NO172548B - Saccharomyces cerevisiae hybride vektorer og anvendelse av disse ved fremstilling av polypeptider - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører gjærhybridvektorer som inneholder promoteren til PH05 genet for sur fosfatase, og disse er istand til å transformere Saccharomyces cerevisia celler. Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for fremstillingen av DNA-framgentene og hybridvektorene, hvorved det anvendes rekombinant DNA-teknologi.

I og med utviklingen av rekombinant DNA-teknologi, har den kontrollerte mikrobielle produksjon av nyttige polypeptider, særlig slike av medisinsk interesse, blitt mulig. Det meste av arbeidet med rekombinant DNA-teknologi i aan senere tid vedrører prokaryote organismer. Det er blitt utviklet fremgangsmåter, som nå er godt etablerte, for å innføre i disse organismene DNA som koder for eukaryote proteiner. Flere bakteriearter, særlig stammer av Escherichia coli, som er blitt modifisert ved denne nye teknologien, er nå tilgjengelig og muliggjør den kommersielle produksjon av polypeptider av største betydning, slik som insulin, human leukocyt-

og -fibroblast interferon og humant veksthormon.

For mange formål vil det imidlertid være ønskelig eller nødvendig i fremtiden å bruke eukaryote systemer ved den kommersielle fremstillingen av proteiner, særlig av farmakologisk viktige proteiner. Ettersom gjær er eukaryoter,

har de mange biologiske reaksjonsbaner til felles med andre eukaryoter, mest betydningsfullt med pattedyrceller. Ettersom mange farmakologisk viktige proteiner syntetiseres av pattedyrceller, kan slektskapet mellom de to systemene være fordelaktig. F.eks. ligner den sekretoriske reaksjonsbanen hos gjær den hos høyere dyreceller, og det er kjent at gjærceller har maskineriet for spaltingen av signalsekvenser (ikke-ladet II-terminale del av et protein, spaltes vanligvis av

under sekresjonstransporten) (47). Glykosyleringssystemet er forbundet med den sekretoriske reaksjonsbanen. De grunn-leggende trinn som fører til glykosylerte proteiner er like hos alle eukaryoter og det forventes at gjærceller, i motsetning til prokaryote celler, kan produsere proteiner som er korrekt glykosylert (selv om noen av slutttrinnene i reaksjonsbanen må modifiseres).

Dessuten er gjærceller fri for endotoksiner. Forurensende endotoksiner finnes ofte i proteinpreparater fra E.coli og må fjernes ved kostbare rensingstrinn.

Ettersom gjær er en mikroorganisme, er gjærceller lette

å dyrke. Cellemassen som kan oppnås pr. volumenhet dyrkingsvæske, er betydelig høyere for gjær enn for E.coli. Dertil er den dyrkningsmessige oppførsel til gjær godt kjent og betingelser for dyrkinger i stor skala er allerede fastslått.

I de siste få årene har bakergjær, Saccharomyces cerevisiae, fått økende oppmerksomhet blant molekylærbiologer innen grunnforskning og anvendt forskning. Denne utviklingen skyldes i stor utstrekning etableringen av et transformasjons-system (Hinnen et al. (1), Beggs (2)) som gjør det mulig for denne mikroorganismen å bli brukt til genetiske manipu-leringer, slik som innføring og kloning av heterologt DNA.

På samme måte som ved prokaryote systemer, er plasmider

de foretrukne vektorer som brukes til å transformere gjærceller, dvs. å innføre rekombinant DNA i gjærceller.

Det finnes forskjellige patentsøknader og andre publikasjoner som vedrører vektorer egnet til å transformere gjærceller, gjær transformert med plasmidene, polypeptider fremstilt ved hjelp av de transformerte gjærene og fremgangsmåter for fremstilling derav: Det generelle transformeringsskjemaet for gjær er beskrevet av Hinnen et al., (1), Beggs (2), Ilicks et al., (3) og

Struhl et al., (4) .

Ekspresjon av et gen for human interferon som er knyttet

til DNA fragmenter fra de 5'-tilgrensende sekvensene i genet for alkohol dehydrogenase 1 (ADH1) hos Saccharomyces cerevisiae i et plasmid og transformert inn i gjærceller, er beskrevet av Hitzeman et al., (5).

Transformeringen av Saccharomyces cerevisiae med et plasmid som inneholder det kromosomale genet for ø-globin hos kanin, er rapportert av Beggs et al., (6). Som angitt i publikasjo-nen, transkriberes genet ukorrekt og det kan ikke påvises noen sammenskjøting av de primære 6-globin-transkripsjons-produktene.

Eukaryote celler, slik som gjær- og særlig pattedyr-celler, som samtidig er transformert med fremmed DNA som koder for et polypeptid og koblet med en induserbar promoter, og med ikke-koblet DNA som gjør identifikasjon av de transformerte cellene mulig, samt en fremgangsmåte for fremstilling derav er beskrevet i PCT patentsøknad nr. 81/02425 (7).

En DNA-sekvens som koder for et eukaryot replikasjonssete, eukaryote vektorer som gir mitotisk stabilitet ved lavt kopiantall, og som inneholder et eukaryot replikasjonssete, og gjærceller transformert med vektorene er beskrevet i EP patent søknad nr. 48081 (8).

Hybride DNA som omfatter bl.a. et eukaryot vert-autonomt replikerende segment, en fremgangsmåte for fremstillingen derav og en fremgangsmåte for høyfrekvent transformering av eukaryote celler, f.eks. gjær, med de hybride DNA-er er beskrevet i EP patentsøknad nr. 45573 (9).

Plasmider som omfatter ovalbumin genet kontrollert av promoteren til Escherichia coli g-lac Z-genet og er istand til å bli transformert inn i gjærceller slik som beskrevet i

DE cffentliggjørelsesskrift nr. 2923297 (10), og FR patent-søknad.nr. 2458585 (11).

Hybride plasmider som omfatter DNA fra et bakterielt plasmid, all eller en del av DNA fra 2 ^-plasmidet fra gjær og URA3-genet fra gjær, samt gjær transformert med hybridplasmidene er beskrevet i EP patentsøknad nr. 11562 (12).

I løpet av de siste årene har det vært store fremskritt innen genteknikkfeltet, og de første systemene som bruker genetisk manipulerte mikroorganismer, særlig stammer av enterobakterien Escherichia coli, funksjonerer nå. Det foreligger imidlertid et behov for ytterligere og forbedrede systemer, særlig eukaryote systemer, slik som gjær, som er egnet for den økonomiske og stor-skala produksjonen av proteiner i industrien. For tiden er forskjellige gjærvektorer tilgjengelige for genkloning. For den virksomme ekspresjon av fremmede gener i gjær, må strukturelt kodende sekvenser kombineres med sterke gjærpromoterer som fordelaktig bør oppvise reguleringsegenskaper som vil muliggjør eksogen kontroll av genekspresjon. Det er et formål ved den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe gjærpromoterer som imøtekommer disse kravene. Det er også et formål ved den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe hybridvektorer som inneholder promoterene og fremmede strukturelle gener, kontrollert av disse promoterene. 1. DNA- fraomenter som inneholder promotere for sur fosfatase fra Saccharomyces cerevisiae oa fremstilling av disse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nylig isolerte S.cerevisiae PH05 promotere med forbedrede ekspresjonsegen-skaper og en fremgangsmåte for fremstilling derav.

Promoteren anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse er avledet fra det genome DNA til Saccharomyces cerevisiae. Minst to strukturelle gener (PH03 og PH05) og flere regulatoriske gener (PH02, PH04, PH080, PH081, PH085) er involvert i ekspresjonen av sur fosfatase i S.cerevisiae (som referanse, se f.eks. (13)). PH05 og PH03 koder for henholdsvis en represerbar (regulert) og konstitutiv sur gjærfosfatase. PH05-genet represeres ved høye konsentrasjo-ner av uorganisk fosfat og aktiveres (represerbarheten oppheves) ved mangel på uorganisk fosfat (vanligvis i utstrakt grad under passende fysiologiske betingelser), mens PH03-genet uttrykkes konstitutivt ved lave nivåer. Det represerbare enzymet glykosileres og har en molekylvekt på ca. 490 kg dalton (14).

Promoterene som kontrollerer genene for sur fosfatase har ikke tidligere vært isolert eller brukt innen rekombinant DNA teknologi, og følgelig har ikke deres nukleotid sekvenser vært klarlagt. I motsetning til andre gjærpromoterer som brukes i nyere rekombinant DNA-teknologi, (f.eks. ADHl), koder DNA-sekvensen som følger umiddelbart etter gjærpro-moterene for sur fosfatase, for signalpeptider som antas å være involvert i sekresjonsprosessen. Det ville være fordelaktig å knytte et kodende område for fremmedprotein til en signalsekvens fra gjær, hvilket ville sikre in vivo transport av proteinet gjennom cellemembranen hos gjær. Dette ville resultere i en reduksjon av produktnedbryting

og forurensning av produktet med vertcelle materialet og ville lette produktutvinning.

Det er en ulempe ved de promoterene som hittil har vært brukt innen rekombinant DNA teknologi, at de respektive genene transkriberes konstitutivt. Det uttrykte polypeptidet kan enten være giftig for gjærcellen (fungicid aktivitet) eller kan i det minste inhibere celle-formering (fungi-statisk aktivitet), eller polypeptidet kan bli enzymatisk nedbrutt innenfor cellen, særlig dersom det eksponeres mot gjærproteaser over en lengre tid. I alle de nevnte tilfel-lene vil utbyttet av det ønskede polypeptidet bli lavt. Disse ulempene kan unngås ved å bruke PH05-promoteren og vektorer som inneholder denne promoteren. PH05-promoteren kan represeres eller aktiveres (represerbarheten oppheves) når den som utfører eksperimentet vil det, ved utelukkende å øke eller nedsette konsentrasjonen av uroganisk fosfat i mediet. Følgelig kan promoteren represeres i løpet av den eksponentielle vekstfasen til gjæren og kan innkobles bare under tidlig stasjonær fase ved maksimal celletetthet og derved tillate ekspresjon av genet kontrollert av PH05-promoteren. Denne egenskap kombinert med et høyt nivå for transkripsjon gjør PH05-promoteren til den foretrukne ved foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en gjærhybridvektor, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA-fragment bestående hovedsakelig av den represerbare sure fosfatase (PH05) -promoteren til Saccharomyces cerevisiae, idet nevnte DNA-fragment omfatter sekvensen eller subfragmenter derav som beholder promoter-funksjonen, en gjær- eller ikke-gjær-polypeptidkodende region som er kontrollert av nevnte promoter, forutsatt at nevnte gjærpoly-peptidkodende region ikke er PH05 genet.

Et DNA-fragment kan ifølge oppfinnelsen fremstilles ved at man

A) fremstiller det sure fosfatase PH05-genet ved å komplementere sure fosfatase PH05 manglende gjærstam-mer ved transformasjon med plasmid DNA fra et gjærgen-bibliotek inneholdende vill-typekopien av

nevnte gen og isolerer nevnte gen,

B) fremstiller subkloner av det oppnådde genet,

C) identifiserer beliggenheten av promoterregionen til ovennevnte subkloner og isolerer ved restriksjons-spaltning DNA-fragmentene som hovedsakelig består av den sure fosfatase PH05 promoteren, og for fremstilling av subfragmenter, forkorter DNA-restriksjonsfragmentene oppnådd ved spaltning med en restriksjonsendonuklease eller med en egnet eksonuklease.

Eventuelt etterfølges S.cerevisiae PH05-promoteren av hele eller den del av signalsekvensen for det S.cerevisiae PH05-kodende området. I tillegg kan DNA-fragmentet inneholde sekvenser som kreves for virksom translasjon av mRNA. De subfragmentene av DNA-fragmentet som beholder promoterfunksjonen er også åpenbaret.

Følgende trinn er involvert i fremstillingen av DNA-fragmentet: (1) Det bygges opp et S.cerevisiae genbibliotek ved å bruke DNA fra S.cerevisiae av vill-typen, klonet inn i et hybrid bakterie (særlig Escherichia coli) S.cerevisiae-plasmid som bærer passende markører som vil kunne gi ekspresjon både i bakterie- og S.cerevisiae-cellen, (med hensyn til passende markører, se nedenunder). (2) Det selekteres for kloner som inneholder S.cerevisiae sur fosfatase PH05-genet ved transformasjon av en sur fosfatase PH05 manglende S.cerevisiae stamme ved å bruke plasmidforråd fra det ovenfor nevnte biblioteket. (3) Plasmider som inneholder sur fosfatase PH05-genet isoleres fra de transformerte S.cerevisiae cellene og amplifiseres ved transformering tilbake i E.coli, idet det selekteres for de fenotype egenskapene til den bakterielle markøren (f.eks. ampicillinresistens). (2') Ved en alternativ fremgangsmåte deles genbiblioteket i undergrupper som brukes til å transformere sur fosfatase PH05 manglende S.cerevisiae stammene, og (3') positive undergrupper deles på nytt og transformeres slik som ovenfor inntil et enkelt klon er identifisert. (4) Den identifiserte klonens plasmid DNA isoleres, brytes opp med passende restriksjons endonukleaser og fragmentene klones på nytt inn i en passende S.cerevisiae vektor. (5) DNA-fragmenter som inneholder S.cerevisiae sur fosfatase PH05-genet kan identifiseres ved å transformere sur fosfatase PH05 manlgende S.cerevisiae stammer med vektorene. Ved hjelp av denne fremgangsmåten kan grensene til genet for sur fosfatase bestemmes ved nøyaktighet på omtrent 300 basepar. (6) DNA-sekvensering av de identifiserte fragmentene tjener til å lokalisere promoterområdene, de proteinkodende områdene for sur fosfatase PH05 og dertil restriksjonsstedet eller stedene som kan være nyttige ved ytterligere behandling, f.eks. til å kutte av DNA-sekvenser som ikke er nødvendige for prometerfunksjonen, med restriksjons endonukleaser.

Avhengig av valget av restriksjons endonukleaser, kan DNA fragmentene som inneholder promoteren for sur fosfatase i 3'- og 5'-endene også omfatte opprinnelig tilgrensende DNA-sekvenser som ikke påvirker promoter-funksjonen, og

kan brukes som sammenbindende sekvenser i de derpå følgende kloningsfremgangsmåter. Om ønsket, kan disse ytterligere sekvensene forkortes ved nedbryting med en restriksjons endonuklease (om mulig), eller med en passende eksonuklease, f.eks. Bal31. I tillegg kan fragmentene bindes til kjemisk syntetiserte DNA-koblere som fortrinnsvis omfatter gjenkjen-ningssekvensen for en passende restriksjons endonuklease.

Dette muliggjør en lettvint sammenknytting av PH05-promoteren for sur fosfatase til kodende områder for fremmedpolypeptid. Det er også mulig å isolere og/eller bygge opp et DNA-fragment som inneholder PH05-promoteren for sur fosfatase hos gjær og en del av eller hele den tilgrensende signalsekvensen fra det kodende området for PH05. Når den bindes til et passende kuttet kodende område for fremmed polypeptid, vil den resulterende hybrid DNA uttrykkes i S.cerevisiae hvorved man får polypeptider med signalsekvenser for PH05 sur fosfatase eller sammensatte signalsekvenser.

S.cerevisiae PH05 sur fosfatase-promoteren kan brukes til å kontrollere ekspresjonen av et kodende område for gjær- eller ikke-gjær-polypeptid i en hybrid gjærvektor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av en transformert Saccharomyces cerevisiae stamme, kjennetegnet ved at en Saccharomyces cerevisiae stamme transformeres med en hybrid vektor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av et gjær- eller ikke-gjær-polypeptid eller et naturlig forekommende derivat derav, kjennetegnet ved at følgende trinn utføres: 1) dyrking av en Saccharomyces cerevisiae stamme transformert med en gjærhybridvektor ifølge et

hvilket som helst av kravene 1 til 8, og

2) isolering og rensing av polypeptidet.

2. Hybride vektorer som inneholder promotere for sur giærfosfatase og deres fremstillin<g.>

Foreliggende oppfinnelse vedrører også hybride gjærvektorer omfattende et DNA-fragment bestående hovedsakelig av den represerbare sure fosfatase (PH05) promoteren fra S.cerevisia og en gjær eller en ikke-gjær-polypeptid kodende region som er kontrollert av nevnte promoter.

Uttrykkene "vektor", "hybrid vektor", "DNA sekvenser" etc. som er brukt i den foreliggende søknad, angår spesielt dobbeltkjedede DNA-er.

Enkjedede DNA-er omfattes imidlertid også. Vektorer og hybrid vektorer kan foreligge i rettkjedet form eller fortrinnsvis være ringformet.

Det kodende området (gen) for gjær- eller ikke-gjær polypeptid kontrollert av en av de ovenfor nevnte promoterer kan være utvunnet fra genom-DNA eller fra cDNA fremstilt via mRNA-linjen eller kan være syntetisert kjemisk. De kodende områder (gener) for ikke-gjær polypeptid har sin opprinnelse fra viruser, prokaryote celler eller eukaryote celler, inkludert fra høyere eukaryote celler, særlig fra menneskeceller. Når de uttrykkes i vert-gjær cellen, kan disse genene gi produksjon av et vidt spekter med polypeptider inkludert glykosylerte polypeptider, slik som enzymer som kan brukes f.eks. til fremstillingen av næringsstoffer og til å utføre enzymatiske reaksjoner innen kjemien, eller ikke-enzymatiske polypeptider, f.eks. hormoner, poly-peptier med immunomodulerende, antivirale og antikreft-egenskaper, antistoffer, virus antigener, vaksiner, sammen-klumpingsfaktorer, matvarer o.l. F.eks. koder slike gener for amylaser, proteaser, lysozym, virus-tymidin kinase, renin, beta-laktamase, glukose isomerase, sekretin, tymo-cin, relaksin, kalsitonin, somatostatin, humant eller okse-veksthormon, insulin, luteiniserende hormon, paratyroid hormon, adrenokortikotropin, 6-endorfin, melanocyt-stimu-lerende hormon, B-lipotropin, urogastron, interferon, slik som human interferon, f.eks. et human interferon-a - eller -B-polypeptid avledet fra humanleukocyt, lumfoblastoid-eller fibroblast celler, eller human interferon-y, lymfo-kiner, tumornekrosefaktor, anti-rennin antistoff, hepatitis A virus antigen, hepatitis B virus (HBV) overflate- eller kjerne antigener, hepatitis ikke-A ikke-B virus antigen, humane vevforenlige antigener, munn- og -klovsyke virus antigen, influensa hemaglutinin, hønsepest virus hemaglutinin, serum albumin, ovalbumin, taumatin, egliner eller plasminogenaktivatorer.

Et utvalgt kodende område for polypeptid kan eventuelt omfatte en signalsekvens eller en del derav. Som angitt ovenfor, kan dette fremkalle et sammensatt protein som inneholder PH05-signal sekvensen eller en hybrid signal sekvens som inneholder en del av PH05-signal sekvensen og en del av signal sekvensen for det fremmede polypeptidet, sammen med det fremmede, fullstendige polypeptidet. I begge tilfeller er de kombinasjoner favorisert som fører til spaltingen av signalsekvensen etter at det fremmedepolypeptidet er fullstendig oppbygget.

Bortsett fra PH05 sur fosfatasepromoteren og et kodende område for gjær- eller ikke-gjær polypeptid, kan hybrid vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde ytterligere DNA-;sekvenser som er uvesentlige eller mindre viktige for funksjonen til promoteren, dvs. for ekspresjonen av det kodende området for polypeptid, men som kan utføre viktige funksjoner, f.eks. ved formeringen av gjærcellene som er transformert med hybridvektorene. DNA-sekvensen(e) som kommer i tillegg, kan være utvunnet fra prokaryote og/eller eukaryote celler og kan omfatte kromosomale og/eller utenom kromosomale DNA sekvenser. F.eks. kan de ytterligere DNA sekvensene stamme fra (eller bestå av) plasmid-DNA, slik som bakterielt eller eukaryot plasmid-DNA, virus-DNA og/eller kromosomalt DNA, slik som kromosomalt DNA fra bakterier,

gjær eller høyere eukaryoter.

Fortrinnsvis bærer de ytterligere DNA sekvensene et start-punkt for gjær-replikasjon og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybrid vektorer som inneholder et start-punkt for. aiær-replikasjon, f.eks. det eller de kromosomale autonomt replikerende segment(er), oppbevares utenfor kromosomene i gjærcellene etter transformasjon og replikeres autonomt etter mitose- Hybrid vektorer som inneholder sekvenser som er homologe med gjær 2|i plasmid-DNA, kan også brukes. Disse hybrid vektorene vil bli integrert ved rekombinasjon inn i 2(i plasmider som allerede er tilstede i cellen, eller vil replikere autonomt. 2\ x sekvenser er særlig egnet for høy-frekvente transformasjons-plasmider og kan fremkalle høye kopiantall.

I tillegg kan hybridvektorene ifølge oppfinnelsen omfatte

en DNA sekvens av et gen som er tilstede i kromosomet til vert-gjæren (f.eks. PH05), hvis promoter kan være knyttet til det kodende området for gjær- eller ikke-gjær polypeptidet. Ved hjelp av den homologe sekvensen kan hele vektoren innføres stabilt i vert-kromosomet ved rekombinering. Under formering vil følgelig avkom-cellene beholde det innførte genetiske materialet selv uten selektivt press.

Med hensyn til den selektive gen-markøren for gjær, kan

et hvilket som helst markør-gen brukes som letter utvelgelsen av transformanter på grunn av fenotype ekspresjonen av mar-køren. Passende markører for gjær er særlig de som uttrykker antibiotisk resistens eller, i tilfellet med auksotrofe gjærmutanter, gener som utfyller vertskaper. Tilsvarende

gener gir f.eks. resistens mot det antibiotiske cykloheksi-midet eller sørger for prototrofi i en auksotrof gjærmutant,

f.eks. URA3-, LEU2-, HIS3 eller TRPl-genet. Det er også mulig å anvende som' markører strukturelle gener som er forbundet med et autonomt replikerende segment under forutset-ning av at verten som skal transformeres, er auksotrof for produktet uttrykt av markøren.

Fordelaktig kan de ytterligere DNA sekvensene som er tilstede i hybrid vektorene ifølge oppfinnelsen, også omfatte et replikasjonsstart-purikt cg en selektiv . genetisk markør for en bakterievert, særlig Escherichia coli. Det foreligger nyttige trekk som er forbundet med nærværet av et replikasjonsstart-punkt fra E.coli og en markør fra E.coli i en gjærhybrid vektor: For det første kan store mengder av DNA fra hybrid vektoren erholdes ved dyrking og forøkning i E.coli, og for det andre, gjøres oppbyggingen av hybridvektorer bekvemt i E.coli ved å gjøre bruk av hele repertoaret av kloningsteknologi basert på E.coli. Plasmider fra E.coli, slik som pBR322 og lignende, inneholder både replikas jonsstart-punkt fra v E.coli og genetiske markører fra E.coli som gir resistens mot antibiotika, f.eks. tetracyklin og ampicillin, og anvendes- fordelaktig som- en del av de hybride gjær vektorene.

De ytterligere DNA-sekvensene som f.eks. inneholder start-punkt for replikasjon og genetiske markører for gjær, og en bakteriell vert (se ovenfor) henvises heretter til som "vektor" som sammen med PH05 sur fosfatase promoteren og det kodende området for gjær- eller ikke-gjær-polypeptid danner en hybrid vektor ifølge oppfinnelsen.

De hybride vektorene kan fremstilles ved fremgansmåter som er kjent innen teknikken, f.eks. ved å innføre i en vektor DNA et DNA-fragment bestående hovedsakelig av den represerbare sure fosfatase (PH05) promoteren og et kodende område for gjær- eller ikke-gjær-polypeptid som kontrolleres av promoteren .

Passende kartlagt rettkjedet eller fortrinnsvis ringformet vektor DNA, f.eks. bakteriell plasmid DNA e.l. (se ovenfor), som i det minste har et restriksjonssted, fortrinnsvis to eller flere restriksjonssteder, kan anvendes. Fordelaktig inneholder vektoren allerede start-punkter for replikasjon og gen-markører for gjær og/eller en bakterievert. Vektoren spaltes ved å bruke en passende restriksjonsendonuklease. Det spaltede DNA bindes til DNA-fragmentet som inneholder promoteren for sur fosfatase, og til DNA-segmentet som koder for et gjær eller ikke-gjær-polypeptid. Før eller etter sammenknyttingen av promoteren og det kodende området for polypeptid (eller også samtidig), er det også mulig å innføre starpunktet for replikasjon og/eller markører for gjær eller en bakterievert. I alle tilfeller må restriksjons- og sammenknyttingsbetingelsene velges på en slik måte at det ikke er noen gjensidig påvirkning mellom de vesentlige funksjonene til DNA fra vektoren og til promoteren. Hybrid vektoren kan bygges opp trinnvis eller ved å binde sammen to segmenter som omfatter alle interessante sekvenser.

Det kan brukes forskjellige teknikker for å knytte sammen DNA segmenter in vitro. Butte ender (dobbelt-DNA som er fullstendig baseparret) fremstilt ved hjelp av visse restriksjons endonukleaser kan bindes sammen direkte med T 4 DNA ligase. Oftere knyttes DNA-segmenter sammen gjennom sine enkjedede kohesive ender og lukkes kovalant ved hjelp av en DNA-ligase, f.eks. T 4 DNA-ligase. Slike enkjedede "kohesive ender" kan dannes ved å spalte DNA med en annen type endonukleaser som gir overhengende ender (de to kjedene i den doble DNA spaltes på forskjellige punkter med en inn-byrdes avstand på noen få nukleotider). Enkle kjeder kan også dannes ved tilføyelsen av nukleotider til butte ender eller overhengende ^ ender ved å bruke terminal transferase ("homo-polymer haledannelse") eller ved ganske enkelt å forkorte en kjede i et buttendet DNA-segment med en passende ekso nuklease, slik som x-eksonuklease. En ytterligere fremgangsmåte for fremstillingen av overhengende ender består i å binde til det buttendede DNA-segmentet en kjemisk synte-

tisert kobler-DNA som inneholder et gjenkjenningssted for

en endonuklease som danner overhengende ender og bryte opp den resulterende DNA med den respektive endonuklease.

For å bli fullgodt uttrykt, må genet som koder for et gjær-eller ikke-gjær protein være korrekt plassert med hensyn

til sekvenser som inneholder funksjoner for transkripsjon (promoter for sur fosfatase) og translasjon (ribosombind-ende steder). For det første må sammenbindingen av DNA-segmentet som omfatter promoteren, til det kodende området for polypeptid utføres i den rette orientering. Dersom

to orienteringen er mulig, kan den korrekte bestemmes ved hjelp av konvensjonell restriksjonsanalyse. Hybrid vektorer som inneholder et ukorrekt orientert gen-innskudd, kan orienteres på nytt ved å fjerne gen-innskuddet med en passende restriksjons endonuklease og på nytt binde genet inn i hy-bridvektorfragmentet. I alle tilfeller kan ukorrekt orientering unngås ved å binde to DNA-segmenter, hver med forskjellige restriksjonssteder ved endene. Videre bør oppbyggingen av hybrid vektoren gjøres på en slik måte at den

gir korrekt oppstarting og avslutning av transkripsjon.

Med hensyn til det siste punktet, bør transkripsjonsproduktet fortrinnsvis ende opp i en DNA7 sekvens' utvunnet., fra kromosomalt DNA fra gjær eller 2\ i plasmid fra gjær. Fordelaktig ender transkripsjons-produktet i en DNA-sekvens som inneholder avslutningssignaler for transkripsjon fra gjær PH05-genet. For det andre må det opprettes en korrekt leseramme. Vanligvis er både nukleotidsekvensen for promoterområdet og for det polypeptid-kodende området kjent før sammenbinding, eller kan lett bestemmes (f.eks. (15)), slik at det ikke er problemer med å opprette den korrekte leserammen. I tillegg kan det være behov for spesifikke sekundære DNA-strukturer for ennå mer effektiv ekspresjon av genet.

Et foretrukket område for å knytte sammen promoteren for PH05 sur fosfatase med en fremmed kodende sekvens, er mellom det viktigste mRNA startpunktet for sur fosfatase og startkodonet ATG-en for det kodende området for sur fosfatase, innenfor en strekning på ca. 40 bp mellom det viktigste mRNA start stedet i PH05 og ATG-en til det kodende området for sur fosfatase i PH05. For en sammenknytting i dette området bør den fremmede kodende sekvensen ha sin egen ATG for oppstarting av translasjon, ellers må den tilveiebringes av et syntetisk tilleggs-oligonukleotid.

