HU204095B - Process for producing yeast vectors - Google Patents

Description

A találmány élesztő savas foszfatáz génjeinek promotereit tartalmazó DNS-fragmensek élesztő-sejtek transzformálására képes, az említett promotereket tartalmazó hibrid vektorok, valamint az említett hibrid vektorokkal transzformált élesztő sejtek előállítá- 5 sara vonatkozik. A találmány tárgya eljárás az említett DNS fragmensek, az említett hibrid vektorok, valamint az említett élesztő-sejtek előállítására, rekombináns DNS technológia alkalmazásával.

A rekombináns DNS technológia fejlődésével lehe- 10 tővé vált hasznos polipeptideknek, különösen gyógyászati jelentőségű fehérjéknek ellenőrzött mikrohiális módszerekkel való előállítása. A rekombináns DNS technológiával végzettlegújabbmunkákzömétprokarióta organizmusokkal végezték. Módszereket fejlesz- 15 tettekki és dolgoztakkx alaposan eukarióta fehérjéket kódoló DNS szakaszoknak az említett organizmusokba való beépítésére. Számos, az új technológiával módosított baktérium-faj, különösen az Escherichia coli törzsei, márhozzáférhetőkéslehetővéteszikalegfon- 20 tosahb polipeptidek, például inzulin, humán leukocita és fibrolaszt interferon és humán növekedési hormon kereskedelmi célokra történő előállítását.

Azonban számos célra kívántos, vagy a jövőben szükséges lesz a fehérjék, elsősorban a gyógyászatilag 25 fontos fehérjék ipari termelése során eukarióta rendszerek alkalmazása. Mivel az élesztők eukarióták, számos biológiai anyagcsere útjukközös más eukariótákkal, ezek közül legfontosabbak az emlős sejtek. Mivel számos gyógyászatilag fehérjét emlős-sejtek szinteti- 30 zálnak, a két rendszer közötti rokonság előnyös lehet. Például az élesztő kiválasztó rendszere hasonló a magasabb állati sejtekhezés ismert, hogy az élesztő sejtek rendelkeznek a szignál-szekvenciák (egy fehérje töltetlen N-terminális része, általában lehasad a kivá- 35 lasztási transzport során) hasításához szükséges biokémiai rendszerrel. A kiválasztással kapcsolatos a glikozilezőrendszer. Aglikozilezett proteinekhez vezető alapvető lépések hasonlóak minden eukariótáhan, ezért elvárható, hogy a prokariota sejtekkel ellentét- 40 ben az élesztő-sejtek képesek helyesen glikozflezett fehérjék előállítására (jóllehet a reakciósorban szereplő néhány végső lépéstmódosftanikell).

Ezenkívül az élesztő-sejtek mentesek az endotoxinoktól. Az Escheria coli-hói származó fehérje-készít- 45 ményekben gyakran találhatók szennyező endotoxinok és drága tisztítási lépésekkel kell eltávolítani azokat

Mivel az élesztő egy mikroorganizmus, könnyű növeszteni. Az egységnyi térfogatú tenyészléből kinyer- 50 hető sejt-tömeg lényegesenmagasahb élesztőnél, mint Escherichia coli-nál. Ráadásul az élesztő fermentációs viselkedése jól ismert és a nagytérfogatú fermentációhozszükségeskörülményeketmárkídolgozták.

Az elmúlt néhány évben a sütőélesztő, a Saccha- 55 romyces cerevisiae egyre jobban magára vonta az alap- és alkalmazott kutatási területeken dolgozó molekuláris biológusokfigyelmét.

Ez a fejlődés nagymértékben egy transzformációs rendszer (Hűmen és mtsai (1), Beggs (2)) kifejlesztésének köszönhető, amely lehetővé tette, hogy ezt a mikroorganizmust genetikai manipulációkra, például heterológ DNS bevitelére és klónozására használják. A prokariota rendszerekhez hasonlóan, előnyösen plazmidokat használnak az élesztő-sejteket transzformáló vektorként, azaz rekombináns DNS-nek az élesztősejtekbe juttatására.

Számos különböző szabadalmi bejelentés és más publikáció vonatkozik élesztő-sejtek transzformálására használható vektorokra, az említett plazmidokkal transzformált élesztő-sejtekre, az említett transzformáit élesztő-sejtekkel előállított polipeptidekre, valamint ezektermelésérehasználható eljárásokra:

Az általános élesztő-transzformálási eljárást Hxnnen és mtsa (1), Beggs (2), Hícks és mtsai (3), valamint Struhl és mtsai (4) közlik. Élesztő-sejtekbe transzformált, a Saccharomyces verevisiae alkohol-dehidrogenát 1 (ADH1) gén 5’, nemkódoló szakaszait tartalmazó DNS szakaszokhoz kötött humán interferongén kifejeződését írják le Hitzeman és munkatársai (5), Beggs és munkatársai írják le Saccharomyces cerevisiae transzformálását a nyúl kromoszomális β-globin génjéttartalmazó plazmiddal. Amint azt aközleményben kimutatták, a gén transzkripciója helytelen és az elsődleges β-globinRNSmásolatokhasxtása-illesztése nemfigyelhetőmeg.

Polipeptidet kódoló idegen DNS-sel együtt transzformáit eukarióta sejteket, például élesztő- és különösen emlősejteket ehhez kapcsolt indukálható promoterrel, valamint a transzformált sejtek azonosítását lehetővé tevő nem kapcsolt DNS-sel, valamint e termékek előállítására szolgáló eljárást ismertet a 81/02425 számúPCT szabadalmi bejelentés (7).

A 48081 számú európai szabadalmi bejelentésben (8) eukarióta replikációs helyet kódoló DNS szakaszt, eukarióta replikációs helyet kódoló DNS szakaszt, eukarióta replikációs helyet tartalmazó és alacsony kópia-számban mitotikus stabilitást nyújtó eukarióta vektorokat és az említett vektorokkal transzformált élesztő-sejteket ímakle,

A 45573 számú európai szabadalmi bejelentésben hibrid DNS-eket ismertetnek, melyek többek között eukarióta gazdaszervezet autonóm replikálódó szakaszát, tartalmazzák, továbbá módszert ezek előállítására, valamint eljárást az említett hibrid DNS-eket történő eukorióta sejtek, például élesztők nagy gyakoriságú transzformálására.

A2923297 számú NSZK-beli nyilvánosságra hozatali iratban (10) és a2458585 számú francia szabadalmi leírásban (11) élesztő-sejtekbe való transzformálására alkalmas, az Escheria coli β-lac Z génjének promotere álal szabályozott ovalbumin gént tartalmazó plazmidokatímakie.

Az 11562számú európai szabadalmi bejelentésben baktérium plazmid-DNS-ből, az élesztő 2 μ-os plazmidjából vagy annak egy részéből, valamint az élesztő GRA 3 génjéből álló hibrid plazmidot és az említett hibrid plazmiddal transzformált élesztő-sejteket írnakle.

Az elmúlt évek során hatalmas fejlődés ment végbe

HU 204095 Β a génsebészet területén, és az első genetikailag manipulált mikroorganizmusokat, különösen az Escherichia coli bélbaktérium törzseit használó első rendszerek már működnek. Azonban szükség van további, és javított rendszerekre, különösen eukarióta rend- 5 szerekre, például élesztőkre, melyek képesek fehérjék gazdaságos és nagyléptékű ipari előállítására. Jelenleg gén-klónozás céljára különböző élesztő vektorok állnak rendelkezésre. Idegen géneknek élesztőben történőkifejeződéséhez arra van szükség, hogy a struktúra- 10 Iís génszakaszt erős élesztő-promoterekkel kell kombinálni, melyek előnyösen szabályozó tulajdonságokat mutatnak, ezzel lehetővé teszik a gén kifejeződésének külső ellenőrzését. A jelen találmány tárgya ezen igényeket kielégítő élesztő-promoterek biztosítása. A ta- 15 lálmány tárgya továbbá az említett promotereket tartalmazó hibrid vektorok, valamint az említett promoterek által ellenőrzött struktúr-gének előállítása.

1. Élesztő savas foszfatázt tartalmazó DNS fragmensek és előállításuk 20

A jelen találmány szerinti élesztő promoterek az élesztő, különösen Saccharomyces cerevisiae kromoszomális DNS-éből származnak. Legalább két struktúrgén (PH03 és PH05) és számos szabályozó gén (PH02, PH04,PH080, PH081, PH085)vesznekrészt a 25 savas foszfatáz kifejeződésében élesztőben (vonatkozó irodalomnak lásd pl. (13). A PH05 és PH03 gének represszálható (szabályozott) és konstitutív élesztő savas foszfatázt, kódolnak. A PH05 gén magas szervetlen-foszfát koncentráció esetén represszálva van és 30 szervetlen-foszfát éhezés során kapcsolódik be (derepresszálódik) (általában nagymértékig normál fíziológiáskörülményekközött), mígaPH03 gén állandóan, alacsony szinten kifejeződik. A represszálható enzim glikozilezve van, molekulatömege körülbelül 490 35 kilodalton(14).

A savas f oszfatáz géneket szabályozó promotereket nem izolálták vagy használták az eddigi rekombináns DNS technológiában, így nukleotid sorrendjüket sem derítettékfel. A jelenlegi rekombináns DNS technoló- 40 giában használt, más élesztő promóterekkel (ADH1) szemben az élesztő savas foszfatáz promotereket közvetlenül követő DNS szakaszok szignál-peptideket kódobiak, melyekről úgy gondolják, hogy a kiválasztási folyamatban játszanak szerepet. Előnyös lenne egy 45 idegen fehérjét kódoló DNS szakaszt a fehérje in vivő transzportját az élesztő sejtmembránján keresztül. Ez a terméknek a gazdasejt anyagaival történő szennyeződésének csökkentését eredményezné, ezzel megkönnyítve a termék kinyerését. A rekombnáns DNS 50 technológiában eddig használt promoterek előnytelen tulajdonsága, hogy a megfelelő gének konstitutíve fejeződnek ki. A génről szintetizálódó polipeptid lehet toxikus az élesztő-sejtre (funigicid hatás), vagy legalábbis gátolhatja a sejtek szaporodását (fungisztatikus hatás), vagy a keletkező polipeptid enzimatikusan lebomolhat a sejten belül, különösen ha hosszú ideig tesszük ki az élesztő proteázok hatásának. Az összes említett esetben a kívánt polipeptid igen kis mennyiségben keletkezik. Ezeket a hátrányokat elkerülhetjük, ha a PH05 promotert és az említett promotert tartalmazó vektorokat használjuk. A PH05 promoter lehet represszált vagy depresszált állapotban, a kísérletező akarata szerint egyszerűen növelve, vagy csökkentve a szervetlen foszfát koncentrációját a tápközegben. így a promotert tarthatjuk represszált állapotban az élesztő exponenciális növekedési fázisában és csak a korai stacioner fázisban, maximális sejtsűrűségnél „kapcsoljuk be”, ezzel lehetőtév téve a PH05 promoter által szabályozott gén kifejeződését. Ez a tulajdonság, egyesítve a magas transzkripciós szinttel, a PH05 promotert a jelen találmányban előnyösen használható promoterré teszt

A jelen találmány az élesztő savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmensre, azaz a PH03 promoterre, vagy előnyösen a PH05 promoterre és az 5’ nem kódoló szakaszokra vonatkozik

Az élesztő savas foszfatáz promotert követheti az említett promoterhez természetesen kapcsolódó élesztő savas foszfatáz gén kódoló szakaszában található szignál-szekvencia, vagy annak egy része. Az említett DNS fragmens ráadásul tartalmazhat a mRNS hatásos transzlációjához szükséges DNS szakaszokat. Az említett DNS fragmensnek a promoter funkcióját megőrző mutánsai is itt találhatók

A találmány szerinti DNS fragmenst például a következőképpen állíthatjuk elő:

A) savas foszfatáz gént állítunk elő, az említett gén vad típusát tartalmazó élesztő génbankból származó plazmiddal transzformálva savas foszfatáz hiányos élesztő törzset, majd izoláljuk az említett gént.

B) a kapott génből szub-klónokat állítunk elő és

C) azonosítjuk a fenti szub-klónokban a promoter régió helyét, majd izoláljuk a savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmenst.

Részletesebben a következő lépésekkel állítjuk elő az említettDNS fragmenst:

1) Mind a baktérium mind az élesztő sejtben megnyilvánuló, megfelelő genetikai bélyegeket (a használható genetikai bélyeket lásd alább) hordozó hibrid baktérium (főleg Escherichia coli)-élesztő plazmidba vad-típusú élesztő DNS-t kódolva élesztő génbankot állítunk elő.

2) Az élesztő savas foszfatáz génjét tartalmazó kiónokat savas foszfatáz hiányos élesztő sejteket a fenti génbankból származó plazmid-keverékkel transzformálva választhatjuk ki.

3) A savas foszfatáz gént tartalmazó plazmidokat a transzformáit élesztőből izoláljuk, majd a bakteriális genetikai bélyeg fenotípusos megnyilvánulására szelektálva (például ampicillin rezisztencia) viszszatranszformáljuk és mennyiségét megsokszorozzukEscheria coli-ban.

2’)Egy másik megközelítés szerint a génbankot felosztjuk és az így kapott szub-populációkkal transzformálunk savas foszfatáz hiányos élesztő sejteket, majd

3’)a pozitív eredményt adó szubpopulációkat tovább osztjuk és transzformálunk velük a fentiek szerint, mindaddig, míg a megfelelő ldónt azonosítjuk.

HU 204 095 Β

4) Az azonosított Hónból izoláljuk a plazmid. DNS-t, megfelelő' restrikciós endonukleázokkal emésztjük és afragmenseketújraldónozzukmegfelelő élesztő vektorban.

5) Az élesztő savas foszfatáz génjét tartalmazó DNS 5 fragmenseket az említett vektorokkal élesztő savas foszfatáz hiányos törzseket transzformálva lehet azonosítani. Ezzel az eljárással a savas foszfatáz gének határait körülbelül 300 bázispár pontossággal lehetmeghatározni. 10

6) Az azonosított fragmensek DNS-e bázissorrendjének meghatározásával azonosíthatjuk a promoter régiókat a savas foszfatázfehérjét kódoló szakaszokat és ezenkívül a további munkához használható restrikciós-enzim vágási helyeket. Ez utóbbiak se- 15 gítségével a promoter funkcióhoz nem szükséges DNS szakaszokat restrikciós endonukleázokkal eltávolíthatjuk.

A választott restrikciós endonukleáztól függően a savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmen- 20 seken rajta lehetnek a promoter funkciót nem érintő, eredeti 3’ és 5’ végű nem kódoló szakaszok, ezeket a következő klónozó eljárásban összekötő szakaszként használhatjuk. Ha szükséges, ezeket a kiegészítő szakaszokat megrövidíthetjük restrikciós endonukleáz- 25 zal emésztve, (halehetséges)vagymegfelelő exonuldeázzal, például Bal31-gyel. Ráadásul a fragmenseket olyan kémiailag szintetizált DNS linkerekhez köthetjük, melyek előnyösen egy megfelelő restrikciós endonukleáz felismerő szakaszáttartalmazzák. Ezlehetővé 30 teszi, hogy a savas foszfatáz promotert kényelmesen egy idegen polipeptid gén kódoló szakaszához kössük. Olyan DNS fragmens izolálása és/vagy kontruálása is lehetséges, mely az élesztő savas foszfatáz promotert és a savas foszfatáz fehérje gén kódoló szakaszával 35 szomszédos szignál-szakaszt vagy annak egy részét is tartalmazza. Ha megfelelően emésztett, idegen fehérjét kódoló génhez kapcsoljuk, a kapott hibrid DNS ki fog fejeződni élesztőben és olyan fehérje keletkezik, mely a savas foszfatázszignálpeptidjét vagy fuzionált 40 szignálpeptideket tartalmaz.

A találmány szerinti élesztő savas foszfatáz promotereket élesztőből vagy más forrásból származó polipeptidet kódoló génszakasz élesztő hibrid-vektorban történő kifejeződésének szabályozására használhat- 45 juk.

2. Élesztő savs foszfatáz promotereket tartalmazó hibrid vektorok és előállításuk A jelen találmány élesztő savas foszfatáz promotert, és az említett promoter által szabályozott élesztőből vagy más forrásból származó polipeptidet kódoló génszakaszból álló hibrid vektorokra is vonatkozik. A jelen szabadalmi leírásban használt „vektor” hibrid vektor”, „DNS szakaszok” stb. kifejezések konkréten kétszálúDNS-ekre vonatkoznak

Azonban egyszálú DNS-ek is tartoznak ide. A vektorok és hibrid vektorok lineáris és előnyös cirkuláris formában is lehetnek

Az élesztő savas foszfatáz promoter főleg az 1. ponthanleírtak egyike, és inkább a PH05, szabályozott 60 savas foszfatázpromoterre vonatkozik A fenti promoterek egyikével szabályozott élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló DNS-szakasz (gén) származhat kromoszomális DNS-ből vagy a mRNS-ről készített cDNS-bó'I (komplementer DNS), vagy készülhet kémiailag szintetizálva. A nem-élesztő polipeptidetkódolóDNSszakaszokszánnazhatnak vírusokból, prokarióta vagy eukarióta sejtekből, ideértve magasabbrendű eukarióta sejteket, különösen emberi sejteket. Agazda élesztő-sejtben kifejeződve ezek a gének képesek igen változatos polipeptidek beleértve glikoziiezettpolipeptídeketis, termelését előidézni, például tápanyagok előállítására, vagy a kémiában enzim-reakciók végrehajtására használható enzimekét, vagy nem enzim-jellegű polipeptidek, például hormonok, immun-szabályozó vírus-ellenes és rák-elleneshatású polipeptidek, antitestek, vírus antigének, vakcinák véralvadás-faktorok, élelmiszerek és hasonlók termelését. Az ilyen gének kódolnak például amilázokat, proteázokat, lizozimet, vírus timidin-kinázt, rennint, β-laktamázt, glókóz-izomerázt, szekretint, timozint, relacint, kalcitonint, szomafosztatint, humán vagy szarvasmarha növekedési hormont, inzulint, luteinizáló hormont, paratiroid hormont, adrenokortiktropint, β-endorfint, melanocita-stimuláió hormont, β-lipotropint, urogasztront, interferont, azaz humán interferont, például humán α-interferont vagy humán leukocitából, Iimfoblasztoid vagy fibroblaszt sejtekből származó β-polipeptidet vagy humán γ-χηterferont; limfokineket, daganat nekrózis faktorokat; antí-rennin antitestet, hepatitisz Avírus antigént, hepatitisz B vírus (HBV) felületi vagy mag antigéneket, nem-Anem-B hepatitisz vírus antigént, humánhisztokompatibilitási antigéneket, száj- és körömfájás vírus antigént, influenza hemagglutinint, baromfi-pestis vírus hemagglutinint, szérum-albumint, ovalbumint, thaumatint, eglineket vagy plazminogén aktivátorokat.

Egy kiválasztott, polipeptid-kódoló génszakasz tartalmazhat szignál-szakaszt vagy annak egy részét. Mint az előbbiekben említettük, az eredményeket PH05 szignál-szakaszt tartalmazó fuzionált fehérjét, vagy érett, idegenpolipeptidet és azidegenpolipeptidhez tartozó szignál-szakasz egy részét és a PH05 szignál-szakasz egy részét tartalmazó hibrid szignál-szakaszt. Mindkét esetben, azok a kedvező kombinációk, . melyekben az idegen polipeptid érése során a szignálszakaszlehasad.

Az élesztő savas foszfatáz promoter és az élesztő vagy nem-élesztő fehérjét kódoló génszakasz mellett a találmány szerinti hibrid vektorok járulékosDNS szakaszt, illetve szakaszokat is tartalmazhatnak, melyek a promoter funkciója, azaz a polipeptidet kódoló génszakasz kifejeződése szempontjából kevésbé fontosak vagy lényegtelenek, de fontos szerepet tölthetnek be, például az említett hibrid vektorokkal transzformált élesztő-sejtek szaporodásában. A járulékos DNS szakasz, illetve szakaszok származhatnak prokarióta és/vagy eukarióta sejtekből és kromoszomális éshwgy extra-kromoszomális DNS szakaszokat tartalmazhat4

HU 204095 Β nak. A járulékos DNS szakaszok származhatnak (vagy állhatnak) plazmid DNS-ből, például bakteriális vagy eukarióta plazmid DNS-ből, vírus és/vagy kromoszomális DNS-ből, úgymint baktérium, élesztő vagy magasahbrendű eukarióta kromoszomális DNS-ből. Az előnyben részesített hibrid vektorok baktérium plazmidokból, főleg Escherichia coli pBR 322 plazmidból vagy rokon plazmidokból, λ fágból, az élesztő 2 μ-os plazmidból és/vagy élesztő kromoszomális DNS-ből származó járulékos DNS-szakaszokat tartalmaznak.

A járulékos DNS-szakaszok előnyösen élesztő replikációs origót és az élesztőben megnyilvánuló szelektív genetikai bélyeget tartalmaznak. Az élesztő replikációs origót, azaz a kromoszomális autonóm replikációs szakaszt (ars) tartalmazó hibrid vektorok transzfomárlás után extrakromoszomálisan fennmaradnak az élesztő-sejtben és a mitózis során önállóan replikálódnak. Az élesztő 2 μ-os plazmid DNS-ével homológ szakaszokat tartalmazó hibrid vektorokat is használhatjuk. Ezek a hibrid vektorokrekombinációval integrálódnak a sejtben már jelenlevő 2 μ-os plazmidokha vagy Önállóan replikálódnak. A 2 μ-os plazmid-szakaszok különösen jól használhatók magas transzformációs gyakoriságú plazmidokhoz.és magas kópia-számot adhatnak.

A találmány szerinti hibrid vektorok tartalmazhatnak ráadásul a gazda-élesztő kromoszómáján levő génből (például PH05) származó DNS-szakaszt, melynek promoterét az élesztő vagy nem-élesztő fehérjét kódoló DNS-szakaszhoz köthetjük. A homológ szakasz következtében az egész vektort stabilan beépíthetjük rekombinációval a gazda-kromoszómába. így az utód-sejtek szaporodása során a bevitt genetikai anyag szelekciós nyomás nélkül is megmarad.

Ami az élesztőnél használható szelektív genetikai bélyeget illet, bármilyen, a bélyeg fenotípusos megnyilvánulásával a transzformált sejtek szelekcióját leaz antibiotikum-rezisztenciát kifejező genetikai bélyegek használhatók jól élesztőnél, vagy élesztő auxotróf mutánsok esetében a gazda-szervezet károsodott DNS-szakaszát komplementáló gének. A megfelelő gének közé tartozik például a cikloheximid antibiotikumra való rezisztencia, vagy auxotróf élesztőmutánsban például az URA3, LEU2, HIS3, vagy TRP1 géneket prototróffá kiegészítő gén. Az is lehetséges, hogy önállóan replikálódni képes szakaszokhoz csatolt struktúrgéneket használunk genetikai bélyegekként, feltételezve, hogy a transzformálandó gazdaszervezet auxotróf a genetikai bélyegről kifejeződő termékre.

A találmány szerinti hibrid vektorokban levő járulékos DNS szakaszok előnyösen tartalmazhatnak egy baktérium gazdaszervezetben, főleg Escherichia coliban működő replikációs origót és szelektív genetikai bélyeget. Számos előnye van, ha élesztő hibrid vektorban Escherichia coli replikációs origó és Escherichia coli szelektív genetikai bélyeg van. Először is nagymennyiségű hibrid vektor DNS-t nyerhetünk Escherichia coli-ban való növesztéssel és sokszorozással másodszor, a hibrid vektorok összeállítását kényelmesen végezhetjük Escherichia coliban, az Escherichia coliban megalapozott teljes klónozási technikai repertoárt felhasználva. Az Escherichia coli plazmidok, úgymint pBR322 és hasonlók tartalmaznak Escherichia coli replikációs origót, valamint Escherichia coli genetikai bélyekeget, melyek antibiotikum rezisztenciának felelnekmeg, és előnyösen használhatók élesztő hibrid vektorokrészeként.

