을 개시 완충액(15mM 소디움 아세테이트 완충액(pH 4.5) 및 40% 아세토니트릴을 함유하는 수용액)으로 평형화시킨 후, 시료를 20㎕의 개시 완충액에 용해시켜 주입하고 개시 완충액에 의한 이소크라틱 용출에 의하여 분리하였다. 유속은 1.4㎖/분, 칼럼의 온도는 40℃로 유지하였다. PTH 아미노산의 검출은 269nm 및 320nm의 자외부 흡광도를 이용하는데, PTH 아미노산의 표준 시료(Sigma사, 각 2nmol)를 동일의 계로 분리하여 유지 시간을 측정하고, 이를 시료와 비교하여 아미노 말단의 아미노산을 확인하는데 사용하였다.

제4도는 본 발명에 따라 효모 세포에서 발현된 G-CSF 단백질을 정제하여 아미노 말단을 분석한 결과를 나타낸 것으로, 아미노 말단의 첫번째 아미노산으로 PTH-트레오닌, 그리고 두번째 아미노산으로 PTH-프롤린이 검출되었음을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따라 효모에서 발현된 G-CSF 단백질은 메티오닌 없는 천연형과 동일한 것임을 확인할 수 있다. 제1도는 인간 U-937 세포로부터 유래된 G-CSF의 유전자 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 아미노 말단의 염기 서열 일부가 치환된 G-CSF2를 보여주며, 천연형 G-CSF 유전자는 치환된 염기 서열 위쪽에 표시되었다.

[실시예 2]

[G-CSF 단백질의 효모 세포 외 분비 발현]

본 출원인의 선 등록 특허(대한 민국 특허 등록 제 60252호: 인간 인슐린 유사 성장 인자의 발현 벡터)의 효모용 발현 벡터 pYLBC A/G αF IGF-I의 클로닝 부위인 XbaI 및 SalI 인지 부위 사이에 G-CSF 유전자를 클로닝하기 위해 XbaI 인지 부위를 포함하는 XbaGCSF4 프라이머(38-mer; 5'-GTATCTCTAGATAAGAGAACTCCTTTAGGTCCTGCTAG-3')를 합성하였다. 이 프라이머는 XbaI 인지 부위(밑줄)를 포함하는 18번째 핵산까지는 αF의 전구 서열 일부이고, 19번째 핵산부터 변형된 G-CSF 염기 서열(즉, G-CSF2)로 이루어져 있다.

실시예 1에서의 발현 벡터 pYLBC A/G UB-G-CSF2를 주형으로 하고 프라이머 XbaGCSF와 GCSFSal을 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 즉, 벡터 주형 10ng, 10배 농축 반응 완충 용액 10㎕, 25mM MgCl₂6㎕, 10mM dNTP 2㎕, 0.75㎍ XbaGCSF3 프라이머 3㎕와 GCSFSal 프라이머 3㎕(0.75㎍), Taq 중합 효소 0.4㎕(5U/㎖, Promega, U.S.A.)에 75㎕의 증류수를 넣어 반응액을 만들어, 94℃, 1분; 50℃, 30초; 72℃, 1분의 반응을 25회 반복하여 556염기쌍의 G-CSF 유전자(G-CSF4)를 증폭하였다. 이 유전자를 XbaI, SalI으로 완전히 절단하고 7% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하여 536염기쌍의 G-CSF4 핵산 절편을 얻었다. 한편, 발현 벡터 pYLBC A/G αF IGF-I 2㎍을 제한 효소 PstI과 XbaI으로 완전 절단하고 또한 동일 플라스미드 2㎍을 제한 효소 PstI과 SalI로 완전히 절단한 다음 1% 아가로스 겔에서 전기 영동 분리하여 4.5kb와 9.8kb의 핵산 절편을 각각 얻었다. 이하, 이들 절편을 각각 절편 PX 및 절편 PL로 칭한다. 절단된 G-CSF4 핵산 절편과 절편 PX, PL을 다음과 같이 연결 반응시켰다. 100ng의 절편 PL, 100ng의 절편 PX, 100ng의 G-CSF4 유전자 절편, 2㎕의 10배 농도 연결 반응 완충 용액(500mM Tris-HCl, pH 7.8, 100mM MgCl₂, 100mM ATP, 250㎍/㎖ BSA), 10단위의 T4 핵산 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 이 반응액을 대장균 HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 형질 전환시킨 후 LB-엠피실린(50㎍/㎖ 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 플레이트에 평판 배양하여 대장균 형질 전환체를 선별하였다. 제5도는 본 발명에 따라 변형된 G-CSF 유전자를 효모 발현 벡터 pYLBC A/G αF-G-CSF4로 클로닝하는 과정을 도시한 것이다. 재조합 플라스미드 pYLBC A/G αF-GCSF4는 알칼리 용해 방법으로 대량 추출하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 사카로마이세스 세레비지애 DC04에 형질 전환시켜 재조합 효모 콜로니를 얻었다.

상기 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지애 DC04/pYLBC A/G αF-G-CSF를 1995년 10월 6일자로 한국 과학 기술 연구원 생명 공학 연구소 부설 유전자 은행에 기탁 번호 제 KCTC 8692P호로서 기탁하였다.

형질 전환된 효모 균주를 YEP 배지에 현탁시켜 48시간 배양한 후 세포 배양액 1㎖에 100% TCA 용액 100㎕를 넣어 단백질을 침전시키고, 30분 정도 빙욕상에 방치한 후 원심 분리하여 단백질 침전을 얻어 아세톤으로 씻어 준 후 건조시켰다. 이 시료의 일부를 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시킨 후 코마시블루(Coomassie brilliant blue R250)로 단백질을 염색하였다. 제6도는 본 발명의 발현 벡터 pYLBC A/G αF-G-CSF4로 형질 전환된 효모 세포를 배양한 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동한 결과를 나타낸 것이다. 제1열 내지 제4열은 본 발명의 발현 벡터 pYLBC A/G αF-GCSF4로 형질 전환된 네개의 서로 다른 효모 클론의 추출액 시료이고, 제5열은 벡터를 함유하지 않는 효모의 추출액으로 음성 조건 시료이고, 제6열은 표준 단백질 분자량을 표시하는 것이다. 여기에서 보는 바와 같이, 18,000달톤 크기에서 단일한 인간 G-CSF 단백질이 분비되는 전체 단백질의 30 내지 40% 정도 생성되었음을 확인할 수 있다.

Claims

아미노 말단의 염기 서열이 다음과 같이 치환된 것을 특징으로 하는 과립구-군체 자극 인자(G-CSF)를 코드하는 재조합 cDNA:
제1항의 cDNA를 포함하는 효모용 G-CSF 발현 벡터.
제2항에 있어서, G-CSF를 코드하는 cDNA가 그의 -1 위치에 메티오닌 코돈이 첨가되고 유비퀴틴 유전자와 융합된 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제3항에 있어서, pYLBC A/G UB-MetG-CSF3.
제2항에 있어서, 효모의 α-인자 전구 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제5항에 있어서, pYLBC A/G αF-G-CSF4.
제2항의 발현 벡터로 형질 전환된 효모 세포주.
제7항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 DC04/pYLBC A/G UB-MetG-CSF(KCTC 8691P) 또는 사카로마이세스 세레비지애 DC04/pYLBC A/G αF-G-CSF(KCTC 8692P).
제7항의 효모 세포를 배양하여 천연형 G-CSF를 회수하는 것을 포함하는 G-CSF 단백질의 제조 방법.