Ettersom mange polypeptider hos høyere organismer først uttrykkes som 3-polypeptider bestående av signalpeptider festet til N-endene i de ferdige polypeptidene, kan det være nyttig å inkludere en signalsekvens i geninnskuddet.

Egnede signalsekvenser er de som naturlig er knyttet til polypeptidgenet som skal uttrykkes, eller til promoteren for sur fosfatase. Alternativt kan sammensatte signalsekvenser bygges opp ved å binde en del av signalsekvensen for sur fosfatase til en del av signalsekvensen for polypeptidet. Dersom den direkte ekspresjon av et ferdig polypeptid er ønsket, må signalsekvenser eller deler derav som eventuelt etterfølger promoter området, eller som eventuelt kommer foran det kodende området for ferdig polypeptid, fjernes, f.eks. ved nedbryting med en eksonuklease, f.eks. med Bal31.

Mellomprodukter, slik som vektorer som fremdeles mangler

en eller flere vesentlige funksjoner, likeså vel som de endelige hybridvektorene ifølge oppfinnelsen, kan transformeres inn i en bakterievert, særlig E.coli, av de ovenfor nevnte grunner (f.eks. produksjon av henholdsvis store mengder mellomprodukter og hybridplasmider). Bakterielle vektorer, slik som E.coli plasmidet pBR322 og de delene av dette som inneholder et bakterielt startpunkt for replikasjon og genmarkør(er), er av den grunn de mest foretrukne vektorer. Når man bruker en slik bakteriell vektor, omfatter sluttrinnene ved fremstillingen av de hybride gjærvektorene fortrinnsvis også innføringen av en genetisk markør og et startpunkt for replikasjon hos gjær.

DNA-segmenter som kan innføres i den bakterielle vektoren

for å fremstille hybridvektorene ifølge oppfinnelsen, slik som et autonomt replikerende segment (ars, jfr, (4)), sekvenser av gjær 2(j. plasmid (2) eller gjærmarkør-DNA (jfr. 16), kan isoleres fra henholdsvis kromosomalt DNA fra gjær og 2|j plasmid-DNA fra gjær på en vanlig brukt måte. Genet som koder for et gjær- eller et ikke-gjær polypeptid kan isoleres fra kromosomalt eller utenom kromosomalt DNA, utvunnet fra cDNA fremstilt via mRNA-linjen (se ovenfor) ved å bruke kjente teknikker (f.eks. 17, 18) eller det kan syntetiseres kjemisk.

Fremgangsmåten for fremstillingen av hybridvektorene omfatter følgende trinn: (1) Å bygge opp et S.cerevisia gen-bibliotek ved å bruke DNA fra villtypegjær, (2) Å isolere genet for PH05 sur fosfatase og klone det inn i et bakterieplasmid slik som pBR322, eller et biologisk funksjonelt, særlig et intakt opphavssted for replikasjon og seleksjonsmarkørholdig fragment derav,

(3) Å innføre i plasmidet en genetisk markør for gjær,

slik som TRPl-genet, og et opphavssted for replikasjon hos gjær, slik som et kromosomalt autonomt replikerende segment eller eventuelt 2\ i plasmidsekvenser fra gjær, i et passende restriksj onssted,

(4) Å innføre et DNA-segment som koder for et gjær- eller et ikke-gjær polypeptid, slik som human interferon eller HBV overflate antigen, på en slik måte at promoteren for PH05 sur fosfatase kontrollerer det polypeptid-kodende segmentet, og (5) Eventuelt å innføre en DNA-sekvens som inneholder avslutningssignaler for transkripsjon fra et gjærgen, f.eks. fra PH05, etter det kodende området for polypeptid.

Det er likeledes mulig å endre rekkefølgen av trinnene, slik som f.eks. trinnene 3-5, ved først å innføre det polypeptid-kodende segmentet og deretter innføre den genetiske markøren og opphavsstedet for replikasjon hos gjær i det rekombinante plasmidet erholdt som et produkt i trinn 2.

Før innføringen av en genmarkør for gjær, et opphavssted

for replikasjon i gjær og et polypeptidkodende segment,

kan eventuelt uvesentlige funksjoner, slik som det strukturelle genet for sur fosfatase, fjernes fra det rekombinante plasmidet erholdt i trinn 2.

Spesielt knyttes DNA-segmentet som koder for et gjær- eller ikke-gjær polypeptid, til promoteren for PH05 sur fosfatase (trinn 4) i området mellom det viktigste oppstartingsstedet til mRNA for sur fosfatase og ATG-en til det kodende området for sur fosfatase. Eventuelt innføres en syntetisk kobler som inneholder et passende restriksjonssted, for å gi en sammenknytting mellom DNA-segmentet og promoteren for sur fosfatase.

Mellomprodukt-hybrid vektorer som omfatter promoteren for S.cerevisiae FH05 sur fosfatase hos gjær, og som fremdeles mangler den kodende sekvensen for gjær- eller ikke-gjær polypeptid, er også

et formål ved foreliggende oppfinnelse og kan fremstilles ved de ovenfor nevnte, etter hverandre følgende trinn (1), (2), (3) og eventuelt (5), hvor promoteren for sur fosfatase fortrinnsvis avsluttes i området mellom det viktigste oppstartingsstedet til mRNA for sur fosfatase, og ATG-en til genet for sur fosfatase og/eller eventuelt innføres en syntetisk kobler som inneholder et passende restriksjonssted for å muliggjøre innføringen av et DNA-segment som koder for et gjær- eller ikke-gjær polypeptid. 3. Transformasjon av gjær med hybrid vektorer som inneholder promoterer for sur fosfatase hos gjær.

Et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse omfatter

en fremgangsmåte for fremstillingen av transformerte S.cerevisiae celler som er istand til å produsere gjær-eller ikke-gjær-polypeptider, idet fremgangsmåten omfatter å transformere S.cerevisiae med en av hybridvektorene ovenfor.

Transformasjonen av S.cerevisiae med hybrid vektorene kan utføres ved fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen, f.eks. ifølge fremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al., (1).

Denne fremgangsmåten kan deles opp i tre trinn:

(1) Fjerning av gjærcelleveggen.

(2) Behandling av de "nakne" gjærceller (sferoplastere)

med den transformerende DNA i nærvær av PEG (polyetylenglykol) og Ca^<+->ioner. (3) Regenerering av celleveggen og utvelgelse av de transformerte cellene i et fast agar-lag.

Foretrukne fremgangsmåter:

ad (1): Gjærcelleveggen fjernes enzymatisk ved å bruke forskjellige preparater av glukosidaser, slik som tarmsaft

(R)

fra snegler (f.eks. Glusulase ^ (reg. varemerke) eller

(R)

Helicase^ (reg. varemerke)) eller enzymblandinger erholdt fra mikroorganismer (f.eks. Zymolyase (^ 5) (reg. varemerke))

i osmotisk stabiliserte oppløsninger (f.eks. 1 M sorbitol).

ad (2): Gjær-sferoplastene klumper seg sammen i nærvær av PEG og det induseres lokale sammensmeltninger av de cyto-plasmiske membraner. Genereringen av "fusjons-lignende" tilstander er avgjørende og mange transformerte gjærceller vil bli diploide eller til og med triploide i løpet av trans-formasjonsprosessen. Fremgangsmåter som gir seleksjon av sammensmeltede sferoplaster kan brukes for å anrike transformanter, dvs. transformerte celler kan lett utsorteres blant på forhånd utvalgte sammensatte produkter.

ad (3): Ettersom gjærceller uten cellevegg ikke deler seg må celleveggen regenereres. Denne regenereringen gjøres ved å legge sferoplasterne i agar. F.eks. blandes smeltet agar (ca. 50°C) med sferoplasterne. Etter avkjøling av oppløsningen til dyrkingstemperaturer for gjær, (ca. 30°C), fås et fast sjikt. Dette agarlaget forhindrer hurtig diffusjon og tap av vesentlige makromolekyler fra sferoplasterne og letter derved regenereringen av celleveggen. Regenerering av celleveggen kan imidlertid også fåes (riktignok i mindre grad) ved å utplate sferoplasterne på overflaten av på forhånd fremstilte agarlag.

Regenereringsagaren fremstilles fortrinnsvis på en måte

som gir adgang til regenerering og utvelgelse av transformerte celler på samme tid. Ettersom gjærgener som koder

for enzymer til biosyntesespor for aminosyrer, er vanlig brukt som selektive markører (jfr. punkt 2), utføres regenereringen fortrinnsvis i minimal agar medium for gjær. Dersom det imidlertid kreves svært høye regenereringsgrader, kan en to-trinns fremgangsmåte være fordelaktig: (1) regenerering av celleveggen i et næringsrikt komplekst medium og (2) utvelgelse av de transformerte cellene ved replika-utplating av cellelaget på selekterende agarplater.

Dersom hybridvektoren ikke inneholder noe markørgen, kan

de transformerte cellene også identifiseres ved hjelp av alternative fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter omfatter f.eks. in situ hybridisering med et merket DNA-fragment som er homologt med deler av hybrid vektoren (f.eks. ifølge Hinnen et al., (1)), in situ immunoanalyser under forut-setning av at antistoffet til produktet av det innførte genet er tilgjengelig, eller andre utsorteringsmetoder som måler genproduktert kodet for av det eller de transformerende plasmid(ene).

Alternativt kan gjæren ko-transformeres med en hybridvektor ifølge oppfinnelsen og en annen vektor som inneholder en genetisk markør for gjær. Dersom de to forskjellige vektorene har DNA-sekvenser til felles (disse kan være bakterielle sekvenser som er tilstede i vektorene), kan det finne sted rekombinasjon som fører til et sammensatt, selekterbart hybridmolekyl.

Det er også beskrevet S.cerevisiae verter transformert med hybridvektorer som inneholder sur fosfatase (PH05) promoteren hos gjær og et kodende område for gjær- eller ikke-gj ær-polypeptid. 4. Dyrking av transformerte gjærceller og induksjon av polypeptid syntese.

I en varierende utstrekning.har gjærceller transformert med autonomt replikerende plasmider, f.eks. plasmider som inneholder 2\ i plasmid-DNA fra gjær, en tendens til å miste det innførte hybridplasmidet (jfr. 16)). Av denne grunn må slike gjærceller dyrkes under selektive betingelser,

dvs. betingelser som krever ekspresjon av et plasmid-innkodet gen for vekst. De mest selektive markører som er i vanlig bruk, er gener som koder for enzymer i aminosyre- eller purinbiosyntese. Dette gjør det nødvendig å bruke syntetiske minimalmedia som mangler den tilsvarende aminosyre eller purinbase. Imidlertid kan også noen gener som gir antibiotisk resistens, brukes (f.eks. gener som gir resistens mot cykloheksimid eller mot aminoglykosidet G 418 (21)). Gjærceller transformert med vektorer som inneholder gener for antibiotisk resistens, kan dyrkes i komplekse media som inneholder det tilsvarende antibiotikum, hvorved hurtigere veksthastigheter og høyere celletettheter kan oppnås.

Gjærceller transformert med DNA som integreres i kromosomene, krever ikke selektive vekstbetingelser. Disse transformerte cellene er tilstrekkelig stabile til å gi vekst uten selektivt press. Av den ovenfor nevnte grunn dyrkes disse cellene fordelaktig i komplekse media.

Gjærceller som inneholder hybrid plasmider med en konstitutiv promoter for sur fosfatase (f.eks. PH03) uttrykker genet for gjær- eller ikke-gjær protein som er tilknyttet promoteren, uten induksjon. Dersom imidlertid genet for gjær-eller ikke-gjær protein er under kontroll av den regulerte promoter for sur fosfatase PH05, må sammensetningen av dyrkingsmediet tilpasses for å oppnå maksimumnivåer av trans-krips jonsprodukter fra mRNA, dvs. dyrkningsmediet må inneholde lav konsentrasjon av uorganisk fosfat for å oppheve hemmingen av PH05-promoteren.'

5. Isolering og rensing av det uttrykte polypeptidet.

Et gjær- eller ikke-gjærpolypeptid, slik som human interferon eller HBV overflateantigen, kan også fremstilles ved følgende trinn: (1) Dyrke en S.cerevisiae stamme transformert med en hybrid vektor som inneholder sur fosfatase PH05 promoteren hos gjær og et kodende område for gjær- eller ikke-gjær-polypeptid, under passende næringsstoffbetingelser, og

(2) Isolere og rense polypeptidet.

De transformerte S.cerevisiae stammene dyrkes i et flytende medium som inneholder assimilerbare kilder for karbon og nintrogen og uorganiske salter.

Forskjellige karbonkilder kan brukes. Eksempler på foretrukne karbonkilder er assimilerbare karbohydrater, slik som glukose, maltose, mannitol eller laktose, eller et acetat som enten kan brukes alene eller i passende blandinger. Egnede nitrogenkilder omfatter f.eks. aminosyrer, slik som kasaminosyre, peptider og proteiner og deres nedbrytnings-produkter, slik som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, videre gjærekstrakter, maltekstrakt, maisstøpevæske, samt ammoniumslater, slik som ammoniumklorid, -sulfat eller --nitrat, som kan brukes enten alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter som kan brukes omfatter f.eks. sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magne-sium og kalsium.

I tillegg kan næringsmediet også inneholder vekstfremmende stoffer og/eller stoffer som utøver et seleksjonspress for å forhindre tap av hybridplasmidet. Vekstfremmende stoffer omfatter f.eks. sporstoffer, slik som jern, sink, mangan o.l., eller enkelte aminosyrer.

Dersom hybridplasmidet inneholder et gen som gir resistens mot et antibiotisk stoff, vil celler som inneholder et slikt hybridplasmid overleve i et medium supplert med det antibiotiske stoffet, mens celler som har mistet hybridplasmidet samt forurensende antibiotisk følsomme mikroorganismer,

ikke vil. Dersom hybridplasmidet inneholder et gen som tilveiebringer prototrofi i en euksotrof gjærmutant, f.eks. LEU2- eller HIS3-genet, kan det utøves et seleksjonspress

ved å unngå genproduktet, slik som leucin eller histidin,

i næringsmediet.

Dersom den dyrkede gjærstammen er blitt transformert med

et hybridplasmid som inneholder den regulerte promoteren for sur fosfatase PH05, må innholdet av uorganisk fosfat reduseres i næringsmediet etter forkulturfasen for å sikre maksimumnivåer av transkripsjonsprodukter fra mRNA og følge-lig maksimumutbytter av polypeptider.

Dyrkingen utføres ved å anvende vanlig brukte teknikker. Dyrkingsbetingelsene, slik som tempertur, pH i mediet og fermenteringstid, velges på en slik måte at det fremstil-

les maksimale nivåer med polypeptider. En utvalgt gjærstamme dyrkes fortrinnsvis under aerobe betingelser i submerg kultur ved rysting og omrøring ved en temperatur på ca. 25-35°C, fortrinnsvis ved ca. 30°C, ved en pH-verdi på fra 4-8, f.eks. ved omtrent pH 7, og i ca. 4-20 timer, fortrinnsvis inntil

det oppnås maksimumutbytter av polypeptider.

Etter at de transformerte gjærcellene er blitt oppdyrket

til en tilfredsstillende celletetthet, består det første trinnet i utvinningen av det uttrykte polypeptidet i å fri-gjøre polypeptidet fra det indre av cellen. Ved de fleste fremgangsmåter fjernes først celleveggen ved enzymatisk nedbrytning med glukosidaser, jfr. punkt 3. Deretter behandles de resulterende sferoplastere med detergenter, slik som Triton. Alternativt kan mekaniske krefter, slik som skjærkrefter (f.eks. X-trykk, fransk trykk) eller rysting med glasskuler, bruken for å bryte opp celler. Den resulterende polypeptid blanding kan anrikes med hensyn på det ønskede polypeptidet ved hjelp av vanlig brukte midler, slik som utfelling med ammoniumsulfat eller triklor eddiksyre,

gel elektroforese, dialyse, kromatografi, f.eks. ionebytter kromatografi, kromatografi basert på størrelse utelukkelse, HPLV eller omvendt fase HPLC, o.l. Sluttrensingen av det

på forhånd rensede produktet kan utføres f.eks. ved hjelp av antistoff-affinitetskromatografi. I prinsippet kan rense-trinnene (med unntak av lysen av cellene) utføres ifølge fremgangsmåten til Staehlin et al., (22) utviklet for rensingen av human leukocytt interferon.

F.eks. kan isoleringen og rensingen av det ønskede polypeptid utføres ved å bruke de følgende trinn:

(1) Lyse av gjærcellene med glukosidase,

(2) Behandling med en detergent,

(3) Fjerning av det meste av ikke-protein materialet ved behandling med polyetylenimin, (4) Utfelling av polypeptidene ved metning av oppløsningen med ammoniumsulfat,

(5) Dialyse i en passende bufferblanding,

(6) Kolonnekromatografi på DEAE-cellulose,

(7) Affinitetskromatografi på en kolonne med monoklonalt antistoff, og (8) Molekylær sortering på en passende Sephadex w (reg. varemerke)-kolonne.

For å oppnå et tilstrekkelig rent produkt, kan ytterligere rensingstrinn vise seg å være nødvendige, f.eks. kation-eller anion bytter kromatografi, adsorbsjon på hydroksyl-apatit, omvendt fase HPLC etc. På den annen side kan et eller flere av de ovenfor nevnte trinnene om mulig utelates eller rekkefølgen av trinnene kan endres.

I det tilfellet hvor det ønskede polypeptidet utskilles

av gjærcellen i det periplasmatiske rommet, kan det brukes en forenklet fremgangsmåte: Polypeptidet kan utvinnes uten cellelyse ved enzymatisk fjerning av celleveggen eller ved behandling med kjemiske midler, f.eks. tiolreagenser eller EDTA, som forårsaker ødeleggelser av cellevegg og lar polypeptidet bli frigjort. I det tilfellet hvor polypeptidet utskilles i dyrkingsvæsken, kan det utvinnes direkte der-fra .

Polypeptidene som lar seg erholde ifølge foreliggende oppfinnelse, er nyttige og verdifulle ved behandlingen av sykdommer hos mennesker og dyr, eller for å forhindre dem (f. eks. interferon, HBV overflate antigen, etc), eller de kan brukes som matvarer, for, foradditiver, eller ved enzymatiske reaksjoner (se pkt. 2 ovenfor). Det skal forstås at fremstillingen av naturlig forekommende derivater av polypeptidene, slik som proteolytisk spaltede polypeptider og/eller glykosylerte polypeptider, også omfattes av den foreliggende oppfinnelse.

Kort beskrivelse av tegningene.

I den påfølgende eksperimentelle del beskrives forskjellige utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse under hen-visning til tegningene hvor: Fig. 1 er et partielt restriksjons endonuklease kart for plasmidene pJDB207/PHO5, PH03 og pBR322/PH05Bam-Sal brukt henholdsvis som kilder for PH05-genet og til DNA-sekvensering. Fig. 2 viser lokaliseringen av PH05- og PH03-genene for sur fosfatase i et 5,1 kb stort BamHI-fragment isolert fra en gjærgen-bank. Fig. 3a og 3b gir DNA-sekvensene til promoterområdet i henholdsvis PH05 og PH03. Fig. 4 er et skjematisk diagram som viser oppbyggingen av plasmidene p30IFN1(8|) og p30LFN2'(8|). Fig. 5 illustrerer sammenbindingen av promoter-DNA-en fra PH05 med cDNA-en fra IFN-8| ved oppbyggingen av plasmid p301FNl(8j_) . Fig. 6 illustrerer skjematisk oppbyggingen av plasmid PJDB207/IFN2'(8£). Fig. 7 er en skjematisk skisse av oppbyggingen av rekombinante DNA-molekyler som inneholder cDNA fra Namalwa. Fig. 8 illustrerer skjematisk teknikkene brukt til å syn-tetisere den IFN-mRNA-spesifike 13-mere DNA-utgangsforbindel-sen. Fig. 9 er et skjematisk diagram som viser identifiseringen av kloner som inneholder cDNA for humant lymfoblastoid-IFN. Fig. 10-14 angir DNA og de tilsvarende aminosyresekvensene til cDNA-innskuddene i plasmidene CG-pBR322/HLycIFN-l'b, -P 1, -4^ -8£ og -51.

Fig. 15 skildrer oppbyggingen av plasmidet CG-pBR(AP)/ LyIFN-a-1 og fig. 16 viser DNA- og aminosyresekvensene til dets cDNA innskudd.

Flg. 17 skildrer oppbyggingen av plasmidet CG-pBR(AP)-LyIFN-a-3 og fig. 18 viser DNA- og aminosyresekvensene til dets cDNA innskudd. Fig. 19 viser DNA- og aminosyresekvensene til cDNA-innskuddet i plasmidet CG-pBR(AP)/LyINF-a-2. Fig. 20 er en skjematisk skisse av oppbyggingen av plasmid p31 som inneholder en avslutningsdel fra PH05. Fig. 21 viser nukleotidsekvensen til Sau3A-PstI avslutningsfragmentet for transkripsjon i PH05. Fig. 22 er en skjematisk skisse av oppbyggingen av plasmidene p31/IFl(51), p31/IF2(51), p31/IF3(51)/ og p31/ IF2(l'b). Fig. 23 er et skjematisk diagram som viser oppbyggingen av plasmidet p31/IF(8|). Fig. 24 illustrerer skjematisk oppbyggingen av et korrekt forbindelsespunkt mellom PH05 og og HBV i plasmid pBR322/ PH05/HBVsAl4. Fig. 25 viser DNA-sekvensen i nærheten av sammenbindings-punktet mellom PH05-promoter og kodende området for HBV

i plasmid pBR322/PH05/HBVs.

Flg. 26 er et skjematisk diagram som viser oppbyggingen

av ekspresjons plasmidene pJDB207/PHO5/HBVsAl4 og pJDB207/ HBVs 14t. Fig. 27 er et skjematisk diagram som viser oppbyggingen av ekspresjonsplasmidene pJDB207/IF2(1<1>b)A og pJDB207/ IF2(51)a72 hos gjær. Fig. 28 viser nukleotidsekvensene til plasmidene pJDB207/ IF2(51)a72 og pJDB207/IF2(5^A82 rundt Xhol-sammenknytningspunktet mellom det 3' ikke-oversatte området til IFN-5^

og avslutningsområdet for transkripsjon i PH05.

Fig. 29 er et skjematisk diagram som viser oppbyggingen av plasmid CD-pBR322/HLycIFN(a-3)-252. Fig. 30 viser strukturene til plasmidene CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 og CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258. Fig. 31 viser en skjematisk skisse av fremgangsmåten for utslettelse av PH05-signalsekvensen i ekspresjonsplasmid p31 og viser spesielt oppbyggingen av plasmid p31/R. Fig. 32 viser skjematisk samlingen av kloner erholdt ved fremgangsmåten skissert i fig. 31. Fig. 35 og 34 viser nukleotidsekvensene til BamHI-EcoRI-restriksjonsfragmentene som inneholder promoterområdene til PH05/R og PH05/Y. Fig. 35-37 viser skjematisk fremgangsmåten for innføring av IFN-a-3, -a-2 og -a-1 DNA i plasmid p31/R. Fig. 38 er et skjematisk diagram som viser oppbyggingen av plasmid pJDB207R/IF(a-3).

De følgende forkortelser er brukt i eksemplene:

EtBr : etidiumbromid

BSA : okseserum albumin

DTT : 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butandiol) EDTA : etylendiamintetra eddiksyre

SDS : natriumdodecyl sulfat

TNE : oppløsning som inneholder 100 mM NaCl, 10 mM

tris.HCl (pH 7,5), og 1 mM EDTA.

Tris.HCL : tirs-(hydroksymetyl)-aminometan, pH justert

med HC1.

PMSF: : fenylmetansulfonylfluorid

TE : oppløsning som inneholder 10 mM tris.HCl (pH

7,5) og 1 mM EDTA.

Eksempel 1.

Oppbygging av en gjærgen- bank.

30 |ig av hel DNA med høy molekylvekt fra gjær (23) fra villtype Saccharomyces cerevisiae stamme S288C inkuberes i 30 minutter ved 37°C med 2 enheter EcoRI metylase (New i 250 Ul EcoRI-metyleringsbuffer, slik som anbefalt av leverandøren. DNA utfelles med etanol, resuspenderes i 500 ui med 25 mM tris.HCl, pH 8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI<*> buffer) (24) og kuttes opp med EcoRI

inntil størrelsesfordelingen av DNA-fragmentene har et maksimum i området 30-50 kb (en Xhol-kutting av XDNA gir passende 33kb og 17 kb markører). Gjær-DNA kuttet under EcoRI<*->betingelser fraksjoneres etter størrelse på

en sukrosegradient (5-20% sukrose i 10 mM tris.HCl 7,5,

1 mM EDTA) i 6 timer ved 38 000 omdr./min i en SW 40 rotor. 30 fraksjoner på 0,4 ml hver samles opp fra toppen av gradi-enten. Fraksjon 16 inneholder DNA-fragmenter med 30-40

kb i størrelse. DNA-en fra denne fraksjonen (3 \ iq) utf elles

med etanol og sammenbindes i 16 timer ved 15°C i et totalt volum på 15 |il til et mikrogram kosmid-vektor pYcl (25), kobles rettkjedet med EcoRI. Sammenbinding utføres med 300

U T4 DNA-ligase ved å bruke buffer systemet [ beskrevet

.av leverandøren. DNA-en pakkes i in vitro inn i. bakteriofacr X (26) oq de ledsagende fagene brukes til å transdusere E.coli stamme HB101 (r~, m~, leu~, pro", recA . Transduksjonseffektiviteten er ca. 500 ampicillinresistente kolonier pr. |ig pYcl vektor. 3000 amp -

kolonier plukkes ut og dyrkes individuelt i brønnene på mikrotiter plater i LB-medium (10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto gjær ekstrakt / 10 NaCl) som inneholder 100 |ig/ml ampicillin.

Eksempel 2.

Isolering av det regulerte surfosfatase- genet PH05 .

Kopier av genbanken dyrkes på LB-agar plater (LB medium pluss 15g/liter agar) som inneholder 100 |ig/ml ampicillin. Cellematerialet fra 500 kolonier utvaskes fra platene og slåes sammen. DNA isoleres fra de enkelte forrådene ved å bruke følgende fremgangsmåter: Cellene høstes ved sentrifugering (Sorvall, GSA sentrifuge, 10 min ved 600 omdr./min, 4°C), resuspenderes i 100 ml TE (10 mM tris-HCl, ImM EDTA, pH 8,0) og sentrifugeres på nytt under de ovenfor nevnte betingelser. Cellepelleten resuspenderes i 3 ml Tsuc (50 mM tris-HCl, pH 7,5, 25% (vekt/ volum) sukrose) og overføres til SS-34 polypropylen Sorvall-rør. Alle etterfølgende trinn utføres på is: 0,3 ml lysozym oppløsning (10 mg/ml, 1 0 000 enheter A. ma) tilsettes,

etter 5 min tilsettes 1 ,2 ml . EDTA (500 mil, PH 8,0) og etter ytterligere 5 min tilsettes 4,-3 ml detergent (0,1% Triton X-100 , 50 mil EDTA, 50 mil Tris- HCl, pH 8,0). Etter 5 minutter sentrifugeres lysatet i en på forhånd nedkjølt SS-34 sentrifuge i 40 min ved 4°C. Superna-

tanten fjernes forsiktig og fast ScCl tilsettes (8,3 g CsCl til 8,7 ml supernatant). Etter tilsetning av etidiumbromid (sluttkonsentrasjon 1 mq/ml supernatant), overføres oppløsningen til 13,5 ml Quick Seal polyallomer-rør (Beckman) og sentrifugeres i en Beckman Ti50-sentrifuge i 40 timer ved 40 000 omdr./min. To fluorescensbånd kan synliggjøres ved hjelp av langbølget UV (366 nm). Det nederste båndet inneholder superoppkveilet plasmid-DNA som samles opp ved å stikke hull i siden av røret med en 2 ml sprøyte (18G-nål). Etidiumbromidet fjernes ved å ekstrahere 5 ganger med like store volumdeler isopropanol (mettet med CsCl)

og produktet overføres til 30 ml Corex-rør. 2,5 volumdeler TE tilsettes og DNA-en utfelles med etanol. Oppløsningen oppbevares deretter i 12-15 timer ved -20°C. Den utfelte DNA samles opp ved sentrifugering i en Sorvall HB-4-sentrifuge i 30 min ved 12 000 omdr./min ved 0°C og oppløses på nytt i 200 |al TE. 50-100 ug hybridplasmid-DNA utvinnes fra en kultur på 100 ml.