A replikációs origót és élesztő, valamint baktérium genetikai bélyegeket (lásd fentebb) tartalmazó járulékos DNS szakaszokat ezentúl „vektor DNS”-ként említjük, mely a savas foszfatázpromoterrel, valamint az élesztő vagy nem-élesztő polipeptid kódoló szakaszával együtt a találmány szerinti hibrid vektort képezi.

A hibrid vektorokat a a szakterületen ismert módszerekkel állíthatjuk elő, például a vektor DNS-be savas foszfatáz promotert, valamint az említett promoterrel szabályozott élesztő vagy nem-élesztő polipeptid-kódoló szakaszt építve.

Megfelelően térképezett lineáris, vagy előnyösen cirkuláris vektor DNS-t, például baktérium plazmid DNS-t vagy hasonlót (lásd fentebb) használhatunk, mely legalább egy, lehetőleg két vagy több restrikciós helyet tartlmaz. A vektor DNS előnyösen már tartalmazza a replikációs origókat, valamint az élesztő és/vagy baktérium gazdaszervezetben működő genetikai bélyegeket. A vektor DNS-t megfelelő restrikciós enzim használatával hasítjuk. Az emésztett DNS-t a savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmenshez, valamint az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakasz összekötése előtt vagy után (vagy egyidejűleg), replikációs origók, és/vagy élesztő vagy baktérium gazda genetikai bélyegek beépítése is lehetséges. Minden esetben az emésztési és összeillesztési körülményeket úgy kell megválasztani, hogy ne legyen káros kölcsönhatás a vektor DNS és a pr omoter lényeges funkciói között. A hibrid vektort lépésekben építgetjük fel, vagy két, az összes fontos szakaszt tartalmazó DNS-szakasz összekötésével.

Változatos technikákat használhatunk a NDS-szakaszok in vitro összekötésére. Tompa végeket (csak bázispárokat tartalmazó DNS duplexek), melyeket bizonyos restrikciós endonuldeázok állítanak elő, közvetlenül T4 DNS ligázzal köthetünk össze. Ennél gyakrabban a DNS-szakaszokat egyszálú tapadós végeiken keresztül, kovalensen kapcsoljuk egy DNS ligázzal, például T4 DNS ligázzal. Az ilyen egyszálú „tapadós végek” a DNS-t más típusú restrikciós enzimekkel állíthatjuk elő, melyek lépcsős végeket hoznak létre, a DNS duplex két szálát néhány nukleotid távolságban különböző pontokon hasítják. Egy szálakat előállíthatunk, ha a tompa vagy lépcsős végekhez terminális transzferázzalnukleotidokat adunk hozzá (”homopolimer kiegészítés”), vagy megfelelő exonukleázzal, például λ-exonuldezzal vissza-emésztjük a tompavégű DNS-szakasz egyik szálát. A lépcsős végek előállításának további módja, ha tompavégű DNS szakaszhoz lépcsős-véget létrehozó endonukleáz felismerési helyét tartalmazó, kémiailag előállított linker DNS-t kötünk, majd a kapott DNS-t a megfelelő endonukleáz5

Hü 204095 Β zal emésztjük.

Ahhoz, hogy hatékonyan kifejeződjön, az élesztő vagy nem-élesztő fehérjét kódoló génnek transzkripciós szakaszokhoz (savas foszfatáz promoter) és transzlációs funkciókhoz (riboszóma kötőhelyek) vi- 5 szonyítva is megfelelőenkell elhelyezkednie.

Először is, a promotert a polipeptidet kódoló szakasszal együtt tartalmazó DNS szakaszt a helyes irányítottsággal kell beépíteni. Ha két orientáció lehetséges, a megfelelőt az ismertrestrikciős analízisselhatá- 10 rozhatjuk meg. A helytelen irányítottsággal beépített gént tartalmazó hibrid vektorokat újra összeállíthatjuk a megfelelő irányítottsággal, ha a beépített gént megfelelő restrikciós endonukleázzal kivágjuk és újra összekötjüka hibrid vektorfragmenssel. Műiden eset- 15 ben elkerülhetjük a helytelen irányítottságot, ha a végíikönkülönböző restrikciós helyeket tartalmazó DNS szakaszokat kötünk össze. A hibrid vektor felépítésének továbbá olyannak kell lennie, hogy tegye lehetővé a transzkripció helyes indulását (iniciáció) és végződé- 20 sét (termináció). Ami az utóbbi feltételt illeti, a transzkripciós egységnek előnyösen az élesztő kromoszómális DNS-ébőI vagy a 2 μ plazmidból származó DNS szakaszban kell végződnie. A transzkripciós egység előnyösen egy élesztő gén, például PH05 vagy 25 PH03 transzkripció terminációs jelét tartalmazó DNS szakaszon végződik Másodszor megfelelő leolvasási fázist kell létrehozni. Összekötés előtt rendszerint mind a promoter szakasz, mind a fehérje kódoló szakasz nukleotid-sorrendje ismert, vagy könnyen meg- 30 határozható (például/15/), úgyhogyahelyes leolvasási fázis létrehozása nem jelent problémát. Ráadásul különleges másodlagos szerkezetű DNS részekre lehet szükség a génméghatékonyabb kifejeződéséhez.

A savas foszfatáz promotemek az idegen fehérjét 35 kódoló szakaszhoz kötésre előnyösen használható szakasza fő savas foszfatáz mRNS szintézist indító DNS régió és a savas foszfatáz kódoló szakasz ATG bázistriplett között van, például ha a PH05 promotert használjuk, akkor 40 bázispáros szakaszon belül afőPH05 40 mRNS szintézist indító szakasz és PH05 savas foszfatázt kódoló régió ATGbázistriplettjeközött. Az ebben a régióban való csatoláshoz az idegen fehérjét kódoló génszakasznak rendelkeznie kell saját ATG bázistripIettel a transzláció iniciálásához, vagy külön szinteti- 45 kus oligonukleotiddal kell bevinni azt.

Mivel a magasabbrendű szervezetek számos polipeptidje pre-polipeptidek formájában, azaz az érett polipeptidekN-terminális végén szignál-pepiidet hordozva fejeződik ki, hasznos lehet egy szignál szakaszt 50 bevinni a beültetett génbe. Azok a megfelelő szignál szakaszok, melyekvagy eredetileg is akifejezendő polipeptid génhez csatlakoztak, vagy a savas foszfatáz promoterhez. Egy változat szerint fuzionált szignálszakaszokat is létrehozhatunk, ha a savas foszfatáz 55 szignál szakaszának egy részét a polipeptid szignálszakasz egy részéhez kötjük. Ha az érett polipeptid közvetlen kifejeződésére van szükség, az esetleg a promoter szakaszt megelőző teljes vagy töredék szignálszakaszt el kell távolítani, például exonukleázzal (Bal31) emésztve.

A közbenső termékeket, azaz egy-két nélkülözhetetlen funkciót még nélkülöző vektorokat, valamint a találmány szerinti végleges hibrid vektorokat baktériumba, főlegEscherichia coli-ba transzformálhatjuk a fenti okok miatt (a közbenső termékek és hibrid plazmidok nagy mennyiségben történő előállítása céljából). Ebből a célból a baktérium vektorok, azaz a Escherichia coli pBR322 plazmidja és ennek a baktérium replikációs origót, valamint genetikai bélyeg(ek)et tartalmazó fragmensei a legelőnyösebben használható vektorok. Ilyen baktérium-vektor használatakor az élesztő hibrid vektorok előállításának végső lépéseiben élesztő replikációs origót és élesztő genetikai bélyeget építünk a vektorba.

A bkatérium-vektorba a találmány szerinti hibrid vektorok előállítására beépített DNS szakaszokat, például egy önállóan replikálódó szakaszt (ars, (4)), az élesztő 2 μ plazmid (2) vagy élesztő genetikai bélyeget hordozó DNS szakaszokat szokásos módon élesztő kromoszómális DNS-ből és élesztő 2 μ plazmid DNSből izolálhatjuk. Az élesztő vagy nem-élesztő polipeptídetkódológéntkonnoszómálisvagyextrakromoszómális DNS-ből, a mRNS-ből ismert technikákkal előállított komplementer DNS-ből (cDNS) izolálhatjuk, vagy kémiai úton szintetizálhatjuk

Atalálmány előnyös kiviteli alakjában a hibrid vektorok előállítása a következő lépésekből áll:

1) Vad típusú élesztő DNS-ből élesztő génbank készítése.

2) Savas foszfatáz gén, főleg a PH05 gén izolálása, klónozása baktérium-plazmádba, például pBR322-be vagy annakbiológiailagműködőképes, azaz érintetlen replikációs origót és szelekciós genetikai bélyeget tartalmazó fragmensébe.

3) Az említettplazmidba élesztő genetikai bélyeg, például a TRP1 gén, valamint élesztő replikációs origó, például, kromoszómális önállóan replikálódó szakaszvagy élesztó'2 μ plazmid szakaszok beillesztése egy megfelelő restrikciós helyre.

4) Élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet, például humán interferont vagy HBV felületi antigént kódoló DNS szakaszt úgy beilleszteni, hogy a savas foszfatáz promoter szabályozza az említett polipeptidet kódoló szakaszt, és

5) esetleg élesztő gén, például a PH05 transzkripció terminációs jelét tartalmazó DNS szakaszt a polipeptidetkódoló szakasztóllefelébeépíteni. Elképzelhető a lépések sorrendjének megváltoztatása, például a 3. és 5. lépésé, először a polipeptidet kódoló szakaszt, majd ezután a genetikai bélyeget és az élesztő replikációs origót beépíteni a 2. lépésben kapottrekombináns plazmidba.

Az élesztő genetikai bélyeg, élesztő replikációs origó és a polipeptidet kódoló szakasz beillesztése előtt a szükségtelen részeket, például a savas foszfatáz strukturgént kivághatjuk a 2. lépésben előállított plazmidbóL

Az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló DNS szkaszt a savas foszfatáz promoterhez kötjük (4.

Ηϋ 204095 Β lépés), a fő savas foszfatáz mRNS szintézis starthely és a savas foszfatáz ATG triplettje közötti régióban. Esetlegmegfelelő restrikciós helyet tartalmazó szintetikus linkért viszünk be a savas foszfatáz promoter és az említett DNS szakasz összekötésére.

Az élesztő savas foszfatáz promotert tartalmazó hibrid vektorok, melyekből az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidek még hiányoznak, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, és a fenti 1) 2) 3) egymást követő lépésekben, esetleg az 5) lépéssel együtt állíthatók elő, melyekben a savas foszfatáz promoter előnyösen a fő savas foszfatáz mRNS starthely és a savas foszfatáz gén ATG triplettje között végződik és/vagy esetleg az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet DNS szakasz beillesztését lehetővé tevő, megfelelő restrikciós helyet tartalmazó szintetikus linkért illesztünk erre a helyre.

3. Élesztőseitek transzformálása élesztő savas foszfatáz promotert tartalmazó hibrid vektorokkal

A találmány tárgya további eljárás élesztő vagy nem-élesztő polipeptideket termelni képes, transzformáit élesztő-sejtek előállítására, azzal jellemezve, hog a 2. fejezetben leírt hibrid vektorok bármelyikével transzformáljuk az élesztőt.

A hasznos élesztők a Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis nemzetségekbe tartozó törzsek közül kerülnek ki, különösen a Saccharomyces cerevisiae törzsekközül.

Az élesztőnek hibrid vektorokkal való transzformálását az irodalomból ismert eljárásokkal végezhetjük, például Hinnen és mtsai által leírt módszerrel (1). Ezt a módszert háromlépésre oszthatjuk:

1) Élesztő-sejtfal eltávolítása

2) A „meztelen” élesztő-sejtek (szferoplasztok) kezelése a transzformáló DNS-selPEG (polietilénglikol) és Ca²⁺ ionok jelenlétében.

3) A sejtfal regenerálása és a transzformált sejtek szelekciója szilárd agarrétegben.

Előnyösen használható módszerek: ad 1) Különböző glükozidáz készítményekkel, például csigabél-preparátum (Glusulase vagy Helicase [gyártó: Endo Laboratories Inc., Garden City, NY 11530USA ill. Industrie Biologique Francaise, Clichy, ER] vagy mikroorganizmusokból nyert enzim-keverékek (például Zymolyase) [gyártó: Seikogaku Kogyo Comp., Tokió, Japán] enzimesen eltávolítjuk az élesztő sejtfalát ozmotikusán stabilizált oldatban (például lMszorbit).

ad 2) PEG jelenlétében az élesztő szferoplasztok aggregálódnak, és a citoplazma-membránok lokális fúziója indul meg. A „fúzió-szerű” állapotok létrehozása igen fontos éa a transzformáció folyamata során sok transzformált élesztő-sejt lesz diploid vagy triploid. Afúzionált szferoplasztok szelekcióját lehetővé tevő eljárásokat használhatjuk a transzformált sejtek dúsítására, azaz a transzformált sejteket könnyen megkereshetjük az elő-szelektált fúziós termékek között.

ad 3) Mivel a sejtfal nélküli éleszt-sejtek nem osztódnak, a sejtfalat regenerálni kell. Ezt a regenerálást kényelmesen megtehetjük a szferoplasztokat agarba ágyazva. Például olvasztott agart (körülbelül 50 °C) keverjük a szferoplasztokkal. Az élesztő növekedési hőmérsékletére (körülbelül 30 °C) hűtve az oldatot, szilárd réteget nyerünk. Az agar-réteg feladata, hogy a fontos makromolekuláknak a szferoplasztoktól való diffundálását és ezzel elvesztését megelőzve és ezáltal megkönnyítse a sejtfal regenerálódását,

A sejtfal regenerálódását azonban úgyis elérhetjük (habár alacsony hatásfokkal), ha a szferoplasztokat előre elkészített agar-rétegre szétosztjuk.

A regeneráló agart előnyösen úgy készítjük, hogy egyúttal a transzformált sejtek regenerálását és szelekcióját is lehetővé tegye. Mivel szelektív generikai bélyegekként általában az aminosav bioszintézisben résztvevő enzimeket kódoló étosztőgéneket használjuk, a regenerálást előnyösen élesztő minimál agaron végezzülí. Ha azonban igen magas regenerációs hatás. fokra van szükség, kétlépéses eljárás lehet előnyös: 1/ a sejtfalregenerálása gazdag, komplex táptalajon és 2/ a sejteket szelektív agrlemezre replilíázva a transzformáit sejteket szelektáljuk.

Ha a hibrid vektor nem tartalmaz genetikai bélyeget, a transzformált sejteket más módszerekkel is azonosíthatjuk. Az ilyen módszerekhez tartozik például a hibrid vektorral homológ jelölt DNS szakasszal végzett in situ hibridizáció (például Hinnen és munkatársai szerint (1), in situ immunassay-k, azzal a feltétellel, hogy a beillesztett gén termékének antisejtje elérhető), vagy más, a transzformáló plazmídokon kódolt gén-termékeket mérő szűrő-módszerek.

Más módszer szerint az élesztőt együtt-traszformálhatjuk egy, a találmány szerinti hibrid vektorral és egy második, az élesztő generikai bélyeget tartalmazó vektorral. Ha a két különböző vektornak vannak közös DNS szakaszaik (ezek lehetnek a vektorokon levő baktérium-eredetű szakaszok), akkor rekombináción keresztül fuzionált szelektálható hibrid molekulák jönnek létre.

A találmány tárgya továbbá eljárás élesztő savas foszfatáz promotert és élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakaszt tartalmazó hibrid vektorokkal transzformált élesztő gazda-sejtek előállítására.

4. A transzformált élesztŐ-sejték növesztése és a polipeptid szintézis indukciója

Az önállóan replikálódó plazmidokkal, például az élesztő 2 μ DNS-t tartalmazó plazmidokkal transzformáit élesztő-sejtek különböző mértékben hajlamosak a bevitt hibrid plazmid elvesztésére (16). Emiatt ezeket az élesztő-sejteket szelektív körülmények között kell növeszteni, azaz a növekedéshez a plazmid-kódolt gén működésére is szükséges köriiíméyek között. Az általánosan használt szelektív genetikai bélyegek zöme az aminosav vagy purin-bioszintézisben résztvevő enzimeket kódoló gén. Ez szükségessé teszi, hogy a megfelelő aminosavat vagy purinbázist nem tartalmazó szintetikus, minimál táptalajokat használjuk. Azonban néhány, antibiotikum rezisztenciát hordozó gént is használhatunk (például a cildoheximid vagy a

HU 204095 Β

G--418 aminoglikozid antibiotikum (21) rezisztenciát hordozó gének).

Az antibiotikum rezisztencia géneket tartalmazó vektorokkal transzformált élesztő-sejteket a megfelelő antibiotikumot tartalmazó komplett táptalajokon növeszthetjük, miáltal gyorsabb növekedés és magasabb sejt-sűrűségérhető el.

A kromoszómákba integrálódó DNS-sel transzformáit élesztő sejtek növesztésére nincs szükség szelektív növekedési körülményekre. Ezek a transzformált sejtek elég stabilak ahhoz, hogy szelektív nyomás nélkül isnöveszthetők. Afenti okból ezekasejtekelőnyösennöveszthetőkkomplex táptalajokon.

Konstitutív savas foszfatáz promotert (például PH03) tartalmazó hibrid plazmidokat hordozó élesztő-sejtek indukció nélkül kifejezik az említett promoterhez csatolt élesztő vagy nem-élesztő fehérje gént. Ha azonban az élesztő vagy nem-élesztő fehérjét kódoló gén szabályozott savas foszfatáz promoter (PH05) ellenőrzése alatt áll, a növesztő táptalaj összetételét ügy kell módosítani, hogy a mRNS másolatok maximális szintjét érjük el, azaz a növesztő közeg a PH05 promoter depresszálása céljából alacsony koncentrációban tartalmazhat szerveden foszfátot.

5. A keletkezett polipeptid izolálása és tisztítása

A humán interferont vagy HBV felületi antigént úgy állíthatjuk elő, hogy

1) élesztő savas foszfatáz promotert és egy élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakaszt tartalmazó hibrid vektorral transzformált élesztő törzset tenyésztünk megfelelő tápanyag viszonyok mellett, és

2) izoláljukés tisztítjuk az említettpolipeptidet.

A jelen szabadalom szerinti transzformált élesztő törzseket emészthető szénforrást, nitrogén forrást szervetlen sókat tartalmazó folyékony közegben tenyésztjük.

Különböző szénforrásokat használhatunk. Az előnyös szénfoirásokra példa az emészthető szénhidrát, például glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy valamilyen acetát, melyet akár egyedül akár megfelelő keverékekben alkalmazhatunk. Az elfogadható nitrogén-források közé tartoznak például az aminosavak, úgymint kazamino-savak, peptidek, és fehérjék, valamint lebomlási termékeik, például tripton, pepton ² vagy húskivonatok, továbbá az élesztő-kivonat, maláta-kivonatrkukorica-lekvár, valamintammóniumsók, például ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, melyeket egyedül vagy megfelelő keverékekben használhatunk. A használható szervetlen sók közé tartoznak £ például a szulfátok, kloridok, foszfátok, karbonátok, nátrium-kálium-, kalcium-vagy magnézium sói.

A tápközeg tartalmazhat még ezen kívül a növekedést gyorsító anyagokat és/vagy a hibrid plazmid elvesztését megelőző, szelekciós nyomást kifejitő anya- 5 gokat. A növekedést gyorsító anyagok közé tartoznak például a nyomelemek, azaz a vas, réz, mangán és hasonlók, valamint egy-egy aminosav.

Ha ahibrid plazmid antibiotikumrezisztenciáthordozó gént tartalmaz, az ilyen hibrid plazmidot tártálmazó sejtek az antibiotikummal kiegészített táptalajon életben maradnak, míg a hibrid plazmidot elvesztett sejtek, valamint a fertőzést okozó antibiotikumérzékeny mikroorganizmusoknem. Ha egy prototrófi5 át okozó gént, példáulLEU2 vagyHIS3 gént tartalmazó hibrid auxotróf élesztő-mutánsban található, a génterméket, azazleucintvagy hisztidint nem tartalmazó táptalajjalfejthetünkki szelekciósnyomást.

Ha a tenyésztett élesztő-törzset a szabályozott

FH05 savas foszfatáz promotert tartalmazó hibrid plazmiddal transzformáljuk, az előtenyésztési fázis után csökkenteni kell a szervetlen foszfát mennyiségét a tenyészlében, hogy a keletkező mRNS maximális szintjét, és következésképpen a polipeptidek maximá15 lis mennyiségét biztosítsuk.

A tenyésztést ismert módszerekkel hajtjuk végre. A tenyésztésiköriilményeket, azazahőmérsékletet, a tenyészlé pH-ját és a fermentáció idejét úgy választjuk meg.hogyapolipeptidekmaximálismennyiségbenke20 Ietkezzenek. A választott élesztő-törzset előnyösen süHyesztett-levegőttetett körülmények között 25 és 35 ’C között, előnyösen 30 ’C körüli hőmérsékleten rázatjuk vagy kevertetjük pH 4 és 8 között, például lehetőleg 7-es pH körül, és körülbelül 4-20 órán át lehetőleg addig, míg a polipeptidek maximális szint jét elérjük.

Miután a transzformált élesztő-sejtek kielégítő sejt-sűrűségig nőttek, a keletkezett polipeptidek kinyerésében az első lépés a polipeptid kiszabadítása a ' sejt belsejéből. A legtöbb eljárásban először enzimes emésztéssel, glükozidázokkal eltávolítjuk a sejtfalat (lásd 3. rész). Ezután a keletkezett szferoplasztokat detergensekkel, például Triton-nal kezelik. Egy másik eljárás szerint mechanikai módszerekkel, azaz nyíró> erőkkel (például X-press, French press), vagy üvegygyöngyökkel rázatva tárhatjukfel a sejteket. Akapott polipeptid keverékben a kívánt polipeptid mennyiségét ismert módszerekkel, például ammónium-szulfátos, trildór-ecetsavas kicsapással, gél-elektroforézis¹ sel, dialízissel, kromatográfiával például ioncserés kromatográfiávai, molekulaszűréssel, HPLC-vel vagy reverz fázisú HPLC-vel és hasonlókkal dúsíthatjuk Az elő-tisztított termék végső tisztítását például antitest affinitás-kromatográfiával végezhetjük. A tisztítási lépéseket elvileg (kivéve a sejtek feltárását) Staehelin és munkatársainak [22] a humán leukocita inter. férőn tisztítására kidolgozott módszere alapján végezhetjük.

1) Az élesztő-sejtek feltárása glükozidázzal

2) kezelés detergenssel

3) a legtöbb nem-fehérje jellegű anyag eltávolítása poIietiléniminnel

4) a polipeptidek kicsapása, az oldatot ammóniumszulfáttal telítve

5) dialízis megfelelő puffer-keverékben

6) DEAE-cellulózosriopkromatográfia

7) affinitás-kromatográfia monoklonális antitest oszlopon^

8) molekulaszűrés megfelelő Sephadex oszlopon.

Hogy kielégítő tisztaságú terméket nyerjünk, to8

HU 204095 Β vábbi tisztítási lépések válhatnak szükségessé, például kation- vagy anion- cseres kromatográfia, hidroxilapatiton való adszorpció, reverz fázisú HPLC és hasonlók. Másrészről a fenti lépések közül egyet vagy többet kihagyhatunk, ha lehetséges, vagy a lépések sorrendjét megváltoztathatjuk.