Plasmid-DNA fra disse forrådene brukes til å transformere S.serevisiae stamme AH216 (a, his3, leu3, pho3, pho5) ifølge fremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al. (1). Gjær-transformanter replika-utplates på magert P^-minimal medium (slik som "Difco gjær-minimal medium uten aminosyrer" supplert med 20 g/l glukose, men fremstilt ut fra bestanddelene ifølge oppskriften til Difco (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA) med unntak av at 0,03 g/l KH2P04

pluss 1 g/l KC1 brukes istedet for 1 g/l KH2P04) og farges for påvisning av sur fosfatase aktivitet ved å belegge dem med fargende agar (1% Difco agar i 100 mM acetatbuffer pH 4,0, 2 mg/ml "Fast Blue B "-salt (Serva) og 0,2 mg/ml a-naftylfosfat Kolonier med et funksjonelt PH05-gen farges rød etter opphevelsen av hemmingen av genet på magert P^-medium. Ved gjentatt sammenslåing av underenheter fra genebanken, ble det erholdt 3 uavhengige kloner som oppviste sur fosfataseaktivitet som lar seg hemme.

En av disse klonene (pG7) analyseres ytterligere. Hybridplasmidet har en størrelse på 42 kb. EcoRI og BamHI-fragmenter av pG7 subklones ihenholdsvis pBR322/HIS3 (16) og pJDB207 (28). Restriksjonsnedbrytningen er som anbefalt av leverandøren og sammenbindinger utføres i 20 ul med 150 U T4 DNA-ligase og 20 ug/ml av de enkelte nedbrutte plasmidene" (betingelser " slik som foreslått av New Enaland Biolabs) . Et 5,1 kb BamHI-fragment i-som er en del av et 8 kb EcoRI-fragment, subklones i gjærvektor pJDB207 og, etter transformasjon av gjær-stamme AH216, frembringer dette hybridplasmidet (pJDB207/PHO5, PH03, se fig. 1) høy fosfataseaktivitet under betingelser (PH05-gen) hvor hemmingen er opphevet (lav P-^-) og lave aktivitetsnivåer i normalt gjær-minimal medium (ekspresjon av PH03-genet).

Eksempel 3.

Lokalisering av PH05- og PH03- genene og DNA-sekvens analyse.

a. PH05- genet.

For lokaliseringen av PH03 og PH05 i BamHI-fragmentet benyt-ter man seg av mønsteret med Sau3A-restriksjonssteder og et unikt Pstl-sted. Oppkutting av BamHI-fragmentet med restriksjons endonuklease Sau3A gir 6 fragmenter (A-F, fig. 2)• Subklo<n>in<q> av en partiell Sau3A-oppkutting i BamHI-stedet hos selvreplikerende gjærvektor. pJDB207 fører til plasmider med forskjellige kombinasjoner av Sau3A-fragmenter. Disse plasmidene brukes til å transformere PH03, PH05 mutantgjæren S. cerevisiae AH216. Transformanter undersøkes med hensyn på sur fosfatase aktivitet etter vekst enten på plater med magert P^- eller normalt minimalmedium. Kloner som inneholder minst Sau3A-fragmenter A og B (fig. 2, nr. 1-4) uttrykker sur fosfatase på samme nivå (kvalitative anslag etter belegging med sur fosfatase-fargende agar, slik som beskrevet i eksempel 2), som hele 5,1 kb BamHI-fragmentet. Ekspresjon reguleres vanligvis ved konsentrasjonen av uorganisk fosfat i mediet. Kloner med bare Sau3A-fragment A (fig. 2 nr. 5, 6) uttrykker lave nivåer med sur fosfatse, som ikke påvirkes av konsentrasjonen av uorganisk fosfat i mediet. Dette indikerer at informa-sjon båret av Sau3A-fragmentet A er tilstrekkelig til konstitutiv ekspresjon av sur fosfatase (PH03). Sau3A-fragment B (fig. 2, nr. 7) fører ikke alene til noen ekspresjon av sur fosfatase, hverken under hemmede betingelser eller under betingelser hvor hemmingen er opphevet. En subklon med den fullstendige sekvensen mellom BamHI- og Pstl-stedene (fig. 2, nr. 10) oppviser imidlertid regulert, men ikke konstitutivt, syntese av sur fosfatase. Denne subklonen må derfor inneholde gjærgenet PH05 (16).

Den nøyaktige lokaliseringen av PH05-genet bestemmes ved DNA-sekvensering ved å bruke fremgangsmåten til Maxan og Gilbert (15). Et 623 bp BamHI-Sall restriksjonsfragment klones inn i plasmid pBR322 (se fig. 1), idet det erstatter BamHI-Sall fragmentet som strekker seg fra posisjon 375

til 650 (pBR322-nomenklatur), ved å bruke oppkuttings- og sammenbindingsbetingelser som beskrevet ovenfor. DNA-fragmenter fra BamHI-Sall DNA-innskuddet merkes asymmetrisk ved deres 5'-ender ?å "følgende steder: BamHI (-541)) Sau3A (-200)" oq Sali (<+>23), (med hensyn til nummereringen, se fig. 3a). Nukleotidsekvensen

til det 623bp store BamHI-Sall DNA-innskuddet er oppteg-net ifig. 3a. Den avslører at innskuddet inneholder promoterområdet til PH05 og en del av det kodende området for fosfa-taseprotein til PH05.

b. PH03- genet.

Den nøyaktige lokaliseringen av PH03-genet bestemmes ved DNA-sekvensanalyse ifølge håndboken "M13 cloning and DNA sequencing system", publisert av New England Biolabs. Et 416 bp (5') Pstl-Rsal(3')-fragment subklones i vektorer Ml3mp8 og Ml3mp9 (49), ved å bruke de eneste Pstl- og Smal-restriksjonsstedene. Nukleotidsekvensen til 416 bp Pstl-Rsal DNA-innskuddet er vist i fig. 3b. Den avslører at innskuddet inneholder promoterområdet til PH03 og en del av den kodende sekvensen forden kodende sekvensen for sur fosfatase til PH03.

Eksempel 4.

Konstruksjon av plasmid p30 ( se fig. 4).

a) Eliminering av Ball- restriksjonsstedet i plasmid pBR322. Skjemaet som er skissert i fig. 4 krever eliminering av

det eneste Ball-restriks jonsstedet i plasmid pBR322. 3 [ iq pBR322 gjøres til gjenstand for fullført oppkutting med restriksjonsendonukleaser Ball (BRL) og PvuII (Biolabs) ifølge anbefalingene til leverandørene. Den doble oppkuttingen av pBR322 med Ball/PvuII resulterer i to restrik-sjonsfragmenter på 3738 bp og 622 bp i størrelse. De to fragmentene adskilles på en 1% lavsmeltende agarosegel (Sigma) i i TBE (90 mM tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM EDTA, 90

mM borsyre)-buffer. DNA-båndene farges med etidiumbromid og synliggjøres under langbølget UV-lys ved 366 nm. Aga-rosestykket som inneholder det 3738 bp store fragmentet skjæres ut av gelen, smeltes ved 65°C, justeres til 500

mM NaCl og inkuberes ved 6 5°C i 2 0 minutter. En volumdel fenol (ekvilibrert med 10 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA,

500 mM NaCl) tilsettes. Den vandige fasen ekstraheres to ganger med fenol og en gang med kloroform. DNA utfelles med 2,5 volumdeler kald absolutt etanol og samles opp ved sentrifugering. DNA-pelleten vaskes med kald 80% etanol og tørkes deretter under vakuum. DNA resuspenderes i TE i en konsentrasjon på 0,15 mg/ml.

Det isolerte 3738 bp DNA fragmentet har to butte ender som skyldes den doble oppkuttingen med Ball og PvuII. DNA gjøres ringformet ved buttende-sammenbinding. 0,6 |ig DNA inkuberes over natten ved værelsestemperatur i 3 0 ul 60

mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP og

900 enheter med T4 DNA-ligase. 5 ul alikvoter av sammenbindingsblandingen tilsettes til 50 ul kalsiumbehandlede, transformasjonskompetente E.coli HB101 celler, fremstilt ved fremgangsmåten til Mandel et al., (29). Blandingen oppbevares på is i 5 minutter, deretter inkuberes den i 2 minutter ved 37°C og hensettes 10 minutter ved værelsestemperatur før utplating på LB-agar plater som inneholder 100 ug/ml ampicillin. 6 amp. kolonier plukkes ut og dyrkes hver for seg i 100 ml LB-medium (slik som ovenfor, men uten agar) som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles fra cellene ved å bruke fremgangsmåten beskrevet 1 eksempel 2. Restriksjonsoppkuttinger med Haelll (levert av Biolabs, oppkuttingsbetingelser som foreslått av lever-andør), PvuII og Ball av plasmidene analyseres på en 1,5% agarosegel i TBE-buffer. Restriksjonsmønsteret og den forut-sagte størrelse av det nyedannede, sammenknyttede fragmentet indikerer at plasmidene er identiske og inneholder alle pBR322-sekvensene med unntak av Ball - PvuII -fragmentet. Disse plasmidene mangler Ball-restriksjons-stedet og betegnes som pBR322ABalI. b) Kloning av et 5, 1 kb BamHI restriksjonsfragment fra gjær som inneholder PH05 og PH03 inn i pBR322ABalI. pJDB207/PHO5, PH03 (se fig. 1) inneholder et 5,1 BamHI-innskudd fra gjær med genene for regulert og konstitutiv sur gjærfosfatse (PH05 og PH03). pJDB207/PHO5, PH03 samt plasmid pBR322ABalI kuttes opp med restriksjons endonuklease BamHI. Etter fullført oppkutting, inaktiveres enzymet i 2 minutter ved 65°C. Begge DNA-er utfelles med etanol og resuspenderes i 10 mM tris-HCl pH 8,0 i en konsentrasjon på 0,2 mg/ml hver. 0,5 ug av hver av de to BamHI-oppkuttede DNA-er føres sammen og bindes sammen i 20 ul sammenbindings-buffer (slik som foreslått av New England Biolabs), som inneholder 300 enheter T4 DNA-ligase, i 20 timer ved 15°C.

5 ul alikvoter av sammenbindingsblandingen tilsettes til

50 ul kalsiumbehandlede E.coli HBlOl-celler og transformasjon utføres slik som beskrevet i eksempel 4a. De trans formerte E.coli cellene undersøkes med hensyn på resistens mot ampicillin og tetracyklin. 8 amp R . tet S-kolonier isoleres og dyrkes i 100 ml LB-medium som inneholder 1000 ug/ ml ampicillin. Plasmid-DNA isoleres fra cellene (se eksempel 2). Restriksjonsoppkuttinger med BamHI viser at 4 plasmider inneholder et 5,1 kb stort innskudd ved siden av det 3,7

kb store vektorfragmentet (pBR322ABall). Restriksjonsoppkuttinger med Sali bestemmer oritenteringen av det innskutte 5,1 kb store fragmentet: to plasmider har innskuddet orientert slik som vist i fig. 4. Et av dem betegnes p30. Retningen for transkripsjon av PH05, PH03-genene i det 5,1 kb store innskuddet er mot urviseren,

slik som indiksert i fig. 4.

Eksempel 5.

Innføring av fremmed- DNA i p30 ( se fig. 4).

a) Isolering av et 3, 9 kb EcoRI- Ball- fragment fra p30 ( fragment A).

10 ug p30-DNA kuttes opp med restriksjons endonuklease Ball. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform, utfelles DNA-en med etanol. DNA-en resuspenderes i 100 ul TE-buffer. Restriksjonsfragmentene adskilles på en preparativ 0,8% lavsmeltende agarosegel (Sigma). Et 5,1 kb fragment som inneholder vektordelén av p30, elueres fra gelen slik som beskrevet i eksempel 4a. DNA-en renses ved å adsorbere DNA-en på

en DE52 (Whatman) ionebytter kolonne i en buffer med lavt saltinnhold (150 mM NaCl, 10 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) og deretter å eluere den med en bufferoppløsning med høyt saltinnhold (1,5 M NaCl, 10 mM tris.HCl pH 8,0 og 1 mM EDTA). DNA-en utfelles med etanol og kuttes videre opp med EcoRI

Det 3,9 kb store EcoRI-Ball- restriksjonsfragmentet utsepareres, igjen på en preparativ 0,8% lavsmeltende agarosegel, utvinnes som beskrevet i eksempel 4a og utfelles med etanol. Dette DNA-fragmentet kalles fragment A. b) Isolering av et 602 bp stort Haelll- EcoRI fragment fra CG- pBR322/ HLycIFN- 8|( fragment B).

E.coli Stamme HB-101 CG-pBR322/HLycIFN-8| (se eksempel 10E) dyrkes i 100 ml LB-medium supplert med 10 ug/ml tetracyklin og plasmid DNA isoleres slik som beskrevet i eksempel 2. 9 ug HLycIFN-8| -DNA utsettes for fullført oppkutting med restriksjons endonuklease Haelll. Restriksjonsfragmentene adskilles på en preparativ 0,8% lavsmeltende agarosegel.

Et 940 bp HaeIII-fragment skjæres ut og elueres fra agarosegelen slik som beskrevet i eksempel 4a. DNA-en renses på DE52 slik som beskrevet i eksempel 5a og deretter kuttes

den ytterligere opp med EcoRI. Det 602 bp store EcoRI-Haelll-fragmentet utsepareres, på nytt på en preparativ 0,8% lavsmeltende agarosegel, utvinnes slik som beskrevet 1 eksempel 4a og utfelles med etanol. Dette DNA-fragmentet kalles fragment B.

c) Sammenbinding av fragmentene A og B ( se fig. 5).

De to restriksjonsfragmentene kan bindes sammen enzymatisk

henholdsvis via de utstikkende EcoRI-endene og de butte Ball- og Haelll-endene, hvorved det fremstilles et ringformet molekyl med et eneste EcoRI-sted og et Ball-Haelll-sammen-knytningspunkt som er spaltbart med Haelll (men ikke med Ball).

Sammenbindingen utføres i et buffersystem som inneholder

60 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP,

300 enheter med T4 DNA-ligase i 16 timer ved 23°C med en DNA-konsentrasjon på 2 0 ug/ml av fragment A og 3 ug/ml av fragment B i et totalt volum på 10ul.

d) Transformering av E. coli HBI01 med de sammenbundne fragmentene. 2 ul alikvoter av den sammenbundne blandingen (se eksempel 5c) tilsettes til 50 ul kalsiumbehandlede E.coli HBlOl-celler (se eksempel 4a). Blandingene utplates deretter på LB-agar-plater supplert med 100 ug/ml ampicillin. Platene inkuberes ved 37°C i 16 timer. Det fremstilles ca. 300 ampicillin resistente kolonier av E.coli HB101. Plasmid-DNA fra 8 ampicillinresistente kolonier isoleres, analyseres og deres struktur bestemmes ved sammenligning av flyttbarheten for restriksjonsfragmentene erholdt etter spalting med EcoRI

og Haelll med standard DNA (X DNA fra bakteriofag oppkuttet med Hindlll, plasmid-DNA fra p30 oppkuttet med Haelll og EcoRI. Etter bekreftelse av strukturen i sammenknytningspunktene, erholdes 5 plasmider som har den korrekte struktur. Et av disse plasmidene, som inneholder PH05-promoteren knyttet til det kodende området for 8|-interf eron polypeptid (se fig. 5), kalles p30IFNl ( 8 j_) .

Eksempel 6.

Tilføyelse av opphavssted for replikasjon og selektiv markør for gjær ( se fig. 4). a) Isolering av et 1, 5 kb EcoRI- fragment fra plasmid Yrp7 og dets innfelling i plasmid p30LFN1( 8^).

For å lette sammenbindingsreaksjonen, renses det 1,5 kb store EcoRI-restriksjonsfragmentet. Plasmid Yrp7 (4) kuttes med EcoRI, de to erholdte fragmentene adskilles på en 0,8% agarosegel og det 1,5 kb store fragmentet som inneholder et autonomt replikerende segment fra gjær og TRPl-genet fra gjær, renses og isoleres slik som beskrevet i eksempel 4a. Sammenbinding utføres (slik som foreslått av New England Biolabs)med 20 ug/ml EcoRI-oppkuttet p30IFNl(8p og 10 ug/ ml av det 1,5 kb store EcoRI-restriks jonsf ragmentet fra Yrp7, det brukes 100 enheter T4-ligase. b) Transformering av E. coli JA 194 med de sammenbundne fragmentene.

Plasmider som inneholder gjærgenet TRP1, er direkte selek-terbare ved transformasjon av mutantstammen E.coli trpC

JA 194 (trpC, leuB, Bl). trpC-genet til E.coli koder for E.coli N-(5'-fosforibosyl)-antranilat isomerasen. E.coli trpC-mutanter kan suppleres med TRPl-genet fra gjær (4). Transformasjon av E.coli stamme JA 194 utføres som beskrevet for E.coli HB101 (se eksempel 4a) med unntak av de følgende modifikasjoner: før utplating av blandingene på agar-plater, oppdyrkes cellene i 1 ml LB-medium ved 37°C i 60 minutter, cellene vaskes en gang med E.coli M9 minimal medium (30)

og plates ut på M9 minimal medium plater supplert med vitamin Bl (1 ug/ml) og L-leucin (20 mg/ml). Platene inkuberes

i to dager ved 37°C. Det fås omtrent 1000 tryptofan-prototrofe kolonier av E.coli.

c) Isolering og karakterisering av hybrid plasmider. Trp<+->kolonier renses på LB-plater supplert med 100 ug/ml

ampicillin. Enkeltkolonier plukkes ut og plasmider isoleres slik som beskrevet i eksempel 2. Rensede plasmider analyseres ved å måle størrelsen av restriksjonsfragmentene som er frembragt etter spalting med EcoRI, Hindlll, Pstl og Bglll. To forskjellige typer plasmider erholdes

som inneholder det 1,5 kb store EcoRI-restriksjonsfragmentet i de to mulige orienteringene (se fig. 4). De kalles p30IFN2(8|) og p30IFN2'(8|) slik som angitt i fig. 4.

Eksempel 7.

Transformering av Saccharomyces cerevisiae RH971 og induksjon av interferon produksjon.

Plasmider p30IFN2(8|) og p30lFN2'(8|) innføres hver for

seg i Saccharomyces cerevisiae stamme RH971 (a, trpl, leu2, his4) i samsvar med det som er beskrevet av Hinnen et al., (1). 1 ug plasmid-DNA tilsettes til 100 ul av en sferoplast-suspensjon og blandingen behandles med polyetylen glykol slik som beskrevet (1). Sferoplastene blandes med 10 ml regenereringsagar og plates ut på plater med gjær-minimal medium uten leucin. Etter inkubering i 3 dager ved 30°C, fås det ca. 1000 transformerte celler.

En enkelt gjærkoloni fra gjærtransformasjonsplatene (kalt

Saccharomyces cerevisiae RH97l/p30IFN2 ( 8|) og /p30IFN2'(8^) henholdsvis) overføres til 10 ml gjær-minimalmedium i en 100 ml Erlenmeyer kolbe og dyrkes ved 30°C ved 200 omdr./min i 24 timer inntil en tetthet på ca. 2-3 ganger 10^ celler/ml. Cellene vaskes 1 gang med 20 ml lav-P^ minimal medium. 3 ml av de resuspenderte cellene brukes til å inokulere henholdsvis 300 ml lav-P^ minimal medium og 300 ml normalt minimalt medium i 1000 ml Erlenmeyer kolber. Inkuberingen skjer ved 30°C ved 160 omdr./min. Induksjon av PH05-promoteren etterfølges av måling av fremkomsten av sur fosfataseaktivitet i hele celler, slik som beskrevet av Toh-e et al., (31). Cellene oppdyrkes til ca. 1-2x10 7 celler/ml (26-30 timer med inkubering).

Eksempel 8.

Fremstilling av gjærcelle ekstrakter og bestemmelse av interferon titeren.

Celler fra det 300 ml store dyrkningsmediet (se eksempel

7) i en tetthet på 1-2x10 /ml samles opp ved sentrifugering i en Sorvall GSA-sentrifuge i 5 min ved 8000 omdr./min ved 4°C. Cellene vaskes en gang med 100 ml I^O, resuspenderes i 6 ml isavkjølt lyseblanding (0,1 M kaliumfosfatbuffer,

PH 7,4, " 1 " volum-% Triton X-100, 0,00111 PI1SF) og overføres til et 30 ml corec-rør. Suspensjonen sentrifugeres på nytt i 5 minutter i en Sorvall SS-34 -sentrifuge ved 8000 omdr./min. ved 4°C og resuspenderes i 3 ml lyseblanding ved 0°C. 4 g glasskuler (0,4 mm i diameter) tilsettes til cellene og suspensjonen rystes på en Vortex-

blander ved full hastighet i 30 sekunder og avkjøles deretter "i 1 minutt på et isbad. Denne rystefremgangsmåten gjentas 5-10 ganger inntil mer enn 90% av cellene er brutt opp (kontroller under lysmikroskop). Celle-rester og glasskuler fjernes fra oppløsnin-gen ved sentrifugering i 10 minutter ved 8000 omdr./min.

ved 4°C i en Sorvall HB-4 sentrifuge. Supernatanten over-føres til Eppendorf-rør, nedfryses i flytende nitrogen og

lagres ved -60°C. Interferon aktivitet bestemmes ifølge fremgangsmåten til Armstrong (32) ved å bruke humane CCL-23 celler og viskulært stomatitis virus (VSV) som prøve-virus. Resultatene er oppsummert i tabell 1.

Tabell 1

Interferon aktivitet i Saccharomyces cerevisiae stamme RH971 etter transformasjon med de rekombinante plasmidene p30IFN2(8j_) og p30IFN2'(8|) henholdsvis, og også med plasmid pJDB207/ IFN2'(8.p (se eksempel 9).

Eksempel 9.

Innføring av interferon- genet i 2u gjærvektoren pJDB 207 ( se fig. 6), som gir høyt kopiantall.

Plasmid p30LFN2'(8|) kuttes opp med restriksjons endonukleasene Hindllll og BamHI ifølge spesifikasjonene til leveran-døren. Det frembringes to ■ fragmenter med størrelse 4,0 kb og 2,0 kb. Det 2,0 kb store restriksjonsfragmentet frasepareres og renses ved elektroforese på lavtsmeltende agarosegel, slik som beskrevet under trinn 4a.

Plasmid pJDB207 (28) kuttes opp med restriksjons endonukleasene Hindlll og BamHI. Det genereres 3 fragmenter. Det 6,5 kb store restriksjonsfragmentet frasepareres slik som ovenfor .

0,3 ug av det 2,0 kb store fragmentet (som inneholder PH05-promoteren knyttet til det kodende området for interferon protein) sammenbindes i løpet av 15 timer med det 6,5 kb store vektorfragmentet i et totalt volum på 20 ul ved å bruke 300 enheter T4 DNA-ligase under betingelser beskrevet av leverandøren (Biolabs). E.coli HB101 celler transformeres og ampicillinresistente kolonier velges ut. Plasmid-DNA-

en isoleres og den korrekte strukturen for den isolerte plasmid-DNA bekreftes ved restriksjonsoppkuttinger under anvendelse av Hindlll og BamHI, ved sammenligning med p30IFN2'(8|) og pJDB207 oppkuttet med de samme enzymene som molekylvektstandarder. Det erholdte, nye plasmidet kalles pJDB207/IFN2'(8|).

Plasmid pJDB207/IFN2'(8|) transformeres inn i S.cerevisiae stamme RH971 i analogi med det som er beskrevet (1) idet det selekteres for leucin prototrofe kolonier. En enkelt leucin prototrof gjærkoloni (kalt Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2'(8|)) plukkes ut og dyrkes som beskrevet

i eksempel 7. Interferon titeren bestemmes slik som beskrevet i eksempel 8. Resultatene er vist i tabell 1.

Eksempel 10.

Produksjon av E. coli stammer transformert med rekombinante plasmider som inneholder de kodende områdene for humane lymfoblastoid interferoner.

A. Isolering av poly( A) RNA anriket på HuIFN mRNA ( fig. 7).

a) Induksjon av Namalwa- cellene.

Namalwa-celler dyrkes i kulturmedium RPMI 1640 som inneholder

10% kalvefoster serum ved 37°C. Når en celletetthet på 3x10 6 celler/ml er nåodd, sentrifugeres suspensjonen ved

værelsestemperatur. De oppsamlede cellene resuspenderes i 200 ml med dyrkingsmedium som inneholder glutamin (0,027 volum-%), penicillin (200 enheter/ml) og streptomycin (50 ug/ml). Cellene inkuberes i 90 minutter ved 37°C med Newcastle sykdom-virus (NDV 110) i et forhold på 190 HAU/10<6 >celler (HAU:hemagglutineringsenheter). Ved å tilsette friskt kulturmedium justeres celletettheten til 1,3 x 10 celler/ ml og cellesuspensjonen rystes ved 34°C ved 100 omdr./min. Etter 12 timer høstes 6 x 10 9 celler og resuspenderes i 50 ml fosfatbufret saltvannsoppløsning ("PBS"; 1 liter PBS inneholder 80 g NaCL, 2 g KC1, 14,4 g Ha2HP04 og 2 g KH2P04). Før høsting av cellene, fjernes en prøve og interferon-aktiviteten bestemmes ifølge fremgangsmåten til Armstrgon (32) ved å bruke humane CC1-23 celler og vesiku-lart stomatitis virus (VSV) som prøve-virus. Det påvises 4300 IFN-enheter/ml. b) Oppbryting av cellene og deproteinisering.

Cellesuspensjonen (6x10 9 celler i 50 ml PBS) tilsettes ved

værelsestemperatur til 800 ml lysebuffer bestående av 0,05M tri.HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA og 2% SDS (krystal-linsk, forskningsgrad, Serva). Lysatet nedbrytes med 0,2 mg/ml på forhånd inkubert (2 timer ved 37°C) protease (protease P, type VI) Ved værelsestemperatur i 1 time : under omrøring av oppløsningen. Oppløsningen avproteiniseres ved å ekstrahere 3 ganger med 500 ml fenol mettet med TNE

og 5 g med 500 ml kloroform. Det erholdes 500 mg nuklein-syrer ifølge måling av absorbans ved 260 nm.

c) Fjerning av forurensende DNA og RNA.

Den lett viskøse, vandige oppløsning erholdt som beskrevet

ovenfor (trinn Ab) justeres til 0,3 M NaCl og 1 oligo(dT) cellulose tilsettes. Etter omrøring i 30 minutter ved værelsestemperatur. sentrifugeres suspensjonen i 1 liter Sorvall-flasker i en Sorvall SC-3 sen-

trifuae ved 4000 omdr./min i 10 minutter ved værelsestemperatur, og oligo(dT) celluloseoppslemmingen vaskes to ganger med 40 ml 2 x TNE som inneholder 0,5% SDS. Den bundne poly(A) RNA elueres deretter med 5 etter hverandre følgende utvaskinger med 2,5 ml H20. Utbyttet er 720 ug poly(A)

RNA bestemt ved å måle den optiske tetthet. Den supernatante RNA-oppløsningen fra den første adsorbsjonen adsoberes en andre gang til 1 g oligo(dT) cellulose og elueres som beskrevet ovenfor, hvorved man får 320 ug poly(A) RNA. Eluat-ene slås sammen, justeres til TNE og poly(A) RNA-en utfelles med 67% etanol ved -20°C i 10 timer. RNA-en samles opp ved sentrifugering ved 10 000 omdr./min i en Sorvall RC-

5B sentrifuge i 10 minutter ved 0°C. Bunnfallet (1 mg) oppløses på nytt i 1 ml 1 mM EDTA.

RNA-en analyseres med hensyn på HuIFN-mRNA-aktivitet ved injeksjon i oocytter fra Xenopus laevis på følgende måte: 50 ni av RNA-oppløsningen injiseres i hver av 20 oocytter. Oocyttene inkuberes i Barth-medium (2 mM tris, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM Ca (NC>3 ) 2 • H20, 0,41 mM CaCl2.2H20, 0,82

mM MgS04-7H20, 2,4 mM NaHC03, 0,01 mg/ml penicillin, 0,01 mg/ml streptomycin; oppløsningen justeres til ph 7,6 med HC1) ifølge Gurdon (33), Barth (34) og Colman et al. (35).

De injiserte oocyttene inkuberes i 42-48 timer og inkuba-sjonsmediet fjernes, sentrifugeres i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge, og supernatantene lagres ved -20°C eller -80°C inntil den brukes til analyse. IFN-aktiviteten måles i det vesentlige ifølge Armstrong (32) med unntak

av av VSV brukes som prøve-virus på Hep-2-celler (Flow Laboratories). Oocytt-ekstraktet har en spesifik aktivitet på 600 IU interferon pr. ug RNA injisert.

d) Anriking av poly( A) RNA for HuIFN mRNA.

Poly(A) RNA-en sendes gjennom en Chelex-100 kolonne (200-400 mesh, med et volum på 6,5 ml. Kolonnen skylles

med 1 ml 1 mM EDTA.

Eluatet (1 mg poly(A) RNA i 2 ml EDTA) oppvarmes i 2 minutter ved 100°C og utsettes for sentrifugering gjennom en sukkrose densitets-gradient (6 14 ml sukkrose oppløsninger med en økning i sukkrose konsentrasjonen fra 5% til 23% (m/v)

og som inneholder 50 mM tris.HCl (pH 7,5), 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA). Sentrifugeringen utføres i en TST 41 sentrifuge (Kontron AG) ved 35 000 omdr./min. i 16 timer ved 5°C.

0,3 ml store fraksjoner samles opp med en ISCO gradient oppsamler. 2 columdeler etanol tilsettes til hver fraksjon og oppløsningen hensettes i 10 timer ved -20°C. Den utfelte mRNA samles opp ved sentrifugering (Sorvall, HB-4 sentrifuge ved 0°C, 10 000 omdr./min. i 10 minutter). Bunnfallet fra hver fraksjon løses på nytt opp i 25 ul 1 mM EDTA og hver fraksjon analyseres med hensyn på human IFN mRNA-aktivitet slik som beskrevet ovenfor (trinn Ac), med unntak av at bare 10 oocytter injiseres pr. RNA-prøve istedet for 20. Resultatene er gjengitt i tabell 2.

Fraksjonene 23-29 slås sammen og poly(A) RNA-en renses videre på følgende måte:

Poly(A) RNA-oppløsningen justeres til 2 x TNE i 0,5% SDS

og tilføres en 200 ul oligo(dT) cellulose kolonne. Kolonnen vaskes ut med 2 ml av 2 x TNE i 0,5% SDS og poly(A) RNA-

en elueres ved 5 utvaskinger med 0,5 ml 1^0. Eluatet justeres til TNE og oppløsningen ekstraheres 2 ganger med et like stort volum fenol (mettet i TNE) og 2 ganger med et like stort volum kloroform. Poly(A) RNA-en utfelles med to volumdeler etanol ved -2 0°C i 10 timer og samles opp

ved sentrifugering i en HB-4 sentrifuge slik som beskrevet ovenfor.

Poly(A) RNA-en oppløses i 100 ul 0,5 mM EDTA. Utbyttet

er 40 ug bestemt ved å måle den optiske tetthet.

En del av poly(A) RNA-en analyseres med hensyn på human IFN-aktivitet slik som beskrevet ovenfor ved å bruke 20 oocytter pr. analyse. Poly(A) RNA-en -preparatet har en spesifik aktivitet på 8100 IE interferon pr. ug RNA.

B. Fremstilling av dobbeltkjedet cDNA ( fig. 7).

Poly(A) RNA anriket på HuIFN mRNA (se trinn Ad) brukes som en templett for å fremstille dobbeltkjedet cDNA i det vesentlige slik som beskrevet av Efstratiadis et al., (36), Maniatis et al., (37) og Hoeijmakers et al. (38).

a) Syntese av den første kjeden.

250 ul reaksjonsblanding som inneholder 40 mM tris.HCl (pH

7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl~, 0,5 mM DTT (Calbiochem.),

32

1 mM dGTP, dCTP, dTTP (P-L Biochemicals) og 1 mM P-dATP (Amersham, spesifik aktivitet 50 000 cpm/nmol), 20 ug/ml oligo(dT) 12-18 (p-L-B;i-ocnemicals) / 40 U9/ml poly(A) RNA

og 100. enheter fjærfe myeloblastosis-virus (AMV) omvendt transkriptase (Life Science, Inc., St. Petersburg, Florida) inkuberes i 80 minutter ved 37°C. Reaksjonen avsluttes ved å justere oppløsningen til 10 mM EDTA og 0,1% SDS. Blandingen ekstraheres 1 gang med 1 volumdel fenol. Den vandige fase ekstraheres på nytt med 1 volumdel kloroform og kjøres på en 3 ml kolonne .med Se<p>hadex G-50

(fin grad). 0,1 ml fraksjoner samles opp. Radioaktiviteten til hver fraksjon bestemmes ved å måle Cerenkov-strålingen. Radioaktive fraksjoner slås sammen og nukleinsyrene utfelles med 2 volumdeler etanol ved -20°C i 10 timer. Prøven sentrifugeres i en HB-4 sentrifuge i 20 minutter ved 10 000 omdr./min. ved 0°C. Bunnfallet oppløses i 95 ul f^O.

5 ul ION NaOH tilsettes og blandingen inkuberes ved 25°C

i 40 minutter. Etter nøytralisering med 5M eddiksyre, tilsettes 50 (il H2O og 2 volumdeler etanol, og prøven lagres ved -20°C i 10 timer. Bunnfallet samles opp ved sentrifugering slik som beskrevet tidligere, og oppløses på nytt i 200 ul 0,1 mM EDTA. Utbyttet av enkjedet cDNA er 3,7

ug. Størrelsen av cDNA-en er 700-1500 nukleotider i lengde, bestemt med grunnlag i dens elektroforetiske forflyttbarhet i en 6% polyakrylamid-gel i tris-borat-EDTA (108 g tris,

9,3 g dinatrium-EDTA og 55 g borsyre pr. 1 liter oppløsning ved pH 8,3) som inneholder 7M urea, i forhold til markør-DNA-er med kjent lengde (39).

b) Syntese av den andre kjeden og oppkutting med S^- endok- unklease. Den erholdte cDNA-oppløsning oppvarmes ved 100°C i 90 sekunder, avkjøles og inkuberes i en 400 pl reaksjonsblanding, omfattende 0,1 M kaliumfosfat buffer (pH 6,9), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dAPT, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, l mM <3>H-dGTP (spesifikk aktivitet 94.000 cpm/nmol) og 165 enheter/ml E.coli DNA polymerase I i 8 timer ved 15°C. Reaksjonen avsluttes ved å tilsette EDTA og SDS til slutt-konsentrasjoner på henholdsvis 10 mM og 0,1%. Blandingen ekstraheres med fenol og kloroform, kromatograferes over Sephadex G.50 (fin grad, 2 ml iojiebyttervolum) og etanol utfelles slik som beskrevet qvenfor (trinn Ba).

Den resulterende DNA behandles i en 50 pl inkuba-sjonsblanding som inneholder 0,25 M NaCl, 50 mM natriumacetat (pH 4,5) og 1 mM ZnSC>4 med 6 enheter S^ endonuklease ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonen stanses med 0,1% SDS og 10 mM EDTA. Reaksjonsblandingen avproteiniseres med 1 volumdel fenol (mettet i 50 mM natriumacetat, pH 4,5) og kloroform. Den vandige fase kromatograferes på en 2ml Sephadex G-50 (fin grad) kolonne i TNE. 100 pl fraksjoner samles opp og Cerenkov strålingen til hver fraksjon bestemmes. Fraksjonene som forkastes, slås sammen og DNA-en utfelles med 2 volumdeler etanol ved -20°C

i 10 timer, slik som beskrevet ovenfor. Utfellingen sentrifugeres i en HB-4 sentrifuge (se ovenfor) og det oppsamlede bunnfall oppløses i en 100 (il oppløsning som inneholder 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Det erholdes 4

ug DNA.

DNA-en fraksjoneres gjennom en sukrosedensitetsgradient (5-23%) i 50 mM tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA i en TST-60 sentrifuge. Sentrifugeringen utføres ved 55 000 omdr./min. i 5 timer ved 15°C. DNA, som sendimenterer hurtigere enn en markøs-DNA med 800 basepar, kjørt i en parallell gradient, slås sammen, justeres til TNE og utfelles med 67% etanol ved

-20°C i 10 timer. Det erholdes 0,4 pg dobbeltkjedet cDNA.

C. Fremstilling av pBR 322 - tilknyttet cDNA ( fig. 7).

a) Fremstilling av dCMP- forlengede cDNA.

3<1->enden i 0,1 ug av den erholdte ds cDNA forsynes med

poly(dC)-haler i et 10 ul stort reaksjonsvolum som inneholder 100 mM natrium kakodylat (pH 7,2), 2,5 mM CoC12, 50 ug BSA pr. ml, 1 mM DCTP og 10 enheter ende-deoksynukleotidyl transferase pr. pg ds cDNA. Etter inkubering (20 minutter ved 27°C), tilsettes EDTA til 10 mM, og prøven lagres ved -20"C inntil den brukes.

a) Fremstilling av Pst I- spaltet, dGMP- forlenget pBR 322.

10 ug plasmid-DNA fra pBR 322 kuttes opp med 10 enhter av

endonukleasen Pst I i en 100 pl oppløsning som inneholder 50 mM NaCl, 6 mM tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2,

6 mM 2-merkaptoetanol og 100 ug/ml gelatin i 1 time ved 37°C. Oppløsningen ekstraheres med 1 volumdel fenol og kloroform. Oppløsningen justeres til TNE og DNA-en som er gjort rettkjedet, utfelles med 2 volumdeler etanol ved

-20°C i 5 timer.

Plasmid-DNA-en som er gjort rettkjedet, forlenges med dGMP

i et 200 ul reaksjonsvolum som inneholder 100 mM natrium kakodylat (pH 7,2), 5 mM MgCl2, 20 mM NaH2P04, 50 ug BSA pr. ml, 1 mM dGTP og 100 enheter ende-deoksynukleotidyl transferase. Etter inkubering i 20 minutter ved 37"C, tilsettes EDTA til 10 mM og reaksjonsblandingen fryses ned ved -20°C inntil den skal brukes. c) Binding av dGMP- f orlengede pBR 322 til dCMP- f orlenget ds cDNA.

En blanding av dCMP-forlenget dobbeltkjedet cDNA (0,1 ug)

og dGMP-forlenget pBR 322 som er gjort rettkjedet (0,5 ug),

i 500 ul TNA-buffer inkuberes ved 65°C i 1 time, ved 46°C

i 1 time, ved 37°C i 1 time, og ved 20°C i 1 time. Oppløs-ningen som inneholder den pBR 322-tilkoblede cDNA, plasseres på is og brukes umiddelbart.til transformering.

D. Transformering av E. coli HB 101 med det sammenkoblede

hybridplasmid.

Kalsium-behandlet E.coli HB 101 fremstilles for transformering ved hjelp av fremgangsmåten til Mandel et al., (29).

10 ul av reaksjonsblandingen som inneholder de sammenkoblede pBR 322 hybridplasmid-DNA-ene fremstilt som beskrevet ovenfor (trinn Cc) tilsettes til en blanding som inneholder 150ul kalsium-behandlet E.coli HB 101 i 10 mM MgCl2, lOmM CaCl2

og 10 mM tris.HCl (pH 7,5) i et totalt volum på 200 ul.

Blandingen avkjøles i is i 20 minutter, varmes opp til 42°C

i 1 minutt og inkuberes ved 20°C i 10 minutter. 1 ml trypto-fanmedium (tryptonmedium som inneholder 10 g Bacto-Trypton

1 g gjærekstrakt; 1 g glukose; 8 g NaCl og 294 mg CaCl2.2H20 i 1 liter destillert vann) tilsettes, og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37'C ved rysting ved 300 omdr./min. Blandingen utplates på to agarplater (Mc Conkey-agar; 0,6 ml/plate) supplert med 10 pg/ml tetracyklin. Platene inkuberes ved 37°C i 12-17 timer. Det fremstilles ca. 5600 tetracyklin-resistente kolonier av transformert E.coli HB 101.

E. Identifikasjon av kloner som inneholder HuIFN cDNA.

a) Syntese av en 13- mer oligodeoksynukleotid-" primer" ( fig. 8). Et oligodeoksynukleotid som er komplementært til en strekning

på 13 nukleotider som både HuIFN-a^- og HuIFN-8 mRNA har til felles, syntetiseres kjemisk ved hjelp av fosfotriester-fremgangsmåten (jfr. Itakura et al., (40). de Rooij et al (41)). De enkelte trinnene i syntesen er skissert i fig.

8. Utgangsmaterialene angitt i linje 1 i fig. 8 (mono-

og dideoksynukleotider som bærer beskyttende grupper), er kjente fra litteraturen. Beskyttelsesgruppene avspaltes ved fremgangsmåten beskrevet av Itakura et al.: Frigjøringen av 5'monometoksytrityl (M)- eller -dimetoksytrityl (D)-substituerte hydroksylgrupper utføres med eddiksyre (80%)

ved værelsestemperatur, og 8-cyanoetylfosfat-gruppene avspaltes med 0,1 N natriumhydroksyd i dioksan-vann (4:1) ved værelsestemperatur. Kondenseringen av byggestenene gjennom-føres ved å bruke triisopropylbenzensulfonylklorid som et aktiverende middel for å bringe oligodeoksynukleotidene opp til den fullstendig beskyttede 13-mer-"primer" angitt i linje 7 på fig. 8. Det siste trinnet (fullstendig fjerning av alle beskyttelsesgrupper) oppnås på følgende måte: En oppløsning som inneholder 64,6 mg av det fullstendig beskyttede 13-mer oligodeoksynukleotidet i 3 ml dioksan og 1 ml acetonitril, behandles med 200 mg syn-p-nitrobenz-113 3

aldoksim og 124 mg N , N , N , N -tetrametylguanidin og hensettes i 27 timer. 10 ml ammoniakk (25%) tilsettes og oppløsningen lagres i 24 timer ved 50°C. Etter at oppløs-ningsmidlet er avdampet under vakuum, oppløses resten i vann, justeres til pH 4 med eddiksyre og oppløsningen ekstraheres 20 ganger med kloroform. Den vandige oppløsningen avdampes under vakuum og resten oppløses i 1 ml eddiksyre

(80%). Oppløsningen hensettes i 1 time, fortynnes med 6

ml vann, ekstraheres 3 ganger med kloroform og lyofiliseres. Den tredje del av det erholdte råproduktet renses ved kroma-tograf i på DEAE-Sephadex A 25 (kolonnestørrelse: 10.1,3

cm) gjennom en 200 ml 0,2-1,2 M trietylammonium bikarbonat-gradient. Eluering av hovedfraksjonen finner sted ved en gradientkonsentrasjon på 0,87 M. Hovedfraksjonen som består av det rene produktet ifølge en HPLC-prøve, avdampes 3 ganger med vann, filtreres gjennom 10 ml Dowex 50 W (NH^-salt)

og lyfiliseres. HPLC (permafase AAX, kolonnestørrelse 90. 0,3 cm, 60°C, 2 ml/min., gradient:A = 0,005 M KH2P04, B

= 0,5 M KH2P04, 0,5 M KC1, pH 4,5; 20% A — 100% B på 30 min.):tR 11,8 min.

32 b) Fremstilling av en - merket cDNA- sondeforbindelse som er spesifik for humant IFN- a og IFN- g ( fig. 9).

40 pmol av den syntetiske 13-mere oligodeoksynukleotid-

32

"primer" (jfr. trinn Ea) og 40 pmol av y- P -ATP (5700 Ci-mmol-<1>, bringe sammen i 100 pl 50 mM tris.HCl

(pH 9,5) , 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT 50 enheter med T4 polynukleotidkinase tilsettes og etter 30 minutter ved 37°C tilsettes ytterligere 20 enheter av enzymet, og inkubering fortsetter i ytterligere 15 minutter ved 37"C. Den vandige oppløsningen som inneholder den "^P-merkede "primer", renses ved fenolekstraksjon. Ytterligere rensing gjennomføres ved kromatografi på en kolonne med 4 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fin grad) i 1 mM tris-HCL (pH 8,0). 0,1 ml fraksjoner samles opp. Radioaktiviteten til hver fraksjon bestemmes ved å måle Cerenkov-strålingen. En spesifik aktivitet på 4-10<6 >Cerenkov cpm pr. pmol oligodeoksynukleotid erholdes. Den <32>P-merkede "primer" (40 pmol) lyofiliseres, resuspenderes i 91 ul H20 som inneholder 14 ug poly(A) RNA (fra indu-serte Namalwa-celler, fremstilt som beskrevet i trinn A)

og oppvarmes i 60 sekunder ved 100°C 9 ul 4 M KCl tilsettes og blandingen inkuberes ved 25°C i 60 minutter.

450 ul omvendt transkriptase-blanding tilsettes slik at

reaksjonsvolumet omfatter 40 mM tris.HCl (pH 8), 4 mM

MgCl2, 1 mM DTT 75 mM KC1, 1 mM hver av dATP, dGTP, dCTP, dTTP og 90 enheter omvendt transkriptase fra fjærkre myeloblastosis-virus (AMV). Inkuberingen forsettes i 1 time ved 37°C. Oppøsningen ekstraheres med 1 volumdel fenol (mettet i TNE) og nukleinsyrene utfelles med 2 volumdeler etanol ved -20°C i 10 timer. Utfellingen samles opp ved sentrifugering (HB-4-sentrifuge, 20 min., 10 000 omdr.|min., 0°C) og oppløstes i 20 ul farge-stoff blanding som inneholder 90% (volum|volum) formamid (Merck, pro analysis), 1 mM EDTA, 0,05% bromfenolblått og 0,05% cylencyanolblått. Prøven varmes opp ved 90°C i 2 minutter og tilføres en 5% polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA (jfr. Peacock et al., (39)). Et enkelt bånd som be-

32

veger seg mellom de267 bp og 435 bp store P-merkede markør-DNA-fragmentene erholdt fra Hae III-oppkuttingen av plasmidet pBR 322, er synlig på autoradiogrammet. Det 32

P-merkede cDNA-fragmentet ekstraheres fra gelen og renses som beskrevet av Mueller et al. (42). Det fås 20 000 Cerenkov cpm fra den <32>P-merkede cDNA-sondeforbindelsen

som er spesifik for humant IFN-a og IFN-B.

c) Utsortering av kolonier som inneholder HuIFN- cDNA ( fig. 9) 1650 av tansformantkoloniene fremstilt som beskrevet ovenfor,

(trinn D) overføres til nitrocellulosefiltere BA 85 (Schleicher & Schuell, 8 cm i diameter). Cellene lyses og deres DNA denatureres og fikseres til filtrene in situ, ifølge Grunstein og Hogness (20). Filtrene som bærer koloniene er på forhånd hybridisert i 4 x SET (en oppløsning som inneholder 0,15 M NaCl, 30 mM tris-HCl (pH 8,0), 1

mM EDTA), 0,1 % vekt/volum Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1% vekt/volum polyvinylpyrrolidon (PVP-360,Sigma), 0,1 volum/ volum BDA, 0,5% SDS, 50 ug/ml denaturert kalvetymus-DNA (fremstilt på følgende måte: 5 mg kalvetymus-DNA (type I, Sigma) kokes i 10 minutter i 0,5 M NaOH for å splitte DNA-en, nøytraliseres med 5 M eddiksyre og utfelles med 2 volumdeler etanol ved -20°C. Utfellingen samles opp ved sentrifugering i en HB-4-sentrifuge i 10 minutter ved 0°C og oppløses

på nytt i 500 ul 0,5 mM EDTA). Ved 65°C i 4 timer under anvendelse av 20 ml blandinger pr. filter og hybridiseres

3 32

med 10 Cerenkov cpm av den -P-merkede sondeforbindelsen pr. nitrocellulosefilter i 5 x SET, 0,02% (vekt/volum) Ficoll, 0,01% polyvinylpyrrolidon, 0,02% (volum/volum) BSA, 0,2%

SDS og 50ug/ml denaturert kalvetymus-DNA. Hybridiseringen utføres ved 65°C i 36 timer.

Filtrene skylles en gang i kloroform, to ganger i SET, 0,5% SDS ved værelsestemperatur og to ganger i SET, 0,5% SDS

i 1 time ved 60°C og en gang med 3 mM Trizma-base ved værelsestemperatur i 1 time. Filtrene tørkes ved oppsuging på 3 MM-papir, og en røntgenfilm eksponeres mot filtrene ved å bruke et raster (Ilford forsterkningsraster) ved -80°C i 72 timer.

Ni positive kolonier identifiseres på autoradiogrammet og brukes til videre undersøkelser.

Ettersom de primære klonene av transformerte celler av og

til inneholder mer enn en type rekombinante DNA-molekyler, isoleres hybridplasmid-DNA-ene fra de 9 positivt hybridiserte klonene og brukes til på nytt å transformere E.coli HB 101 slik som beskrevet tidligere.

Den hybride plasmid-DNA isoleres på følgende måte: En koloni brukes til å inokkulere 10 ml tryptonmedium, supplert med 10 ug/ml tetracyklin som beskrevet ovenfor i en 25 ml Erlenmeyer kolbe. Kulturen rystes i 15-18 timer ved 37°C ved 300 rpm. Cellene høstes ved sentrifugering (Sorvall, HS-4-sentrifuge, 10 minutter ved 4000rpm, 4°C). Ca. 0,1 g celler erholdes og resuspenderes i 1 ml 50 mM tris.HCl (pH 8,0). 0,25 ml lysozymoppløsning (10 mg/ml i 50 mM tris.HCl (pH 8,0), tilsettes, og etter inkubering ved 0°C i 10 minutter, tilsettes 0,15 ml, 0,5 EDTA (pH 7,5).

Etter ytterligere 10 minutter ved 0°C, tilsettes 60 pl 2% Triton X-100. Etter 30 minutter ved 0°C

sentrifugeres prøven i 30 minutter ved 15 000 rpm og 4°C

i en Sorvall SA-600-sentrifuge. Supernatahten avproteiniseres med 1 volumdel fenol (mettet i TNE). Fasene adskilles ved sentrifugering (Sorvall HB-4-sentrifuge) i 10 minutter ved 5000 rpm ved 4°C. Den øvre fase ekstraheres to ganger med 1 volumdel kloroform. RNAse A fra bukspyttkjertel (Sigma, 10 mg/ml i TNE, på forhånd oppvarmet 10 minutter ved 85°C) tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 25 ug/ml og blandingen inkuberes i 40 minutter ved 37°C. Oppløsningen justeres så til 1 M NaCl og 10% polyetylenglykol 6000 (Fluka, autoklavert i 20 minutter ved 120°C) og inkuberes ved -10°C

i 2 timer. Utfellingen samles opp i en Sorvall HB-4-sentrifuge (20 minutter ved 10 000 rpm, 0°C) og oppløses på nytt i 100 ul TNE. DNA-oppløsningen ekstraheres med volumdel fenol og DNA-en utfelles med 2 volumdeler etanol ved -80°C

i 10 minutter.

Utfellingen samles opp ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge og DNA-en oppløses på nytt i 20 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. 8-10 ug hybridplasmid-DNA utvinnes fra en kultur på 10 ml.

E.coli HB 101 transformeres med hver av ni isolerte hybrid-DNA-er og de transformerte cellene utplates på agarplater som inneholder tetracyklin slik som beskrevet tidligere (trinn D). Fra hver transformasjon, plukkes det ut 3 tetra-cyklinresistente kloner, det fremstilles 10 ml store kulturer og hybrid DNA-ene isoleres fra kulturene slik som beskrevet tidligere.

Alle DNA-prøvene før og etter retransformasjonen analyseres ved spalting med endonuklease Pst I og elektroforese gjennom en 1% agarosegel 50 mM tris.acetat (pH 7,8) og 1 mM EDTA. Alle prøvene fremviser identiske spaltingsmønstere før og etter retransformasjon.

En av de reklonede rekombinante DNA-molekylene gir to bånd, et med mobiliteten til Pst I-spaltet pBR 322, det andre med en mobilitet som svarer til ca. 1000 bp. Det betegnes CG-pBR 322/HLycIFN-l'b.

En annen rekombinant DNA gir 3 bånd, et med mobiliteten til Pst I-spaltet pBR 322, et med mobiliteten til ca. 600 bp og et med en mobilitet på ca. 150 bp. Det rekombinante DNA-molekylet i denne klonen er betegnet CG-pBR 322/ HLycIFN-B ^. d) Karakterisering av klonene CG- pBR 322/ HLycIFN- l' b og CG- pBR 322/ HLycIFN- E^.

De rekombinante plasmid-DNA-ene til klonene CG-pBR 322/ HLycIFN-11 b og CG-pBR 322/HLycIFN-[.^ isoleres fra kulturene slik som beskrevet ovenfor, (trinn Ec) og karakteriseres ved å fastsette nukleotidsekvensen til cDNA-innskuddet ved å bruke fremgangsmåten beskrevet av Maxam og Gilbert (15). Grovt sett brukes den følgende fremgangsmåte: Den isolerte rekombinante plasmid DNA kuttes opp med forskjellige restriksjons endonukleaser. Enzymene er ansett viktige som beskrevet av leverandøren (New England Biolabs), med unntak av at BSA erstattes med gelatin i enzym-bufferne. Oppløsningen som inneholder den oppkuttede DNA, avproteiniseres med fenol (mettet med TNE). DNA-en utfelles med etanol, oppløses på nytt i 50 mM tris-HCl (pH 8,0) ved en DNA-konsentrasjon på 50 ug/ml og inkuberes med 0,1 enheter alkalisk fosfatase fra klavetarmer

pr. pmol DNA 5'-ender i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved å varme opp oppløsningen i 60 minutter ved 65°C. DNA-en renses ved DEAE-cellulose-kromatografi som beskrevet av Mueller et al. (42) og utfelles med etanol. DNA-en merkes deretter i 5'-endene med [y- <32>P]-ATP (>5000 Ci/mmol, Amersham) og T4 polynukleotid-kinase (P-L-Biochemicals) i det vesentlige som beskrevet av Maxam og Gilbert (15) med unntak av at DNA-en ikke denatureres før kinasereaksjonen. Vanligvis når de

spesifike aktivitetene opp i 1-3,10 g cpm/pmol 5'-ender.

Demerkede DNA-fragmentene spaltes med en andre restriksjonsendonuklease og produktene adskilles ved elektroforese gjennom en 6%, 8% eller 10% polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA buffer. DNA-fragmentene ekstraheres fra gelen og renses som beskrevet av Mueller et al (42). For bestemmelse av nukleotidsekvensen, brytes DNA-fragmentene ned kjemisk og produktene adskilles ved polyakrylamid-gel elektroforese som beskrevet av Maxam og Gilbert (15).

Spesielt behandles de isolerte plasmid-DNA-ene av klonen CG-pBR 322/HLycIFN-l'b på følgende måte: På den ene side kuttes 5 ug av plasmid-DNA-en opp med Bgl II, merkes i 5'-endene og spaltes med Pvu II. Pvu II-Bgl II<*> (<*>indikerer der merkede stedet) og Bgl II- Pvu II<*->DNA-fragmentene isoleres på en 6% polyakrylamidgel. På den annen side, kuttes 5 ug av plasmidet opp med Alu I, merkes i 5'-endene og spaltes med Pst I. Pst I - Alu I<*->DNA-fragmentet isoleres på

en 8% polyakrylamid-gel. Deretter nedbrytes og sekvenseres de enkelte fragmentene ifølge Maxam og Gilbert. Den erholdte nukleotidsekvensen er tegnet opp i fig. 10. En strekning på ca. 25-35 deoksyguanosin-rester kommer foran ved 5<1->enden til cDNA-innskuddet. Den viste nukleotidsekvensen er ganske lik den til IFN-a (type F)-cDNA beskrevet av Goeddel et al. ((43), jfr. også Weissmann (44)), ikke desto mindre fremviser den en mengde særskilte avvik (punktmutasjoner) hvorav noen påvirker de resulterende aminosyrene (jfr. fig. 10) .