Abban az esetben ha a kívánt polipeptidet az élesztő-sejt aperiplazmatikus űrbe választjaki, egyszerűsített eljárást alkalmazhatunk. A polipeptidet kinyerhetjük anélkül, hogy a sejtet feltárnánk, a sejtfal enzimes eltávolításával vagy vegyszeres kezeléssel, például tiol vegyületekkel vagy EDTA-val okozunk olyan sejtfal sérüléseket, hogy a polipeptidek kiszabadulnak. Abban az esetben, ha a polipeptid a tenyésztőben kiválasztódik, közvetlenül onnan kinyerhetjük.

A jelen találmány szerinti előállítható polipeptidek igen hasznosak és értékesek emberi és állati betegségek kezelésében vagy megelőzésében (például interferon, HBV felületi antigén stb.) vagy élelmiszerként, takarmányként, takarmány adalékként vagy enzim-reakciókban.

Az ábrák rövid leírása

A következő kísérleti részben a jelen találmány különböző részeit ismertetjük a kísérő rajzokra hivatkozva, melyekben az 1. ábra a PH05 gén forrásaiként vagy DNS szekvenálásra használt pJDB 207/PH05, PH03 és pBR 322/PH05 Ba-Sal plazmídok részleges, restrikciós endonukleáz térképe.

A 2. ábrán a PH05 és PH03 savas foszfatáz gének elhelyezkedését láthatjuk az élesztő génbankból izolált 5.1 kb BamHI fragmensben.

A 3a. és 3b. ábrákon a PH005 és PH03 promoter régiókDNS szekveniáját látjuk.

A 4. ábra a pS^TNl^) és p30IEN2’(8’₁) plazmidokkészítésének sematikus diagramja.

Az 5. ábra a p30IENl plazmídok előállítása során a PH05 promoter DNS és azIEN-8’iCDNS összekötését mutatja.

A 6. ábra a pJDB 207/0342^8^) plazmid készítését mutatja be sematikusan.

A 7. ábra a Nemalwa cDNS-t tartalmazó rekombináns molekulák készítésének sematikus vázlata.

A 8. ábra az IEN mRNS-specifikus DNS primer szintézisében használt technikákat mutatja be sematikusan.

A 9. ábra a humán lomfoblasztoid IEN cDNS-t tartalmazó kiónok azonosítását bemutató sematikus diagram.

A 10-14. ábrákon a CG-pBR 322/HLyc IFN-l’b, -βρ -4’j, -8’i és -5j, plazmídokha beültetett cDNS-ek DNS- és megfelelő aminosav-sorrendjét látjuk.

A15. ábrána CG-pBR(AP)/LyIEN-a-l plazmxdkészítése, a 16. ábrán a beültetett cDNS DNS- és aminosav-sorrendje látható.

A17. ábrán a CG-pBR(AP/LyIEN-ce-3 plazmid készítését, a 18. ábrán a beültetett cDNS DNS-és aminosav-sorredjét látjuk.

A 20. ábra a PH05 terminációs fragmentet tartalmazó p31 plazmi készítésének Sematikus vázlata.

A 21. ábrán a PH05 Sau 3A-Pst 1 transzkripciós terminációs fragment nukleotid sorrendjét látjuk.

A22.ábraap31/IF1 (5_Χ), p31/EP2(5₁), p31/IF3 (5j) és p31/IF2 (l’b) plazmídok készítésének sematikus vázlata.

A 23. ábra a p31/EF(8 ’ _t) plazmid készítését bemutató sematikus diagram.

A 24. ábrán a helyes PH05 - HBVs kapcsolat létrehozását láthatjuk sematikusan pBR 322/PH05/HBVsA14 plazmidban.

A 25. ábrán a PH05 promoter és HBVs kódoló szakasz fúziós pontja szomszédságának DNS szekvencióját látjuk pBR 322/PH05/HBVs plazmidban.

A 26. ábra a p JDB207/HBVsA14 és pJDB 207/HBVsA14t élesztő expressziós plazmídok készítését bemutató sematikus diagram.

A 27. ábra a pJDB 207/IF2(l’b)Á és pJDB 207/ΙΕ2(5ι)Δ72 élesztő expressziós plazmídok készítését bemutatónsematikus diagram.

A 28. ábrán azJEN-5j nem-transzlálódó szakasz és a PH05 transzkripciós terminációs szakasz Xhol kötődése körüli nukleotid sorrend látható a pJDB 207/DF2 (5j)A72 és pJDB 207/DF2 (5j)A82plazmidokban.

A 29. ábra a CG-pBR 322/HLyc IEN(a-3)-252 plazmid készítését bemutató sematikus ábra.

A 30. ábra a CG-pBR322/HLyc ΪΕΝ(α-2)-261 és CG-pBR322/HLydFN(a-l)-258 plazmídok felépítését mutatja be.

A 31. ábra a PH05 szignál szakasznak a p31 expressziós plazmidból való eltávolítását és különösen a p31/R plazmid készítését bemutató sematikus ábra.

A 32. ábra a 31. ábrában bemutatott eljárás szerint előállított Idónok gyűjteményét mutatja be.

A 33. és 34. ábrán a PH05/Rés aPH05/Ypromoterszakaszokat tartalmazó BamHI és EcoRl látható.

A 36., 36. és 37. ábrán az IEN-a-3, -a-2 és -a-1 DNS-eknek a p31/R plazmidba való beépítésének sémáját látjuk.

A 38. ábra a pJDB 207R/EF(a-3) plazmid készítését bemutató sematikus ábra.

A következő példák a jelen találmány bemutatását szolgálják és nem tekinthetők annak korlátozásaként.

Kísérleti rész

APéldák-ban a következő rövidítéseket használjuk:

EtBr: etídium-bromid

BSA szarvasmarha széram-albumin

DTT: 1,4-ditxotreitol (l,4-dimerkapto-2,3-butándiol)

EDTA: etiléndiamin-tetraecetsav

SDS: nátrium-dodecil-szulfát

TNE: lOOmM NaCl, lOmM TrisHCl (pH7,5) és ImMEDTA oldat

Tris-HCl: tris-(hidroxi-metil)-amin-metán, pH sósavval beállítáva

PMSF: fenií-metánszulfonil-fluorid

TE: lOmMTris-HCl (pH 7,5) és 1 mMEDTA oldat.

1. Példa

Élesztő génbank készítése μ, vad típusú Saccharomyces cerevisiae S 288c

Hü 204 095 Β törzsből származó nagy molekula tömegű teljes élesztőDNS-t [23] 30 percig37 ’C-on inkubálunk2 egység EcoRI metilázzal (New England Biolabs) 250 μΐ EcoRI metiláz pufferben a gyártó előálítása szerint. A DNS-t etanollal kicsapjuk, szuszpendáljuk 500 ml 5 25 mM Tris-BCl pH 8,5,2 mMMgCl₂ oldatban (EcoRI* puffer) [24] és addig emésztjük EcoRI enzimmel (Boehringer), míg a DNS-fragmensek nagyság-eloszlásánakamaxűnumaa30-50kb tartománybakerül (a DNS Xhol-el emésztve megfelelő 33 és 17 kb standard 10 DNS-t eredményez). Az EcoRI* körülmények között emésztett élesztő DNS-t méret szerint szacharóz gradiensen (5-20% szacharóz 10 mM Tris-HCl pH 7,5, mMEDTA pufferben) frakcionáljuk 6 órán át centrifugálva 38 000/perc fordulatszámmal SW40 rotor- 1 δ bán. A gradiens tetejéről 30,0,4 ml-es frakciókat szerűik. A 16-os frakció tartalmazza a 30-40 kb méretű DNS fragmenseket. Azebben afrakcióban levő DNS-t (3 gg) etanollal kicsapjuk és 16 órán 15 ’C inkubáljuk .15 gl össztérfogatban 1 gg EcoRI-gyel linearizált 20 pYcl kozmid-vektorral [25]. ADNS szakaszok összekötését (ligálás) 300 egység T4DNS ligázzal végezzük a gyártó általleírtpuffer-rendszerben.ADNS-tin vitro Xfágba csomagoljuk, és az összeállított fágokat használjuk Escherichia coli HB101 (r'_K, m'_K- leu, 25 pro' rec A') törzs transzdukálására. A transzdukció hatékonysága: 5000 ampicillin rezisztens telep mikrogram pYcl vektor.3000 amp^R telepet izolálunk és növesztünk külön LB táptalajban [10 g Bacto-Tryptone(Difco),5gBactoYeastExtract(Difco), lOgNaCl] 30 100 gg/ml ampicillin jelenlétében mikrotiter lemezek lukaiban.

2. példa

AszabályozottPH05 savas foszfatáz gén izolálása 35

Agénbankotképező izolátumokat 100 gg/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezeken (LB táptalaj, plusz 15 g/1 agar) növesztjük. 500 telepből származó sejt-tömeget lemosunk a lemezekről és egyesítünk. Az 500-anként egyesített sejttömegből a következőkép- 40 pen izoláljuk a DNS-t.

A sejteket centrifugálással összegyűjtjük (Sor-vall, GSAroto, 10’, 6000/perc, 4 ’C), újra szuszpendáljuk 100 ml TE pufferben (10 mM Tris-HCl, 1 mMEDTA, pH 8.0), majd a fenti körülményekközött újra Iecent- 45 rifugáljuk. A sejt-üledéket 3 ml Tsuc pufferben (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,25 súly% szacharóz) szuszpendáljuk és átvisszük SS-39 Sor-vall polipropilén csövekbe.

Az összes következőlépést jégenhajtjukvégre:

0,3 ml 10 mg/ml koncentrációjú lizozim oldatot adunkhozzá (Warthington, 11000E/mg), majd 5 perc múlva 1,2 ml EDTA-t (500 mM 8.0), majd űjabb 5 perc elteltével 4,8 ml detergenst [0,1% Triton-X 100 (Merck), 50 mMEDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0]. 5 perc múlva a lizátumot előhűtött SS-34 rotorban 40 percig 4 ’C-on centrifugáljuk. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk és szilárd cézium-ldoridot adunk hozzá (8,3 g Cad-t 8,7 ml felülúszóhoz).

Etidium-bromid (Sigma) hozzáadása után (végkoncentráció 1 mg/ml felülúszó) az oldatot áttesszük

13.5 ml-es Quick Seal poliallomer csövekbe (Beckman), majd Beckman Ti 50 rotorban 40 órán át 40 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Hosszúhullámú UV-fénnyel (366 nm) két fluoreszcens csíkot figyelhetünk meg. Az alsó csík tartalmazza a teljesen Összetekeredett, natívplazmid DNS-t, melyet tűvel ellátott 2 ml-es fecskendővel szívhatuhkle, ^lyukasztva a cső oldalát. Ötször, azonos térfogatú, cézium-ldoriddal telített izopropanollal extrahálva az oldatot tudjuk az etidium-bromidot eltávolítani, majd a színtelen oldatot áttesszük 30 ml-es Corex csőbe, 2,5 térfogat TE puffért adunk hozzá és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az oldatot ezután 12-15 órán át -20 ’C-on tartjuk. A kicsapott DNS-t Sorwall HB-4 rotorban 30 percig 12 000/perc fordulatszámmal 4 ’C-on centrifugálva gyűjtjük össze, majd újra feloldjuk200 gl TE pufferben. 100 ml tenyészetből 50-100 gg hibrid plazmid DNS-t nyerhetünk.

Az ilyen keverékekből származó DNS-t használjuk aS.cerevisiaeAH216 (a, his3, Ieu3,pho3,pho5) törzs transzformálására. Hűmen és munkatársai [1] által leírt módszer alkalmazásával. Az élesztő transzformánsokat alacsony foszfát koncentrációjú minimál táptalajra replikázzuk [”Difco élesztő minimál táptalaj” 20 gŰ glükózzal kiegésztve, de komponenseiből előállítva Difco recept szerint (Difco Manual, Difco Laboratories,Detroit, USA), aszal a kivétellel, hogy 0.03 g/1 KH₂PO₄-et és 1 g/1 KCl-t használunk 1 g/1 KHjPfy helyett], majd a savas foszfatáz aktivitás kimutatására festő-agarral rétegezzük le [1% Difco agar, 100 mM pH 4,0 acetát pufferben, 2 mg/ml Fást Blue B só (Serva) és 0,2 mg/ml α-naftil foszfát (Serve)]. Működő PH05 génnel rendelkező telepek az alacsony szervetlen-foszfát-tartalmú táptalajon depresszálódó gén miattvörösrefestődnek. Apozitíveredményt adó génbankot ismételten tovább osztva 3 független, represzszálható savas foszfatáz aktivitást mutató ldónt nyertünk.

Akiónok egyikét (pG7) tovább vizsgáljuk. Ahibrid plazmid mérete 42 kb. A pG7 plazmid EcoRI és BamHl fragmenseit szubldónozzzuk pBR. 322/hIS3 [16] és pJDB 207 [28] plazmidban. Arestrukciós emésztést az enzimek előállítójának utasításai szerint végezzük (New England Biolabs), a ligálást 20 gl térfogatban 150 egység T4 DNS ligázzal (New England Biolabs) végezzük; az egyes emésztett plazmidokat 20 gg/ml koncentrációban használjuk (a New England Biolabs által javasoltkörülményekközott).A8kbEcoRIfrag50 ment részét képező 5,1 kb-os BamHl fragmentet a pJDB 207 élesztő vektorban szubklónozzuk, majd az AH 216 élesztő-törzset transzformálva vele, ez a hibrid plazmid (pJDB 207/PH05, PH03 lást 1. ábra) deprepresszáló körülmények között (alacsony Pj) magas 55 foszfatáz aktivitást fejt ki (PH05 gén) és alacsony szintű aktivitást normál élesztő minimál táptalajon (aPH03 génkifejeződése).

3. példa

APH05ésPH03génekIokalizálásaésDNSnukleo10

HU 204095 Β tid-sorrend analízise

a) A PH05 gén

A PH03 és PH05 géneknek a BamHI fragmenten való lokalizálásánál kihasználjuk a Sau 3 A restrikciós helyek elhelyezkedése, valamint az egyetlen PstI restrikciós hely adta előnyöket. A BamHI fragmentet a Sau 3A (New England Biobals) restrikciós endonukleázzal emésztve 6 fragmentet kapunk (A-F, 2. ábra). A részlegesen emésztett Sau 3 A fragmenteket az önállóan szaporodó pJDB 207 élesztő vektor BamHI helyére beépítve a Sau 3 Afragmentek különböző kombinációit tartalmazó plazmidokat kapunk. Ezekkel a plazmidokkal azután a S.cerevisiae AH 216 phö3, pho5 mutáns élesztőt-transzformáljuk. A transzformált sejteket alacsony szervetlen foszfát-tartalmú vagy normál minimál táptalajon növesztve, leellenőrizzük a savas foszfatáz aktivitásukat. Alegalább A ésB Sau 3Afragmenteket(2. ábra. 1-4) tartalmazó ldónok ugyanolyan savas foszfatáz aktivitást mutatnak mint a teljes BamHI fragment (közelítő becslés, savas foszfatáz agarral való felüirétegzés után, amint azt a 2. példában leírtuk). A gének kifejeződését normális körülmények között a táptalaj szervetlen-foszfát tartalma szabályozza. A csak a Sau 3A A fragmentet (2. ábra, 5,6) tartalmazó kiónok savas foszfatáz aktivitása alacsony, és nem befolyásolja a táptalaj szervetlen-foszfát koncentrációja. Ez azt mutatja, hogy a Sau 3A A fragmenten kódolt információ elegendő a konstitutív savas foszfatáz (PH03) kifejeződéséhez. A Sau 3A B fragment nem eredményez savas foszfatáz aktivitást sem represszált, sem derepresszált körülmények között. Azonban a BamHI és PstI restrikciós helyek közötti teljes szakaszt (2. ábra, 10.) tartalmazó szubklón szabályozott, nem konstitutív savas foszfatáz szintézist mutat. Tehát ennek a szubklónnak kell az élesztő PH05 gént tartalmaznia [16].

A PH05 gén pontos helyét Maxam-Gílbert féle DNS-szekvenálássalhatározzukmeg [15]. Egy623 bázispár méretű BamHI-Sall restrikciós fragmentet klónozzuk a pBR322 plazmidba (lásd 1. ábra) a 375-650 bázispárok (lásd pBR 322 nomenklatúra) közötti BamHI-Sall fragmentet helyettesítve vele, a fentiekben leírt emésztési és ligálási körülmények alkalmazásával (minden enzim a New Negland Biolabs-tól származik). Abeillesztett BamHI-Sall szakasz fragmentjei aszimmetrikusan vannak jelölve az 5’ végeiken, a következő helyeken: BamHI (-541), Sau3A(-200) és Sa11(+82), (a számozást lásd a 3a ábrán). A beillesztett, 623 bp hosszúságú BamHI-Sall DNS szakasz nukleotid-sorrendjét a 3a. ábrán láthatjuk. Ebből kiderül, hogy a beillesztett szakasz a PH05 promoter régiót és a PH05 foszfatáz-fehérje kódoló szakaszának egy részét tartalmazza.

V)APH03gén

A PH03 gén pontos helyét a New England Biolabs által kiadott „M13 cloning and DNA sequencing system” leírás alapján végzett DNS-szekvencia analízissel határoztukmeg.

Egy 416 bp hosszúságú (5’) PstI~RsaI(3’) fragmentet az egyediPsH és Smalrestrikcióshelyek felhasználásával M13 és mp8 és Ml 3 mp9 vektorokba szubklónozunk. A 416 bp hosszúságú Psű-Rsal DNS szakasz nukleotid-sorrendjét a 3b. ábrán mutatjuk be. Ebből kiderül, hogy a beépített DNS szakasz a PH03 promotert és a PH03 foszfatáz-fehérje kódoló szakaszának egy részét tartalmazza.

4. példa

A p30 plazmid készítése (lásd 4. ábra)

a) A Ball restrikciós hely eliminálása a pBR322 plazmidból

A 4. ábrán vázolt séma megkívánja a pBR322 plazmidban páratlanul előforduló Ball restrikciós hely eliminálását. 3 μg pBR322 plazmidot emésztünk meg teljesen a gyártók előírása szerint Ball (BRL) és PvuH (Biolabs) restrikciós endonukleázokkal. A pBR322 plazmidot Ball és PvuH enzimekkel emésztve két, 3738 bp és 622 bp méretű fragmentet kapunk. A két fragmentet 1% alacsony olvadáspontú agaróz gélen (Sigma), TBE pufferben (90 mM Tris HCl, pH 8.3,

2,5 mM EDTA, 90 mM bórsav) választjuk el. A DNS csíkokat etidium-bromiddal festjük és hosszúhullámú UV fénnyel (366 nm) tesszük láthatóvá. A 3738 bp hosszúságú fragmentet tartalmazó agaróz-darabot kivágjuk a gélből, megolvasztjuk 65 °C-on, a NaCI koncentrációját 500 mM-ra állítjuk és 20 percig 65 °C-on tartjuk. Egy térfogat fenolt adunk hozzá (10 mM Tris. HCl, pH 7.5,1 mM EDTA és 500 mM NaCl oldattal telítve). A vizes fázist kétszer extraháljuk még fenollal és egyszer kloroformmal. ADNS-t 2,5 térfogat hideg abszolút alkohollal kicsapjuk és centrifugálással öszszegyűjtjük. ADNS csapadékot 80%-os hideg etanollal mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk. A DNS-t annyi TE pufferben szuszpendáljuk, hogy koncentrációja 0,15 mg/ml legyen.

Az izolált 3738 bp hosszúságú DNS-nek a Ball és PvuH enzimekkel való emésztés miatt két tompa vége van. A DNS-t körbe zárjuk tompavég ligálással. 0,6 μg DNS-t inkubálunk egy éjszakán át szobahőmérsékleten 30 μΐ 60 mM Tris -HCl, pH 7,5,10 mM MgCl₂. 10 mM DTT, 4 mM ATP és 900 egység T4 DNS ligáz (Biolabs) tartalmú reakció-elegyben. A ligáló keverékből 5 μΐ-es alikvot részeket adunk 50 μΐ, Mandel és mtsai [29] szerint készített, kalcium-ionnal kezelt, kompetens E.coli HB 101 sejtekhez. A keveréket 5 percig jégen tartjuk, majd 2 percig 37 °C-on, majd 10 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk mielőtt 100 μβ/ηύ amplicillint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük. Hat amp^ telepet izolálunk és külön növesztünk 100 ml, 100 μ§/ηύ ampicillint tartalmazó LB táptalajban (ugyanaz mint az előbb, csak agar nélkül). Aplazmid DNS-t a 2. példában leírt módszerrel izoláljuk a sejtekből. A Hae Hl (Biolab-tól vásárolva, az emésztés körülményei a gyártó által javasoltak), PvuH és BaH enzimekkel való emésztés után kapott restrikciós fragmenteket 1,5%-os agaróz gélen, TBE pufferben analizáljuk. Arestrikciós minta, valamint az újonnan keletkezett kapcsolt fragment előre megjósoltmérete azt mutatja, hogy a plazmidok azonosak és a BallPvuH fragment kivételével az egész pBR322 plazmi11

HU 204095 Β dót tartalmazzák. Ezekben a plazmidokban nincs Ball restrikciós hely, és PBR322 ABall-ként hivatkozunk rájuk.

b) A PHQ5 és PH03 DNS szakaszokat tartalmazó élesztő 5,1 kb BamHIrestríkciósfragment klónozása pBR322ABalI-be (4.ábra)

ApJDB 207/PH05, PH03 (lásd 1. ábra) tartalmazza az élesztő 5,1 BamHl fragmentet a szabályozott és konstitutív élesztő savas foszfatáz génekkel (PH05 és PH03). ApJDB207/PH05, PH03, valamint a pBR322 Δ Ball plazmidot BamHl restrikciós endonukleázzal emésztjük. A teljes emésztés után az enzimet 2 percig 65 ’C-on tartva inaktiváljukMiüdkétDNS-t etanollal kicsapjuk, majd szuszpendáljuk 10 mM Tris-HCl-ben (pH 8.0), mindegyiket 0,2 mg/ml koncentrációban. Mindkét BamHl enzimmel emésztettDNS-ből 0,5 pgot 20 μΐ ligáló pufferben (NewEnglandBiolabs előírásai szerint) 300 egység T4 DNS ligázzal 20 órán át 15 °C-oninkubálva összekötünk. Aligálókeverék5 ples alikvotjait 50 pl kalcium-ionokkal kezelt E. coli HB101 sejtekhez adjuk és a transzformált E. coli sejteknek megvizsgáljuk az amplicillin és tetraciklin rezisztenciáját. Nyolc ampicillin rezisztens, tetraciklin érzékeny telept izolálunk, majd 100 pg/ml ampicillin tartalmú LB táptalajon növesztjük. A plazmid DNS-t izoláljuk a sejtekből (lásd 2. Példa). ABamHI enzimmel végzett emésztések azt mutatják, hogy 4 plazmid tartalmaz a 3,7 kb vektor-fragment (pBR322/ Ball) mellett egy 5,1 kb hosszúságú DNS szakaszt. Sáli enzimmel (New England Biolabs) végzett emésztéssel meghatározzukabeépített5,l kb fragment irányítottságát: két plazmidban van a beépített szakasznak a 4. ábrán bemutatott irányítottsága. Ezek közül az egyiket p30-naknevezzük Az 5,1 kb hosszúságú beépített szakaszon a 4. ábrán jelzett módon a PH05 és PH03 gének transzkripciójának az iránya az óramutató járásával ellentétes irányú.