Den isolerte plasmid-DNA fra klonen CG-pBR 32 2/HLycIFN-f?1 behandles på en lignende måte. 5 ug av plasmidet kuttes opp med Pvu II og merkes i 5'-endene. Halvparten av blandingen spaltes med Pst I og resten med Bgl II. Pst I- Pvu II<*-> og Bgl II- Pvu II<*->fragmentene isoleres ved elektroforese på en 6% polyakrylamidgel og brytes ned som nevnt ovenfor. Nukleotidsekvensen (N-endesekvenaen) er tegnet opp i fig. 11 og avslører at cDNA-innskuddet starter ved nukleo-tidtall 102 i IFN-e^-cDNA-en som beskrevet av Taniguchi et al. (45). cDNA-innskuddet har derfor evne til å kode for humant IFN-e^ som mangler 11 aminosyrer ved N-enden. cDNA-innskuddet er i sin 5'-ende flankert av en strekning på ca. 20-25 etoksyguanosinrester og har en punktmutasjon i posisjon 153, hvor en C-rest er omdannet til en T-rest uten å påvirke den resulterende aminosyre. e) Identifisering av kloner som inneholder rekombinante DNA- molekyler kryss- hybridiserende ved CG- pBR 322/ HLyc FN-l' b- og CG- pBR 322/ HLycIFN-Bj^- innskuddene.

De rekombinante plasmid-DNA-ene til klonene CG-pBR 322/ HLycIFN-1'b og CG-pBR 322/HLycIFN-B1 isoleres fra kulturene som beskrevet ovenfor (trinn Ec). Plasmid-DNA til CG-pBR 322/HLycIFN-l'b (5 ug) kuttes opp med Bgl II, merkes i 5'-endene og spaltes med PvuII. På den annen side, kuttes den isolerte plasmid-DNA-en til CG-pBR 322/HLycIFN-@1

(5ug) opp med Pvu II, merkes i 5<1->endene og spaltes med Bgl II. Pcu II-Bgl II<*> (351 bp)-DNA-fragmentet (sondeforbindelse A) og Pvu II<*->Bgl II (368 bp)-DNA-fragmentet (sondeforbindelse B) isoleres fra en 8% polyakrylamidgel som beskrevet ovenfor (trinn Ed) og brukes til in situ koloni-hybridisering (se nedenunder). Restriksjonen av plasmid-DNA-ene, merkingen og rensingen av DNA-fragmentene gjennom-føres på samme måte som beskrevet ovenfor (trinn Ed).

4000 av transformantkoloniene fremstilt som beskrevet ovenfor (trinn D), overføres til nitrocellulosefiltere BA 85

(8 cm i diameter). Cellene .. lyses og deres DNA denatureres . og fikseres in situ, ifølge Grunstein og Hogness (20). Hybridiseringen til sondeforbindelsene A

og B (begge sondeforbindelser er blandet) utføres som beskrevet tidligere (trinn Ec). 6 positive kolonier identifiseres ved autoradiografi, hvorav 3 betegnet

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-4-L,

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-Sj^ og

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8|

burkes til videre undersøkelse. Plasmid-DNA-ene til disse klonene isoleres, retransformeres og isoleres på nytt som beskrevet ovenfor (trinn Ec, Ed).

For å fastslå typen for de rekombinante DNA-innskuddene, fastlegges nukleotidsekvensene til cDNA-innskuddene (delvis eller fullstendig) ved å bruke den generelle fremgangsmåten beskrevet ovenfor (trinn Ed).

Spesielt kuttes 5ug av de isolerte plasmid-DNA-ene CG-pBR 322/HLycIFN-41 og CG-pBR 322/HLycIFN-8| hver med Pvu II, merkes i 5<1->endene og spaltes med Pst I. DNA-fragmentene fraksjoneres på en 8% polyakrylamidgel og Pst I-Pvu II<*>

(ca. 120 bp) fra 8^-DNA og Pst I-Pvu II<*> (82 bp) fra 4^

DNA isoleres på vanlig måte.

Den isolerte plasmid-DNA CG-pBR 322/HLycIFN-51 behandles som følger. På den ene side kuttes 5 ug av plasmid-DNA-

en opp med Hae III, merkes i 5'-endene og spaltes med Pst I. Pst I-Hae III<*> (57 bp)-DNA-fragmentet isoleres på en

10% polyakrylamidgel. På den annen side, kuttes 5 ug av plasmidet opp med EcoR I, merkes i 5'-endene og spaltes med Pst I. Pst I-EcoR I<*> (235 bp) og EcoR I<*-> Pst I (ca.

700 bp)-DNA-fragmentene isoleres på en 8% polyakrylamidgel. De forskjellige DNA-fragmentene sekvensanalyseres ifølge Maxam og Gilbert (15).

Nukleotidsekvensene til cDNA-innskuddene er tegnet opp i fig. 12-14. I fig. 12 er det vist en partiell nukleotidsekvens fra cDNA-innskuddet i CG-pBR 322/HLycIFN-41. Innskuddet er flankert i 5'-enden med en strekning på 23 deoksyguanosin-rester og omfatter en del av cDNA-en til IFN-c^

(Le) beskrevet av Streuli et al., (46). I det 3'-utenom-

cistroniske området er det noen mindre avvik (punktmutasjoner) og en strekning på ytterligere 318 nukleotider. Nukleotidsekvensen til cDNA-innskuddet i CG-pBR 322/HLycIFN-8|

er tegnet opp i fig. 13. Innskuddet er flankert i 5'-enden av en strekning på 20-23 deoksyguanosinrester og er lignende med men ikke identisk med IFN-a (type D) cDNA-en beskrevet av Goeddel et alk. ((43), jfr. også Mantei et al., (27)). Bortsett fra forskjeller i cDNA-områdene som går foran og følger etter den IFN-kodende sekvensen, inneholder IFN-genet i posisjonene 28-30 en GCC-triplett og i posisjonene 409-411 en GCG-triplett som koder for alanin istedet for henholdsvis GTC og GTG, som koder for valin. Til sist avslø-rer nukleotidsekvensen for cDNA-innskuddet hos CG-pBR 322/ HLycIFN-5^ (se fig. 14) en strekning på 17 deoksyguanysin-rester ved 5'-enden. Nukleotidsekvensen er beslektet med den til IFN-a (type B)-cDNA beskrevetav Goeddel et al., (43). Der er imidlertid ytterligere nukleotider ved 5'-enden av cDNA-innskuddet i HLycIFN-5^, punkmutasjoner, fjer-ninger og innføringer i det utenom cistroniske området og i det IFN-kodende sekvensen, særlig i posisjonene 22 og 361-372, også.

F. Syntese av human interferoner med E. coli som inneholder human IFN- spesifikke rekombinante DNA- molekyler.

De frem klonene som er påvist å inneholde human-IFN-spesifike rekombinante DNA-molekyler, nemlig

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41,

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-Sj^,

E,coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8' 1 og

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-B ,

prøves med hensyn på IFN-aktivitet, som i hvert tilfelle gjennomføres på følgende måte: Kulturer av den tilsvarende E.coli klon (30 ml suspensjoner) dyrkes i trypton medium inntil en optisk tetthet (OD^i-q)

på ca. 1. Cellene høstes og resuspenderes i 0,5 ml av en vandig oppløsning som inneholder 30 mM NaCl og 50 mM tris-HCl (pH 8,0). Lysozym tilsettes tii. -\mg/ml.

Etter 30 minutter ved 0°C, nedfryses suspensjonene (flytende nitrogen) og tines (ved 37°C) 5 ganger, og sentrifugeres i 20 minutter ved 20 000 rpm i en SS 34 Sorvall-sentrifuge ved 4°C. Supernatentene analyseres med hensyn på IFN-aktivitet ved å bruke den cytopatiske bioanalysen ifølge Armstrong (32) som beskrevet i trinn Ac. De følgende aktivitetene ble funnet:

Det er mulig at kloner som ikke oppviser noen målbare IFN-aktiviteter, inneholder rekombinante DNA-er hvor HuLy-IFN-cDNA-innskuddet foreligger i en ukorrekt orientering med hensyn til retningen for transkripsjon. Derfor orienteres den rekombinante DNA til den slik klon (CG-pBR 322/HLycIFN-l'b) som inneholder et cDNA-innskudd i fulllengde, på nytt på følgende måte: Plasmid-DNA-en til klonen E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b isoleres som beskrevet ovenfor (trinn Ec) og spaltes med Pst I. 0,5 ug av den spaltede DNA i 20 ul av en bufferblanding som inneholder 20 mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 25 mM NaCL og 50 ug /ml gelatin, behandles med" 0,2 enheter T4 DNA ligase og 0,5 mM ATP i 2 timer ved 15°C. E.coli HB 101 transformeres med cDNA-blandingen som beskrevet ovenfor (trinn D). Transformerte kolonier velges ut på Mc Conkey-agarplater supplert med tetracyklin og deretter replika-utplatet på nitrocellulosefiltere. 4 bakteriekolonier hybridisert ved 32 det P-merkede Pvu II-Bgl II*-fragmentet (351 bp) av den rekombinante DNA CG-pBR 322/HLycIFN-l'b (jfr. trinn Ee) betegnes E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b1 til -1'b^ Ekstrakter av de 4 klonene fremstilles og prøves med hensyn på IFN-aktivitet slik som beskrevet ovenfor. De følg-ende aktiviteter ble funnet:

Følgelig innehlder plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-l<1>b4 et cDNA-innskudd som er istand til å styre syntesen av et polypeptid med IFN-aktivitet.

G. Oppbygging av rekombinante plasmider som er istand til

å produsere høye nivåer av polypeptider med IFN- aktivitet.

I; Oppbygging av CG- pBR ( AP)/ LyIFN- a- 1 rekombinant plasmid.

For å forbedre det INF-spesifike proteinutbyttet til klonen E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b, utfelles den følgende oppbygging som angitt skjematisk i fig 15.

a) Fremstilling av cDNA- innskuddet.

Den rekombinante plasmid-DNA (150 ug) fra klonen E.coli

HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b spaltes med Pst I (Biolabs) ved å bruke standard fremgangsmåte (jfr. trinn Ed). Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling, isoleres det fjernede innskuddet ved hjelp av sukrosedensitets gradient-sentrifugering (5-23%) i 50 mM tris-HCl (pN 8,0) og 1 mM EDTA. Sentrifugeringen utføres ved 35 000 rpm i en TST 41-sentrifuge (Kontron AG) ved 15°C i 16 timer. 0,3 ml fraksjoner samles opp med en ISCO gradient oppsamler ved 1 ml/min. Fraksjonene som inneholder det lille fragmentet (dvs. innskuddet) slås sammen. DNA-en utfelles med etanol som vanlig og utfellingen samles opp ved sentrifugering i en HB-4-sentrifuge (Sorvall) ved 10 000 rpm og 0°C i 10 minutter. Bunnfallet løses på nytt opp i 60 ul 10 mM tris-HCl (pH

7,5) og 0,05 mM EDTA. Det utvinnes 30 ug DNA bestemt ved å måle den optiske tetthet.

Den innskutte DNA (10 ug) kuttes opp med .Hae "III*

og fragmentene fraksjoneres på en 2% agarosegel i en oppløs-ning som inneholder 50 mM tris, 50 mM borsyre, 1 mM EDTA

og 0,5 ug/ml etidiumbromid. De største DNA-fragmentene,

Hae III-Pst I (869 bp) og Hae III-Hae III (82 bp, jfr. fig. 15, henholdsvis fragmentene 3 og 4), skjæres begge ut av gelen, sprøytes gjennom en tynn nål med en sprøyte inn i 5 ml 0,15 M NaCl, 50 mM tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA og elueres over natten ved rysting. Eluatet sendes gjennom en 100 ul DE-52 Pasteur-pipette kolonne f°<r> å adsobrere DNA-en. Kolonnen utvaskes med 2 ml av den samme bufferen og DNA-en elueres med 400 ul av en oppløsning som inneholder 1,5 M NaCl, 50 mM tris (Ph 8,0) og 1 mM EDTA. DNA-en utfelles med 2 volumdeler etanol ved -20°C over natten. Utfellingen samles opp ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge.

Hae III-Hae III-DNA-fragmentet (82 bp) oppløses på nytt

og kuttes, opp med Sau 3A. Enzymet varme-inaktiveres ved 65°C i 30 minutter. 1 ug av Hae III-Pst I DNA-fragmentet (869 bp) tilsettes, oppløsningen justeres til 10

mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,5 mM ATP, og T4 DNA-ligase tilsettes inntil 30 enheter/ul reaksjonsvolum. Oppløsningen inkuberes i 10 timer ved 15°C. Etter ekstraksjon med fenol og kloroform, fraksjoneres blandingen på en 2% agarosegel i tirs-borat-EDTA i nærvær av etidiumbromid. Sau 3A-Pst I-DNA-fragmentet (jfr. fig. 15, fragment 5) ekstraheres

som beskrevet tidligere, utfelles med etanol og oppløses på nytt i 10 ul av en oppløsning som inneholder 10 mM Tris.

HC1 (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

b. Fremstilling av DNA- fragmentet som inneholder det laktamase-. regulerende området ( ApPr) til pBR 322.

Plasmidet pBR 322 spaltes med Pst I (jfr. trinn Cb) og behandles med 4 enheter/ml av eksonukleasen Bal 31 Research Lab.) ved 30°C i 4-10 minutter for å fjerne det 8-laktamase-kodende segmentet.

En kjemisk DNA-kobler med formelen

5'-ATGTGTGATCACACAT-3<1>

syntetiseres ved å bruke fremgangsmåten beskrevet ovenfor (trinn Ea). Kobleren tilsettes til den Bal 31-behandlede pBR 322-DNA ved å bruke vanlige midler. Det resulterende hybridmolekylet spaltes med restriksjonsendonukleasene Bel Bel I og EcoRI. I Oppkuttingsproduktene fraksjoneres

på en 8% polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA, slik som beskrevet tidligere (trinn Ba). DNA-fragmenter (ApPr DNA-fragmenter), som strekker seg mellom 184 bp og 234 bp store markør-DNA-er, isoleres som beskrevet ovenfor (trinn Ia),

og utfelles med etanol på vanlig måte. Bunnfallet oppløses på nytt i en oppløsning som inneholder 10 mM tris.HCl (pH 7,5) og 0,0 5 mM EDTA.

c. Binding av ApPr- DNA- fragmentet til cDNA- innskuddet. Oppløsningene som inneholder ApPr-DNA-fragmentene og cDNA-innskuddet slås sammen. Blandingen justeres til 10 mM MgCl^ r 10 mM DTT og 0,5 mM ATP, og inkuberes med 3 0 enheter/pl T4 DNA-ligase ved 15'C i 12 timer. Etter ekstraksjon med fenol og kloroform, fraksjoneres blandingen på en 1% lavtsmeltende agarosegel. Det erholdte ApPr-cDNA-fragmentet knyttes til det store fragmentet pBr 322 spaltet med både Pst I og EcoRI på følgende måte. Gelstykket som inneholder ApPr-cDNA-fragmentet (ca. 20 ul) blandes med Pst I-EcoR I-fragmentet fra pBR 322, smeltes ved 65°C i 2 minutter, avkjøles til 37°C, justeres til 0,5 mM ATP, 10 mM DTT og 10 mM MgCl2

og inkuberes med 30 enheter/ul T4 DNA-ligase<r> i 12 timer ved 150C.

1/10 volum av oppløsningen som inneholder 100 mM tris-HCl

(pH 7,5), 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2, tilsettes, oppløs-ningen varmes opp i 10 minutter ved 65°C for å inaktivere ligasen, og avkjøles til 37°C. Oppløsningen brukes deretter til å transformere Ca 2++-behandlet E.coli HB 101 slik som beskrevet ovenfor (trinn D) og plates ut på Mc Conkey-agar plager supplert med 10 ug/ml tetracyklin. De transformerte koloniene utsorteres etter IFN-aktivitet (jfr. trinn F). Klonen som syntetiserer det høyeste nivået med IFN-aktivitet, velges ut og betegnes E.coli HB 101 CG-pBR(AP)-LyIFN-a-1.

Det fås en aktivitet på 40 000 (IE/ml) som utgjør en 1300 ganger stimulering sammenlignet med den opprinnelige klonen E.coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-l'b.

Den rekombinante plasmid-DNA til klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-

a-1 isoleres fra kulturen slik som beskrevet ovenfor (trinn 3c) og karakteriseres ved å fastslå nukleotidsekvensen til cDNA-innskuddet (IFN-gen) og reguleringsområdet for & - laktamase. Resultatet er oppsummert i fig. 16. II. Oppbygging av det rekombinante plasmidet CG- pBR( AP)-LyIFN- a- 3.

De IFN-spesifike proetinutbyttene fra klonen E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^ forbedres på følgende måte (jfr. fig. 17) : .

a. Fremstilling av DNA- fragmentet som inneholder reguleringsområdet for S- laktamase fra CG- pBR( AP)/ LyIFN- a- 1.

CG-pBR(AP)/LyIFN-a-l DNA (100 ug) spaltes med Hind III og Bgl II.. Etter i fenolekstraksjon og ietanolutfellincr isoleres det fjernede I DNA-fragmentet ved hjelp av 1 sukrosedensitets gradient-|sentrif ugering (5-23%)

i 50 mM tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Sentrifugeringen utføres ved 58 000 rpm i 1 TST 60-sentrifuge (Kontron AG)

ved 15°C i 4 timer. 0,2 ml fraksjoner samles opp som beskrevet tidligere. Fraksjonene som inneholder det lille fragmentet (Hind III-Bgl II) slås sammen og DNA-en utfelles med etanol på vanlig måte. Bunnfallet oppløses på nytt i 80 ul 10 mM tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA. Det utvinnes 16 ug DNA bestemt ved å måle den optiske tetthet.

DNA-fragmentet (Hind III-Bgl II) (4 ug) spaltes med Sau

0<3 oppkuttingsproduktene fraksjoneres på en 6% polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA som beskrevet tidligere. DNA-fragmentene farges i EtBr (0,5 ug/ml), Hind III-Sau 3A DNA-fragmentet (239 bp) ekstraheres og isoleres som tidligere. DNA-en utfelles med etanol på vanlig måte. Bunnfallet oppløses på nytt i 20 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

b. Fremstilling av cDNA- innskuddet.

cDNA-innskuddet fjernes fra det rekombinante plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-8| slik som beskrevet ovenfor (del Ia).

cDNA-innskuddet (2 ug) kuttes opp med 2,5 enheter Sau 3A

i 10 ug/ml EtBr og inkuberes ved 37°C i 60 minutter. Oppkuttingsproduktene fenolekstraheres og DNA-en utfelles

i etanol som ovenfor. DNA-fragmentene fraksjoneres på en 1,2% agarosegel i en oppløsning som inneholder 50 mM tris,

50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 ug/ml etidiumbromid.

Det nest største DNA-fragmentet (Sau 3A-Pst I: 693 bp) ekstraheres fra gelen og renses slik som beskrevet i del Ia).

DNA-en oppløses på nytt i 20 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5)

og 0,05 mM EDTA.

c. Binding av Hind III- Sau 3A DNA- fragmentet til cDNA-

innskuddet ( Sau 3A- Pst I).

Like store mengder av begge DNA-fragmenter (ca. 5 0 ng) inkuberes i en oppløsning som inneholder 10 mM MgCl2 , 10 mM DTT, 0,5 mM ATP og 30 enheter/pl T4 DNA-ligase ved 15°C i 3 timer. Blandingen inkuberes i 15 minutter ved 80'C og justeres til 50 mM NaCl. DNA-blandingen kuttes opp med 0,5 enheter Pst I og 1 enhet Hind III i 20 minutter ved 37°C. DNA ekstraheres med fenol, etanolutfelles og oppløses på nytt i 20 pl 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 0,05 mM

EDTA.

Halvparten av den resulterende blanding bindes sammen med det store Hind III-Pst I DNA-fragmentet til plasmidet pBR 322 (ca. 100 ng) i 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP som inneholder 30 enheter/ul T4 DNA-ligase i 2 timer ved 15C-C.

1/10 av oppløsningsvolumet brukes til å transformere E.coli HB 101 som beskrevet i trinn D. De transformerte koloniene brukes til å undersøke med hensyn på IFN-aktivitet slik

som beskrevet tidligere (jfr. trinn F).

Klonen som syntetiserer det høyeste nivået med IFN-aktivitet, velges ut og betegnes E.coli HB 101 CG-pBR (AP)/Ly IFN-ot-3 .

IFN-aktiviteten bestemmes som beskrevet ovenfor (trinn F). En aktivitet på 70 000 (IE/ml) fås som utgjør en 700 ganger stimulering sammenlignet med den opprinnelige klonen E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^.

Den rekombinante plasmid-DNA til klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-ct-3 isoleres fra kulturen som beskrevet ovenfor (trinn Cc) og karakteriseres ved å fastslå nukleotidsekvensen til cDNA-innskuddet (IFN-gen) og reguleringsområdet for 6-laktamase. Resultatet er oppsummert i fig. 18.

Fremgangsmåten for oppbyggingen av plasmidet CG-pBR(AP)/

LyIFN-a-3 kan brukes på alle -IFN-cDNA-gener eller passende kuttede kromosomale a-IFN-gener generelt.

Ved f.eks. å gå ut fra plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-S^ erholdes plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 på en identisk måte som beskrevet for plasmidet CG-pBR(AP)-LyIFN-a-3. Dette nye plasmidet inneholder DNA-innskuddet fra CG-pBR 322/ HLycIFN-51 og reguleringsområdet for 8-laktamase fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1. Det velges ut en klon betegnet E.coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 slik som beskrevet ovenfor.

Det fås en IFN-aktivitet på 50 000 IE/ml som utgjør en 5 ganger stimulering sammenlignet med den opprinnelige E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51. Nukleotidsekvensen til cDNA-innskuddet og reguleringsområdet for B-laktamase til plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 fastslås som beskrevet ovenfor,

og skildres i fig. 19.

III. Deponering av fremstilte mikroorganismer.

Mikroorganismer og rekombinante DNA-molekyler fremstilt

som beskrevet i eksempel 10 eksemplifiseres ved kulturer deponert i kultursamlingen til Agricultural Research Culture Collection (NRRL) 14. september 1981, og har fått de følgende deponeringsnummere:

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-^: NRRL B-12528

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41: NRRL B-12 529

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l<1>b: NRRL B-12530

E.coli HB loi CG-pBR 322/HLycIFN-Sj^: NRRL B-12531

E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8|: NRRL B-12532

Eksempel 11.

De kodende sekvensene for lymfoblastoid-IFN-11 b og IFN-5.^

i E.coli-plasmidene CG-pBR 322/HLycIFN-l' b og -5-j^ (jfr. eksempel 10), kan subklones inn i plasmid p30 (jfr. eksempel 4) på en analog måte med den beskrevet for IFN-8| i

eksempel 5 og 6. Det kreves en partiell oppkutting med restriksjons endonuklease Hae III. Gjærhybrid plasmidene erholdt på denne måte er p30IFN2 (1 'b)., p30IFN2 ' (1 'b) , p30IFN2(51) og p30IFN2'(5X).

Disse erholdte hybrid plasmidene kan brukes til å transformere Saccharomyces cerevisiae PH971 som beskrevet i eksempel 7. De følgende koloniene som inneholder et hybrid plasmid med et cDNA-innskudd for lymfoblastoid-IFN, kan velges ut:

S. cerevisiae RH971/p30IFN2(1'b)

S.cerevisiae RH971/p30IFN2'(1'b)

S.cerevisiae RH971/p30IFN2( 51)

S.cerevisiae RH971/p30lFN2'(51)

Eksempel 12.

På en analog måte med den beskrevet i eksempel 9, kan de følgende gjærhybrid plasmider erholdes ved å gå ut fra henholdsvis plasmidene p30IFN2 (11 b) , -(5-^, -(8|) og p30IFN2 ' (l'b) , -(5^ : pJDB207/IFN2(l'b) , pJDB207/IFN2' (1' b) , pJDB207/IFN2 ( 5^^) , pJDB207/IFN2'( 5^ og pJDB207/IFN2(8|).

Disse hybrid plasmidene kan transformeres inn i S. cerevisiae stamme RH971 og derved selektere for leucin-prototrofe kolonier. De følgende koloniene som inneholder et hybrid plasmid med et cDNA-innskudd for lymfoblastoid-IFN, kan erholdes:

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(1'b)

S. cerevisiae RH97l/pJDB207/IFN2<1>(1<1>b)

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2( 51)

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2<1>(5-^

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(8|)

Eksempel 13.

Oppbygging av et ekspresjons plasmid som inneholder PH05- promoteren og avslutningssignaler for transkripsjon av PH05 ( se fig. 29).

a) Eliminering av EcoRI- restriksjonsstedet i plasmid p30: Skjemaet som er trukket opp i fig. 20-22, krever eliminering

av det eneste EcoRI-restriksjonssted i plasmid p30. 5 ug p30 DNA (jfr. eksempel 4) utsettes for fullført oppkutting med restriksjons endonuklease EcoRI (Boehringer). For å utfylle de resulterende utstikkende ender, inkuberes 1 ug med EcoRI-oppkuttet p30 i 50 ul 50 mM NaCl, 10 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,2 5 mM dATP og 0,2 5 mM dTTP i 30 minutter ved 37°C med en enhet DNA-polymerase (Klenow stort fragment, BRL). Den DNA som ble utvunnet fra etanolutfelling, bindes sammen på vanlig måte og brukes til transformasjon av kompetente E.coli HB 101-celler som beskrevet i eksempel 4. Kloner som er resistente overfor EcoRI-oppkutting, refereres til som p30/EcoRI .

b. Isolering av et 0, 37 kp Sau3A- PstI- avslutningsfragment for transkripsjon av PH05.

PH05-transkripsjonsproduktene er blitt kartlagt ved Sl nuklease-kartlegging (48). Signalene for transkripsjons-avslutning er påvist å være lokalisert til et 0,37 kb Sau3A-Pst I-fragment i PH05-genet. Nukleotidsekvensen til Sau3A-Pst I-fragmentet er gjengitt i fig. 21. 5 ug pJDB207/PHO5, PH03 DNA (jfr. eksempel 2) gjøres til gjenstand for fullført oppkutting med restriksjons endonukleaser Sau3A og Pst I. Restriksjonsfragmentene adskilles på en vertikal, 1,5% lavtsmeltende agarosegel i TBE-buffer. Det 0,37 kb store Sau3A-Pst I-fragmentet lokaliseres ved etidiumbormid-farging og det skjæres ut et minst mulig gelstykke som inneholder dette DNA-fragmentet.

c) Kloning av Sau3A- Pst I- PH05- fragmentet i M13mp9: Ml3mp9-fag-DNA er en nyttig kloningsvektor med en gruppe

enestående restriksjonssteder (49). 5 ug M13mp9-DNA utsettes for fullført oppkutting med restriksjons endonuklasene BamHI og Pst I. Det større 7,2 kb DNA-fragmentet adskilles fra et svært lite fragment (8 bp) på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Gelstykket som inneholder det store DNA-fragmentet skjæres ut av gelen. Gelstykker med det 0,37 kb store Sau3A-PstI-fragmentet til pJDB207/PHO5,PH03 (jfr. eksempel 13b) og det 7,2 kb store BamHI-Pstl-fragmentet til Ml3mp9 smeltes ved 65°C, blandes i omtrent ekvimolare mengder og fortynnes med ^0 for å senke agarosekonsentrasjonen til 0,3%. Sammenbinding utføres i en 200 ul oppløsning som inneholder 60 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheter T4 DNA-liqase. Trans-duksjon av kompetente celler av stamme E.coli JM101 (Ca++) gjøres ifølge håndboken "M13 kloning and DNA sequencing system", publisert av New England Biolabs. Fager fra en rekke hvite plaques oppdyrkes og analyseres med hensyn på størrelsen av deres DNA-innskudd ved å spalte med restriksjons endonukleaser EcoRI og Pstl.

En M13mp9-avledet klon som inneholder Sau3A-PstI-avslutningsfragmentet for transkripsjon av PH05, isoleres og refereres til som Ml3mp9/PH05 (Sau3A-PstI). d) Kloning av avslutningsfragmentet for transkripsjon av PH05 i p3 0/ EcoRI-- :

Det opprinnelige avslutningsfragmentet for transkripsjon

av PH05 klonet i fag M13mp9 (Ml3mp9/PH05(Sau3A-PstI)), klones på nytt som et Haelll-HindIII-fragment i plasmid p30/EcoRI spaltet med Ball og Hindlll: Ml3mp9/PH05/Sau3A-PstI)-DNA utsettes for fullført oppspalting med restriksjons endunuk-leaser Haelll og Hindlll. De resulterende to DNA-fragmentene adskilles på en 1,5% vertikal lavsmeltende agarosegel i TBE-buffer. 0,39 kb fragmentet isoleres i et gelstykke skåo ret ut av gelen. P30/EcoRI R-DNA kuttes opp med Ball

og Hind III. Det store 3,98 kb-fragmentet frasepareres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel i TBE-buffer og isoleres ved å skjære ut et gelstykke som inneholder DNA-fragmentet.

Gelstykker med det 0,39 kb store Haelll-Hindlll-avslutningsfragmentet for transkripsjon av PH05 og det 3,98 kb store Bal I-Hind III-fragmentet fra p30/EcoRI smeltes ved 65°C og blandes i omtrent ekvimolare mengder. Sammenbinding samt transformering av kompetente E.coli HBlOl-celler er som beskrevet i eksempel 4. DNA fra transformerte celler analyseres ved å spalte med Ball og Haelll. En klon som inneholder avslutningsfragmentet for transkripsjon av PH05, analyseres ytterligere og refereres til som p31 (se fig. 20) .

Ekspresjonsplasmidet p31 inneholder promoterområdet til PH05 med en del av signalsekvensen til PH05 og tilgrensende et DNA-fragment med avslutningssignaler for transkripsjon av PH05. Fremmede kodende sekvenser som skal uttrykkes i denne vektoren, kan passende være innført mellom promoter og avslutningssekvenser for transkripsjon.

Eksempel 14.

Innføring av DNA for lymfoblastoid- interferon-

5.^ i plasmid p31( se fig. 22).

a) Isolering av HaeIII- HpaI- fragmenter fra plasmid CG- pBR 322/ HLycIFN- 51.

E.coli stamme HB101 CG-pBR322/HLycIFN-51 (se eksempel

10E) dyrkes i 100 ml LB-medium supplert med 10 ug/ml tetracyklin og plasmid-DNA-en isoleres som beskrevet i eksempel 2. 10 ug CG-pBR3 22/HLycIFN-51-DNA utsettes for fullført oppkutting med restriksjons endonukleasen Pstl og Hpal. Restriksjonsfragmentene adskilles på en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Pstl-Hpal-fragmentet på ca 860 bp som inneholder den IFN-5^-kodende sekvensen, skjæres

ut av gelen og isoleres fra agarosegelen, slik som beskrevet i eksempel 4a, og renses ved DE52 ionebytterkromatografi slik som utførlig omtalt i eksempel 5a.

Pstl-Hpal-fragmentet inneholder 3 Haelll-steder: i posisjon 41, 65 og 146 (fra ATG-en) i den kodende sekvensen for IFN-5-j^. Delvis oppkutting med Haelll fører til 3 Haelll-Hpal-fragmenter med henholdsvis 699 bp, 780 bp og 804 bp. Oppkutting med Haelll justeres forsiktig for å erholde ca.

like store mengder av alle tre fragmentene. Blandingen med fragmenter ekstraheres med fenol, utfelles med etanol og resuspenderes i 10 mM tris pH 8 til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml.

b) Fremstilling av Ball- spaltet, defosf<p>rylert plasmid p31

5 ug p31 DNA (jfr. eksempel 13d) utsettes for fullført oppkutting med restriksjons endonuklease Ball. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling, oppløses DNA-en på

nytt i 100 ul 50 mM tris pH 8,0 og sendes gjennom et 50

ul stort volum ekvilibrert Chelex 100 i en silikon-belagt Pasteur-pipette. Det som strømmet gjennom og 4 50

ul derpå følgende vaskevann, blandes. 0,4 enheter alkalisk fosfatase fra kalvetarmer tilsettes. Etter 1 times inkubering ved 37°C, inaktiveres enzymet ved 65°C i 1,5 timer. NaCl-konsentrasjonen i inkubasjonsblandingen justeres til 150 mM. Den defosforilerte p31-DNA som er gjort rettkjedet, renses ved DE52 ionebytterkromatografi (se eksempel 5a). Etter etanolutfelling, suspenderes DNA-en på nytt i 10 mM tris pH 8 til en konsentrasjon på 0,3 mg/ml. c) Binding av defosfprylert p31- DNA som er gjort rettkjedet, til HaeIII- HpaI- fragmentene til IFN- 5-j^ DNA.

0,6 ug defosforilert p31-vektor-DNA spaltet med Ball bindes til 0,5 ug partielle HaeIII-HpaI-f ragmenter av IFN-5-^-DNA (se eksempel 14a). Sammenbinding utføres i 10 ul 60 mM

tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP og 300 enheter

T4 DNA-ligase over natten ved værelsestemperatur.

En 1 ul alikvot av sammenbindingsblandingen tilsettes til

50 ul kalsiumbehandlede transformasjons-kompetente E.coli HBlOl-celler. Transformasjonsfremgangsmåten er som beskrevet i eksempel 4a.

Transformerte amp -kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles ifølge fremgangsmåten til Holmes et al. (50) og analyseres ved oppkutting med restriksjons endonuklease BstEII (et enkeltstående sted i PH05-promoteren). 20 kloner som inneholder IFN-5^ innskuddet analyseres videre ved BstEII-EcoRI-dobbelt oppkuttinger for å bestemme orienteringen til og størrelsen av innskuddet. Blant 8 kloner med innskuddet i den rette orienteringen, fås alle de tre forventede innskudd-størrelsene. Størrelsen svarer til de tre HaeIII^_3-HpaI-fragmentene frembragt ved delvis Haelll-oppkutting av IFN-5-^-genet (jfr. eksempel 14a). Klonene refereres til som p31/IFI(%1), p31/IF2(51) og p31/IF3(51) med IFN-S^innskudd på henholdsvis 804 bp (HaeIII1-HpaI), 780 bp (HaeIII2-HpaI) og 699 bp (Haelll-Hpal).

Eksempel 15.

Innføring av DNA for lymfoblastoid- interferon-

l' b i plasmid p31 ( se fig. 22).

a) Isolering av HaeIII- RsaI- fragmenter fra plasmid CG-pBR3 2 2/ HLycIFN- l' b: 10 ug CG-pBR322/HLycIFN-l'b DNA (se eksempel 10E) kuttes opp med restriksjons endonukleasene Pstl og Rsal. Restriks j onsf ragmentene adskilles på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Et Pstl-Rsal-fragment på ca. 870 bp isoleres fra gelen og renses som beskrevet ovenfor (eksempel 14a).

Pstl-Rsal-fragmentet inneholder tre Haelll-steder: i posisjon 13, 37 og 118 fra ATG-en i den kodende sekvensen for IFN-1'b. Delvis Haelll-oppkutting fører til tre Haelll-Rsal-fragmenter på henhodlsvis 735 bp, 816 bp og 840 bp. Fragmentblandingen fenolekstraheres, etanolutfelles og resuspenderes i 10 mM tris pH 8,0 til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml. b) Binding av defosf<p>rylert p31- DNA som er gjort rettkjedet, til Haelll- Rsal- fragmenter av IFN- 1' b DNA. 0,6 ug def<p>sf<p>rylert DNA fra p31-vekt<p>r spaltet med Ball (se eksempel 14b) bindes til 0,5ug partielle Haelll-Rsal-fragmenter fra IFN-1'b-DNA. Fremgangsmåten f<p>r sammenbinding, transf<p>rmasj<p>nen av k<p>mpetente E.c<p>li HB 101-celler med sammenbindingsblandingen <p>g utvelgelsen av transformerte amp -kplpnier utføres som beskrevet i eksempel 14c. Plasmid-DNA fremstilles ifølge fremgangsmåten til Holmes et al., (50) og analyseres ved å kutte opp med restriksjons endonuklease BstEII. 7 kloner som inneholder IFN-1<1>b-innskuddet analyseres ved dobbelt oppkutting med BstEII-PvuII. Det viser seg at to kloner inneholder Haell^-Rsal-fragmentet (816 bp) i den rette orientering. Denne konstruksjonen refereres til som p31/IF2(1'b).

Eksempel 16

Innføring av DNA for lymfoblastoid- interferon-

8| i plasmid p31 ( se fig. 23).

a) Isolering av et 1, 46 kb Sall- EcoRI- fragment fra plasmid p30IFNl( 8|). 5 ug p3 0IFNl(8|)-DNA (se eksempel 5d) kuttes opp med restriksjons endonukleasene Sali og EcoRI. Et 1,46 kb Sall-EcoRI-fragment som inneholder PH05-promoteren koblet til det protein-kodende området til IFN-8| fraskilles på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel. DNA-båndet lokaliseres ved etidiumbromid-farging og skjæres ut av gelen. b) Isolering av et 3, 5 kb Sall- EcoRI- fragment av plasmid p31 5 ug p31-DNA (se eksempel 13d) utsetes for fullført oppkut-fc ting med restriksjons endonukleasene Sali og EcoRI. Det 3,5 kb store vektorfragmentet som inneholder avslutnings-sekvensen for transkripsjon av PH05, frasepareres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel og DNA-båndet skjæres ut. c) Ligering av et 1, 46 kb Sall- EcoRI- fragment fra 031IFN1( 8^) med et 3, 5 kb Sall- EcoRI- fragment fra p31.

Gelstykket med 0,67 ug av det 3,5 kb store Sall-EcoRI-fragmentet fra p31 og 0,5 ug av det 1,4 6 kb store Sall-EcoRI-fragmentet fra p31IFNl(8|) bindes sammen i 240 ul

som beskrevet i eksempel 4a ved 15°C over natten. 10 ul av sammenbindingsblandingen brukes til å transformere kompetente E.coli HB 101 celler.

Transformerte amp -kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles ifølge fremgangsmåten til Holmes et al. (50)

og analyseres ved å kutte opp med restriksjons endonuklease BstEII (et enkeltstående sted i PH05-promoteren).

En rekke kloner som inneholder IFN-8|-innskuddet analyseres ved doble oppkuttinger med BstEII-PvuII. De inneholder alle det 1,46 kb store Sall-EcoRI-fragmentet. De identiske klonene refereres til som p31/IF(8|).

Eksempel 17.

Subkloning av genkonstruksjonene i gjærvektoren pJDB2 07 med høyt kopiantall.

Konstruksjonene beskrevet i eksemplene 14-16 inneholder PH05-promoteren, forskjellige interferon-kodende områder

og avslutningssignalene for transkripsjon av PH05 i en rekkefølge etter hverandre, alle innført i en pBR322

avledet vektor. For ekspresjon i gjær subklones hele inn-

skuddet som sådant i gjærvektor pJDB207 (28), hvilket åpner muligheten for seleksjon med hensyn på leucin-prototrofe kolonier (jfr. eksempel 9 og fig. 6). 2 ug av henholdsvis p31/IF(8|)-DNA, p31/IFl(51)-DNA, p31/IF2(51)-DNA, p31/IF3(5^) -DNA og p31 (IF2 (1' b)-DNA kuttes opp med restriksjons endonukleasene Sali og Hindlll. Restriks j onsf ragmentene adskilles på en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det lille fragmentet (ca. 2 kb i størrelse) fra hver oppkutting, skjæres ut av gelen. 10 ug pJDB207-DNA kuttes opp med restriksjons endonukleasene Sali og Hindlll. Det store 6,2 kb fragmentet isoleres fra en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Gelstykkene som inneholder DNA-fragmentene smeltes ved 65°C og fortynnes med H2O for å senke agarosekonsentrasjonen til ca. 0,3%.

Hvert av de 2 kb store SalI-HindIII-fragmentene fra plasmidene p31/IF(8'1), p31/IFl(51), p31(IF2(51), p31/IF3(5-L) og p31/IF2(l'b) blandes med en ekvimolar mengde av det 6,2

kb store HindIII-SalI-fragmentet fra pJDB207. Sammendinger utføres i 100 (il i 4 timer ved 50°C. 10 (il av hver samme-bindingsblanding brukes til å transformere kompetente E.coli HB 101-celler som beskrevet i eksempel 4a. Flere amp - kolonier fra hvert eksperiment dyrkes opp hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA-et analyseres med hensyn på størrelsen av innskuddet ved spalting med restriksjons endonukleasene Hindlll og Sali. De resulterende klonene med de korrekte innskuddene kalles pJDB207/IF(8|), pJDB207/IF1( 51), pJDB207/IF2(51), (jfr. fig. 27), pJDB207/IF3( 51) og pJDB207/IF2(l'b)

(jfr. fig. 27).

Eksempel 18.

Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae AH220 og induksjon av interferon produksjon.

Plasmidene pJDB207/IF ( 8j_) , pJDB207/IFl ( 51) , pJDB207/IF2 ( 51) , pJDB207/IF3(51) og pJDB207/IF2(1'b) innføres enkeltvis i Saccharomyces cerevisiae stamme AH220 (a, trpl, leu2-3, leu2-112, his3, pho5, pho3) ved å bruke transformasjonsfremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al. (1). Transformerte gjærceller velges ut på gjær-minimal medium-plater som mangler leucin. Enkeltstående transformerte gjærkolonier plukkes opp og dyrkes som beskrevet i eksempel 7. De forskjellige gjærkoloniene refereres til som

Saccharomyces cerevisiae AH 220/pJDB207/IF(8^), Saccharomyces cerevisiae AH 220/pJDB207/IFl ( ) , Saccharomyces cerevisiae AH 220/pJDB207/IF2(5^), Saccharomyces cerevisiae AH 220/pJDB207/IF3 ( 5-^) og Saccharomyces cerevisiae AH 220/pJDB207/IF2(1'b).

Eksempel 19.

Fremstilling av gjærcelle- ekstrakter og bestemmelse av interferon titeren.

Celleekstrakter fremstilles og interferonaktivitet bestemmes som beskrevet i eksempel 8.

Resultatene er oppsummert i tabell 3.

Eksempel 20.

Ekspresjon av overflateantigen fra hepatitis B-virus ( HBVs) under kontroll av PH05- promoteren fra gjær. a) Konstruksjon av en fusjon mellom PH05- promoteren og det kodende området for HBVs- protein. 5 ug DNA fra plasmid pHBVl3 0 (51) kuttes opp med restriksjons endonuklease Aval som foreskrevet av leverandøren Et fragment med 1336 bp erholdes som inneholder hele det proteinkodende området til HBVs, inkludert 27 basepar av en potensiell pre-HBVs-sekvens (se fig. 2 i litteraturhenvisning 51: Aval-fragmentet spenner over DNA-segmentet fra Xho-stedet til et Aval-sted 62 basepar på den andre siden av BamHI-stedet som ligger mellom det kodende området for overflaten og det kodende området for kjernen). Det 13 36 basepar store fragmentet renses ved elektroforese på bløt agarose (0,8% agarosegel som beskrevet i eksempel 4a). 5 ug plasmid pBR322/PH05 Bam-Sal (se fig. 1) kuttes med restriksjons endonukleasene Sali og Aval (posisjon 1424 i pBR322) og det resulterende 3,9 kb vektorfragmentet som innehodler pBR322-sekvenser sammen med Bam-Sal-segmentet fra PH05, renses ved elektroforese på bløt agarose som beskrevet ovenfor. 1 ug av det 133 6 basepar store fragmentet bindes til 3 ug av 3,9 kb store vektorfragmentet i 50 ul 60 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 4 timer. Transformasjonen av E.coli HB101 til ampicillin-resistens og plasmidisolering utføres som beskrevet i eksempel 4a.

Den korrekte strukturen til pasmidet bekreftes ved restriksjonsanalyse. Det således oppbygde nye plasmidet kalles pBR322/PH05/HBVs (se fig. 24). b) Justering av PH05- promoteren til det nøyaktig kodende området for HBVs- protein.

Den beskrevne fusjon frembringer et DNA-sekvens-arrangement som tegnet opp i fig. 25. Sekvensdataene tas fra fig. 3 (PH05) og fra Pasek et al., (52; HBVs). Oppstartingsstedet for mRNA bestemmes ved vanlig Sl-kartlegging (48) under anvendelse av BamHI-Sall-fragmentet til pBR322/PH05 Bam-

Sal (fig. 1). For å fjerne det kodende området for PH05-protein i pBR322/PH05/HBVs, kuttes 5 ug av plasmidet opp med restriksjons endonuklease Kpnl (betingelser angitt av leverandør, som produserer ét plasmid som er gjort rettkjedet. 4 pg plasmid som er gjort rettkjedet, kuttes opp med 1 enhet eksonuklease Bal31 ved 30°C i 45 sekunder i 12 mM CaCl2, 12mM MgCl2, 300 mM CaCl, 20 mM tris. 1 mM EDTA pH 8,1 i et totalt volum på 100 pl. Reaksjonen stanses ved fenolekstraksjon som beskrevet ovenfor.

Etter etanolutfelling resuspenderes DNA-en i 50 ul TE.

1 ug DNA ringsluttes på nytt ved binding med T4 DNA-ligase i et volum på 20 (il (betingelser, se eksempel 4a) . Etter transformasjon av E.coli HB101 til ampicillinresistens (se eksempel 4a), isoleres plasmid-DNA som beskrevet og de enkelte plasmidfremstillingene analyseres ved restriksjonsanalyse med de følgende enzymer: Haelll, Pstl, BstEII og Hhal. Denne analyse gir mulighet til å bestemme nærværet av Hhal-stedet (6 basepar før starten for det kodende området for HBVs-protein) og gir et mål for størrelsen av fjerningen. DNA-sekvensen i sammenknytningsområdet bestemmes ved å bruke fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (15) (radioaktiv merking i BstEII-stedet i posisjon -374, se fig. 3). Endepunktene for den frembragte fjerningen i et av plasmidene er angitt i fig. 24. Dette plasmidet kalles pBR322/PH05/HBVsA14. c) Overføring av PH05- HBVs- fusjonen til gjærplasmidet pJDB207 ( se fig. 26). 5 pg DNA fra plasmid pBR322/PH05/HBVsA14, kuttes opp med restriksjons endonukleasen BamHI. Et 1,8 kb stort BamHI-fragment fremstilles ved elektroforese på bløt agarosegel (0,8% agarose) som beskrevet i eksempel 4a. 2 ug av gjærvektoren pJDB207 kuttes opp med det samme enzymet. 1 ug oppkuttet pJDB207 og 1 ug av det 1,8 kb store BamHI-restriksjonsfragmentet bindes sammen i et totalt volum på 20 ul ved å bruke betingelsene beskrevet i eksempel 20a. Transformasjon av E.coli HB101 til ampicillin resistens

og isolering av plasmid-DNA utføres som beskrevet ovenfor (eksempel 4a). Individuelle plasmider analyseres ved BamHI-restriksjonsanalyse og orienteringen til det innførte BamHI-fragmentet bestemmes ved dobbel oppkutting med Hindlll/BstEII.

Fig. 26 skisserer oppbyggingen. Plasmidet erholdt som angitt i fig. 26 kalles pJDB207/PHO5/HBVsAl4.

Plasmidet transformeres inn i gjærstamme AH220 som beskrevet i eksempel 7. Transformerte gjærceller selekteres, inkuberes i flytende medium og dyrkes under betingelser for opphevelse av hemming som beskrevet i eksempel 7. En eneste transformert gjærkoloni refereres til som Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/HBVsAl4.

Fremstilling av celleekstrakt gjøres som beskrevet i eksempel 8 og den fremstilte mengden HBVs-protein bestemmes ved å bruke Abbott radioimmun analyse (51). Under antagelse av at HBVs-antigenet fremstilt av gjær reagerer på lignende måte som antigenet i human serum, fås ca. 2 ug HBVs-antigen/ ml gjærekstrakt under betingelser med oppheving av hemming. Under betingelser med oppheving av hemming, er titeren under 0,001 ug/ml. d) Overføring av det sammensatte PH05- HBVs- produktet til et gjærplasmid som inneholder en avslutningssekvens for

transkripsjon av PH05.

5ug DNA fra plasmid pJDB207/IF(8|) (eksempel 17) kuttes opp med BamHI som beskrevet ovenfor, og den 6,9 kb store vektordelen isoleres ved elektroforese på bløt agarose (0,8% agarose) som beskrevet i eksempel 4a. 5 ug pBR322/PH05/HBVs-Al4 kuttes opp med BamHI som beskrevet ovenfor og det 1,8

kb store BamHI-fragmentet isoleres ved elektroforese på

bløt agarosegel. 1 ug av det 6,9 kb store vektorfragmentet bindes med 1 ug av det 1,8 kb store BamHI-fragmentet i et totalt volum på 20 ul ved å bruke betingelsene beskrevet i eksempel 20a. Transformasjon av E.coli HB101 til ampicillinresistens og plasmid isolering gjøres som beskrevet i eksempel 4a. Plasmid analyse utføres ved oppkuttinger med restriksjons endonuklease. Plasmidet erholdt som angitt i fig. 26 kalles pJDB207/HBVs 14t. Transformasjon av gjær-stamme AH220 og seleksjon av de transformerte cellene gjøres som beskrevet i eksempel 7. En eneste transformert gjærkoloni refereres til som Saccharomyces cerevisiae AH220/ pJDB207/HBSsAl4t.

Eksempel 21.

DNA-sekvenser fra hepatitis B virus (HBV) som er fjernet

fra plasmidene

pBR3 22-PstI dG:HBV-Kpnl dC;

pBR322-PstI dG:HBV-BamHI dC;

pBR322-PstI dG:HBV-BHII dC ;

pBR32 2-PstI dG:HBV-EcoRI dC;

pBR322-BamHI: HBV-BamHI;

pBR3 2 2-EcoRI: HBV-EcoRI;

pBR322-PstI dG:HBV-Kpnl dC;

pBR322-PstI' dG:pHBV114-PstI dC;

((pBR322-EcoRI Hindlll: Pac-promoter-sekvens)-Hindlll:HBV 114-HhaI Hindlll-koblere)-BamHI;

pUR2-EcoRI; HBV114-HhaI EcoRI-koblere,

pUR2-EcoRI: HBV114-HhaI EcoRI-koblere,

pBR322-PstI dGj_pHBVH4-Aval dC og

pBR322-PstI dG:pHBVH4-Taq dC.

som beskrevet i EP patentsøknad nr. 13828, kan innføres (fortrinnsvis etter passende tilpasning av endene) i plasmidene p30 eller p31 ifølge eksemplene 5, 14 eller 15, og deretter i plasmid pJDB207 ifølge eksempel 17. Transformasjon av S. cerevisiae utføres ifølge eksempel 18. Ekspresjon av polypeptider som fremviser HBV-antigene egenskaper, bestemmes ifølge eksempel 20c.

Eksepel 22.

Fjerning av 3'- ikke- oversatte DNA sekvenser i plasmidene pJDB207/ IF2( 51) og pJDB207/ IF2 ( 1' b)

( se fig. 27 og 28).

Oppbyggingen av plasmidene pJDB207/iF2 ( 5^^) og pJDB207/ IF2(l'b) (jfr. eksempel 17) resulterte i et forholdsvis langt 3<1->ikke-oversatt område med henholdsvis ca. 440 bp og 480 bp. For å forkorte dette området i konstruksjonene, kuttes DNA-en opp med eksonuklease Bal31 fra et enkelt Saml-sted i midten av dette området. Xho-koblere innføres og DNA-en ringsluttes ved sammenbinding. a) Bal 31- oppkutting av Smal- spaltede plasmider pJDB207/ IF2( 51) og pJDB207/ IF2( 1' b).

20\ iq av hver av plasmid-DNA-ene kuttes opp med restriksjonsendonuklease Smal. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform, utfelles DNA-en med etanol. DNA-en resuspenderes i 10 mM tris pH 8,0 til en konsentrasjon på 0,5 mg/ml. 10 ug av de Smal-spaltede DNA-ene spaltes hver opp med 2 E endonuklease Balel (BRL) i 100 ul 20 mM tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 12

mM MgCl2, 12 mM CaCl2 og 1 mM EDTA. Alikvoter på 3 ug DNA tas ut etter 90, 120 og 150 sekunder med inkubering ved 30°C og blandes umiddelbart med 50 ul fenol og 60 ul TNE. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform, og etanolutfelling, resuspenderes DNA-en i 10 mM tris pH 8,0 til en konsentrasjon på 100 ug/ml. For å analysere eksonukleaseoppkuttingen med Bal31, kuttes alikvoter på 0,7 ug DNA fra hvert tidspunkt

med Hindlll/EcoRI når det gjelder pJDB207/IF2(51)-avledede prøver eller med pVUII/Hindlll når det gjelder pJDB207/ IF2(1'b)-avledede prøver. Til ytterligere eksperimenter

ble DNA-ene fra tidspunktet 90 sekunder brukt.

b) Tilføyelse av Xhol- koblere til de Bal31- behandlede DNA-ene .

2,2 ug av hver av plasmid-DNA pJDB207/IF2( 51) og pJDB207/ IF2(l'b), etter 90 sekunder med Bal31-oppkutting (se eksempel 22a) inkuberes i 1 time ved 37°C med 2,8 E Klenow DNA-polymerase (stort fragment av polymerase I, BRL) i 3 5 ul 60

mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 0,1 mM dNTP<1>s.

3 ug Xhol-koblere (5<1->CCTCGAGG-3<*>, Collaborative Research) kinasebehandles i 50 ul med 6 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2 4 mM DTT, 0,5 mM ATT og 35 E T4 polynukleotid-kinase (Boehringer)i 30 minutter ved 37°C.

0,67 ug kinasebehandlede Xhol-koblere og 0,4 ug Bal31-behand-

let buttende-DNA fra plasmid pJDB207/IF2(5^ eller pJDB207/ IF2(l'b) bindes sammen over natten ved værelsestemperatur

i 25 ul 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 4 50 E T4 DNA-ligase. Den sammenbundne DNA adskilles fra overskudd koblere ved isopropanolutfelling i nærvær

av 10 mM EDTA, 0,3 M natriumacetat pH 6,0 og 0,54 volumdeler isopropanol. Etter 35 minutter med inkubering ved værelsestemperatur, sedimenteres DNA-en ved sentrifugering. Pellet-ene tørkes i luft og resuspenderes i 17 ul m mM tris pH

7,9, 150 mM NcCl, 6 mM MgCl2 og 6 mM merkaptoetanol. Xhol-koblerne bundet til DNA-en spaltes med Xhol, DNA-en utfelles med isopropanol som beskrevet tidligere, og ringsluttes ved sammenbinding. Etter 6 timer med sammenbinding ved 15°C i 50 ul 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 E T4 DNA-ligase, tilsettes 10 ul av hver sammenbindingsblanding til 100 ul kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E.coli HB101 celler (se eksempel 4a). 72 transformerte, amp -kolonier som inneholder plasmider med et IFN-5-^-innskudd, dyrkes hverfor seg i LB-medium som inneholder 100 mg/liter ampicillin. Plasmid-DNA analyseres ved Haelll-oppkutting. Restriksjonsmønstret gir mulighet for å bedømme den omtrentlige størrelse av den innførte fjerning med Bal31. To kloner analyseres videre og måles med hensyn på interferonaktivitet. De refereres til som pJDB207/IF2(5X)a72 og pDJB207/IF2(51)a82.

Nukleotidsekvensen på hver side av det nye sammenknytningspunktet (Xhol-kobler) mellom det 3<1->ikke-oversatte området i IFN-5-^-genet og avslutningsområdet for transkripsjon av PH05 er gjengitt i fig. 28.

På o en analog måo te dyrkes 60 amp R-kolonier som inneholder plasmider med et IFN-1<1>b-innskudd, hver for seg i LB-medium som inneholder 100 mg/liter ampicillin. Plasmid-DNA analyseres som beskrevet ovenfor. En klon velges ut

og måles med hensyn på IFN-aktivitet. Den refereres til

som pJDB2 07/IF2(1'b)A.

Eksempel 2 3

Konstruksjon av rekombinante plasmider som inneholder flyttbare cDNA- innskudd for IFN- 5.^ - 8^

og - l' b som kan brukes til direkte ekspresjon- av fullt utviklet lymfoblastoid- IFN ( jfr, fig. 29

og 30).

a) Fremstilling av cDNA- innskuddene.

cDNA-innskuddene fjernes fra de rekombinante plasmidene

CG-pBR322/HLycIFN-8|, CG-pBR322/HLycIFN-l'b, CG-pBR322/HLycIFN-5^ ved oppkutting av hver av 150 ug plasmid-DNA med

Pstl (Biolabs) under anvendelse av fremgangsmåten foreslått av leverandøren. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling isoleres de fjernede innskuddene ved hjelp av sukkrose-tetthetsgradient-sentrifugering (5-23%) i 50 mM tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Sentrifugeringen utføres ved 35000 rpm i en TST 41-sentrifuge (Kontron AG) ved 15°C i 16 timer. 0,3ml fraksjoner samles opp med en ISCO-gradient oppsamler med 1 ml/min. Fraksjonene som inneholder det lille fragmentet (dvs. innskuddet) slås sammen. DNA-en utfelles med etanol på vanlig måte og utfellingen samles opp ved sentrifugering i en HB-4-sentrifuge (Sorvall) ved 10 000 rpm,

ved 0°C i 10 minutter. Bunnfallet oppløses på nytt i 60

ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA. Ca. 30 ug DNA utvinnes, bestemt ved å måle den optiske tetthet. 2 ug av hver av cDNA-innskuddene kuttes opp med 2,5 enheter Sau3A (Biolabs) i 10 ug/ml EtBr og inkuberes ved 37°C i 60 minutter. Oppkuttingene fenolekstraheres og DNA-en utfelles i etanol som ovenfor. DNA-fragmentene fraksjoneres på en 1,2% agarosegel i en oppløsning som inneholder 50 mM tris,

50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 ug/ml etidiumbromid.