5. példa

Idegen DNS beépítése a p30 plazmidba (lásd 4. áb- ra)

a) A p30 plazmid 3,9 kb hosszúságú EcoRI-Ball fragmentjének (Afragment) izolálása 10 pgp30 DNS-t emésztünk Ball restrikciós endonukleázzal. Fenol-kloroformos extrakció után aDNS- ² t etanollal kicsapjuk. A DNS-t 100 pl TE pufferben oldjuk. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os, alacsony olvadáspontú preparatív agaróz-gélen választjuk et A p30 plazmid vektor-részét tartalmazó 5,1 kb fragmentet a 4a. példában leírt módon eluáljuk a gélből. A í DNS-t tisztítás céljából DE52 (Whatman) ioncserélő oszlopra kötjük alacsony sótarflamú pufferben (150mMNaCl, 10mMTRIS-HClpH8,0 1 mMEDTA), majd magas sótartalmú pufferrel (l,5MNaCl 10 mM TRIS-EC1 pH 8,0 és ImM EDTA) leoldjuk. A 6 DNS-t etanollal kicsapjuk, majd tovább emésztjük Eco KI enzírnTnet (Boehringer). A 3,9 kb EcoRI-Ball restrikciós fragmentet ismét 0,8%-os, alacsony olvadáspontú preparatív gélen választjuk el, majd visszanyerjűka4a.példábanleírtmódonésetanollalkicsap- 6 juk. Ezt a DNS fragmentethíyják A fragmentetnek

b) A602 bp HaelH-EcoRI fragment izolálása (B fragment) CG-pBR 322/HlyCIFN-8’i-ből AHB-10I CG-pBR 322/HLyc IFN-8’j Aco// tör! zset (lásd 10E példa) 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített 100 mlLB táptalajon növesztjük, majd a plazmid DNS-t a 2. példában leírt módon izoláljuk Kilenc μ% HLycIFN-8’! DNS-t teljesen megemésztünk Hae IH restrikciós endonukleázzal. A restrikciós fragmente) két 0,8%-os, alacsony olvadáspontú preparatív agaróz gélen elválasztjuk A940 bp méretűHaeED[ fragmentet kivágjuk és a 4a. példábanleírtmódonkioldjuk az agaróz gélből. A DNS-t DE 52 oszlopon, az 5a. példában leírt módon tisztítjuk majd tovább emésztjükEcoRI» génA602bp-sEcoRI-HaeIHfragmentetújrapreparatív, 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen elválasztjuk a 4a. példában lent módon kinyerjük és etanollalkicsapjuk Ezt aDNS fragmentet hívjukB fragmentnek • c) AzAésBfragmentekligáIása(lásd5.ábra)

Akétrestrikciós fragmentet a ragadós EcoRI végeiknél enzimesen összekötjük valamint a tompa Ball és HaeHC végeknél is, így egy egyetlen EcoRI hasítási hellyel, valamint egy HaeHI enzimmel hasítható (de Ball-gyel nem) BalI-HaelH kapcsolattal rendelkező kör alakú molekulát hozunk létre. A ligálást 60 mM Tris-HCl pH 7,5,10 mM MgCl₂,10 mM DTT, 4 mM ATP és 300 egység T4 ligáz tartalmú oldatban végezzük 16 órán át 23 ’C-on, a DNS-ek koncentrációja 20 pg/ml Afragment, 3 pg/ml B fragment, 10 plössztérfogatban.

d) AzE.coliHB101 törzs transzformálása aligáltfragmentekkel pl ligáló keveréket (lásd 5c. példa) adunk 50 pl kalcium ionokkal kezeltE.coliHB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa). A keveréket ezután 100 pg/ml ampicillmt tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük A lemezeket 16 órán át 37 ’C-on inkubáljnk Körülbelül 300, ampicillin rezisztens E,coliHB 101 telepet izolálunk Nyolc ampicillin rezisztens izolátumból kinyerjük a plazmid DNS-t, analizáljuk, és szerkezetüket az EcoRI és HaeQI enzimekkel történő emésztés után kapott restrikciós fragmentek mobilitását standardt DNShez viszonyítva állapítjuk meg [λ. bakriofágDNS Hind m enzimmel emésztve (New England Biolabs), p30 plazmid DNS HaeHI és EcoRI enzimekkel emésztve]. A kapcsolódások szerkezetének igazolása után 5 plazmidot kaptunk, melyek a helyes szerkezettel rendelkeznek Az egyik ilyen plazmidot, amelyik a PH05 promotert a 8’j-interferont kódoló szakaszhoz kapcsolva tartalmazza (lásd 5. ábra), p30 IFNl(8’j)-nek nevezzük

6. példa

Élesztő replikációs origó és szelektív genetikai bélyeg beépítése

a) 1,5 kb EcoRI fragment izolálása az Yrp 7 plazmádból és beépítése a p30 ΙΕΝΙζδ’ρ plazmidba Aligálási reakció elősegítése célából az 1,5 kb EcoRI retrikciós fragmentet megtisztítjuk Az Yrp7 [4]

HU 204095 Β plazmidot EcoRI enzimmel hasítjuk és a kapott két fragmentet 0,8%-os agaróz gélen elválasztjuk, az élesztő önállóan replikálódó szakaszt és az élesztő TRJPI gént tartalmazó 1,5 kb fragmentet a 4a. példában leírt módon tisztítjuk és izoláljuk. A ligálást (a New England Biolabs előírásai szerint) 20 ^g/ml EcoRI enzimmel hasított PSOIFNlíS’j) DNS és 10 μg/ml az Yrp7-ből származó 1,5 kb méretű EcoRI fragment között hajtjuk végre, 100 egység T4 ligázt használva.

b) E.coli JA 194 transzformálása a ligáit fragmentekkel

A TRP1 élesztő-gént tartalmazó plazmidok közvetlenül szelektálhatok az E.coli trpC JA 194 mutáns 3 törzs (trpC, leuB, BI) transzformálásával. Az E.coli trpC gén az E.coli N(5’-foszforibozil)-antraniIátizomerázt kódolja. Az E.coli trpC mutánsok komplementálhatók az élesztő TRP1 géneel [4], AzE.coli JA 194 törzs transzformálását az E.coli HB 101-re leírt módon hajtjuk végre, a következő módosítással: mielőtt a keveréket agarlemezekre szélesztjük, a sejteket hagyjuk regenerálódni, 1 ml LB táptalajban 37 ’C-on 60 percig inkubálva őket, a sejteket egyszer mossuk E.coli M9 minimál táptalajjal [30], majd 1 ^g/ml BI vitamint és 20 mg/ml L-leucint tartalmazó, M9 minimál táptalajra szélesztjük. A lemezeket két napig 37 ’C-on inkubáljuk. Körülbelül 1000 triptofán pozitív telepet izolálunk.

c) A hibrid plazmidok izolálása és jellemzése

A Trp⁺ telepeket 100 |xg/ml ampicillinnel kiegészített LB lemezeken tisztítjuk. Az egyes telepeket izoláljuk és a plazmidokat a 2. példában leírt módon állítjuk elő. A tisztított plazmidokat az EcoRI, Hindin, Pstl és BglH (Biolabs) enzimekkel való emésztés után kapott restrikciós fragmentek méretének meghatározásával analizáljuk. Két különböző típusú plazmidot kapunk, melyek az 1,5 kb EcoRI restrikciós fragmentet a két lehetséges orientációban tartalmazzák (lásd 4. ábra). Ezeket p30IEN2(8’1),iUetvep30IFN2’(8^,1)néwel láttuk el, amint az a 4. ábrán látható.

7. példa

A Saccharomyces cerevisiae RH 971 törzs transzformálása és az interferon termelés indukálása

Ap30HN2(8’₁)ésp30IFN2’(8’₁)plazmidok mindegyikét a Hinnen és munkatársai [1 ] által leírt módszer analógiájára bejuttatjuk a Saccharomyces RH971 (a, trp *, /e«², his⁴) törzsbe. Egy μg plazmid DNS-t adunk 100 μΐ szferoplaszt szuszpenzióhoz, és a keveréket a leírt módon [1] polietilén-glikollal kezeljük. A szferoplasztokat 10 ml regeneráló agarral keverjük és leucint nem tartalmazó élesztő minimál táptalajra rétegezzük. 3 napi 30 °C-os inkubálás után kb. 1000 transzformált sejtet kapunk.

Az élesztő transzformációs lemezekről leveszünk egy élesztő telepet (neve egy Saccharomyces cerevisiae RH971/p30W2(8’₁) vagy/p30IFN2’(8’₁)], majd 100 milliliteres Erlenmeyer lombikban levő 10 ml élesztő minimál táptalajba tesszül: és 30 ’C-on 200/perc fordulatszámmal 24 óráig a kb. 2-3xl0⁷ sejt-sűrűségig növesztjük. A sejteket egyszer mossuk ml, alacsony szervetlen-foszfát tartalmú minimál táptalajjal. A szuszpendált sejtek 3-3 ml-ét használjuk 1000 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 300 ml alacsony szervetlen foszfát tartalmú, illetve 300 ml normál foszfát-tartalmú minimál táptalaj beoltására. Az inkubálást 30 °C-on 160/perc fordulatszámmal végezzük. A PH05 promoter indukcióját a teljes sejtekben Toh és munkatársai [31] módszerével a savas foszfatáz aktivitás megjelenésével mérjük. A sejteket körülbelül l-2xl0⁷ sejtsűrűség eléréséig növesztjük (26-30 órás inkubálás).

8. példa

Élesztő-sejt kivonatok készítése és az interferon mennyiségénekmeghatározása

300 ml tenyészléből származó sejteket (lásd 7. példa), mennyiségük l-2xl0⁷/ml, Sorvall GSA rotorral 8000/perc fordulatszámmal, 5 percig 4 ’C-on centrifugálva összegyűjtjük. A sejteket egyszer mossuk 100 ml vízzel, szuszpendáljuk 6 ml jéghideg Hzáló keverékben [Ο,ΪΜ kálium-foszfát puffer, pH 7,4; 1 térfogatszázalék Triton x-100; Ο,ΟΟΟΙΜ PMSF (Merck)], majd 30 ml-es Corex csőbe tesszük. A szuszpenziót újra centrifugáljuk 5 percig Sorvall SS-34 rotorban, 8000/perc fordulatszámmal 4 ’C-on és újra szuszpendáljuk 3 ml lizáló keverékben 0 ’C-on. Négy gramm üveggyöngyöt (0,4 mm átmérőjű) adunk a sejtekhez és a szuszpenziót Vortex Mixeren rázatjuk. (Scientific Instruments Inc. USA) teljes sebességgel 30 másodpercig, majd egypercig jégfürdőben hűtjük. Ezt a rázási eljárást 5-10 alkalommal megismételjük, amíg a sejteknek több mint 90%-a feltáródik (fénymikroszkóppal ellenőrizve). A sejt-törmeléket és az üveggyöngyöket 10 percig 8000/perc fordulatszámmal 4 ’C-on Sorvall HB-4 rotorban centrifugálva eltávolítjuk. A felülúszót Eppendorf csövekbe tesszük, folyékony nitrogénben lefagyasztjuk, majd -60 ’C-on tároljuk. Az interferon aktivitását Armstrong eljárásával [32] határozzuk meg, emberi CCL-23 sejteket, és kórokozóként hólyagos szájgyulladás (VSV) vírust használva. Az eredményeket az 1. Táblázatban foglaljuk össze.

1. Táblázat

Interferon aktivitás a Saccharomyces cerevisiae RH971 törzsben, a p30IFN2(8’₁) és pSOIFN^’!) rekombináns plazmidokkal, valamint a pJDB207HEN2’(8’₁) plazmiddal (lásd 9. példa) való transzformálás után

Interferon ektivitás egység/ml élesztőPlazmid kivonat egységben kifejezve

p30-	p30-	pJDB207
-IFN2(8’1)	-IEN2’(8’l)	/EPN2’(8’1)
represszált körülmények (normális foszfát- 0 -koncentráció	30	100
derepresszált körülmények (alacsony foszfát -koncentráció 700	7000	50000

HU 204095 Β

9. példa

Az interferon gén beillesztése a nagy kópia-számú élesztő pJDB207 2 μ vektorba (6. ábra)

A p30IEN2’(8’j) plazmidot a gyártó (Biolabs) előírásai szerint HindlH és BaniHT restrikciós endonukle- 5 ázzál emésztjük. 2,0 kb és 4,0 kb méretű fragmentek keletkeznek. A 2.0 méretű restrikciós fragmentet a 4a lépésben leírt módon alacsony olvadáspontú agaróz gél-elektroforézissel elválasztjuk és tisztítjuk. A pJDB207plazmidot [28] Hindin és BamHI restrikciós 10 endonukleázzal emésztjük. Három fragment keletkezik A 6,5 kb méretű restrikciós fragmenteket a fentiekbenleútmódon elválasztjuk.

A 2,0 kb méretű fragmentből 0,3 pg-ot (ez tartalmazza az interferon fehérje-kódoló szakaszhoz kötött 15 PH05 promotert) Egálunk 15 órán át a 6,5 kb méretű vektor fragmenthez 20 plössztérfogatban, 300 egység T4 DNS Egázt használva, az előállító (Biolabs) álal előírt körülmények ö8zött E.coli HB 101 sejteket transzformálunk, és az ampicfllin rezisztens telepeket 20 kiválasztjuk. A plazmid DNS-t izoláljuk, és az izolált plazmid DNS szerkezetét HindTTI és BamHI enzimmel végzett restrikciós emésztéssel igazoljuk, molekulatömeg standardként pSOU^’^) és pJFB207, ugyanilyen enzimekkel emésztett plazmidokat használva. A 25 kapott új plazmidot pJDB 207/0542^8^) névvel latjukéi.

A pJDB 207/JFN2’(8’j) plazmidot Saccharomyces cerevisiae RH971 törzsbe transzformáljuk az [l]-ben leírt eljárás analógiájára, leucin pozitív telepeket sze- 30 lektálva. Egyetlen leucin pozitív élesztő telepet [neve Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB 207/IFN2’(8’ j)] izolálunk és a 7. példában leírt módon növesztjük. Az interferon mennyiségét a 8. példában leírt módon határozzuk meg. Az eredmények az 1. 35 Táblázatban találhatók.

10. példa

A humán limfoblasztocid interferonokat kódoló DNS szakaszokat tartalmazó rekombináns plazmi- 40 dokkal transzformált-E. coli törzsek előállítása A.HuIFN mRNS-ben gazdagított poli (A) RNS előállítása

a) Namalwasejtekindukálása

Namalwa sejteket növesztünk 37 °C-on 1Q% borjú- 45 magzat szérumot tartalmazó RPMI1640 táptalajon.

Ha elérjük a 3xl0⁶ sejt/ml koncentrációt, a szuszpenziót szobahőmérsékleten 10 percig 800 g-vel centrifugáljuk. Az összegyűjtött sejteket 200 ml 0,.027 térfogatszázalék glutamint, 200 egység/ml penicillint és 50 50 pg/ml streptomicint tartalmazó tápközegben szuszpendáljuk. A sejteket 90 percig 37 “C-on inkubáljuk Newcastle betegség vírussal (NDV 110) 190HAU/10⁶ sejt arányban (HAU: haemagglutinin egység). Friss tápközeghozzáadásával a sejt-sűrűséget 55 1.3xl0⁶ sejt/ml-re áEítjűk és a sejt-szuszpenziót 34 ’C-on rázatjűk 100/perc fordulatszámmal. 12 óra múlva 6xl0⁹ sejtet gyűjtünk össze és szuszpendálunk újra 50 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (’TBS”: 11 PBS 80 gnátrium-kloridot, 2 g káEum-kioridot, 14,4 g 60 dinátrium-hidrogén-foszfátot és 2 g kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz). Mielőtt összegyűjtjük a sejteket, mintát veszünk a szuszpenzióból és az interferon aktivitást Armstrong [32] módszerével határozzukmeg, humán CCL-23 sejteket és kórokozóként hólyagos szájgyuHadás vírust (VSV) használva. 4 300 egység/ml értéket találunk.

b) Asejtekfeltárása és fehérje-mentesítése Asejt-szuszpenziót (6xl0⁹ sejt 50 mlPBS-ben) szobahőmérsékleten 800 ml, 0,05 M Tris-HCl-t (pH 7,5),

0,1 MNaCl-t, 5 mMEDTA-t és 2% SDS-t (kristályos, kutatási minőség, Serva) tartalmazó lizáló pufferhez adjuk. AEzátumotO,2mg/ml eló'inkubált (2 óra, 37 ’C) proteázzal (proteaseP, type VT, Sigma) emésztjükszobabőmérséldeten, miközben kevertetjük az oldatot.

Az oldatot háromszor 500 ml TNE-vel teEtett fenollal és ötször 500 ml kloroformmal extrahálva febérje-mentesítjük. 260 nm-en mért abszorpció alapján 500mgnuldemsavatkapunk.

c) AszennyezőDNS ésRNS eltávoEtása

A fentiekben leírt módon (Ab lépés) nyert enyhén viszkózus vizes oldat nátrium-klorid koncentrációját 0.3 móka állítjuk be és 1 goEgo (dl) cellulózt (7 típus, P-L Biochemicals) adunk hozzá. 30 percig szibahőmérsékletenkevertetjük, majd a szuszpenziót 1 literes SorvaU palackokban SorvaU RC-3 centrifugában szobahőmérsékleten 10 percig 4000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk és az oligo (dT) ceUulóz iszapot kétszer mossuk 40 ml, 05% SDS-t tartalmazó 2xTNE pufferrel. Amegkötött poE(A) RNS-t ötször egymás után 2,5 ml vízzel mosva leoldjuk. Az optikai elnyelés alapján meghatározva 720 pg poIi(A) RNS-t lápunk. Az első adszorpció után kapott felülúszóban levő RNS-t másodszor 1 g oligo (dT) cellulózra adszorbeáljuk, és a fentiekben leírt módon leoldva 320 pg poU(A) RNS-t kapunk. Az eluátumokat egyesítjük, TNE-re állítjuk és apoE(A) RNS-t 67%-os etanollalkicsapjuk (-20 ’C, 10 óra). Az RNS-t 10000/perc fordulatszámmal RC5b centrifugában 10 percig 0 ’C-on centrifugálva kinyerjük. A csapadékot (1 mg) újra feloldjuk 1 ml 1 mMEDTA-ban.

AzRNSHuIFNmRNS aktivitását a következőképpen vizsgáljukXenopus laevis petesejtbe injektálva:

ni RNS oldatot injektálunk 20 petesejt mindegyikébe. ApetesejteketBarth táptalajban inkubáljuk (2 mM TRIS 88 mM nátrium-klorid, 1 mM káliumklorid, 0,33 mM Ca(NO₃)₂JI₂O, 0,41 mM CaCl₂.H₂O,0,82mMMgSO₄.7H₂O,2,4 mMnátriumhidrogén-karbonát, 0,01 mg/ml penicillin, 0,01 mg/ml streptomicin, az oldat pH-ját sósavval pH 7.6-ra állítjuk) Gurdon [33], Bartb [34] és Colman és munkatársai [35] szerint. Az injektált petesejteket42-48 óráig inkubáljuk, majd az inkubációs táptalajt eltávoUtjukS percig Eppendorf centrifugában centifuálva, és a felülúszót -20 ’C-on vagy -80 ’C-on tároljuk, amíg a vizsgálathoz fel nem használjuk. Az IFN aktivitást lényegében Armstrong [32] módszerével mérjük, azzal a különbséggel, hogy kórokozóként VSV vírust használunk Hep-2-sejteken (Flow Laboratories). A petesejt extraktum specifikus aktivitása 600IU interferon per

HU 204095 Β μgbeinjektáltRNS.

d) HuIFNmRNS dúsítása poli(A)RNS-ben Apoli(A) RNS-t 0,5 ml ágy-térfogatú Chelex-100 oszlopon 0,037-0,074 mmBio-Rad) engedjük keresztül. Az oszlopot 1 ml 1 mMEDTA-val öblítjük.

Az eluátumot (1 mgpoli(A) RNS 2ml EDTA-ban) 2 percig 100 ’C-on tartjuk, majd szacharóz -gradiensen centrifugáljuk (6 db 14 ml, 5-23 tömeg% között növekvő koncentrációjú szacharóz oldat, amelyek 50 mM Tris-HCl-t [pH 7.5], 0,2 M NaCl-t és 1 mM EDTA-t tartalmaznak). A centrifugálást TST 41 rotorban hajtjuk végre (Kontron AG) 35 000/perc fordulatszámmal 5 ’C hőmérsékleten 16 órán át. 0,3 mles frakciókat gyűjtünk ISCO gradiens frakció-szedővel. 2 térfogat etanolt adunk mindegyik frakcióhoz és azoldatot 10 órán át-20 ’C-on hagyjuk állni. Akicsapódott mRNS-t centrifugálással nyerjük ki (Sorvall, HB-4 rotor, 0 ’C, 10000/perc fordulatszám, 10 perc). Minden rfakciónak a csapadékát· újra feloldjuk 25 μΐ 1 mM EDTA-ban és minden frakciónak megvizsgáljuk a humán IEN mRNS aktivitását, amint az a fentiekben (Ac lépés) leírtuk, azzal a különbséggel, hogy 20 helyett csak 10 petesejtet injektálunk 1-1 RNS mintával. Az eredményeket a 2. Táblázatban közöljük.

2. Táblázat

Szacharóz sűrűség-gradiensből nyert frakciók HuXFN mRNS aktivitása

Frakció száma	IEN aktivitás (egység/ml)
1-18	-
19	162
20	162
21	162
22	162
23	nincs vizsgálva
24	729
25	nincs vizsgálva
26	405
27	nincs vizsgálva
28	486
29	nincs vizsgálva
30	162
31	nincs vizsgálva
32	162
33	nincs vizsgálva
34	54
35-40	nincs vizsgálva

A 23-29 frakciókat egyesítjük és a poli(A) RNS-t, tovább tisztítjuk a következők szerint:

A poli(A) RNS-t 2xTNE-re állítjuk 0,5% SDS-ben, majd 200 μΐ oligo(dT) cellulóz oszlopra visszük. Az oszlopot 2 ml 2xTNE-vel mossuk (0,5% SDS-ben) és a poli(A) RNS-t ötször 0,5 ml vízzel mosva oldjuk le. Az eluátumot TNE-re állítjuk és az oldatot kétszer egyenlő térfogatú (TNE-vel telített) fenollal extraháljuk és kétszer egyenlő térfogatú kloroformmal. A poli(A) RNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk, 10 órán át 20 ’C-on tartva és HB-4 rotorban a fentiek szerint centrifugálva összegyűjtjük.

Apoli(A) RNS-t 100 μΐ 0,5 mMEDTA-ban oldjuk.

Akitermelés optikai elnyelés alapján 40 μ&

A poli(A) RNS egy részének humán IEN aktivitását a fenteikben leírt módon 20 petesejt felhasználásával vizsgáljuk. A poli(A) RNS készítmény specifikus aktivitása 8100IU interferon per μgRNS.