Det nest største DNA-fragmentet (Sau 3A-PstI) fra hver av

de tre oppkuttingene fjernes fra gelen, sprøytes gjennom

en tynn nål med en sprøyte inn i 5 ml med 0,15 m NaCL, 50

mM tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA og elueres over natten ved rysting. 'Eluatet sendes <q>iennom en 100 ul DE-52 Pasteur-pipette-kolonne for å adsorbere DNA-en. Kolonnen vaskes med 2 ml av den samme buffer og DNA-en elueres med

400 ul av en oppløsning som inneholder 1,5 mM NaCl, 50 mM tris (pH 8,0) og 1 mM EDTA. DNA-en utfelles med to volumdeler etanol ved -20°C over natten. Utfellingene samles

opp ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge og oppløses på nytt i 10 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,8), 0,05 mM EDTA.

b) Fremstilling av akseptor- plasmid- DNA- fragmentet.

1. Oppkutting av plasmidet pBR322 ved EcoRI og .

10 ug plasmid-DNA pBR322 kuttés opp med 15 enheter EcoRI (Biolabs) i 60 minutter ved 37°C under betingelser beskrevet av leverandøren. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling, oppløses DNA-en på nytt i 25 (il ^O og de utstikkende endene fjernes ved behandling av DNA-en med 2 0 enheter endonuklease (P-L Biochemicals) i 350 ul av en oppløsning som inneholder 250 mM NaCl, 30 m natriumacetat, (pH 4,5), 1 mM ZnS04 ved 30°C i 30 minutter. Reaksjonen stanses ved å tilsette

EDTA (pH 7,5) i 10 mM. DNA-en ekstraheres med fenol, oppkonsentreres ved etanolutfelling og oppløses på nytt i

50 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,8), 0,05 mM EDTA.

2. Sammenbinding av en kjemisk syntetisert DNA- kobler med pBR322 oppkuttet med EcoRI og S.^.

2 oligodeoksynukleotider med formlene

syntetiseres ved å bruke fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10Ea.

De syntetiske oligodeoksynukleotidene fosforyleres i sine 5'-ender ved å inkubere 80 pmol av begge oligodeoksynukleo-3 2 -1

tidene med 20 uCi [ y- P]-ATP (6700 Ci.mmol , Amersham)

i et 80 ul reaksjonsvolum som inneholder 0,1 mM rATP (Sigma), 50 mM Tris-HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2. 5 mM DTT og 20 enheter T4 polynukleotid-kinase i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonen stanses ved nedfrysing av blandingen ved -80°C.

Den resulterende radioaktivt fosforyliserte kobler med formelen

inkuberes deretter med 6 ug pBR322 spaltet med EcoRI og

(se ovenfor) i et 200 ul reaks jonsvolum som inneholder 0,5 mM rATP 0,1 mM DTT, 20 mM Tris. HC1 (pH 7,8), 10 mM MgCl2 og 4,IO<3> enheter T4 DNA-ligase ved å inkubere blandingen i 2 timer ved 15'C.

Oppløsningen avproteiniseres ved fenolekstraksjon og DNA-

en oppkonsentreres ved etanolutfelling. DNA-en oppløses pa nytt i 100 ul 10 mM tris.HCl (pH 7,5), 0,05 mM EDTA

og sentrifugeres gjennom en sukkrosegradient (5-23%) i 50 mM tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA. Sentrifugeringen ut-føres ved 60 000 rpm i en TST 60-sentrifuge (Kontron AG) ved 15°C i 2,5 timer. 0,2 ml fraksjoner samles opp med en ISCO-gradient oppsamler med 1 ml pr. minutt. Fraksjonene som inneholder den [ 32P]-merkede plasmid-DNA (fraksjonene 11-14 av 22 fraksjoner) slås sammen, DNA-en utfelles med etanol og kuttes opp med 12 enheter BC11 som foreskrevet av leverandøren. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling, behandles den oppkuttede DNA med 10 enheter Pstl som foreskrevet av leverandøren. Den fenolekstraherte oppkuttingen sentrifugeres deretter gjennom en (5-23%) sukkrose-tetthetsgradient i 15 timer ved 35 000 rpm, ved 15°C i 1 TST 41-sentrifuge (Kontron AG). 0,3 ml fraksjoner samles opp (se ovenfor) og fraksjonene som inneholder det store [ 3 2P]-merkede Bcll-Pstl-DNA-fragmentet (fraksjonene 27-31 av 42 fraksjoner) slås

sammen og oppkonsentreres ved etanolutfelling. DNA-en opp-løses på nytt i 20 ul tris.HCl pH 7,8, 0,05 mM EDTA. c) Sammenbinding av akseptor- cDNA i fragmentet med cDNA-innskuddene.

2ul av plasmid-DNA-fragmentet for akseptor (ca. 100 ng)

(se ovenfor) inkuberes med 5 ul av hvert cDNA-innskudd (ca.

20 ng) (se ovenfor) i et reaksjonsvolum som inneholder 20

mM tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 0,1 mM rATP, 0,1 mM

DTT og 400 enheter T4 DNA-ligase i 10 ul i 3 timer ved 15°C.

5 ul av reaksjonsblandingene tilsettes deretter til en blanding som inneholder 150 ul kalsium-behandlet E.coli HB101

i 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 og 10 mM tris.HCl (pH 7,5) i et totalt volum på 200 ul.

Blandingen nedkjøles på is i 20 minutter, oppvarmes til

42°C i 1 minutt og inkuberes ved 20°C i 10 minutter. 1 ml tryptonmedium (tryptonmedium inneholder 10 g Bacto-Trypton 1 g gjærekstrakt, 1 g glukose, 8 g NaCl og 294 mg CaC12.2 H2O i 1 liter destillert vann) tilsettes og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C med rysting ved 300 rpm. Blandingen plates ut på 2 agar-plater (Mc Conkey gar, Difco; 0,6 ml/plate) supplert med 10 jjg/mol tetracyklin. Platene inkuberes ved 37 °C i 12-17 timer. Omtrent 1000 kolonier erholdes pr. transformasjonsblanding. 4 kolonier plukkes ut fra hver transformasjonsblanding for videre analyser.

d) Restriksjonsanalyse av hybrid plasmidene.

For å analysere de potensielle hybrid plasmidene videre,

isoleres plasmid-DNA-en fra 12 kolonier (4 fra hver av de 3 sammenbindingsblandingene, se ovenfor).

Den hybride plasmid-DNA isoleres på følgende måte: en koloni brukes til å inokkulere 10 ml Trypton-medium supplert med 10 ug/ml tetracyklin som ovenfor i en 25 ml Erlenmeyerkolbe. Kulturen rystes i 15-18 timer ved 37°C og 300 rpm. Cellene høstes ved sentrifugering (Sorvall, HS-4-sentrifuge, 10 minutter ved 4000 rpm, 4°C). Det erholdes ca. 0,1 g celler og disse resuspenderes i 1 ml 50 mM tris.HCl (pH 8,0).

0,25 ml lysozym-oppløsning (10 mg/ml i 50 mM tris-HCl (pH 8,0), lysozym leveres av Sigma) tilsettes og etter inkubering ved 0°C i 10 minutter, tilsettes 0,15 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5). Etter ytterligere 10 minutter tilsettes 60 ul 2% Triton X-100 (Merck). Etter 30 minutter ved 0°C, sentrifugeres prøven i 3 0 minutter ved 15 000 rpm og 4°C i en Sorvall SA-600 sentrifuge. Supernatanten avproteiniseres med en volumdel fenol (mettet i TNE). Fasene adskilles ved sentrifugering (Sorvall HB-4 sentrifuge) i 10 minutter ved 5000

rpm og 4°C. Den øvre fasen ekstraheres 2 ganger med 1 volumdel kloroform. RNAse A fra bukspyttkjertel (Sigma, 10 mg/ml i TNE, på forhånd oppvarmet i 10 minutter ved 85°C) tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 25 ug/ml og blandingen inkuberes i 40 minuter ved 37°C. Oppløsningen justeres så til 1 M NaCl og 10% polyetylenglykol 6000 (Fluka, autoklavert i

20 minutter ved 120°C) og inkuberes ved -10°C i 2 timer. Utfellingen samles opp i en Sorvall HB-4 sentrifuge (20 minutter ved 10 000 rpm, 0°C) og oppløses på nytt i 100

ul TNE. DNA-oppløsningen ekstraheres med 1 volumdel fenol og DNA-en utfelles med 2 volumdeelr etanol ve -80°C i 10 minutter.

Utfellingen samles opp ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge og DNA-en oppløses på nytt i 20 ul 10 mM tris.HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. 8-10 ug hybrid-plasmid-DNA utvinnes fra 10 ml kulturoppløsning.

Alle plasmid-DNA-ene analyseres ved den følgende doble oppkuttingen: 0,5 pg av hver DNA kuttes opp med Hindlll og Pvyll, Hindlll og Pstl, Hindlll og BamHi, EcoRI og Pstl ved å bruke standard fremgangsmåter, og fraksjoneres på en 1,5% agarosegel etter størrelse i 40 mM Tris.acetat (pH 7,8), 1 mM

EDTA som inneholder 0,5 pg/ml EtBr.

Hybrid-plasmidene som har det ønskede restriksjonsenzym mønstret velges ut. Resultatet er oppsummert i fig. 29 og 30. Plasmid-DNA som inneholder innskuddet avledet fra pBR322/ HLycIFN-8| eller pBR322/HLycIFN-51 eller pBR322/HLycIFN-

l'b betegnes henholdsvis CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 og CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 og CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258.

For å ytterligere bekrefte strukturen i sammenknytningspunktet mellom kobleren og starten på den kodende sekvensen til IFN-cDNA-ene, fastlegges nukleotidsekvensen i dette området. Spesielt kuttes 2 ug av den isolerte plasmid-DNA CG-pBR322/HLycIFN(a-l)-258 opp med EcoRI, merkes i 5'-endene og spaltes med Pstl. DNA-fragmentene fraksjoneres på en 6% polyakrylamid-gel og EcoRI<*->PstI (9,4 bp) DNA-fragmentet ekstraheres som beskrevet ovenfor. DNA-fragmentet sekvensanalyseres ifølge Macxam og Gilbert (15).

Strukturen i sammenknytningspunktet mellom kobleren og starten for den kodende sekvensen til IFN-cDNA-ene i plasmidene CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 og CG-pBR322/HLycIFN(a-3)252 bekreftes på analog måte.

I plasmidene CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258, -(a-2)-261 og

-(a-3)-252 har de IFN-kodende sekvensene det følgende nukleo-tidsekventet som inneholder et EcoRI-restriksjonssted, foran seg:

Eksempel 24.

Fjerning av signalsekvensen til PH05 i ekspresjonsplasmidet P31 ( se fig. 31).

Ekspresjonsplasmidet p 31 inneholder promotersekvensen til PH05 inkludert start-stedene for mRNA, start-kodonet

ATG for translasjon av sur fosfatase og dertil 40 nukleotider som koder for en del av signalsekvensen for sur fosfatase.

I denne konstruksjonen fjernes nukleotidene for signalsekvensen og ATG-en ved Bal31-oppkutting. EcoRI-koblere innføres for å åpne muligheten for sammenknytning av PH05-promoteren til passende, fullstendige kodende sekvenser (f.eks. interferon-gener).

a) Bal31- oppkutting av Ball- spaltet plasmid p30.

20 ug p30 DNA (se eksempel 4b) kuttes opp med restriksjonsendonuklease Ball, hvilket resulterer i 2 fragmenter på

3,7 og 5,1 kb. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform, utfelles DNA-en med etanol. DNA-en resuspenderes i 10 mM tris pH 8,0 til en konsentrasjon på 0,5' ug/ml. 9 ug Ball-spaltet p30-DNA kuttes opp med 2 E eksonuklease Bal31 (BRL) i 100 ul 20 mM tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 12

mM CaCl2 og lmM EDTA. Alikvoter på 2 ug DNA hver tas ut etter 15 sekunder, 30 sekunder, 45 sekunder og 60 sekunder med inkubasjon ved 30°C og blandes umiddelbart med 50 ul fenol og 60 ul TNE. Etter ekstraksjon med fenol/

kloroform og etanolutfelling, resuspenderes DNA-en i 10

mM tris pH 8,0 til en konsentrasjon på 100 ug/ml. For å analysere utstrekningen av eksonukleolyttisk spalting med Bal31, oppkuttes 0,5 ug DNA fra hvert tidspunkt med endonuklease BalHI og analyseres på en 1,5% agarosegel i tris-borat-buffer, pH 8,3. I gjennomsnitt fjernes 70 bp fra hver ende av fragmentet etter 45 sekunder med Bal31-oppkutting. For ytterligere eksperimenter brukes DNA fra 45 sekunders tidspunktet.

b) Tilføying av EoRI- koblere til den Bal31- behandlede DNA.

2 A260-enheter med EcoRI-koblere (5'-GGAATTCC-3', BRL) resuspenderes i 250 31 10 mM tris pH 8, 1 mM EDTA. 2 ug EcoRI-koblere kinasebehandles i 75 ul 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DDT, 10 uM ATP og 33 E T4 polynukleotid-kinase. Etter 1 time ved 37"C får blandingen avkjøles til værelsestemperatur og lagres deretter ved -20°C.

De sammenknyttede, dobbeltkjedede EcoRI-koblerne, bindes

med sine butte ender til Bal31-behandlede DNA-fragmenter.

Et halvt ug Bal31-behandlet DNA (se eksempel 24a), inkuberes i 16 timer ved værelsestemperatur med et 50 x overskudd kinasebehandlede EcoRI-koblere i 20 ul 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP og 600 E T4 DNA-ligase Etter inaktivering av T4 DNA-ligasen (10 minutter ved 65°C), spaltes overskuddet med EcoRI-koblere med 50 E EcoRI i et volum på 50 pl. DNA ekstraheres med fenol/kloroform, utfelles med etanol og resuspenderes i 10 mM Tris, 1 mM EDTA.

Restriksjons endonuklease EcoRI spalter ikke bare EcoRI-koblerne som er tilføyd endene på begge Ball-fragamentene (3,7 kb og 5,1 kb), men også ved et indre EcoRI-sted i det 5,1 kb store fragmentet, hvilket gir et 3,9 kb stort og et 1,2 kb stort fragment. De 3,7 kb og 3,9 kb store fragmentene adskilles fra det 1,2 kb store fragmentet på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel (Sigma) i 90 mM tris-HCl pH 8,3, 90 mM borsyre og 2,5 mM EDTA. DNA-båndene farges med etidiumbromid og synliggjøres under langbølget UV-lys ved 3 66 nm. De to store DNA-fragmentene på 3,7 kb og 3,9 kb adskilles ikke. De skjæres ut av gelen i et eneste gelstykke og ekstraheres som beskrevet i eksempel 4a.

De rettkjedede fragmentene som avsluttes i EcoRI-utstikkende ender ringsluttes ved sammenbinding. Ca. 0,25 ug av fragmentene bindes i 100 ul 60 mM tris Ph 7,5, 10 mM MgCl2,

10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 E T4 DNA-ligase i 4 timer ved 15°C. 10 ul alikvoter av sammenbindingsblandingen tilsettes til lOOul kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E.coli HBlOl-celler (se eksempel 4a). 35 transformerte, amp R-kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles ifølge fremgangsmåten til Holmes et al., (50) og analyseres ved dobbelt oppkutting med EcoRI/BamHI. c) Nukleotidsekvens analyse for å bestemme posisjonen til den innførte EcoRI- kobler.

De fleste av de 35 klonene vil adskille seg fra hverandre med hensyn til posisjonen for den innførte EcoRI-kobler i PH05-promoter området avhengig av graden av Bal31-oppkutting på de enkelte DNA-molekylene. For nukleotidsekvensana-lyse kuttes plasmid-DNA opp med EcoRI. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform, utfelles den restriksjonsbehandlede DNA med etanol. DNA-en;defosforyleres og 5'-endene merkes som beskrevet i eksempel 10Ed. De merkede DNA-fragmentene spaltes med en andre restriksjons endonuklease, BamHI. Produktene separeres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det 0,5-0,6 kb store 5<1->merkede EcoRI-BamHI-fragmentet isoleres fra den lavtsmeltende agarose som beskrevet i eksempel 4a. For bestemmelse av nukleotidsekvensen som grenser opp til EcoRI-kobleren, nedbrytes de forskjellige DNA-fragmentene kjemisk og produktene adskilles ved polyakrylamidgel-elektroforese som beskrevet av Macam og Gilbert (15).

De forskjellige klonene og posisjonene for det tilsvarende siste nukleotidet i PH05-sekvensen (deretter fulgt av en EcoRI-kobler) er oppstilt i tabell 4 (se også fig. 32). d) Isolering av et 0, 53 kb BamHI- EcoRI- fragment som inneholder PH05/ R- promoteren.

Plasmid pR inneholder PH05/R-promoteren i et 534 bp BamHI-EcoRI-fragment. Ifølge nummereringen i fig. 3a, dekker fragmentet PH05-promotersekvensene fra nukleotid -541 (BamHI-sted) til nukleotid -10. En EcoRI-kobler bundet til nukleotid -10 (se eksempel 24b) bidrar med 2 G-rester etter EcoRI-spalting.

Plasmid pR kuttes opp med restriksjons endonukleasene BamHI og EcoRI. Det 0,53 kb store BamHI-EcoRI-fragmentet fraskilles på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel og isoleres som beskrevet i eksempel 4a. Nukleotidsekvensen er gjengitt i fig. 33.

På en analog måte kuttes plasmid pY opp og et 0,53 kb BamHI-EcoRI-fragment som inneholder PH05/Y-promoteren, isoleres. Nukleotidsekvensen er gjengitt i fig. 34. e) Erstatning av Sali EcoRI- fragmentet i plasmid p31 med et Sall- EcoRI- fragment fra de nye konstruksjonene. 5 ug p31 (jfr. eksempel 13d) kuttes opp med restriksjonsendonuklease Sali. Den restriksjonsbehandlede DNA utfelles med etanol og resuspenderes i 50 ul 100 mM tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2. DNA-en utsettes for fullført oppkutting med EcoRI. Restriksjonsfragmentene adskilles på

en 0,8% lavtsmeltende agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer pH 8,3. Et 3,5 kb DNA-fragment isoleres i et lite gelstykke som inneholder DNA-båndet.

5 ug av hver av klonene pR og pY (jfr. tabell 4 og fig.

32) kuttes opp med Sali og EcoRI på samme måte som beskrevet ovenfor. De 0,8 kb store DNA-fragmentene isoleres i små stykker med lavtsmeltende agarosegel.

0,67 ug av det 3,5 kb store Sall-EcoRI-fragmentet av vektor p31 bindes sammen med 0,34 ug av det 0,8 kb store Sall-EcoRI-fragmentet av henholdsvis plasmid pR og pY. Passe store gelstykker som inneholder DNA-fragmentene blandes og smeltes ved 65°C. Den smeltede gelen fortynnes 3 ganger. Sammenbinding utføres i et totalt volum på 240 ul med 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 7 50 E T4 DNA-ligase (Biolabs) over natten ved 15°C. En 2 ul alikvot av hver av sammenbindingene tilsettes til 10 ul kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E.coli HBlOl-celler

(se eksempel 4a).

8 transformerte, amp -kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA analyseres ved restriksjonsanalyse. Klonene fra hver gruppe er identiske. En klon fra hver brukes videre og refereres til som henholdsvis p31/R eller p31/Y, (fig. 31).

Eksempel 25.

Innføring av DNA for lymfoblastoid- interferon-

Q- 3 DNA i plasmid p31/ R eller p31/ Y ( jfr, fig. 31).

Denne konstruksjonen knytter PH05-promoterområdet til genet som koder for fullt utviklet interferon-a-3. Ingen av signalsekvensene til PH05 eller interferon er tilstede,

men der er en EcoRI-kobler innført på stedet for sammenknyttingen .

Plasmid p31/R (se eksempel 24e) inneholder PH05-promotersekvensen som avsluttes 9 nukleotider foran ATG-en i genet for sur fosfatase med en EcoRI-kobler 5<1->GGAATTCC-3<1>. Genet for lymfoblastoid-interferon-a-3 gen i plasmid CG-pBR322/ HLycIFN(a-3)-252 (se eksempel 23) tilpasses spesielt for sammenknyttingen med EcoRI-kobleren i PH05-promoteren.

De ytterligere nukleotidene i 5'-enden til den kodende sekvensen for fullt utviklet interferon-a-3 tilveiebringer et EcoRI-restriksjonssted og en ATG som er nødvendig for translasjonen av interferon-genet. (Jfr. fig. 29). I det vesentlige den samme oppbyggingen gjøres også med plasmid p31/Y (se eksempel 24e). a) Fremstilling av EcoRI spaltet, defosforylert plasmid p31/ R.

5 pg plasmid p31/R utsettes for fullført oppkutting med restriksjons endonuklease EcoRI. Etter ekstraksjon med fenol/kloroform, utfelles DNA med etanol og resuspenderes i 100 pl 50 mM Tris pH 8,0. Passering av DNA gjennom Chelex 100, defosforylering med alkalisk fosfatase fra kalvetarmer og rensing av den defosforylerte DNA ved DE52 ionebytter kromatografi gjøres

som beskrevet i eksempel 14b. DNA-en resuspenderes i 10

mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA til en konsentrasjon på 0,2 mg/ml.

b) Isolering av et 0, 6 kb EcoRI- fragment av plasmid CG-pBR322/ HLycIFN( a- 3)- 252 som inneholder den kodende sekvensen

for IFN- a- 3.

10 ug plasmid CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 kuttes opp med restriksjons endonuklease EcoRI. Oppkuttingen resulterer i 2 fragmenter på 3,8 kb og 0,6 kb. Det 0,6 kb store fragmentet inneholder det kodende området for interferon-a-3. Fragmentet isoleres på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel

i tris-borat-EDTA-buffer. Gelstykket som inneholder det 0,6 kb store DNA-fragmentet skjæres ut av gelen og brukes til sammenbinding.

c) Sammenbinding av defosforylert p31/ R DNA som er gjort rettkjedet, og det 0, 6 kb store EcoRI- fragmentet fra DNA

for IFN- a- 3.

1,5 ug defosforylert p31/R-vektor DNA spaltet med EcoRI, bindes sammen med 0,19 ug av det 0,6 kb store EcoRI-fragmentet fra IFN-a-3. Det sistnevnte fragmentet foreligger i et lite stykke lavtsmeltende agarosegel som smeltes ved 65°C. Den smeltede gelen fortynnes to ganger. Sammenbinding utføres i et totalt volum på 220 ul 60 mM tris pH 7,5, 10

mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 800 E T4 DNA-ligase (Biolab) over natten ved 15°C. En 10 ul alikvot av sammenbindingsblandingen tilsettes til 100 ul kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E.coli HBlOl-céller (se eksempel 4a).

6 transformerte, amp -kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles ifølge fremgangsmåten til Holmes et al. (50)

og analyseres ved Bglll/BstEII dobbelt oppkuttinger for å bestemme orienteringen av og størrelsen på innskuddet.

En av disse klonene refereres til som p31R/IF(a-3).

Den samme konstrueringen gjøres med p31/Y (se eksempel 24e). Plasmidene fra 6 transformerte, amp -kolonier analyseres. 2 kloner har den rette orienteringen for innskuddet. En av den refereres til som p3lY/IF(a-3).

Eksempel 26.

Innføring av DNA for lymfoblastoid- interferon-g-

2 i plasmid p31/ R ( se fig. 36).

Denne konstrueringen knytter PH05-promoteren til det kodende området for fullstendig utviklet interferon-ct-2. a) Isolering av et 3, 9 kb HindIII- EcoRI- fragment av vektor p31/ R. 10 ug av vektor pel/R tsettes for fullført oppkutting med Hindlll. Bufferen justeres med 0,1 volumdel 1 M tris pH 7,5. Den Hindlll-spaltede p31/R-DNA kuttes deretter opp med EcoRI. Det 3,9 kb store HindIII-EcoRI-fragmentet isoleres fra en 0,8 % lavtsmeltende agarosegel i et gelstykke som skjæres ut av gelen. b) Isolering av et 0, 9 kb XbaI- HindIII- fragment av pJDB207/ IF2 ( 5-^ . 5 ug plasmid pJDB207/IF2 (5.^) (jfr. eksempel 17) utsettes for fullført oppkutting med Hindlll. Bufferen justeres med 0,1.volumdel 1 M tris pH 7,9. Det Hindlll-spaltede plasmidet kuttes deretter opp med Xbal. Det 0,9 kb store XbaI-HindIII-fragmentet inneholder en del av den kodende sekvensen for interferon-a-2 og avslutningssignalene for transkripsjon som kommer etter PH05. Det 0,9 kb store fragmentet fraskilles på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel og skjæres ut av gelen.

c) Isolering av et 252 bp EcoRI- Xbal- fragment fra plasmid CG- pBR32 2/ HLycIFN( ct- 2)- 2 61 som inneholder en del av den

kodende sekvensen for IFN- a- 2.

10 ug plasmid CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 (se eksempel 23)

kuttes opp med Xbal i 100 ul 6 mM tris pH 7,9, 150 mM NaCl,

6 mM MgCl2 og 6 mM merkaptoetanol. Etter fullført oppkutting med Xbal, kuttes plasmid-DNA-en som er gjort rettkjedet, delvis opp med 3 E EcoRI (Boehringer). Etter 20 minutter ved 37°C stanses oppkuttingen ved nedfrysing ved -70°C. DNA-fragmentene analyseres på en 1,5% agarosegel i tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. Det 252 bp store EcoRI-Xbal-fragmentet inneholder 5<1->delen av den kodende sekvensen for det fullstendig utviklede interferon-a-2 (opp til Xbal-stedet) med den spesifike kobleren for sammenknyttingen med PH05-promoteren. Det 252 bp store fragmentet isoleres i et lite gelstykke fra en 0,8% lavtsmeltende agarosegel.

d) Sammenbinding av DNA- fragmenter.

3 DNA-fragmenter beskrevet i eksemplene 2 6a-c som har passende

utstikkende ender, bindes sammen i en enkelt omsetning:

0,67 ug av det 3,9 kb store HindIII-EcoRI-fragmentet fra vektor p31/R, 0,16 ug av det 0,9 kb store XbaI-HindIII-fragmentet fra pJDB207/IF2(51) og ca. 70 ng av det 250 bp store EcoRI-Xbal-fragmentet fra CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 bindes sammen. Alle 3 DNA-fragmentene foreligger i små gelstykker av lavtsmeltende agarose. De tre stykkene med agarosegel føres sammen, smeltes ved 65°C og fortynnes 3 ganger. Sammenbindingen gjøres i et totalt volum på 450 ul 60 mM tirs pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 1200 E T4 DNA-ligase ved 15°C i 16 timer. En 10 ul alikvot av sammenbindingsblandingen tilsettes til 100 ul kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E.coli HBlOl-celler (se eksempel 4a) .

12 transformerte, amp -koloner dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles ifølge fremgangsmåten til Holmes et al. (50)

og analyseres ved dobbelt oppkutting med BamHI/Hindlll.

Alle klonene oppviser et identisk oppkuttingsmønster. En

av dem refereres til som p3lR/IF(a-2).

Istedet for det 0,9 kb store XbaI-HindIII-fragmentet fra pJDB207/IF(51) kan også et 0,5 kb stort XbaI-HindIII-fragment fra plasmid pJDB207/IF2 ( 5- L) A72 eller pJDB207/IFl ( 51) A82

(se eksmpel 22) brukes til sammenbindingen. Istedet for det 3,9 kb store HindIII-EcoRI-fragmentet fra vektor p31/R, utføres sammenbindingen også med det 3,9 kb store HindlllEcoRI-fragmentet fra vektor p31/Y.