B. Kétszálú cDNS készítése (7. ábra)

HuIFN. mRNS-ben dúsított poli(A) RNS-t (lásd Ad lépés) használunk kétszálú cDNS készítésére, lényegében Efstratiadis és munkatársai [36], Maniatis és munkatársa [37], valamint Hoeijmakers és munkatársai [38] módszere szerint.

a) Az első szál szintézise

250 μΐ 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5mMMgCl₂ 0,5 mM DTT (Calbiochem), 1 mM dGTP, dCTP, dTTP (P-L Biochemicals) és 1 mM ³²PdATP (Amersham, specifikus aktivitása 50 000 cpm/nmól), 20 μ§/πύ oligo (dT)i₂.₁₈ (P-L Biochemicals), 40 μ^πύ poli(A) RNS és 100 egység madár myeloblasztózis vírus reverz transzkriptáz (Life Sciences, Inc., StJPtersburg, Florida) tartalmú reakció-elegyet 80 percig 37 ’C-on inkubálunk. Areakciót leállítjuk az elegyben 10 mM EDTA és 0,5% SDS koncentrációt hozva létre. Az elegyet egyszer extraháljuk 1 térfogat fenollal. A vizes fázist újra extraháljuk 1 ml kloroformmal és 3 ml G-50 (Pharmacia, finom) oszlopra visszük. 0,1 ml-es frakciókat szedünk. Minden frakció rádióaktivitását Cserankov-sugárzásának mérésével határozzuk meg. A rádióaktív frakciókat egyesítjük és a nuldeinsavat 2 térfogat etanollal -20 ’C-on 10 órán át tartva kicsapjuk. A mintát HB-4 rotorban 20 percig 0 ’C 10 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A csapadékot 95 μΐ vízben oldjuk. 5 μί 10 n nátrium-hidroxidot adunk hozzá és az elegyet 40 percig 25 ’C-on inkubáljuk. 5 mólos ecetsavval történő semlegesítés után 50 μί vizet és 2 térfogat etanolt adunk hozzá, és a mintát 10 órán át -20 ’C-on tartjuk. A csapadékot a fentiekben leírt módon centrifugálással összegyűjtjük és 200 μί 0,1 mMEDTA-ban oldjuk. Akapott egyszálú cDNS mennyisége 3,7 pg. A cDNS mérete 7001500nukleotid hosszú, melyet 7 M karbamidot tartalmazó 6%-os poli-akrilamid gélben, ismert méretű standard DNS-ekhez viszonyított elektroforetikus mobilitása alapján határozunk meg Trisz-borát EDTA pufferben (108 g Trisz, 9,3 g EDTA-dinátrium só, és 55gbórsavper 1 liter pH 8.3-as oldat).

b)A második lánc szintézise és Sj endonukleázos emésztés

A kapott cDNS oldatot 90 másodpercig 100 ’C-on tartjuk, lehűtjük, majd 400 μΐ 0,1 M kálium-foszfát puffer (pH 6.9), 10 mMMgCl₂,10 mMDTT (Calbiochem). 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP (P-L Biochemicals), 1 mM ³H-dGTP (Amersham, specifikus aktivitás 94 000 cpm/mmól) és 165 egység/ml E.coli DNS-polimeráz I (Biolahs, New England) tartalmú reakció-elegyben inkubáljuk 8 órán át 15 ’C-on. A reakció leállítására a reakció-elegy EDTA koncentrációját 10 mM-ra, SDS koncentrációját 0,1%-ra állítjuk. A keveréket fenollal és kloroformmal extrahál15

HU 204095 Β juk, Sepáhdex G-50 oszlopon kromatografáljuk (Pharmacia,finom,2ml ágy-térfogat),majdafentiekhenleírt módon etanollal kicsapjuk (Ba lépés).

A kapott DNS-t 50 pl, 0(25 M nátrium-kloridot, mM nátrium-acetátot (pH 4,5) és I mM cink-szulfátot tartalmazó reakció-elegyben 6 egység Sj^ endonukleázzal (P-L Biochemicals) kezeljük 30 percig 37 ’C-on. A reakciót 0,1% SDS-sel és 10 mMEDTAval leállítjuk. A reakcióelegyet 1 térfogat (50 mM, pH

4,5 nátrium-acetáttal telített) fenollal és kloroformmal fehérje-mentesítjük. A vizes fázist 1 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, finom) oszlopon, TNE-ben kromatografáljuk. 100 μΙ-es frakciókat szedünk és minden egyes frakció Cserenkov-sugárzást meghatározzuk. A kizárt frakciókat egyesítjük és a DNS-t a fentiekben 1 leírt módon 1 térfogat etanollal -20 °C-on 10 órán át kicsapjuk. A csapadékot HB-4 rotorban centrifugáljuk Öásd fentebb) és a kapott csapadékot 100 pl 10 mM Trisz-HCl (pH 7.3) és 0,5 mMEDTA tartalmú oldatban oldjuk. 4 pgDNS-tkapunk.ADNS-tszacha- 2 róz sűrűség-gradiensen keresztül (5-23%) frakcionáljuk50mTrisz-HCl-ben(pH7.5) és 1 mMEDTA-ban, TST-60 rotorban (Kontron AG). A centrifugálást 55 000/perc fordulatszámmal végezzük 5 óráig 15 ’C-on. Egy párhuzamos gradienshenfutó 800 bázispár mére- 2 tű standard DNS-nél gyorsabban ülepedő DNS-t öszszegyűtjük, TNE-reállítjukés 67% etanollal -20 ’C-on 10 óráigkicsapjuk. 0,4 pgkétszálúcDNS-tkapunk.

C.pBR 322-höz kötött cDNS készítése (7. ábra)

a) dCMP-velhosszabbítottcDNSkészítése 3

A kapott kétszálú cDNS 0,1 pg-jának3’-végétpoH(dC) végződéssel látjuk el, 10 μί, 100 mM nátriumkakodüát (pH 72), 2,5 mM kobalt-klorid, 50 μg/ml BSA (Calbiochem), 1 ml dCTP és 10 egység terminális dezoxinukleotidil transzferáz (P-L Biochemicals) per 3i pg kétszálú DNS tratalmú reakcióelegyben. 20 perc 27 ’C-os inkubálás után 10 mMEDTA-t adunk hozzá ésamintátfelhasznáIásig-20 ’C-on tároljuk.

b) PstI enzimmel hasított, dGMP-vel hosszabbított pBR322készítése 4( pgpBR322plazmidDNS-t 10 egységPsűendonukleázzal (Biolabs) emésztünk 100 μί, 50 mM nátrium-kloridot, 6mM2-merkapto-etanoltés 100 pg/ml zselatint tartalmazó oldatban 1 órán át, 37 ’C-on. Az oldatot 1 térfogat fenollal és kloroformmal extrahál- 4í juk. Az oldatot TNE-re állítjuk éslinearizált DNS-t 2 térfogat etanollal -20 ’C-on 5 órán átkicsapjuk.

Alinearizált plazmid DNS-t dGMP-vel hosszabbítjuk200 pl, 100mMnátrium-kakodiIát(pH7,2), 5mM MgCl2,20mMNaH₂P04,50pgBSA/ml,lmMdGTP 5C és 100 egység terminális dezoxinukleotidil transzferáz (P-LBiochemicals) tartalmú reakcióelegyben 20 perc, ’C-os inkubálás után 10 mMEDTA-t adunkhozzá ésamintátfeIhaszaáIásig-20 ’C-on tároljuk

c) A dGMP-vel hosszabbított pBR322 hozzákötése a 55 dCMP hosszahbítottkétszálúDNS-hez

0,1 pg dCMP-vel hosszabbított kétszálú cDNS és 0,5 pg dGMP-velhosszabbítottpBR322DNS keverékét 500 pl TNE pufferben inkubáljuk 65 ’C-on egy órát, 46 ’C-on egy órát, 37 ’C-on egy órát és 20 ’C-on 60 egy órát. A pBR 322-höz kötött cDNS-t jégre tesszük és azonnal felhasználjuk transzformáláshoz.

O.E.coli HB 101 transzformálása a hibrid plazmiddal

Transzformációhoz készített, kalcium-ionokkal kezelt E.coli HB 101 sejtszuszpenziót Mandel és munkatársai [29] módszerével állítjuk elő. ApBR 322hibrid plazmidDNS-t (a Cc lépés szerint készítve) 150 pl 10 mMmagnéziumldorídot, lOmMkalcium-kloridot és 10 mM Trisz-HCl-t (pH 7.5) tartalmazó oldatban levő kalcium-ionokkal kezelt E. coli HB 101 sejtszuszpenziőhoz adjuk, 200 pl össztérfogatban.

A keveréket 20 percre jégbehűtjük, 1 percre 42 ’Cra melegítjük és 20 ’C-on tartjuk 10 percig. 1 ml trip5 tón táptalajt adunkhozzá [10 gBacto-Tripton (Difco); 1 g élesztő-kivonat (Difco), 1 g glükóz, 8 g nátriumklorid és 294 mg desztillált vízben] és 30 percig 37 ’C-on inkubáljuk 300/percfordulatszámmal rázatva. A keveréket 2 agarlemezre szélesztjük (Mc !0 Conkey agar, Difco; 0,6 mlZtemez), mely 10 pg/ml tetracíklint tartalmaz (Sigma). A lemezeket 37 ’C-on inkubaijuk 12-17 órán át A transzformáltE. coliHB 101-ből körülbelül 5600 tetraciklin-rezísztens telepet izolálunk.

E.4 HÜIFN DNS-t tartalmazó kiónok azonosítása

a) 13 tagú oligodezoxinukleotid primer szintézise

Egy 13 tagú, mind a HuIFN-cq mind a HuIFN-β mRNS-ben előforduló nukleotid-szakasszal komplementer oligodezoxinukleotidot szintetizálunk kémiai0 lag a foszfotirészter módszerrel [Itakura és munkatársa (40), de Rooij és munkatársai (410]. A szintézis egyeslépéseit a 8. ábrán mutatjuk be. A8. ábra elsősorában feltüntetett kiindulási anyagok (védőcsoportokat hordozó mono- és didezoxinukleotidok) ismertek 5 az irodalomból. A védőcsoportokat az Itakura és munkatársai által leírt módszerekkel hasítjuk le: az 5’-monometoxi-tritil (M) vagy dimetoxi-tritil csoport eltávolítását a hidroxil csoportról 80%-os ecetsavval végezzük szobahőmérsékleten, a β-ciano-etil-foszfát ) csoportokat szobahőmérsékleten 0,1 n nátrium-hidroxiddal 4:1 arányú dioxán-víz oldószerben távolítjuk el. Az építő-blokkokkondenzációját aktiváló szerként tri-izopropil-henzolszulfonil-kloriddal végezzük, így kapjuk a 8. ábra 7. sorában bemutatott 13-tagú, telje> sen védett prímért. Az utolsó lépést (az összes védőcsoport teljes eltávolítását) a következőképpen hajt. jukvégre:

A teljesen védett 13 tagú oligodezoxinukleotidból 64,6 mg-ot 3 mldioxántés 1 mlacetonitrilttartalmazó ¹ oldatot 200 mg szin-p-nitro-benzaldoximmal és 124 mg N¹,N²N³J4³-tetrametil-guanidinnel kezelünk, majd 27 órán át állni hagyjuk 10 ml 25%-os ammóniát adunk hozzá, majd 24 órán 50 ’C-on tartjuk. Miután az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk, a maradékot vízben oldjuk, pH-ját 4,0-ra állítjuk ecetsawal és az oldatot hússzor kloroformmal extraháljuk.A vizes oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk és a maradékot 1 ml 80%-os ecetsavban oldjuk. Az oldatot egy órán át állni hagyjuk, 6 ml vízzel hígítjuk, háromszor extraháljuk kloroformmal és liofilizáljuk.

HU 204095 Β

A nyerstermék egyharmadát DEAE Sephadex A 25 (oszlopméret:10xl,3 cm) oszlopon kromatografáljuk 200 ml 0,2-1,0 mólos trimetü-ammónium-hidrogénkarbonát gradienssel szemben. A fő frakció 0,87 M koncentrációnál jön le az oszlopról. AHPLC-vel vizsgálva tiszta terméket tartalmazó fő-frakciót háromszor vizes oldatból bepároljuk, 10 ml Dowex 50 W-n (NH₄-só) szűrjük át, majd liofilizáljuk. HPLC (permaphase AAX, oszlopméret 90x0,3 cm, 60 ’C, 2 ml/perc, gradiensA=0,005 M kálium-dihidrogénfoszfát, B= 0,5 M kálium-dihidrogén-foszfát, 0,5 M kálium-dihidrogén-foszfát, 0,5 M kálium-klorid, pH 4,5; 20% A-> 100% B 30 perc alatt): t_R 11,8 perc.

b) A ³²P-vel jelölt humán IENa és ΙΕΝ-β specifikus cDNS készítése (9. ábra) pmól szintetikus, 13 tagú oligo-dezoxinukleotid prímért (lásd Ea lépés) és 40 pmól [β-³²Ρ]-ΑΤΡ-ΐ (5700 Címmól'¹, Amersham) elegyítünk 100 μΐ 50 mM Tris-HCl-t (pH 9,5), 50 mM magnézium-kloridot és 5mMDTT-t tartalmazó oldatban. 50 egységT₄ polinuldeotid kinázt (P-LBiochemicals) adunk hozzá, majd 30 perces 37 °C-os inkubálás után újabb 20 egység enzimet adunkhozz, majd az inkubálást további 15 percig folytatjuk 37 ’C-on.

A ³²P-vel jelölt prímért tartalmazó vizes oldatot f enol-extrakcióval tisztítjuk. A további tisztítást 4 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, finom) oszlopon való kromatográfiával végezzük 1 mM Tris-HCl (pH 8.0) oldatban. 0,1 ml-es frackiókat gyűjtünk. Minden egyes frakció rádioaktivitását a Cserenkov sugárzás mérésével határozzuk meg. 4x10⁶ Cserenkov cpm/pmól specifikus aktivitást kapunk. A ³²P-vel jelölt 40 pmól prímért liofilezzük, újra szuszpendálunk 14 μg poli(A) RNS-t (indukált Namalwa sejtekből, az Alépés szerint előállítva) tartalmazó 91 μ1 4 M kálium-kloridot adunk hozzá és az elegyet 25 ’C-on inkubáljuk 60 percig. 450 μΐ reverz transzkriptáz elegyet adunk hozzá, a reakció-elegy ekkor 40 mM Tris-HCl-t (pH 8), 4 mM magnézium-kloridot, 1 mMDTT-t (Calbioehem,Inc.,) 74 mM kálium-kloridot, a dATP, dGTP, dCTP és dTTP (P-L Biochemicals) mindegyikéből 1 mM-t és 90 egység madár mieloblasztózis vírus (AMV) reverz transzkriptázt tartalmaz. Egy órán át 37 ‘C-on inkubáljuk. Az oldatot 1 térfogat, TNE-vel telített fenollal extraháljuk, majd a nukleinsavat 2 térfogat etanollal -20 °C-on 10 órán át kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze (HB-4 rotor, 20 perc, 10 000/perc fordulatszám, 0 °C(, majd 20 μΐ, 90 térfogatszázalék formamidot (Merck, analitikai minőség), mMEDTA-t, 0.015% brómfenol-kéket és 0.05% xilol-cianol-kéket tartalmazó festék-elegyben oldjuk. A mintát 2 percig 90 ’C-on tartjuk, majd Tris-borát EDTA oldatban készült 5%-os poli-akrilamid gélre viszszük [Peacock és munkatársai (39)]. A ³²P-vel jelzett, pBR. 322 plazmid HaelH emésztésével nyert 267 bp és 435 bp méretű standard DNS-ek között vándorló, egyetlen sáv látható az autoradiogramon, A ³²P-vel jelzett cDNS fragmentet extraháljuk a gélből és Mueller és munkatársai [42] szerint tisztítjuk. 20 000 Cserenkov cpm mennyiségű ³²P-vel jelölt humán IFN-a ésIENp specifikus cDNS próbát kapunk.

c) HuIFN cDNS-t tartalmazó telepek keresése (9. ábra)

A fentiekben leírt D lépés szerint készített transzformált telepek közül 1650-et BA 85 (Schleicher és Schuell, 8 cm átmérőjű) nitrocellulóz membránokra viszünk. A sejteket Grunstein és Hogness [20] módszerével lízáljuk és DNS-üket denaturáljuk, majd helyben a membránhoz kötjük. A telepeket hordozó membránokat elő-hibridizáljuk4xSET oldatban [0,15 M nátrium-klorid, 30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA], 0,1 vegyes-százalékos Ficoll 400 (Pharmacia); 0,1 vegyes-százalékos polivinilpirrolidon (PVP360, Sigma), 0,1 tömeg% BSA, 0,5% SDS, 50 μg/ml denaturált borjú timusz DNS (készítése: 5 mg borjú timuszDNS-t(I-es típus, Sigma) 10 percig 0,5Mnátrium-hidroxidban forralunk a DNS feldarabolására, 5 mólos ecetsawal semlegeítjük, majd 2 térfogat etanöllal -20 ’C-on kicsapjuk. A csapadékot HB-4 rotorban 10 percig 0 ’C-on centrifugálva összegyűjtjük, majd 0,5 mM EDTA-ban újra feloldjuk) jelenlétében, 20 ml elegyet használunk egy membránhoz és hibridizáljuk a ³~P-jelölt próbából 10³ Cserenkov cpm-mel, 5xSET, 0,02% V% Ficoll, 0,01% polivinilpirrolidon, 0,021% BSA, 0,2% SDS és 50 μg/ml denaturált borjú timusz DNS elegyben. A hibridizálást 65 ’C-on végezzük 36 órán át.

A membránokat egyszer kloroformban, kétszer 0,5% SDS-t tartalmazó SET-ben öblít jük szobahőmérsékleten, majd 0,5% SDS-ben egy órán át 60 ’C-on és egyszer 3 mM Trisz bázissal szobahőmérsékleten egy órán át. A membránokat Whatman 3 MM-papírra helyezve szárítjuk, majdUford intenzifikáló lap (screen) használatával -80 °C-on 72 órán át Fuji röntgen-filmeket exponálunk rajtuk.

Az autoradiogram kilenc pozitív telepet azonosítunk és használunk a további vizsgálatokhoz.

Mivel a transzformált sejtekből származó elsődleges telepek alkalmanként egynél több fajta rekombináns DNS molekulát tartalmaznak, a 9 jól hibridizáló kiónból izoláljuk a hibrid DNS-t, és az előzőekben leírt módonE. co//HB 101 sejtek transzformálására használjuk.

A hibrid plazmid DNS-t a következőképpen izoláljuk: 25 ml-es Erlenmeyer lombikban levő, 10 μg/ml tetraciklint tartalmazó lOml tripton táptalajt oltunk 1 teleppel. A tenyészetet 15-18 órán át 37 ’C-on 300/perc fordulatszámmal rázatjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük (SorwaÜ, HS-U rotor, 10 perc 4000/perc, 4 ’C). Körülbelül 0,1 gsejt-tömegetkapunk és ezt 1 ml 50 mMTris-HCl-ben (pH 8,0) szuszpendáljuk, 0,25 ml lizozim oldatot adunk hozzá (10 mg/ml 50 mM Tris-HCl-ben (pH 8,0), a lizozim Sigma gyártmányú) és 10 perces 0 °C-os inkubálás után 0,15 ml 0,5 M EDTA-t (pH 7,5) adunk hozzá. Újabb 10 perces 0 ’C-os inkubálás után 60 μ1 2%-os Triton X-100 (Merck) oldatot adunk az elegyhez. 30 percig 0 ’C-on inkubáljuk, majd 30 percig 15 000/perc fordulatszámmal 4 ’C-on Sorvall SA-600 rotorban centrifugáljuk. A felülúszót 1 térfogat fehollal (TNE-vel telített) fe17

HU 204095 Β hérje-mentesítjük. A fázisokat centrifugálással választjuk szét Sorvall HB-4 rotor, 10 perc 5000/perc, 4 ’C). A felső fázist kétszer egy térfogat kloroformmal extraháljuk. Pankreatikus RN-ázt (Sigma, 10 mg/ml TNE-ben 10 percig 85 ’C-ra melegítve) 25 μ^άηΐ végkoncentrációban adunkhozzá és a keveréket 4θ percig 37 ’C-on inkubáljuk. Az oldat nátrium-klorid koncentrációját 1 M-ra, a PEG 6000 koncentrációját 10%-ra állítjuk (Huka, 20’ 120 ’C) majd -10 ’C-on tartjukkét óráig. A csapadékot SorvalIBB-4 rotorban centrifugáljuk (20 perc, 10 000/perc, 0 ’Q és μ1 TNEben oldjukújra. ADNS oldatot 1 térfogatfenollal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 ’C-on 10 percig tartvakicsapjuk. AcsapadékotEppendorfcentrifugával centrifugálva gyűjtjük össze, és a DNS-t 20 μΐ, 10 mM Tris-HCl-t (pH 7,5) és 0,5 mMEDTA-t tartalmazó oldatban oldjuk újra. 10 ml tenyészetből

8-10 gg hibrid plazmidDNS-tnyerüakíd.

E. coli HB 101 sejteket transzformálunk a kilenc izolált hibrid DNS mindegyikével, és a transzformáit sejteket az előzőekben leírt módon (D lépés) tetraciklin-tartalmú agarlemezekre szélesztjük. Minden egyes transzformálásból 3 tetracüdin-rezisztens telepet választunk ki, 10 ml-es tenyészeteket készítünk és az előzőekben leírt módon a hibrid DNS-t izoláljuk a tenyészetekből.

Az összes DNS-mintát a retranszformálás előtt és után Psű endonukleázzal emésztve és 1%-os agaróz gélen (50 mM Tris-acetát, pH 7.8 és 1 mM EDTA) elektroforetizálva analizáljuk. Az összes minta azonos hasításiképetmutat aretranszformálás előtt és után.

Az újra klónozott DNS molekulái egyike 2 csíkot képez, az egyik mobilitása a Psű-gyel hasított pBR 322-é, a másik mobilitása megfelel körülbelül 1000 bázispámak. Ezt CG-pBR 322/HLycIFN-l’b-vel jelöljük.

Egy másik rekombináns DNS három csíkot ad, az egyik mobilitása megegyezik a PsŰ-gyel hasított pBR 322 mobilitásával, a másik körülbelül 600 bázispár a harmadik körülbelül 150 bázispár mobilitásával. Az ‘ ebben a kiónban levő rekombináns DNS molekulát CG-pBR322/HLycIFN-p_I-gyel jelöljük.

d)A CG-pBR 322 HLydEN-l’b és CG-pBR

322/HLydEN-p₁ ldőnok jellemzése

A CG-pBR 322/HLydFN-l’b és CG-pBR ⁴ 322ZHLydEN-p₁ klónokból származó rekombináns plazmid DNS-eket az Ec lépésben leírt módon izoláljuk a tenyészetekből és a Maxam-Glíbert módszer [15] alkalmazásával megállapítjuk a beillesztett cDNS szakasz nukleotíd-sorrendjét, ezzel jellemezve a Idő- € nokat. Lényegében a következő megközelítést alkalmazzuk:

Az izolált rekombináns plazmid DNS-t különböző restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Az enzimeket lényegében az előállító (NewEnglandBiolabs) ál- 6 tál előírt módon használjuk, azzal a kivétellel, hogy BSA helyett zselatint teszünk az enzim-pufferekbe.

Az emésztett DNS-t tartalmazó oldatot TNE-vel telített fenollal fehérje-mentesítjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk, újra oldjuk 50 μg/nll koncentrációban 6 mM Tris-HCl-ben (pH 8.0) és borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 0,1 egység-pmói 5’ DNS végkoncentrációban 30 percig 37 ’C-on inkubáljuk. Az enzimet inaktiváljuk ha az oldatot 60 percig 65 *C5 ontartunk.ADNS-tMueUerésmunkatársaiáltaHeírt módon [42] DEAE-cellulóz kromatográfiával tisztítjuk és etanollal kicsapjuk. ADNS-t azután az 5’ végén [y/³²P]-ATP-vel ( 5000 Ci/mmól, Amersham) és T4 polinukleotid kinázzal (P-L Biochemicals) jelöljük lé0 nyegében a Maxam-Gilbert módszer szerint, azzal a kivétellel, hogy a DNS-t nem denaturáljuk a kináz reakció előtt. A specifikus aktivitás általában l-3xl0⁶ cpm/pmól5’-vég.

A jelzett DNS fragmenteket egy második restrikci5 ós endonukleázzal hasítjuk és a termékeket elektroforézissel, 6%-os, 8%-os vagy 10%-os poliakrilamid gélen, Tris-borát-EDTA pufferben szétválasztjuk. A DNS fragmenteket Mueller ésmunkatársaimódszerével [42] kivonjuk a gélből és tisztítjuk. A nuldeotid0 sorrend meghatározása céljából a DNS fragmenteket kémiailag lebontjuk és a termékeket a Maxam és Gilbert általleírt módon [15] poliakrilamid gél-elektroforézissel elválasztjuk.

Részletesebben, a CG-pBR 322/HLydEN-l’b klónból izolált plazmid DNS-t a következőképpen kezeljük. Egyrészt 5 gg plazmid DNS-t BglU-vel emésztünk, 5’ végen jelöljük, majd PvuH-vel hasítjuk. A PvuH-BglH* (* jelzi a jelzett véget) és a BglD-PvuH* DNS fragmenteket 6%-os poliakrilamid gélen izolál3 juk. Másrészt 5 gg plazmidot Alulenzimmel emésztünk, 5’-végén jelöljük majd PsŰ enzimmel hasítjuk. APsű-AluI* DNS fragmentet 8%-os poliakrilamid gélen izoláljuk. Az egyes fragmenteket ezután Maxam és Gilbert szerint lebontjuk és a nukleotid-sorrendet meghatározzuk. A kapott nuldeotid sorrendet a 10. ábrán láthatjuk. A beillesztett cDNS szakaszt körülbelül 25-35 dezoxi guanozin csoport előzi meg az 5’ végénél. A bemutatott nukleotid sorrend valamelyest hasonló a Goeddel és munkatársai [43], valamint We> issmann által leírt IEN-α (F Típus) cDNS-hez, mindazonáltal számos eltérést (pontmutációt) mutat, melyek közül néhány érinti az aminosav-sorrendet is (lásd 10. ábra).

A CG-pBR 322/HLycIFN-p₁ klónból izolált plazmid DNS-t hasonló módon kezeljük. 5 gg plazmidot emésztünk PvuH-vel és 5’ végén jelölünk. A keverék . egyikfelétPsŰ-gyel, amásikfelétBglH-vel emésztjük. APsű-PvuH* és BglH-PvuH*fragmenteket elektroforézissel izoláljuk 6%-os poliakrilamid gélen és a fentiekben leírt módon lebontjuk. A nukleotid sorrendet (N-terminális sorrend) all. ábrán mutatjuk be, melyből kiderül, hogy a beillesztett cDNS az HN-Pj cDNS 102 számú nukleotidjánál indul, amint azt Taniguchi és munkatársai leírták [45]. Ezek szerint a cDNS képes a humán IFN-β £ kódolására, de az N-terminális véről hiányzik 11 aminosav. A beillesztett cDNS-t az 5’ végen 20-25 dezoxiguanozin csoprotból álló szakasz előzimeg, és a 153-ashelyen pontmutáció látható, egyC helyett T van, de eznem érinti az aminosav sorrendet.

e)A CG-pBR 322/HLyJFN-l'b és CG-pBR

HU 204095 Β

322/HLyc IFN-fii beillesztett DNS szakaszaival kereszt-hibridizációt mutató rekombináns DNS molekulákat tartalmazó kiónok azonosítása A CG-pBR 322/HLycIEN-l’b és CG-pBR 322/HLyc!FN-p₁ kiónok rekombináns plazmid DNSeit a fentiekben leírt Ec lépés alapján izoláljuk a tenyészetekből. A CG-pBR 322/HLycIFN-l’b plazmid DNS-ből 5 p,g-ot BglII-vel emésztünk, az 5’ végét jelöljük, majd PvuH-vel hasítjuk. Más módon az izolált CG-pBR 322/Hlyc IFN-β! plazmid DNS-ből 5 μg-ot PvuH-vel emésztünk, az 5’ végét jelöljük és BglH-vel emésztjük. APvuH-BgUI* 351 g bázispár méretű DNS fragmentet (A próba) és a PvuH*-Bgin 368 bázíspár méretű DNS fragmentet (B próba) az Ed lépésben leírt módon 8% polí-akrilamid gélből izoláljuk és in situ telep-hibridizáláshoz használjuk (lásd lejjebb). A plazmid DNS-ek emésztését, a jelölést, valamint a DNS fragmentek tisztítását a fentiekben leírt ED lépés szer int végezzük.

A D lépés szerint előállított transzformált telepek közül 4000-t BA 85 (Schleicher és Schüell, 8 cm átmérőjű) nitrocellulóz membránra visszük.

A sejteket Grunstein és Hogness [20] szerint lizáljuk, DNS-üket denaturáljuk és in situ a membránokhoz rögzítjük. Az A és B próbákhoz való hibridizálást mindkét próbát összekverjük) az előzőekben lírt Ec lépés szerint végezzük. Autoradiográfiával 3 telepet azonosítunk, melyek közül hármat a következő jelekkel látunk el:

E. co/iHB101CG-pBR322/HLycIEN-4’₁

E. co/z HB 101 CG-pBR322/HLycGN-5₁es

E. coh'HB 101 CG-pBR 322/HLycIEN-8’₁ és a további vizsgálatok céljára használjuk. Ezekből a kiónokból származó plazmid DNS-eket a fentiekben leírt Ec, Ed lépések szerint izoláljuk, retranszformáljuk és újra izoláljuk.

A rekombináns DNS-ekbe beillesztett szakaszok természetének megismerése céljából a fentiekben leírt Ed lépésben leírt általános módszer szerint meghatározzuk a beillesztett DNS-szakaszok (az egész vagy töredék) nukeotid sorrendjét.

Részletesen a CG-pBR 322/HLycIFN-4₁ és a CGpBR322/HLycIFN-8’j plazmid DNS-eket PvuII-vel emésztjük az 5’ véget megjelöljük és PstI enzimmel hasítjuk.

A DNS fragmenteket 8%-os poliakrilamid gélen elválasztjuk és a 8’j DNS-ből a -120 bp méretű PstlPvuH* fragmentet és a 4j DNS-ből a 82 bp méretű Pstl-PvuH* fragmentet a szokásos módon izoláljuk.

A CG-pBR 322/HLydEN-52-ből izolált plazmid DNS-t a következő módon kezeljük. Egyrészt 5 ^g plazmid DNS-t HaeHI enzimmel emésztünk, 5’ végét megjelöljük és PstI enzimmel hasítjuk. Az 57 bp méretűPstI-HaeIH*DNSfragmentet 10%-os poliakrilamid gélből izoláljuk.

Másrészt 5 p„g plazmid DNS-t EcoRI enzimmel emésztünk, 5’ végét jelöljük és Pstl-gyel hasítjuk. A 235 bp méretű Pstl-EcoRI* és a - 700 bp méretű EcoRí*-Pstlfragmenteket 8%-os poliakrilamid gélből izoláljuk. A különböző DNS fragmentek nukleotid sorrendjét Maxam és Gilbert szerint [15] meghatározzuk.

A beépített cDNS szakaszok nukleotid sorrendjét a

12-14. ábrán láthatjuk. A 12. ábrán a GC-pBR 322/HLycIEN-4₁ beépített cDNS részleges sorrendjét látjuk. A beépített szakaszt az 5’ végen egy 23 dezociguanozin nukleotidból álló szakasz követi és a Streuli és munkatársai által leírt [46] IEN-o^ (Le) cDNS egy részét tartalmazza. A 3’, génen kívüli szakaszban néhány pontmutáció található és egy további 318 nukleotidból álló szakasz. A CG-pBR 322/HLydEN-8’₁-be beépített cDNS szakasz nuldeotid-sorrendje a 13. ábrán látható. A beépített szakaszt az 5’ végen 20-23 dezoxiguanozin nukleotidból álló szakasz követi, és a szakasz hasonló de nem azonos a Gieddel és munkatársai [43], és Mantei és munkatársai [27] által leírt D típusú IEN-a-hoz.

Az IFN-kódoló nukleotid-sorrendet megelőző és követő cDNS régiókban levő különbségek mellett az IFN gén a 28-30 helyzetben egy GCC triplettet, a 409-411 helyzetben egy alantot kódoló GCG triplettet tartalmaz valtot kódoló GTC és GTG helyett. Végezetül a CG-pBR 322/HLycIEN-5₁ nukleotid-sorrendje (lásd 14. ábra) az 5’ végen egy 17 dezoxiguanoztoból álló szakaszt tár fel. A nukleotid sorrend kapcsolatban van a Goeddel és munkatársai által leírt [43] BFN-a (B típus) cDNS-sel. Azonban további nukleotidok találhatók a beépített HLycIEN-5 cDNS- szakasz 5’ végén, pontmutációk, hiányzó és extra beépített nukleotidokvannak génen kívüli szakaszban, valamint az UN kódoló szakaszban, főleg a 22 és 361-372 helyzetekben.

F. Humán interferonok szintézise humán IFN-specifikus rekombináns DNS molekulákat tartalmazó E. coli sejtekkel

Azt az öt kiónt, melyről kimutatták, hogy humán

IFN specifikus rekombináns DNS molekulát tartalmaz, nevezetesen a

E. coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-l’b,

E. Co/z HB 101 CG-pBR322ZHlycIFN-4₁,

E: co//HB101CG-pBR322/HLycIFN-5₁,

E. coliHB 101 CG-pBR322/HLycIEN-8’₁ és E. coliHB 101 CG-pBR322/HLycIEN^j, kiónokat megvizsgáljuk, van-e IEN aktivitásuk. Ezt minden esetben a következő képpen hajtjuk végre:

A megfelelő E. coli klónból származó tenyészetet (30 ml szuszpenzió) tripton táptalajon körülbelül 1 optikai sűsűrégig (OD₆₅₀) növesztjük.

A sejteket összegyűjtjük, majd 0,5 ml, 30 mM nátrium-kloridot és 50 mM PH8.0 Tris-HCl-t tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Lizozimet (Sigma) adunk hozzá 1 mgünl koncentrációban. 30 percig 0 ’C-on tartjuk, majd a szuszpenziót ötször megfagyasztjuk (cseppfolyós nitrogénben) és megolvasztjuk (37 ’C), majd 20 percig SS34 Sorvall rotorben 20 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk.

A felülúszó IFN aktivitását vizsgáljuk az Ac lépésben leírt Armstrong [32] féle citopatikus biológiai vizsgáló módszerrel. A következő aktivitásokat találjuk:

Hü 204095 Β 2

Kivonat eredete IFN aktivitás

RekombináusDNS-ttartalmazó (NE/ml)

K co/iHBlOl

CG-pBR322/HLycIFN-l’b 0;0

CG-pBR322/HLycIFN-4₁ 0;0

CG-pBR322/HLycIFN-5₁ 10000;10000

CG-pBR322/HLycIFN-8₁ 100;100

CG-pBR322/HLycIFN-3₁ 0;0

A nem mérhető IFN aktivitást mutató kiónok valószínűleg olyan rekombináns DNS-t tartalmaznak melyben aHuLylEN- cDNS darab a transzkripció irányának szempontjából helytelen irányítottsággal rendelkezik. Ennélfogva egy ilyen, teljes hosszúságú cDNS-t tartalmazó ldónban (CG-pBR322/HLycIEN1 *b) a rekombináns DNS-t a következő módon rendezzük át:

AzE coli 101 CG-pBR322/HLycIFN-l’b kiónban levő plazmid DNS-t azEc lépésben leírt módon izoláljuk és Pst I enzimmel hasítjuk. A hasított DNS-ből 0,5 pg-ot 20 pl, 20 mM Tris-HCl-t (pH 7.8), 10 mM magnéziumkloridot, 10 mM DTT-t, 25 mM nátriumkloridot és 50 pg/ml zselatint tartalmazó pufferelegyhen 0,2 egység T4 DNS ligázzal (Biolab) és 0.5 mM ATP-vel kezeljük 2 órán át 15 °C-on. E. coli HB 101 sejteket transzformálunk a fentiekben leüt D lépés szerint a cDNS keverékkel. A transzformált telepeket tetraciklin-tartalmú Mc Conkey agar-Iemezen szelektáljuk, majd nitrocellulóz membránra replikázzuk. A CG-pBR 322/HLycIFN-rb rekombináns DNS-ból származó ³²P-vel jelölt, 351 bp méretű PvuH-Bgin*fragmenthezhibridizáló 4 baktérium-telepet E. coli'BE 101 CG-pBR322ZHLydFN-l’b_rtől-l’b₄ számozással láttuk el. A 4 kiónból kivonatokat készítünk és a fentiekben leírt módon megvizsgáljuk IFN aktivitásukat. Akövetkező aktivitásokattaláltuk:

Kivonat forrása IFN aktivitás

RekombináusDNS-ttartalmazó (NE/ml)

E. coli 101

CG-pBR322/HLydEN-l’b₁ 0;0

CG-pBR322/HLydEN-l’b2 0.Ό

CG-pBR322/HLydFN-l’b₃ 0;0

CG-pBR322/HLydFN-l’b₄ 30;30

ACG-pBR322/HLydEN-l’b₄plazmidIFN aktivitással rendelkező polipeptid szintézist irányítani képes cDNS szakaszt tartalmaz.

GNagymennyiségfi, IFN aktivitással rendelkező polipepüdék szintézisét irányítani képes plazmidok készítése

I CG-pBR (AP)ZLylFN-a-l rekombináns plazmid készítése

AzK co/ΠΙΒ 101 CG-pBR 322/HLycIFN-rb klón által termelt IFN specifikus fehérje mennyiségének növelése céljából a 15. ábrán sematikusan ábrázolt módonállítjukösszeaplazmidot.

a) A cDNS inszertum izolálása

NE. co/íHB 101 CG-pBR322/HLydFN-l’bHónból származó rekombináns plazmid DNS-ből 150 pgot PstI enzimmel (Biolabs), standard eljárás szerint (lásdEd lépés) hasítunk. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a kivágott fragmentet szacharóz sűrűség-gradiens centrifugálással (5-23%, 50 mM TrisHClpH80 és 1 mMEDTA) izoláljuk A centrifugálást 35 000/perc fordulatszámmal TST 41 rotorben (Kontron AG) végezzük 15 ’C-on 16 órán át. ISCO gradiens5 kollektorral 1 ml/percsebességgel 0.3 ml-es frakciókat gyűjtünk. Akis fragmentet (cDNS) tartalmazó frakciókat egyesítjük. ADNS-t a szokásos módon etanollal kicsapjuk és a csapadékot HB-4 rotorban (Sorvall) 10 000/perc fordulatszámmal 0 ’C-on 10 percig cent10 rifugálva gyűjtjük össze. A csapadékot újra feloldjuk 50 pl, 10 mMTris-HCl-t (pH 7.5) és 0.05 mMEDTA-t tartalmazó oldatban. Az optikai elnyelés alapján 30 pgDNS-tnyerünkki.

pgDNS fragmentet Hae© (Biolabs) enzimmel emésztjük és a kapott fragmenteket 50 mM TRIS, 50mMbórsav, lmMEDTAésO.5 pg/ml etidium-bromid-tartalmú oldatban 2%-os agaróz gélen elválasztjuk

A legnagyobb DNS fragmenteket, a 869 bp méretű !0 HaelH-Pstl és a 82 bp méretű HaelH-HaelH fragmenteket (15. ábra, 3 és 4 fragmentek) kivágjuk a gélből, fecskendővel keresztül nyomjuk egy vékony tűn 5 ml, 0,15 M nátrium-klorid, 50 mM Trís-HCl φΗ 8.0) és 1 mMEDTA összetételű oldatba, majd éjszakán átrá5 zatva kioldjuk a gélből. Az eluátumot a DNS megkötésére 100 pl térfogatú DE-52 (Whatman) Pasteur-pipetta oszlopon engedjük keresztül. Az oszlopot 2 ml fenti összetételű pufferrel mossuk, majd a DNS-t 400 pl 1,5 M nátrium-kloridot, 50 mM TRIS-HQ-t φΗ 8,0) és 1 mMEDTA-t tartalmazó pufferrel leoldjuk ADNS-t 2 térfogat etanollal -20 ’C-on egy éjszakán át kicsapjuk A csapadékot Eppendorf centrifugában centrifugálva nyerjükki.

A82bp méretűHaelH-HaeHIDNS fragmentet újra oldjuk és Sau 3A (Biolabs) enzimmel emésztjük Az enzimet hővel inaktiváljuk 30 percig 65 ’C-on tartva az oldatot. 1 pg Hae©-Pasl fragmentet (869 bp) adunk hozzá, majd az oldat összetételét 10 mM MgQ₂,10 mMDTT és 0,5 mM ATP-re állítjuk, majd ) 30 egység/pl reakció-térfogat mennyiségű T4 DNS ligázt (Biolabs) adunk hozzá. Az oldatot 10 órán át 15 °C-on inkubáljuk Fenol-kloroformos extrakciót követően a keveréket 2%-os Tris-borát-EDTA oldatban agaróz gélen, etidium-bromid jelenlétében elvái lasztjuk. A Sau 3A-PstI DNS fragmentet (15. ábra, 5. fragment) a fentiekben leírt módon extraháljuk, eta. nolIalkicsapjukéslOpI, 10ιηΜΤΓί3-Η(Ι1-ΙφΗ7.5)έ5 0.05 mMEDTA-t tartalmzó oldatban feloldjuk

b)ApBR 322-fi-Iaktamáz gén szabályozó szakaszát ¹ (ApPr) tartalmazó DNS fragment készítése ApBR322plazmidot PstI enzimmel (lásd Cb lépés) hasítjuk és 4 egység/ml Bal 31 exonukleázzal (Bethesda Research Láb.) kezeljük 4-10 percig 30 ’C-on a β-Iaktamáz kódoló szakasz eltávolítására. A fentiekbenlefrt módon (Ea lépés)

5’-ATGTGTGATCACAACAT-3’ képletű DNS-linker molekulát szintezizálunk A linkért szokásos módszerekkel a Bal 31-gyel kezelt pBR 322 DNS-hez kötjük A kapott hibrid molekulát Bel I (Biolabs) és EcoRI restrikciós endonukleázzal

HU 204 095 Β hasítjuk Az emésztés termékeit 8%-os poliakrilamid gélen, Tris-borát-EDTA pufferben a fentiekben leírt módon (Ba lépés) elválasztjuk A 184 bp és 234 bp marker DNS-ek között vándorló ApPr DNS fragmenteket az la lépésben leírt módon izoláljuk, majd a szokásos módon etanollal kicsapjuk A csapadékot 10 mM Tris-Hcl (pH 7,5) és 0,05 mMEDTA összetételű oldatban oldjuk.

c)Az ApPr DNS fragment összekötése a cDNS inszertummal

Az ApPr DNS fragmenteket és a cDNS inszerktumot tartalmazó oldatokat egyesítjük. Az elegy összetételét 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT és 0,5 mM ATP-re állítjuk, majd 30 egység/ml T4 DNS ligázzal (Biolabs) inkubáljuk 12 órán át 15 ’C-on. Fenol-kloroformos extrakció után a keveréket 1%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen frakcionáljuk. A kapott ApPr-cDNS fragmentet a mind PstI (Biolabs), mind EcoRI (Biolabs) enzimmel· emésztett pBR 322 plazmid nagy fragmentjéhez kötjük a következő módon. Az ApPr cDNS-fragmentet tartalmazú gél-darabot (körülbelül 20 μΐ) a pBR 322 Pstl-EcoRI fragmentjével keverjük össze, 2 percig 65 ’C-on tartva megolvasztjuk 37 °C-ra hűtjük, összetételét 0,5 mM ATP, 10 mM DTT és 10 mM MgCl₂-re állítjuk, majd 12 órán át 15 °C-on inkubáljuk 30 egység/pl T4 DNS ligázzal (Biolabs).

100 mM Tris-HQ (pH 7.5), 100 mM CaCl₂ és 100 mMMgCl₂ összetételű oldatból egytized térfogatnyit adunk az oldathoz, majd a ligáz inaktiválása céljából 10 percig 65 °C-on tartjuk és 37 °C-ra hűtjük Ezzel az oldattal transzformáljuk a D lépésben leírt módon a kalcium-ionokkal kezelt E. coli HB 101 sejtet, majd 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó Mc Conkey agar-lemezekre szélesztjük. A tmaszformált telepeknek megvizsgáljuk az IFN aktivitását (lásd F lépés). A legnagyobb mennyiségű IEN-t szintetizló telepet kiválasztjuk és E. coli HB 101 CG-pBR (Ap)/LyIEN-ct-l jelzéssel látjuk el. 40.000 NE/ml-es aktivitást találtunk és ez 1300-szoros növekedést jelent az eredetiK coli HB 101 CG-pBR 322/HLyc IFNl’b kiónhoz képest.

A CG-pBR (AP)/LyIFN-a-l rekombináns plazmidot tartalmazó klón tenyészetéből a 3c lépésben leírt módon izoláljuk a plazmid DNS-t és a cDNS szakasz (IFN gén), valamint a β-laktamáz szabályozó szakasz nukleotid sorrendjének meghatározásával jellemezzük. Az eredményt a 16. ábrán mutatjuk be.

II.A CG-pBR(AP)/LyIFN-o.-3 rekombináns plazmid készítése

AzE. coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-8’₁ klón által termelt IFN-specifikus fehérje mennyiségét a következő módon növeljük (lásd 17. ábra),

a) A CG-pBR (AP)/LyIEN-a-l β-laktamáz-szabályozó szakaszát tartalmazó DNS szakasz készítése

100 pg CG-pBR (AP)/LyIFN-a-l DNS-t hasítunk Hindin (Biolabs) és BglH (Biolabs) enzimekkel. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a kivágott DNS-fragmentet szacharóz sűrűség-gradiens centrifugálással izoláljuk (5-23%, 50 m IRIS-HC1 (pH 8.0) és 1 mM EDTA oldatban). A centrifugálást

000/perc fordulatszámmal végezzük TST 60 rotorban (Kontron AG) 15 ’C-on 4 órán át. Az előzőekben leírt módon 0,2 ml-es frakciókat gyűjtünk. A kis (HindHI-BgUI) fragmentet tartalmazó frakciókat egyesítjük és a DNS-t a szokásos módon etanollal kicsapjuk. A csapadékot 80 pl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) és 0.05 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az optikai elnyelés mérése alapján 16 pg DNS-t nyerünk így ki.

A 4 pg Hindin-BglII DNS fragmentet Sau 3A enzimmel (Biolabs) emésztjük és az emésztett terméket 6%-os poliakrilamid gélen frakcionáljuk trisz-borátEDTA oldatban az előzőekben leírtak szerint. A DNS fragmenst 0,5 pg/ml EtBr-ban inkubáljuk, a 239 bp HindHI-Sau 3A DNS fragmentet az előzőek szerint extraháljuk és izoláljuk. A DNS-t a szokásos módon etanollal kicsapjuk. A csapadékot 20 pl 10 mM triszHCl (pH 7,5) és 0,05 mM EDTA elegyben oldjuk.

b) A cDNS inszertum izolálása

A cDNS inszertum azla részben leírt módon vágjuk ld a CG-pBR 322/HLycIEN-8’₁ rekombináns plazmidból.

A cDNS inszertum (2 pg) 2,5 egység Sau 3A enzimmel (Biolabs) emésztjük 10 pg/ml EtBr-ban és 37 ’Con inkubáljuk 60 percig. Az említett DNS-t fenollal extraháljuk és a DNS-t a fentiekben leírt módon etanollal kicsapjuk. A DNS fragmenteket 1,2%-os agaróz-gélen frakcionáljuk 50 mM Tris, 50 mM bórsav mMEDTA és 0,5 pg/ml etidium-bromid oldatban.

A második legnagyobb DNS fragmentet (Sau 3APstl 693 bp) kivonjuk a gélből és az la részben lírt módon tisztítjuk. A DNS-t 20 pl 10 mM Tris-HQ (pH

7,5) és 0,05 mMEDTA oldatban oldjuk.

c) A HindHI-Sau 3A DNS fragment hozzákötése a cDNS inszertumhoz (Sau 3A-Psű)

Mindkét DNS fragmentből egyforma mennyiséget (50 ng) inkubálunk 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 0,5 mMATP és 30 egység/pl T4 DNS ligáz (Biolabs) tartalmú oldatban 3 órán át 15 ’C-on. A keveréket 15 percig 80 ’C-on inkubáljuk, majd nátrium-klorid koncentrációját 50 mM-ra állítjuk. ADNS keveréket 0,5 egység PstI (Biolabs) és í egység HindlH (Biolabs) enzimmel emésztjük 20 percig. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 20 pl, 10 mM TrisHCl-t (pH 7.5) és 0,05 mM EDTA-t tartalmazó oldatban oldjuk.