Betingelsene for sammenbinding av DNA-fragmentene og transformasjonen av E.coli HB101 er de samme som beskrevet ovenfor

12 transformerte, amp -kolonier fra hver sammenbinding dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA analyseres ved dobbelt oppkutting med BamHI/

Hindlll. De resulterende klonene refereres til som p31R/ IF(a-2)A72, p31R/IF(a-2) A82, p31Y/IF ( a-2 ) , p31Y/IF(a-2)A72 og p3lY/IF(a-2)A82.

Eksempel 27.

Innføring av DNA for lymfoblastoid- interferon-

g - 1 i plasmid p31/ R ( se fig. 37).

a) Isolering av et 3, 9 kb HindIII- EcoRI- fragment fra vektor p31/ R: 10 ug vektor p31/R kuttes opp med Hindlll og EcoRI som beskrevet i eksempel 26a. De resulterende 0,4 kb og 3,9 kb store fragmentene adskilles på en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det 3,9 kb store HindIII-EcoRI-fragmentet elueres fra gelen som beskrevet i eksempel 4a. DNA-en renses ved DE52 ionebytterkromatografi (se eksempel 5a), utfelles med etanol og resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml. b) Isolering av 0, 9 kb PvuII- Hind I - fragment fra pJDB207/ IF2( l' b) : 5 ug plasmid pJDB207/IF2(1'b) (jfr. eksempel 17) kuttes opp med PvuII og Hindlll. De resulterende fragmentene på 0,9 kb og 7,5 kb adskilles på en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det 0,9 kb store fragmentet elueres fra gelen og renses som beskrevet i eksempel 27a. DNA-en resuspenderes i 10 mM tris pH 8,0, 1 mM EDTA til en konsentrasjon på 0,05 mg/ml.

c) Isolering av et 286 bp EcoR - PvuII- fragment fra plasmid CG- pBR322/ HLycIFN( a- l)- 258 som inneholder en del av den

kodende sekvensen for IFN- a- 1.

10 ug plasmid CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258 (se eksempel 23) kuttes opp med PvuII og EcoRI. Et 286 bp restriksjonsfragment adskilles fra et 4,2 kb fragment på en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det 286 bp store EcoRI-PvuII-fragmentet elueres fra gelen og renses som beskrevet i eksempel 27a. DNA-en resuspenderes i 10 mM tris pH 8,0, 1 mM EDTA i en konsentrasjon på 0,03 mg/ml.

d) Sammenbinding av DNA- fragmentene.

0,5 ug av det 3,9 kb store HindIII-EcoRI-fragmentet fra

vektor p31/R, 0,25 ug av den 0,9 kb store PvuII-Hindlll-fragmentet fra pJDB207/IF2(1'b) og 0,1 ug av det 286 bp store EcoRI-PvuII-fragmentet fra plasmid CG-pBR322/ HLycIFN(ail)-258 bindes sammen i 16 timer ved 15°C i 20

(il 60 mM tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 4 mM ATP og 600 E DNA-ligase. En 3 ul alikvot av sammenbindingsblandingen tilsettes til 100 ul kalsium-behandlede, transformasjonskompetente E.coli HBlOl-celler (se eksempel 4a). 12 transformerte, amp -kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium med 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA analyseres ved dobbel oppkutting med BamHI/Hindlll. En klon som gir opphav til et 1,4 kb BamHI-fragment og et 390 bp BamHI-HindIII-fragment, analyseres videre og refereres til som p3lR/IF(a-l).

Det 3,9 kb store HindIII-EcoRI-fragmentet fra vektor p31/R kan erstattes med HindIII-EcoRI-fragmentet fra vektor p31/Y. Istedet for det 0,9 kb store PvuII-HindIII-fragmentet fra pJDB207/IF2(1'b), kan også et 0,45 kb PvuII-HindIII-fragment fra pJDB207/IF2(l'b)A brukes til sammenbindingen. De resulterende klonene analyseres som beskrevet ovenfor. Klonene refereres til som p3lR/IF(a-1)A, p3lY/IF(a-l) og p31Y/ IF(a-l)A.

Eksempel 28.

Subkloning av gen- konstruksjoner i gjærvektoren pJDB207 med høyt kopiantall ( se fig. 38).

Konstruksjonene beskrevet i eksempel 25 til 27 inneholder PH05-promoteren, forskjellige kodende områder for interferon og avslutningssignalene for transkripsjon av PH05 i en rekke-følge etter hverandre, idet alle er innført i en vektor avledet fra pBR322. SalI-HindIII-fragmenter som inneholder hele rekkefølgen bindes inn i det 6,2 kb store Sall-HindIII-fragmentet fra pJDB207 som beskrevet i eksempel 17. 2 ug plasmid p31R/IF(a-3) kuttes opp med restriksjons endonukleasene Sali og Hindlll. Restriksjonsfragmentene adskilles på en preparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det lille fragmentet (1,8 kb i størrelse) skjæres ut av gelen.

Plasmid pJDB207 kuttes opp med restriksjons endonukleasene Sali og Hindlll og det store 6,2 kb fragmentet isoleres

som beskrevet i eksempel 17.

Sammenbinding av DNA-fragmentene og transformasjon av kompetente E.coli HB101 celler utføres som beskrevet i eksempel 17. 8 amp -kolonier dyrkes hver for seg i LB-medium som inneholder 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA-en analyseres med hensyn på størrelsen av innskuddet ved spaltinger med restriksjons endonukleasene Hindlll og Sali. En klon med det korrekte innskuddet velges ut og refereres til som pJDB207R/IF(a-3).

På en analog måte, ved å gå ut fra plasmidene p3lY/IF(a-

3), p31R/IF(a-2), p31R/IF( a- 2)A72, p3lR/IF(a-2)A82, p31Y/IF(a-2), p31Y/IF(a-2)A72, p31Y/IF(a-2), p31R/IF(a-1), p31R/IF(a-l) , P3lY/IF(a-l) og p31Y/IF(a-1)A, erholdes de følgende klonene med det korrekte innskuddet:

pJDB207Y/IF(a-3),

pJDB207R/IF(a-2) ,

pJDB207R/IF(a-2)A72,

pJDB2 07R/IF(a-2)A82,

pJDB207Y/IF(a-2),

pJDB2 07Y/IF(a-2)A72,

pJDB207Y/IF(a-2)A82,

pJDB207R/IF(a-l) ,

pJDB207R/IF(a-1)A ,

pJDB207Y/IF(a-l) og

pJDB2 07Y/IF(a-1)A .

Eksempel 29.

Transformering av Saccharomyces cerevisiae AH220 og indusering av interferon produksjon.

Hvert av plasmidene pJDB207/IF2(51)A72, pJDB207/IF2(51)A82, pJDB207/IF2(l'b)A, pJDB207/IF(a-3), pJDB207Y/IF(a-3), pJDB207R/IF(a-2), pJDB207R/IF(a-2)A72, pJDB207R/IF(a-2)A82, pJDB207Y/IF(a-2), pJDB207Y/IF(a-2)A72, pJDB207Y/IF(a-2)A82, pJDB207R/IF(a-l), pJDB20 7R/IF(a-1)A, pJDB207[/IF(a-1) og pJDB207[/IF(a.l)A (se henholdsvis eksempel 22 og 28), inn-føres i Saccharomyces cerevisiae stamme AH220 (a, trpl, leu2-3, leu2-112, his3, pho5, pho3) ved å bruke transfor-meringsfremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al (1). Transformerte gjærceller velges ut på plater med minimalmedium for gjær som mangler leucin. Enkelttransformerte gjærkolonier plukkes ut og dyrkes som beskrevet i eksempel 7. De forskjellige gjærkoloniene refereres til som Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2( 5^)A72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2( 5^)A82, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(1<*>b)A, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2)A72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2)A82, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-2)A72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-2)A82, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-1), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-1)A, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-1) og Saccharomyces cerevisiae AH22 0/pJDB207Y/IF(a-1)A.

Eksempel 30.

Transformering av Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 og indusering av interferon produksjon.

Analogt med fremgangsmåten beskrevet i eksempel 29 transformeres Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (a, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can ) med plasmidene som er oppstilt i eksempel 29. De forskjellige gjærkoloniene refereres til som

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/IF2 ( 5-^) A72 , Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/IF2(51)A82, Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/IF2(1<1>b)A, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF ( a-2). A72 , Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2)A82, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF ( a-2■)'. A72 ,'., Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-2)A82, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-1), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-1)A, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-1) og Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-1)A.

Eksempel 31.

Fremstilling av gjærcelle- ekstrakter og bestemmelse av interferon titeren.

Celler fra 50 ml dyrkingsmedium med en celletetthet på 1-2x10 7/ml samles opp ved sentrifugering i en Sorvall GSA-sentrifuge i 10 minutter ved 3000 rpm. Cellene resuspenderes i 2 ml 0,1 M KH2P04 pH 7,4 og sentrifugeres ved værelsestemperatur i 5 minutter ved 3000 rpm. De sedimenterte cellene resuspenderes i 1,2 ml iskald lyseblanding (0,1 M kaliumfosfat buffer pH 7,4, 1 volum-% Triton X-100, 0,1 mM RMSF (Merck) og overføres til et 30 ml Corex-rør. 1,6 g glasskuler (0,4 mm i diameter) tilsettes til cellene og suspensjonen rystes på en Vortex-blander (Scientific Instruments Inc., USA)

med full hastighet i 30 sekunder og avkjøles deretter i 1 minutt i et isbad. Denne ryste-fremgangsmåten gjentas 5-10 ganger inntil mer enn 90% av cellene er brutt opp (kontroller under lysmikroskop).

Cellerester og glasskuler fjernes fra oppløsningen ved sen-trif ugering i 10 minutter ved 8000 rpm og 4°C i en Sorvall HB-4 sentrifuge. Supernatanten overføres til Eppendorf-

rør, fryses ned i flytende nitrogen og lagres ved -60°C. Interferonaktivitet bestemmes ifølge fremgangsmåten til Armstrong (32) ved å bruke human CCL-23-celler og vesiku-lart stomatitis virus (VSV) som prøve-virus. Resultatene er oppsummert i tabell 5.

Interferon-aktiviteten i S.cerevisiae stamme AH220 og GRF18 etter transformering med et rekombinant plasmid er vanligvis identisk. Tabell 6 viser en sammenligning av interferon-aktivitetene hos begge stammene etter transformering med plasmidene som er oppstilt i eksemplene.

Eksempel 32.

Fremstilling av interferon- a- 2 med en rekombinant stamme av gjæren Saccharomyces cerevisiae i en skala på 300 liter.

Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18/pJDB207R/IF(a-2)A82 bærer et plasmid som inkluderer en leucinmarkør som gir mulighet til selektiv opprettholdelse av plasmidet i vertorganis-men, et strukturelt gen for human-interferon-a-2 og PH05-promoteren for sur fosfatase som gir mulighet for ekspresjon av genet for IFN-a-2 i media med begrensende mengder uorganisk fosfat.

Stammen oppbevares på skrå agar kulturer fremstilt med et definert medium som mangler aminosyren leucin for å sikre bibeholdelse av plasmidet. Friskt inokulerte skråkulturer inkuberes i 24 timer ved 30°C. Overflatekulturen fra en skråkultur resuspenderes i 3 ml forkultur-medium som deretter overføres til den første forkulturen i rystekolbe. Den 500 ml store kolben har en eneste ledeplate og inneholder 100 ml forkultur-medium med den følgende sammensetningen (verdier i g/l) : ' gjær ek st r akt....10'0; L-aspargin, 6,6; KH2P04, 1,0; MgS04.7H2=, 1,0: L-histidin, 0,02 og D-glukose (monohydrat), 33,0. Mediet som er fremstilt ved

å bruke avionisert vann, har en pH-verdi på omtrent 6,0. Glukosen steriliseres separat. Denne første forkulturen inkuberes i 24 timer ved 30°C i en baneryster med 5 cm for-skyvning ved en hastighet på 250 omdr./min.

Den første forkultur-kolben gir inokulumet til de andre forkultur-kolbene. Disse kolbene mottar et inokulum-nivå

på 1 volum-%. Mediet og inkubasjonsbetingelsene er identiske med de ved den første forkulturen. Dyrkingsvæskene fra 36 slike kolber blandes, hvorved man får et inokulum på 1 volum-% til fermenteren for hovedproduksjon.

Produksjonsfermenteren har et totalt volum på omtrent 500 liter, inneholder 4 ledeplater og en eneste 6-bladet skive-turbin-rører med en diameter på 230 mm. Omrøringshastigheten er 450 omdr./min, overtrykket 0,3 bar og luftingshastigheten er 1 volumdel/volumdel/min. Fermenteren inneholder 300

liter av et medium med den følgende sammensetning (verdier i g/liter): L-aspirgin, 2,0; L-histidin,.0,02; KH2P04 ,

0,03; MgS04.7H20, 0,5; NaCl, 0,1; CaCl2.2H20, 0,1; KC1,

1,0; D-glukose (monohydrat), 20,0; vitamin-oppløsning,

5 ml(1 og sporelement-oppløsning, 5 ml/l. Mediet justeres til pH 7,2 ved å bruke NaOH før sterilisering. Glukosen, vitaminene og sporelementene steriliseres, separat og tilsettes mediet. Forrådsoppløsningene for vitaminer og sporelementer har de følgende sammensetninger (i g/liter): Vitaminer -

biotin, 0,0002; kalsium-D-pantothenat, 0,04; folinsyre, 0,0002; nikotinsyre, 0,04; p-aminobenzosyre, 0,02; pyridok-sinhydroklorid, 0,04; riboflavin, 0,02; tiaminhydroklorid, 0,04; og inositol, 0,2 i 1 liter avionisert vann, sporelementer - borsyre, 0,05; CuS04.5H20, 0,004; Kl, 0,01; FeCl3-6H20, 0,02; MnS<0>4.4H20, 0,04; Na2Mo04.2H20, 0,02 og ZnS04.7H20, 0,04 i 1 liter avionisert vann. Dyrkings-temperaturen er 30°C. pH-verdien faller til en verdi på

ca. 4,0 til 4,2 men kan kontrolleres om ønsket til en mellom-

liggende verdi ved å bruke natriumhydroksyd. Etter dyrking i ca. 18 timer, oppnås maksimumutbyttet av interferon (som bestemt ifølge Armstrong (32)). Den optiske tetthet som nås ved ca. 2,0 enheter og den sure fosfataseaktiviteten er nyttige indikasjoner på utviklingen av dyrkingen. Dyrkingsvæsken kan om nødvendig avkjøles til 10°C før innhøsting av gjærcellene.

Eksempel 33.

Isolering og rensing av HLyIFN- ct- 2.

a) Fremstilling av polypeptid oppløsningen til kolonnen med monoklonalt antistoff.

Et totalt volum på 600 liter dyrkingsvæske med en pH på

4,1 avkjøles til 10°C. Cellene separeres ved å bruke en Alfa-Laval BRPX-207 av-slammings-sentrifuge. Den klare supernatanten inneholder ingen IFN-aktivitet. Resterende supernatantvæske som er iblandet cellene, fjernes ved å vaske med 20 liter Lysis-buffer A (100 mM KHoP0., 500 mM NaCl, 0,1% volum-% Triton X-100 ^ og 0,1 mM PMSF justeres med KOH til pH 7,5). Innholdene i sentrifugeskålen (7 liter) kastes ut med fullstendig av-slamming og av-slammen vaskes en gang med 5 liter Lysis-buffer A. Den erholdte cellemassen fortynnes med buffer A til 60 liter og har en pH-verdi på 7,3. Suspensjonen avkjøles til 5-10°C og sendes gjennom en DYNO<®> -Mill (type KD 5) med en tilf ørselshastighet på

100 liter/time. Møllen i er utstyrt med polyuretan-omrørings-skiver og 4200 ml glasskuler med 0,5-0,75 mm i diameter,

og kjøres ved 1625 omdr./min. Suspensjonen med oppbrutte celler (pH ca. 7,3) sentrifugeres som beskrevet tidligere. Supernatanten (75 liter) oppkonsentreres til 3 liter ved ultrafiltrering. En alikvot (300 ml) av denne polypeptid-oppløsning sendes gjennom en H1P100 hullfilterpatron ved å bruke et Amicon DC-2 hullfibersystem. Ytterligere 2 liter av buffersystem B (30 mM tris-HCl, 500 mM NaCl, justert til pH 8,5) tilsettes filteret. Det kombinerte filtratet og vaskevannene (2 liter) oppkonsentreres til 100 ml ved

hjelp av en H1P10 hullfilterpatron. Konsentratet adsorberes på en kolonne med i DEAE-Trisakryl _R M_._ ..DEAE Kolonnen skylles og elueres deretter med buffer C (200 mM NaCl, 20 mM tris-HCl ved pH 8,5). Eluatet har en interferonaktivitet på o 1,4 x 10 6 IE/mg polypeptid målt ifølge fremgangsmåten til Armstrong (32). Eluatet lagres ved -20°C

før videre rensing på kolonnen med monoklonalt antistoff.

b) Rensing av human LyIFN- ot- 2 på en kolonne med monoklonalt antistoff.

Kolonnen NK2 med monoklonalt antistoff (lagvolum 20 ml), ekvilibreres med 20 mM Na-fosfat, 154 mM NaCl,

pH 7,4 og deler av den ovenfor nevnte polypeptid-oppløsningen tilføres kolonnen ved værelsestempera-

tur i en strømningshastighet på 50 ml/time. De første fraksjonene som inneholder de ikke-adsorberte polypeptidene,

og 100 ml PBS-utvaskinger, kastes. Videre elueres ikke-spesifikt bundne polypeptider med 100 ml PBS som inneholder ytterligere 0,5 M NaCl og 0,2% Triton X ™ Kolonnen vaskes med 200 ml 20 mM Na-fosfat, 0,3 M NaCl, pH 7,4, hvoretter de spesifikt adsorberte polypeptidene elueres med 50 ml buffer D (0,1 M sitronsyre, 0,3 M NaCl, pH 2). Oppløsningen justeres til pH 6,3 med 2N NaOH og oppkonsentreres ved 4°C

TM

ved hjelp av en nedsenkbar CX molekylseparator (Milli-pore ®). Konsentratet tilføres en Sephadex G-25 <®> fin grad-kolonne.(2,6 x 34 cm, 200 ml lagvolum) ekvilibrert med 0,025 M histidin.HCl ved pH 6,3. Kolonnen elueres med den samme histidin.HCl-buffer ved 4°C og med en strømnings-hastighet på 42 ml/time. 20 fraksjoner på 10,5 ml hver samles opp. Polypeptid-inneholdende fraksjoner påvises ved sin optiske adsorbsjon ved 280 nm. Fraksjonene 7 og 8 inneholder polypeptidet med IFN-aktivitet påvist ved målingen ifølge Armstrong (32). De aktive fraksjonene som inneholder LyIFN-a-2, lagres ved -20°C inntil videre bruk. IFN-aktiviteten til fraksjonene er 1,8.10 g IE/mg polypeptid (32).

Ved å lyofilisere de ovenfor nevnte fraksjonene fra 1 ml oppløsning, erholdes det 20-40 ug polypeptid.

SDS-polyakrylamidgel elektroforese (jfr. (53)) avslører

en molekylvekt hos den erholdte LyIFN-a-2 på ca. 18 kg dalton.

Eksempel 34.

Interferon utskillelse av transformerte gjærceller

i dyrkingsmediet.

For å bestemme virkningen av en signalsekvens for N-ende-protein på proteinutskillelse, dyrkes gjærstamme S.cerevisiae GRF18/pJDB207/IF(8|) (som inneholder en hybrid signalsekvens, se eksempel 17) og gjærstamme S.cerevisiae GRF18/ pJDB207R/IF(a-3) (uten signalsekvens) som beskrevet i eksempel 28. Mengden av den produserte interferon som er tilstede i dyrkingsmediet, samt mengden av interferon som er tilstede i celleekstraktene (fremstilt som beskrevet i eksempel 31) bestemmes og resultatene er gjengitt i tabell 7.

Litteraturhenvisninger.

1. A. Hinnen et al., "Transformation of yeast", Proe, Nati. Sei, USA 75, 1929 (1978). 2. J.D. Beggs, "Transformation og yeast by a replicating hybridplasmid", Nature 275, 104 (1978). 3. J. Hicks et al., "Properties og yeast transformation", Cold Spring Harbor, Symp. Wuant. Biol. 43, 1305 (1979). 4. K. Struhl et al., "Hich-frequency transformation of yeast; autonomous replication of hybrid DNA molecules", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 1035 (1979). 5. R.A. Hitzeman et al., "Expression of a human gene for interferon in yeast", Nature 293, 717 (1981). 6. J.D.Beggs et al., "Abnormal ecpression of chromosomal rabbit e-globin gene in Saccharomyces cerevisiae", Nature 283, 835 (1980). 7. R. Axel, "The use of eukaryotic promoter sequences in the production of proetinaceous materials", PCT patent søknad nr. 81/02425. 8. J.A. Carbon et al., "DNA capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaroyte, method of preparation thereof and eukaryotic cell containing same", EP patentsøknad nr. 48081 (The regents of the University of California). 9. D.T. Stinchcomb et al., "Eukaryotic autonomously replication segment", EP patentsøknad nr. 45573 (The board of trustees of Leland Stanford Junoir University). 10. "Plasmidvektoren, Hybridplasmide und ihre Verwendung zur Herstellung von Proetinen", DE off.skrift nr. 2.923.297 (Institut Pasteur). 11. "Procédé de production de protéines par expression des génes correspondants dans des microorganismes et vec-teurs susceptibles d'étre mis en oeuvre dans de tels procédés", FR patentsøknad nr. 2.458.585 (Institut 12. M. Aigle et al., "Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant", EP patentsøknad nr. 11562 (Agence nationale de valorisation de la recherche).

13. A. Schurr et al., J. Gen. Microbiol. 65y 291 (1971)

og A. Toh-e et al., Mol. Gen. GEnet. 162, 139 (1978).

14. P. Mildner et al., Biochim. Biophys. Acta 429, 274 (1976). 15. A.M.Maxam et al., in "Methods in Enzymology", vol. 65, side 499, New York 1980. 16. A. Hinnen et al., "Vectors for cloning for yeast", Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96, 101 (1982). 17. A. Hinnen et al., in "Eukaryotic Gene REgulation", vol. 14, side 43, New York 1979.

18. "Genetic Engineering" (utg. A.M. Chakrabarty), West

Palm Beach 1978.

19. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971.

20. M. Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72,

3961 (1979).

21. A. Jimenez et al., Nature 287, 869 (1980).

22. T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750 (1981).

23. M.V. Olson et al., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979).

24. H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1978).

25. B. Hohn et al., i "Genetic Engineering", vol. 2, side 169, New York 1980.

26. B. Holm "Methods in Emzymology" vo.. 68, side 299,

New York 1979.

27. N. Mantei et al., Gene 10, 1 (1980).

28. J.D. Beggs i "Genetic Engineering", vol. 2, side 175,

New York 1981.

29. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970).

30. M.H.Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor 1972.

31. A.Toh-e et al., J. Bacteriol. 113, 727 (1973).

32. J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 723 (1971).

33. J.B. Gurdon. J. Embryol. Exp. Morph. 20, 401-414 (1968).

34. Barth, J. Embryol. Exp. Morph. 7, 210-222 (1959).

35. A. Colman, Cell 17, 517 (1979).

36. A. Elfstratiadis et al., Cell 4, 367-378 (1975).

37. T. Mamoatos et al-., Cell 8, 163-182 (1976).

38. J.H.J. Hoeijmakers et al., Gene 8, 391-417 (1980).

39. A.C. Peacock et al., Biochemistry 6, 1818 (1975).

40. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975).

41. J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim, Pays-Bas 98, 537-548 (1979).

42. w. Mueller et al., J. Mol.Biol. 124, 343 (1978).

43. D.V. Goeddel et al., Nature 290 (1981).

44. C. Weissmann, EP patentsøknad nr. 32134 (Biogen N.V.).

45. T. Taniguchi et al., Gene 10, 11 (1980).

46. M. Streuli et al., Science 209, 1343 (1980).

47. Perlman et al., Proe, Nati. Acad. Sei. USA 79, 781 (1982).

48. A.J.Berk et al., Cell 12, 721-732 (1977).

49. J. Messing, I "the 3rd Cleveland Symposium on Macromole-cules: Recombinant DNA" (utg. A. Walton), Elsevier, Amsterdam 1981, sidene 143-153. 50. D. S. HOlmes et al., Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981).

51. N.M. Gough et al., J. MOI. Biol. 162, 43-67 (1982).

52. Pasek et al., Nature 282, 575-579 (1979).

53. U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970).

Appendiks.

Symboler brukt i fig. 10-14 i de vedlagte tegningene har de følgende betydningene:

I de rsspektive figurene viser de angitte symbolene til de mest nærliggende litteraturhenvisningene til teknikkens stand, slik som nevnt i eksempel 10.

I de øvrige figurene i de vedlagte tegningene, har symbolene som er brukt, de følgende betydninger:

Claims (20)

1. Gjærhybridvektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA-fragment bestående hovedsakelig av den represerbare sure fosfatase (PH05) promoteren til Saccharo myces cerevisiae, idet nevnte DNA-fragment omfatter sekvensen eller subfragmenter derav som beholder promoter-funksjonen, en gjær- eller ikke-gjær-polypeptidkodende region som er kontrollert av nevnte promoter, forutsatt at nevnte gjærpoly-peptidkodende region ikke er PH05 genet.

2. Gjærhybridvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et DNA-fragment med sekvensen eller subfragmenter derav som beholder promoterfunksjonen.

3. Gjærhybridvektor ifølge krav 2 , karakterisert ved at den omfatter et DNA-fragment med sekvensen

4. Gjærhybridvektor ifølge krav 2, karakterisert ved at den omfatter et DNA-fragment med sekvensen

5. Gjærhybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den polypeptid-kodende regionen koder for humant interferon.

6- Gjærhybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den polypeptid-kodende regionen koder for et hepatitt B virusantigen.

7. Gjærhybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den omfatter transkripsjonstermineringssignalene til et gjærgen.

8. Gjærhybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at en signalsekvens er forut for den gjær- eller ikke-gjær-polypeptidkodende regionen.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et DNA-restriksjonsfragment bestående hovedsakelig av den represerbare gjær sur fosfatase (PH05) promoteren som omfatter sekvensen og subfragmenter derav som beholder promoterfunksjonen, karakterisert ved at man A) fremstiller det sure fosfatase PH05 genet ved å komplementere sure fosfatase PH05 manglende gjærstam-mer ved transformasjon med plasmid DNA fra et gjærgen-bibliotek inneholdende vill-typekopien av nevnte gen og isolerer nevnte gen, B) fremstiller subkloner av det oppnådde genet, C) identifiserer beliggenheten av promoterregionen til ovennevnte subkloner og isolerer ved restriksjons-spaltning DNA-fragmentene som hovedsakelig består av den sure fosfatase PH05 promoteren, og for fremstilling av subfragmenter, forkorter DNA-restriksjonsfragmentene oppnådd ved spaltning med en restriksjonsendonuklease eller med en egnet eksonuklease.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9 , karakterisert ved at DNA-fragmentet har sekvensen eller et subfragment derav, som beholder promoterfunksjonen.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DNA-fragmentet har sekvensen

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DNA-fragmentet har sekvensen

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en gjærhybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at man innfører inn i et vektor-DNA et DNA-fragment bestående hovedsakelig av Saccharamyces sur fosfatase PH05-promoter og en gjær- eller ikke-gjær-polypeptidkodende region som ikke er det PH05 strukturelle genet fra gjær, slik at den kodende regionen er kontrollert av nevnte promoter.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av en transformert Saccharomyces cerevisiae-stamme, karakterisert ved at en Saccharomyces cerevisiae-stamme transformeres med en hybrid vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av et gjær- eller ikke-gjær-polypeptid eller et naturlig forekommende derivat derav, karakterisert ved at følgende trinn utføres:

1) dyrking av en Saccharomyces cerevisiae stamme transformert med en gjærhybridvektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, og

2) isolering og rensing av polypeptidet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at polypeptidet er et humant interferon.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at polypeptidet er IFN-a-1.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at polypeptidet er IFN-a-2.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at polypeptidet er IFN-a-3.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at polypeptidet er et hepatitt B virus antigen.