A kapott keverék felét a pBR 322 plazmid (kb. 100 ng) nagyHindlH-PstlDNS fragmentjéhez kötjük, órán át 15 ’C-on át inkubálva 10 mM magnéziumklorid, 10 mMDTT, 0,5 mMATP és 30 egység/ml t4 DNS ligáz (Biolabs) tartalmú oldatban.

Az oldat egytized részét használjuk a D lépésben leírt módon E. coli HB 101 transzformálására. A transzformált telepek IFN aktivitását a korábbiakban leírt módon (F. lépés) vizsgáljuk.

A legmagasabb IFN-szintezitáló képességű klónt kiválasztjuk és E. colit® 101 CG-pBR(AP)/LyIFNct-3 jelöléssel látjuk el.

Az IFN aktivitást a fentiekben leírt módon (F lépés)

HU 204095 Β határozzuk meg. 70 000 NE/ml aktivitás mérhető, ez azeredeti-E¹. coZ/HB 101 CG-pBR 322/HLydFN-8’j klónhozképest700-szoros emelkedést jelent.

A CG-pBR(AP)/LyIEN-a-3 klón rekombináns plazmidDNS-ét a Cc lépésben leírt módon izoláljuk a tenyészetből, majd a cDNS (EE*N gén) és a β-laktamáz szabályozó szakasz nukteotid-sorrendjének meghatárzosávaál jellemezzük. Az eredmény a 18. ábrándítható.

A CG-pBR(AP)LyIEN-a-3 plazmid előállításának eljárását átalánosan lehet használni az összes a-IEN cDNS gén vagy megfelelően hasított kromoszómális a-IEN génekre is.

Például, a CG-pBR 322/HLydEN-5₁ plazmidból kiindulva a CG-pBR(AP)LyIEN-a-2pIazmidot a CGpBR(AP)/LyIEN-a-3 plazmiddal teljesen azonos módon állíthatjuk elő. Ez az új plazmid tartalmazza a CG-pBR 322/HLycIEN-5₁ plazmidba beépített DNS szakaszt és a CG-pBR(AP)ZLyIEN-a-l-ből származó β-laktamáz szabályozó szakaszt.

A fentiekben leírt módon egy E. coliHB 101 CGpBR(AP)/LyIFN-a-2 jelzéssel ellátott Hónt szelektálunk. 50 000 E/ml IEN aktivitás mérhető, mely az eredeti K co&'HB 101 CG-pBR 322ZHLycIEN-5₁ Hónhoz képest ötszörös emelkedést jelent. A CGpBR(AP)/LyIEN-a-2plazmidban a cDNS szakasz és a β-Iakíamáz szabályozó szakasz nuHeotid sorrendjét meghatározzuk, az eredmények a 19. ábrándíthatok. ΊΠΑζ előállított mikroorganizmusok letétbe helyezése

A 10. példában leírt módon előállított mikroorganizmusokat és rekombináns DNS molekulákat az Agricultural Research Culture Collection (NRRL) törzs gyűjteményben, megfelelő tenyészetek formájában letétbe helyeztük 1981. szeptember 14-én a kővetkező letétisorszámszerint:

E. coli EB 101 CG-pBR 322/HLydEN^₁: NRRL B12528

E. coliHS, 101 CG-pBR 322/HLycIEN-4₁: NRRL B12529

E. coEHB101CG-pBR322/HLydEN-l’b:NRRL B-12530

E. coliHE 101 CG-pBR322/HLycIEN-5₁:NRRL B12531

E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIEN-8’₁: NRRL ² B12532 ll.példa

AzE. coli CG-pBR 322/HLycIFN-rb és -5_} plazmidok (lásd 10. példa) Iimfoblasztoid IEN-l’b és IFN- £ 5j-et kódoló DNS szakaszait szubHónozhatjuk a p30 plazmidba (lásd 4. példa) az IFN-8’j-re az 5. és 6. példában leírt eljárással megegyező módon. HaeHI enzimmel végzett részleges emésztésére van szükség. Az ilyen módon nyert élesztő hibrid plazmidokat 5 p30IDN2(l’b), p30IFN2^,(l’b), p30IEN2(5₁) és ρΒΟΙΕΝΣ^) jelzéssellátjukel.

Az így nyert hibrid plazmidokat használhatjuk a Saccharomyces cerevisiaeRH 971 törzs transzformálására a 7. példában leül módon. A következő limfoblasztoidlEN cDNS szakaszt tartalmazó hibrid plazmidókat hordozó telepeket szelektálhatjuk:

S. cerevisiae RH 971/p30IFN2(l’b)

S. cereviriűeRH971/p30IEN2’(í’b) i & cerevísiűeRH971/pO3IFN2(5j)

S. cerevisíízeRh971/p30IEN2’(5j)

12. példa

A9.példában leírt eljárással azonosmódon akövet3 kező élesztő- hibrid plazmidokat kaphatjuk a P30IEN2 (l’b), - (5^, - (8’j) ésp30IEN2’(l’b), - (5J plazmidokbólkündulva:

pJDB207ZIEN2(l’b), p3DB207/IFN2’(l’b), pJDB207/IFN2(5₁), pJDB207ZIFN2’(5₁) és ) pJDB207ZIEN(8’₁).

Ezeket a hibrid plazmidokat transzformálhatjuk S. cervisiaeRH971 törzsekbe, leucinprototróf telepeket szelektálva. Akövetkező Iimfoblasztoid IEN cDNS inszertumot tartalmazó hibrid plazmidot hordozó teleI pékét izolálhatjuk:

S. cerevisiűeRH971/pJDB207/IEN2(l’b)

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2’(l’b)

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IEN2(5₁)

S. cerevisiae RH971/pJDB207/IEN2’(5NMRspektrum (CDC1₃) δ: 1)

S. cerevisiűeRH971^AppIDB207^AIFN2(8’j)

13. példa

AFH05 promotert ésPH05 transzkripciós termináció szakaszt tartalmazó expressziós plazmid készítése (lásd 20. ábra) &)Az EcoRI restrikciós hely kivágása a p30 plazmidból

A 20-22. ábrán vázolt séma végrehajtásához arra van szükség, hogya p30 plazmidból Hvágjuk az egyetlen EcoRI restrikciós helyet. 5 pg p30 DNS-t (lásd 4. példa) teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós endonuHeázzal (Boehringer). A kapott ragadós végek feltöltése céljából 1 pg EcoRI-gyel emésztett p30 plazmidot 50 pl, 50 mM nátrium-Horidot, 10 mMTris-HCl-t (pH7.5), 10 mM magnézium Horidot, 1 mMDTT-t, 0,25 mM DTTP-t tartalmazó oldatban inkubálunk 37 ’C-on 30 percig 1 egységDNS polimerázzal (Klenow nagy fragment, BRL). Az etanolos HcsapásutánvisszanyertDNS-t a szokásos módon ligáljuk és kompetens E. coli HB 101 sejtek transzformálására használjuk a 4. példában leírt módon. Az EcoRI-es emésztésnek ellenálló Hónokat p30ZEcoRI^R jelöléssel látjuk el.

b) A 0,37 kb méretű. Sau3A-Pstl PH05 transzkripció ferminációs fragment izolálása APH05 transzkripciós egységet SÍ nuHeáz térképezéssel térképeztük (48). A transzkripciót leállító jeleket a PH05 gén 0,37 kb méretű Sau3A-PstI fragmentjében mutattuk H, A Sau 3A-PstT fragment nukleotid sorrendjét a 21. ábrán mutatjuk be.

Öt pgpJDB207/PH05, PH03 DNS-t (lásd 2. példa) teljesen megemésztünk Sau3A és Psű restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket TBE pufferben, függőleges 1,5% alacsony olvadáspontú agaróz

Ηϋ 204095 Β gélen választjuk el. A 0,37 kb Sau3A-Psű fragmentet etidium-bromidos festéssel mutatjuk ki és a lehető legkisebb, ezt a DNS fragmentet tartalmazó darabot vágunk ki ebből a gélből.

c) A Sau3A-PstI PH05 fragment klónozása Ml 3 mp 9-ben

Az Ml 3 mp 9 fág DNS nagyon hasznos, számos csak egyszer előforduló restrikciós helyet tartalmazó klónozó vektor [49]. Öt pg M13 mp 9 DNS-t teljesen megemésztünk BamHI és PstI restrikciós endonukleázokkal. A nagyobb, 7,2 kb DNS fragmentet 0,8%-os alacsony olvadásponté agaróz gélen választjuk el egy nagyon kicsi (8 bp) fragmenttől A nagy DNS fragmentet tartalmazó gél-blokkotkivágjuk ágéiból.

ApJDB 207/PH05, PH03 (lásd 13b. példa) plazmid 0,37 kb méretű Sau3A-Psű fragmentjét tartalmazó gél-darabokat és az M13 mp 9 fág 7,2 kb BamHI-PstI fragmentet 65 ’C-on megolvasztjuk, körülbelül azonos mólnyi mennyiségét összekeverjük, és az agaróz koncentrációnak 0,3%-ra csökkentése érdekében desztillált vízzel hígítjuk. A ligálást 200 pl, 60 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű oldatban 600 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) végezzük. Az E. coli JM 101 (Ca**) törzs kompetens sejtjeit transzdukáljuk a NewEngland Biolabs „Ml 3 cloning and DNA sequencing system” című kézikönyve szerint. A számos fehér tarfoltból származó fágot növesztjük és a beépített DNS szakasz méretét EcoRI és PstI restrikciós endonukleázzal emésztve határozzuk meg.

Egy Sau3A-PstI PH05 transzkripciós terminációs fragmentet tartalmazó M13 mp 9 kiónt izolálunk, és M13 mp 9/PH05 (Sai 3a-Psű) jelöléssel látjuk el.

d) APH05 transzkripciós terminációs fragment klónozása p30/EcoRÍ^R plazmídban:

Az eredeti, M13 mp 9 fágban klónozott PH05 transzkripciós terminációs fragmentet (M13 mp9/PH05 Sau 3A-PstH) HaeDI-HindlII fragmentként újra klónozzuk Ball és HindDI enzimekkel hasított p30/EcoRI^R plazmídban: a M13 mp9/PH05 (Sau3 A-Psü) DNS-t teljesen megemésztjük HaeHI és HindDI restrikciós endonukleázokkal. A kapott két DNS fragmentet 1,5%-os, függőleges, alacsony olvadáspontú gélen TBE pufferben, eválasztjuk. A 0,39 kb fragmentet a gélből kivágott darabból izoláljuk. A p30/EcoRI^R DNS-t Ball és HindDI enzimekkel emésztjük. A nagy 3,98 kb fragmentet 0,8%-os alacsony olvadáspontú gélen elválasztjuk TBE pufferben, majd a DNS fragmentet tartalmazó géldarabot kivágjuk és belőle a DNS-t izoláljuk.

A 0,39 kb HaeM-Hindin PH05 transzkripciós terminációs fragmentet és a p30/EcoRI^R plazmid 3,98 kb Ball-Hindin fragmentjét tartalmazó géldarabokat 65 ’C-on megolvasztjuk és egyenlő mólarányban öszszekeverjük. A ligálást és a kompetenst, coli HB 101 sejtek transzformálását a 4. példában leírt módon végezzük. A transzformált sejtekből izolált DNS-t Ball és HaeHI enzimmel hasítva vizsgáljuk. A PH05 transzkripciós terminációs fragmentet tartalmazó kiónt tovább vizsgáljuk és p31 jelöléssel látjuk el (lásd

20. ábra).

A p31 expressziós plazmid a PH05 promoter szakaszt, a PH05 szignál- szakaszának egy részét és közvetlenül mellette a PH05 transzkripciós terminációs jelet tartalmazó DNS fragmentet tartalmazza. Az ebben a vektorban kifejezendő idegen fehérjét kódoló szakaszt kényelmesen beilleszthetjük a promoter és transzkripciós terminációs szakaszok közé.

14. példa

A limfoblasztoid interferon-SiDNSbeülesztésea p31 plazmidba (lásd 22. ábra)

a) A CG-pBR322/HLycIEN-5j plazmid HaeHI-Hpal fragmentjeinek izolálása

AzE. coliMB 101 CG-pBR322/HLycIFN-5₁ törzset (lásd 10E példa) 100 ml, 10 pg/ml tetraciklinnel kiegésztített LB táptalajban növesztjük és a plazmid DNS-t a 2, példában leírt módon izoláljuk. Tíz mikrogram CG-pBR322/HLydFN-5₁ DNS-t teljesen megemésztünk PstI és Hpal restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os preparatív alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el. Az IEN-Sj kódoló szakaszt tartalmazó körülbelül 860 bázispár méretű Pstl-Hpal fragmentet kivágjuk a gélből és a 4a. példában leírt módon kioldjuk az agaróz gélből, majd az 5a példában részletezett módon DE52 ioncserés kromatográf iával tisztítjuk.

A Pstl-Hpal fragment 3 HaeHI helyet tartalmaz: az IFN-Sj kódoló szakaszban (az ATG-től számítva) és 41,65 és 146-os helyzetben. Ennek megfelelően részleges HaeHI emésztéssel három, 699 bp, 780 bp és 804 bp méretű HaeHI-Hpal fragmentet kapunk. AHaeHI emésztés körülményeit gondosan úgy állítjuk be, hogy a három fragmentből körülbelül egyforma mennyiség keletkezzen. A fragmentek keverékét fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 0,5 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris-ben (pH 8) újra oldjuk.

b) BalI-gyel hasított, defoszforilezett p31 plazmid

DNSkészítése

Hat pg p31 DNS-t (lásd 13d példa) teljesen megemésztünkBaUrestrikciós endonukleázzal (BRL). Fenolos extrakció és alkoholos kicsapás után a DNS-t újra oldjuk 100 pl 50 mM Tris-ben (pH 8.0) és szilikonozott Pasteur-pipeítában levő 50 pl ágy-térfogatú, kiegyenlített Chelex 100-on (Biorad) folytatjuk keresztül. Az átmenet folyadékot és a 450 pl mosófolyadékot egyesítjük. 0.4 egység borjúbél alkalikus foszfatázt (Boehringer) adunk hozzá. Egy órát 37 ’C-on inkubáljuk, majd az enzimet inaktiváljuk, 1.5 órán át 65 ’C-on tartva az elegyet. Az inkubált keverék nátrium-ldoridkoncentrációját 150 mM-ra állítjuk.

A linearizált, defoszforilezett p31 DNS-t DE 52 ioncserés kromatográfiával tisztítjuk (lásd 5a példa). Etanolos kicsapás után a DNS-t 10 mM Tris-ben (pH 8.0) oldjuk0,3 mg/ml koncentrációban.

c) A linearizált defoszforilezett p31 DNS hozzákötése azIEN-Őj DNSHaeHI-Hpalfragmentjeihez

0,6 pg defoszforilezett, Ball enzimmel hasított p31 vektor DNS-t kötünk 0,5 pg, azIFN-5, DNS részlegesen emésztett HaeHI-Hpal fragmentjeihez (lásd 14a.

HU 204095 Β példa). A ligálást 10 pl, 60 mM Tris (pH 7.5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mMDTT és 4 mM ATP tartalmú oldatban végezzük300 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs), éjszakán át szobahőmérsékleten inkubálva. A ligáló elegyből 1 μΐ-t adunk 50 pl, kalcium-ionokkal kezelt, transzformációra kompletens E. coli HB 101 sejtekhez. A transzformáció végrehajtásának leírását a 4a példában közöltük.

A transzformált, amp¹¹ telepeket külön növesztjük 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai [50] módszerével izoláljuk és BstEH enzimmel végzett emésztéssel vizsgáljuk (egyetlenhasítási helyevan, aPH05promoterben).

20, az IEN-5₁ szakaszt tartalmazó Hónt tovább vizsgálunk BstEH-EcoRI kettős emésztéssel, hogy a beillesztett szakasz irányítottságát és méretét meghatározzuk. 8db, megfelelő orientációjú beillesztett szakasszal rendelkező Hón között mind a 3, különböző méretű beillesztett szakasz megtalálható. A méretek megfelelnek azIEN-őj gén (lásd 14a. példa) fragmentek. A Hónok a p31/31(5^, p31/^2(5^ és p31/1^3(5^ jelölést kaptak és a 804 bp méretű JHaelHj-Hpal szakaszt, a 780 bp méretűHaéEO^-Hpal szakaszt, valamint a 699 bp méretű HaeIH₃-HpaI szakaszt tartalmazzák.

15. példa

Alimfoplasztoid interferon-l’b DNS beillesztése a p31 plazmidba (lásd 22. ábra)

a) A CG-pBR322/HLycIFN-rb plazmid HaeE-Rsal fragmentjének izolálása:

Tíz pg CG-pBR322/HLydFN-I’b DNS-t (lásd 10E példa) Pstl és RSal restrikciós endonuHeázokkal emésztünk. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el. A körülbelül 870 bp méretűPstl-RSalfragmentet izoláljuk ágéiból és a 14. példábanleírtmódon tisztítjuk.

A Pstl-Rsal fragmentben három HaeDI hely található: azIEN-l’b kódoló szakasz ATG bázísháromasá- tói számítva al3,37ésll8-as helyen. RészlegesHaelHemésztésselhárom, 735bp, 816 bp, és 840 bp méretű HadH-Rsal fragmentet kapunk. A fragmentek keverékét fenollal extraháljuk, etanollal Hcsapjuk és 10 mM Tris-ben (pH 8.0) 0,1 mg/ml koncentrációban ⁴ oldjuk.

b) A linearizált, defoszforilezett p31 DNS hozzákötése azIEN-1 ’b DNS HaeHt-Rsal fragmentjeihez 0,6 pg Ball enzimmel hasított defoszforilezett p31 vektor-DNS-t (lásd 14b példa) hozzákötünk 0,5 pg, az í IFN-l’b DNS részleges emésztéséből származó HaelΠ-Rsalfragmentekhez. Aligálási eljárást akompetens E. coli HB 101 sejtek transzformálását a ligáló keverékkel, valamint a transzformált amp^R telepek szelekcióját a 14c példában leüt módon hajtjuk végre. A 55 plazmid DNS-t Holmes és munkatársai [50] módszerével állítjuk elő és BstEH restrikciós endonuHeázzal emésztve vizsgáljuk. AzIFN-1 ’b szakaszt tartalmazó 7 Hónt VstEH-PvuH kettős emésztéssel vizsgáljuk. Két Hónról sikerültkimutatni, hogy a 816hpHaéni2-RsaI 60 fragmentet a helyes orientációban tartalmazzák. Ezt a

DNS molekulát p31ZEF2( 1 ’b) jelöléssel láttuk d.

16. példa

Alomfoblasztoid interferon-8’i DNS beillesztése a p31 plazmidba (lásd 23. ábra)

a) A p30 IEN1(8’j) plazmid 1,46 kb Sall-EcoRI fragmentjének izolálása

Öt pg P30IFNl^) DNS-t (lásd 5d példa) Sáli és 10 EcoRI restrikciós endonuHeázokkal emésztünk. Egy 1,46 kb, aPH05 promotert azIEN-8’! fehérje-kódoló szakaszhoz kötve tartalmazó Sall-EcoRI fragmentet elválasztunk 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen. ADNS csíkotetidium-bromidosfestéssd Hmu15 tatjuk, majdHvágjukagélbőL

b) A p31 plazmid 3,5 kb Sall-EcoRI fragmentjének izolálása

Öt pg p31 DNS-t (lásd 13d példa) teljesen megemésztünk Sáli és EcoRI restrikciós endonuHeázzal. 10 APH05 transzkripciós terminációs szakaszt tartalmazó 3,5 kb vektor DNS-t 0,8%-ra alacsony olvadáspontű agarőz-gélen elválasztjuk és aDNS csíkotHvágjuk.

c) A p30 ΙΕΝΗδ’Ρ plazmid 1,46 kb Sall-EcoRI fragmentjének hozzákötése a p31 plazmid Sall-EcoRI (3,5kb)fragmentjéhez

0.67 pgp313,5 kb Sall-EcoRI fragmentet és 0,5 pg p30 IFNl^’j) 1,46 kb Sall-EcoRI fragmentet (a Hvágott gél-darabban) 240 pl térfogatban a 4a. példában leírt módon 15 °C-on egy éjszakán át inkubálva össze0 kötjük.Aligáló keverékből 10 pl-thasználunkkompetensK co/iHB 101 sejtek transzformálására.

A transzformált, amp®· telepeket külön növesztjük 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai módszerével 5 [50] állítjuk elő és BstEH restrikciós endonuHeázzal emésztve vizsgáljuk (egyetlen hasítási hellyel renddkezikaPH05promoterben).

Néhány ΙΕΝ-S’j szakaszt tartalmazó HóntBstEHPvuH dupla emésztéssel vizsgálunk. Mindegyik tartal) mazta az 1,46 kb Sall-EcoRI fragmentet. Az azonos

Hónokatp31/07(8^) jelölésselláttukel.

17. példa

Agén-szerkezetek szubHónozása a nagy kópia-szá5 múpJDB 207élesztő-vektorban

A14-16. példákban leüt szerkezetek tartalmazzák . a PH05 promotert, különböző interferon-kódoló szakaszokat és a PH05 transzkripciós termináciős jeleket, egymás utáni elrendezésben, egypBR322szárma¹ zék-vektorba beépítve. Az élesztőben való kifejeződéshez az egész beépített szakaszt szubHőnozzuk, Ieucinprototróf telepek szelekciójátlehetővé tevő pJDB

207 [28] élesztő vektorban (lásd 9. példa és 6. ábra).

Ap31/IF(8’i), p3 l/EF^’i), p31/(5j), p31/^3(5^ és p31/IF2(l’b) DNS-ek mindegyikéből 2 pg-ot Sáli és Hind IH restrikciós endonuHeázokkal emésztünk. A restrikciós fragmenteket 0,8%-ospreparatív, alacsony olvadáspontú agarózgélen választjuk el. Mindenegyes emésztési reakciónál a kis (kb. 2 kb méretű) fragmentet vágjukH ágéiból.

HU 204095 Β pg pJDB 207 DNS-t Sáli és Hindin restrikciós endonukláezokkal emésztünk. Anagy 6,2 kb fragmentet izoláljuk 0,8%-os preparatív, alacsony olvadásponté gélből. ADNS fragmenteket tartalmazó géldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk és vízzel annyira hígítjuk, hogy az agaróz koncentrációt kb. 0,3%-ra csökkentsük.

A p31ZIF(8’i). ρ31(ΙΡ1(5ι), p31IF2(5₁), p31/EF3(5₁) és p31/3F2(l ’b)plazmidokmindegyikéből kivágott 2 kb Sall-HindlII fragmentet ekvimoláris mennyiségben összekeverjük a pJDB 207 plazmid

6,2 kb HindlII-SalI fragmentjével. A ligálást 100 μϊ térfogatban 15 °C-on 4 órán át végezzük. Minden egyes ligálási keverékből 10 μΐ-t használunk kompetens E. coli HB 101 sejtek transzformálására, a 4a. példában leírt módon.

Minden egyes kísérletből néhány amp¹¹ telepet külön 100 pg/ml ampicillin-tartalmúLB táptalajon növesztünk. A plazmid DNS-t a beépített szakasz ellenőrzése céljából Hindlll- és Sáli restrikciós endonukleázokkal hasítjuk. A kapott megfelelő beépített szakaszokat tartalmazó kiónokat pJDB 207/11^(8^) (lásd 26. ábra) pJDB207/IFl(5₁), pJDB207/IF2(5₁), (lásd 27. ábra), pJDB207ZIF3(5₁) és pJDB207/IF2(l’b) (lásd 27. ábra) jelöléssel láttuk el.

18. példa

Sacharomyces cerevisiae AH220 transzformálása és az interferon-termelés indukciója

A pJDB207/IF(8’₁), pJDB207/IFl(5₁), pJDB207/EF2(5₁), pJDB207/IF3(5₁) és pJDB207/IF2(rb) plazmidok mindegyikét bejuttatjuk a Saccharomyces cerevisiae AH220 törzsbe, (a, trpl, leu2-3, leu2-113, his3,ph05, ph03) aHinnen és munkatársai [1] által leírt transzformálási eljárás felhasználásával. A transzformált élesztő-sejteket leucint nem tartalmazó élesztő minimál táptalajon szelektáljuk. Az egyes transzformált élesztő-telepeket izoláljuk és a 7. példában leírt módon növesztjük. A különböző élesztő-telepek nevei:

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF(8’₁),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/DFl(5₁),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF2(5₁),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF3(5₁) és

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF2(l’b)

19. példa

Élesztő sejt-kivonatok készítése és az interferon tartalom meghatározása

A sejt-kivonatok készítését és az interferon-aktivitás meghatározását a 8. példában leírt módon végezzük. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók

Interferon aktivitás a Saccharomyces cerevisiae AH220 törzsekben a következő plazmidokkal való transzformálás után:

3. Táblázat

Plazmidok	Interferon aktivitás
pJDB207/ED(8’1) pJDB207/IDl(51) pJDB207/ID2(51) pJDB207/ID3(51)	egység/ml élesztő-sejt kívánat 1.107 7.105 5.105 3.103
pJDB207/ID2(l’b)	4.103

20. példa

Hepatitisz B vírus felületi (HBVs) antigén kifejeződése az élesztő PH05 promoter szabályozásával

a)

Fúzió létrehozása a PH05 promoter és a HBVs fehérje kódoló szakasz között (24. ábra) pg pHBV130 plazmidot [51] emésztünk AVal restrkciós endonukleázzal az előállító (New England Biolabs) előírásai szerint. 1336 bázispár méretű, a HBVs teljes fehérje-kódoló szakaszát tartalmazó fragmentet kapunk benne a 27 bázispár méretű potenciális pre-HBV szakasszal (lásd 2. ábra az [51] sorszámú irodalmi hivatkozásban: az Aval fragment a Xho helytől az Aval hely-ig terjedő DNS szakaszon található, mely Aval hely 62 bázispárral a felületi fehérjét kódoló szakasz és a mag-fehérjét kódoló szakasz között levő BamHI hely felett van).

Az 1336 bázispár méretű fragmentet a 4a. példában leírt módon lágy-agaróz elektroforézissel (0,8% agaróz gél) tisztítjuk. 5 pg pBR322/PH05 Bam-Sal plazmidot (lásd 1. ábra) Sáli és Aval restrikciós endonukleázokkal hasítunk (1424-es bázispár a pBR322 plazmidban) és a kapott 3,9 kb a pBR322 szakaszt és a PH05 Bam-Sal szakaszt tartalmazó vektor fragmentet lágy-agar elektroforázissel tisztítjuk.

Az 1336 bázispár méretű fragmentből 1 pg-t 3 pg

3,9 kb fragmenthez kötünk 50 μϊ térfogaté, 60 mM Tris-HCl (pH 7.5), lOmMmagnézium-klorid, lOmM DTT, 1 mM ATP tartalmú oldatban 15 'C-on 4 órán át 6000 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs). A HB101E. coli transzformálását ampiciiiin rezisztenssé és a plazmid-izolálást a 4a. példában leírt módon végezzük.

A plazmid helyes szerkezetét restrikciós analízissel igazoljuk. Az így készített plazmidok a pBR322/PH05 HBVs jelölést kapják.

b) A PH05 promoter illesztése & pontos HBVs fehérjét kódoló szakaszhoz. Aleírt fúziós a 25. ábrán látható DNS nukleotid-sorrend elrendeződést hoz létre. A szekvencia-adatoka a 3. ábráról (PH05), valamint Pasek és munkatársaitól [52; HBVs] vettük. A mRNS iniciációs helyét ismert Sj térképezéssel [48] határozzuk meg, a pBR322/PH05 Bam-Sal plazmid (1. ábra) BamHI-Sall fragmentjét használva. A pBR322/PH05/HBVs plazmidból a PH05 fehérje-kódoló szakasz eltávolítására 5 pg DNS-t emésztünk KpnI restrikciós endonukleázzal (a gyártó által meghatározott körülmények között;

HU 204095 Β

New England Biolabs), így linearizált plazmidot kapunk.

A linarizált plazmidból 4 pg-ot egy egység Bal31 exonukleázzal (Bethesda Research. Laboratory) emésztünk 30 °C-on 45 másodpercig 12 mMkalciumklorid, 12 mM magnézium-klorid, 300 mM nátriumklorid, 20 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.1 összetételű oldatban, 100 pl össztérfogatban. A reakciót a fentiekben leírt fenolos extrakcióval állítjuk le. Etanolos kicsapás után aDNS-t50 pl TE-hen oldjuk lio mg DNS-t újra körbe zárunk T4 DNS ligázzal 20 pl össztérfogatban (a körülményeket lásd 4a. példában). E. coli HB101 törzs transzformálása után ampicillm rezisztens Hónok (lásd 4a. példa) plazmidDNS-ét izoIáljukalefrt módon, és az egyes plazmid-készítményeket akövetkező’ enzimekkel végzettrestrikciós emésztésekkel analizáljuk:TTaeTTT, PstI, BstEHés Hhal.Ez az analízis lehetővé teszi, hogy meghatározzuk, jelen van-e a Hhalhely (hatbázispárral van aHBVs fehérje kódoló szakasz kezdete előtt), és a deléció mértékét is megadja.

A kapcsolódás környékén a DNS-szekvenciát Maxam és Gilbert [15] módszerével határozzuk meg (radioaktívon jelöljük aBsŰHhelyen a 374pontban, lásd

3. ábra). Az egyik plazmidban létrehozott deléció végpontjait a 24. ábrán mutatjuk be. Ezt a plazmidot pBR322/PH05ZHBVs Δ14 jelöléssellátjukel.

c) A EH05-HBVs fúzió bevitele a pJDB207 élesztő plazmidba (lásd 26. ábra) pg pBR322/PH05/HBVs Δ14 plazmid DNS-t emésztünk BamHI restrikciós endonuHeázzal (New EnglandBiolabs, agyártó által előírt körülményekközött). Egy 1,8 kb BamHI fragmentet izolálunk a 4a. példában leírt módon, lágy agarőz-gél elektroforézissel (0,8% agaróz). A pJDB 207 vektorból 2 pg-ot emésztünk ugyanezzel az enzimmel. 1 pg emésztett pIDB207plazmidot és 1 pg 1,8 kb BamHI restrikciós fragmentet ligálunk 20 pl össztérfogatban a 20a példábanleírt köriilményekközött. AzE. co/zHBlOlsejtek transzformálását ampicillin rezisztenssé és plaz- ‘ midDNS izolálását a 4a. példábanleírtmódonhajtjuk végre. Az egyes plazmidokat BamHI restrikciós enzimmel emésztve analizáljuk és a beépített BamHI fragment orientációját HindIDTBstEII kettős emésztéssel határozzuk meg. A plazmid-konstrukció a 26. ² ábrán látható. A 26. ábrán bemutatott plazmidot pJDB/PH05/HBVsA14 jelöléssel láttuk el.

A plazmidot a 7. példában leírt módon transzformáljuk az AH220 élesztő-törzsbe. A transzformált élesztő-sejteket szelektáljuk, folyékony táptalajban £ inkubáljuk és a 7. példában leírt módon depresszált körülmények között növesztjük. Egy transzformált élesztő-telepet Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/HBVsA14 jelöléssel láttunk el. Sejtkivonatot a 8. példában leírt módon készítünk és a tér- 5 melt HBVs fehérje mennyiségét Abbott radioimmunassay-vel [51] haátorzzukmeg. imák a feltevésnek az alapján, hogy az élesztő által termeltHBVs antigén, az emberi szérumban levő antigénhez hasonlóan reagál, derepresszált körülmények között körülbelül 2 pg 6

HBVs antigén található egy ml élesztő-kivonatban.

Represszáló körülmények között a szint 0,001 pg/ml alatt van.

d) APH05-HBVsfúzió bevitele aPH05 transzkripciós 5 terminációs szakaszt tartalmazó élesztő plazmidba pg pJDB207/IF(8’₁) plazmid DNS-t (17. példa) emésztünk a fentiekben leírt módon BamHI enzimmel és a 6,9 kb vektor részt a 4a. példában leírt módon lágy agaróz eiektroforézissel (0,8% agaróz) izoláljuk. 5 pg 0 PBR322/PH05/HBVsA14DNS-temésztűnkafentiékben leírt módon BamHI enzimmel és az 1,8 kb BamHI fragmentet lágy agar eiektroforézissel izoláljuk. 1 io m 6,9 kb vektor fragmentet ligálunk 1 pg 1,8 kb

BamHI fragmenttel 20 pl össztéforgatban a 20a. pél5 dábanleírtkörülményekközött.AzE. co/tHBIOlsejtek ampicillin rezisztenssé transzformálását és a plazmid izolálását a 4a. példában leírt módon hajtjuk végre. A plazmidok elemzését restrikciós endonuHeáz emésztésekkel végezzük. A 26. ábrán bemutatott plaz0 midot pJDB207/PH05/HBV&A14t jelöléssel láttuk el.

Az AH220 élesztő törzs transzformálását és a transzformáit sejtek szelekcióját a 7. példában leírt módon végezzük Egy transzformált élesztő telepet Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/HBVsA14tjelö5 Iésselláttuhkel.

21. példa

A következő plazmidokból Hvágott DNS szakaszokat ) pBR322-PsűdGiHBV-KpnIdC; pBR322-PsűdG:HBV-BamHIdC; pBR322-PsűdGíHBV-VgIIIdC; pBR322-PstIdGJIBV-EcoRIdC; PBR322-BamHI::HBV-BamHI;

» pBR322-EcoRI:HBV-EcoRI; pBR322-PsűdGíHBV-KpnIdC; pBR322-PstT dG:pHBVl 14-PstIdC; ((pBR322-EcoRI Hindin: Lac promoter szekvencia) HindJH: HBV114-HhaIBSndiniihkerek)-BamHI, ' pUR2-EcoRI:HBV114-HhaIEcoRIlinkerék pIR2-EcoRt HBV114-HhaIEcoRI linkerek, pBR322-PsűdG:pHBV114-AvaIdC, és pBR322-Pstí dGpHBVl 14-Tac dC az európai Szabadalmi bejelentés 13828 sorszáma alatt leírt módon (előnyösen először megfelelően illeszteni a végeket) beépíthetjük a p30 vagy p31 plaz. midokba, az 5,14 és 15. példák szerint, majd a 17. példa szerint a pJDB207 plazmidba. A S.cerevisiae törzs transzformálását a 18. példa szerint hajthatjuk végre. A HBV antigén tulajdonságokat mutató polipeptidek kifejeződését a 20c. példa szerint határozhatjukmeg.

22. példa

A 3’ nem-transzlálódó DNS szekvencia deléciója a pJDB207/IF2(5]) és a pJDB207/IF2(l’b) plazmidokból (lásd 27. és 28. ábra)

A pJDB207/IF2(5₁) és pIDB207/IF2(l’b) plazmidok készítése során (lásd 17. példa) viszonylag hosszú 3’ nem-transzlálódó szakasz keletkezett, körülbelül

HU 204095 Β

440 bp és 48 bp méretben. Ennek a szakasznak a megrövidítésére a DNS-t Bal31 exonukleázzal emésztjük az egyetlen Smal helytől, a szakasz közepén. Xho linkereket építünk be és DNS-tligálássalkörré zárjuk.

a) A Smal-gyel hasított pJDB207/IF2(5₁) és pJDB207/tF2(l’b) plazmidok emésztése Bal31 enzimmel

Mindegyik plazmid DNS-bóT 20 p-ot emésztünk

Smal endonukleázzal. Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t 10 mM Tris-ben (pH 8.0) 0,5 mg/ml koncentrációban oldjuk. Mindegyik Smai-gyel hasított DNS-ből 10 μg-ot emésztünk 2 egység BalSl exonukleázzal (BRL) 100 pl, 20 mM Tris (pH 8,0), 100 mM nátrium-klorid 12mMmagnézium-klorid, 12mM CaCl₂ és lmMEDTA összetételű oldatban. 90,120 és 150 másodperc után 3 pg DNS-t kiveszünk a 30 °C-on inkubálódó elegyből és azonnal 50 μΐ fenollal és 60 |ü TNE-vel keverjük össze. Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 20 mM Tris-ben (pH 8.0) oldjuk 100 pg/ml koncentrációban. ABal31 exonukleázos emésztés ellenőrzésére minden időpontból 0,7 pg DNS-t emésztünk a pJDB207/IF2(5₁)-ből származó minták esetében HindHIZEcoRI-gyel vagy a pJDB207/IF2(rb)-ből származó minták esetében PvuUZHindDI-mal.

További kísérletekhez a 90 másodperces időpontból származó DNS-eket használjuk.

b) Xhol linkerék hozzáadása a Bal31 -gyei kezelt DNShez

A pJDB 207/^2(5^ és pJDB207/DF2(l’b) plazmid

DNS-ekből 2,2 pg-ot 90 másodperces Bal31 -es emésztése után (lásd 22a. példa) 1 órán át 37 °C-on 2,8 egység Klenow DNS- polimerázzal (polimeráz I nagy alegysége BRL) inkubálunk 35 pl, 60 mM Tris (pH

7.5) , 10 mM magnézium-klorid és 0,1 mM dNTP öszszetételű oldatban.

Három pg Xhol linkért (5’-CCTCGAAGG-3’, Collaborative Research) kezelünk 50 pl, 6 mM Tris (pH

7.5) 10 mM magnézium-klorid, 4 mM DTT, 0,5 mM Alí? és 35 egység T4 plinukleotid-kináz (Boehringer) összetételű oldatban 30 percig 37 °C-on.

0.67 pgkinázzalkezeltXhoIlinkertésO,4 pgBal31gyel kezelt tompavégű pJDB207/EF2(5i) vagy pJDB207/IF2(l^,b) plazmid DNS-t éjszakán át ligálunk szobahőmérsékleten 25 pl 60 mM Tris (pH 7.5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP és 450 egység T4 DNS ligáz összetételű elegyben. A ligáit DNS-t izopropanolos kicsapással választjuk el a feleslegben levő linkertől 10 mM EDTA, 0,3 M nátrium-acetát (pH 6.0) és 0,54 térfogat izopropanol jelenlétében. 35 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után a DNS-t centrifugálással ülepítjük. A csapadékot levegőn szárítjuk és oldjuk 17 pl, 6 mM Tris (pH 7,9) 150 mM nátrium-klorid, 6 mM magnéziumklorid és 6 mM merkapto-etanol összetételű oldatban. A DNS-hez kötött Xhol linkért Xhol enzimmel hasítjuk, a DNS-t izopropanollal kicsapjuk az előzőekben leírtak szerint és ligálással körbezárjuk. 6 órán, 15 ’Cos, 50 pl 60 mM TRIS (pH 7,5), 10 mM magnéziumklorid, lOmMDTT, 1 mMATP és 600 egység T4 DNS ligáz elegyben történő ligálás után mindegyik ligáló elegyből 10 pl-t adunk 100 pl kalcium-ionokkal kezelt, transzformációhoz kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa).

transzformált, ampicillin rezisztens, IFN-5j beépített szakasszal rendelkező plazmidot tartalmazó telepet növesztünk külön-külön, 100 mg/Iiter ampicillint tartalamzó LB táptalajban. A plazmid DNS-t HaeΠΙ emésztéssel analizáljuk. A restrikciós kép alapján meg lehet becsülni a Bal31 által okozott deláció közelítő méretét. Két kiónt tovább elemzűnk és vizsgáljuk interferon aktivitásukat. pJDB207/IF2(5j)A72 és pJDB207/IF2(5 j)A82 jelzéssel láttuk el őket.

Az új csatlakozás (Xhol linker) mindkét oldalán, az IFN-őj gén 3’ nem transzlálódó szakasza és a PH05 transzkripció terminációs szakasz között, a nuldeotid sorrendet a 28. ábrán adjuk meg.

Analóg módon 50IEN-1 ’b szakaszt tartalmazó ampicillin rezisztens telepet növesztünk külön-külön 100 mg/1 LB táptalajon. Aplazmid DNS-t a fentiekben leírt módon elemezzük. Egy kiónt szelektálunk és vizsgáljuklFN aktivitását. Jelölése pJDB207/IF2(l’b)A.

GH23. példa

HordozhatóIFN-5p -8’p és l’b cDNS szakaszokat tartalmazó rekombináns plazmidok készítése, melyek érett limfoblasztoid IFN közvetlen kifejezésére használhatók (lásd 29. és 30. ába)

a) cDNS szakaszok készítése

A cDNS szakaszokat a CG-pBR322/HLycIFN-8’₁, CG-pBR322/HLycIFN-l’b, CG-pBR322/HLycIFN5j rekombináns plazmidokból vágjuk ki mindegyik plazmid DNS-ből 150 pg-ot PstI (Biolabs) enzimmel emésztve, a gyártó által javasolt eljárást alkalmazva. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a kivágott szakaszokat szacharóz sűrűség-gradiens centrifugálással választjuk el (5-23%) 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) és 1 mM EDTA oldatban. A centrifugálást 35 000/perc fordulatszámmal TST41 rotorban (Kontron AG) 15 ’C-on végezzük 16 órán át. 6.3 m-es frakciókat gyűjtünk ISCO gradiens-gyűjtővel 1 ml/perc sebességgel. Akis fragmentet (a kivágott szakaszt) tartalmazó frakciókat egyesítjük. A DNS-t a szokásos módon etanollal kicsapjuk és a csapadékot HB-4 rotorban (Srovall) 10 000/perc fordulatszámmal 0 ’C-on 10 percig centrifugálva gyűjtjük össze. A csapadékot 60 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) és 0,05 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az optikai elnyelés mérése alapján meghatározva kb 30 pg DNS-t nyerünk ki.

Mindegyik cDNS szakaszból 2 pg-ot emésztünk 2,5 egység Sau3A (Biolabs) enzimmel 10 pg/ml etidíum bromidban 50 percig 37 ’C-on. Az emésztett DNS-t fenollal extraháljuk és a fentiekbenleírt módon etanolal kicsapjuk. ADNS fragmenteket 1,2% agaróz gélen elválasztjuk 50 mM Tris-t, 50 mM bórsavat, 1 mM EDTA-t és 0,5 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó oldatban.

Mindhárom emésztett DNS-ből a második legnagyobb DNS fragmentet kivágjuk a gélből, fecskendő27

HU 204095 Β vei vékony tűn nyomjuk keresztül 5 ml 0,15 M nátríum-kloridot, 50 mMTris-HCI-t (pH 8.0) és 1 mMEDTA-t tartalmazó oldatba és egy éjszalkán át rázatva kioldjuk. ADNS megkötésére azeluátumot 100 μΐ térfogatú DE-52 (Whatman) Pasteur-pipetta oszlopon engedjük keresztül. Az oszlopont 2 ml ugyanilyen összetételű pifferrel mossuk és a DNS-t 400 pl 1,5 M nátrium-kloridot, 50 mMTris-t (pH 8.0) és 1 mMEDTA-t tartalmazó oldattal leoldjuk. ADNS-t 2 térfogat etanollal -20 ’C-on éjszakán át állni hagyva kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf centrifugában centrifugálva összegyűjtjük és 10 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) és 0,05mMEDIA összetételű oldatban oldjuk,

b) A befogadó platmid DNS-fragment készítése 1) A pBR322plazmid emésztés&EcoRIésSj enzimekkel 10 pgpBR322plazmidDNS-t 15 egység EcoRl (Biolabs) enzimmel emésztünk60 percig 37 ’C-on az előállító előírásaiszerint. Afenolos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 25 pl vízben oldjuk és aragadós végeket eltávolítjuk 20 egység S_x exonukleázzal (P-L Biochemicals) 30 percig 30 C-on kezelve a DNS-t 350 pl 250 mM nátrium-kloridot, 30 mM nátriumacetátot (pH 4,5) és 1 mM cink-szulfátot tartalmazó oldatban. A reakciót EDTA (pH 7,5) hozzádásával (10 mM) állítjukle. ADNS-tfenollal extraháljuk, etanolos kicsapással töményítjük és 50 pl 10 mM TrisHCl (pH 7,8) és 0,05 mMEDTA összetételű oldatban oldjuk.

2) Kémiailag szintetizált DNS linker hozzákötése az

EcoRI-gyel és Sj-gyel emésztett pBR322-höz

A5’-AATTCTATGTGT-3’ és

5’-GATCACACATAGAATT-3’ összetételű oligodezoxinukleotidokat a lOEapéldábanleírt módon szintetizáljuk.

A szintetikus oligodezoxi-nuklezotidokat az 5’ végükönfoszforüezzük, mindegyik oligo-dezoxi-nukleotidból 80 pikomólt 20 pCi [y-³²P]-ATP-vel (6700 Cimmól¹ Amersham) 30 percig 37 ’C-on inkubálva 80 pl reakciótérfogatban 0,1 mMrATP-trobi-deznozim-trifoszfátot Sigma), 50 mM Tris-HCl-t (pH 9,5), ‘ 10wMmagnézium-kIoridot,50mMDTT-tés20 egység T4 polinuldeotidkűiázt (P-LBiochemicals) tartalmazó oldatban.

Areakciótaz elegy- 80 ’C-rahűtésével állítjukle.

Eztkövetőenakapott ² [³²P]-AATTCIATGTGT

TIAAGATACACACTAG-[³²P] képletű radioaktívan foszforilezett linkért 6 pg

EcoRl és Sj enzimekkel emésztett pBR322 DNS-sel Qásdelőzőekben) inkubáljuk2óránát 15 °C-on200 pl í reakció-térfogatban, 0,5mMrATP-t ribo-adenozintrifoszfátot, Sigma), 0,1 mM DTT-t (Calbiochem), mM Tris-HCl-t (pH 7,8), 10 mMmagnézium-kloridot és 4.10³ egység T4 DNS ligázt tartalmazó oldatban. δ

Az oldatot fenolos extrakcióval fehérje-mentesítjük és a DNS-t etanolos kicsapással töményítjük. A DNS-t 100 pl lOmMTris-HCI-t (pH 7.5) és 0,05 mM EDTA-t tartalmazó oldatban oldjuk és (5-23%) szacharóz gradiensen 50 mM TRIS-HCl (pH 8,0) 1 mM 6

EDTA oldatban centrifugáljuk. A centrifugálási

000/perc fordulatszámmal, TST60 rotorban (Kontron AG) 15 'C-on 2,5 órán át végezzük. ISCO gradiens-gyűjtővel 0,2ml-es frakciókat gyűjtünk, 1 ml/perc δ sebességgé. A[³²P]-veljelöltpIazmidDNS-ttartaImazó frakciókat (a 11-14-es frakciók a 22-ből) egyesítjük, a DNS-t etanollal kicsapjuk és 12 egység Beül enzimmel (Biolabs) emésztjük, agyártó előírásaiszerint.

Fenolos extrakció és etanolos kícsapás után az emészí 0 tettDNS-t 10 egység PstI (Biolabs) enzimmel kezeljük a gyártó előírásai szerint A fenollal extrahált emésztett DNS-t ezután (5-23%) szacharóz gradiensen centrifugáljuk 15 órán át 35 000/perc fordulatszámmal TST 41 rotorban (Kontron AG). 0,3 ml-es frakció5 kát szedünk (lásd az előzőekben) és a nagy, [³²P]-vel jelölt BclH-PstlDNS fragmentet tartalmazó frakciókat (42 frakcióból a 27-31-es) egyesítjük és etanolos kicsapással töményítjük. ADNS-t 20 pl Tris-HCl (pH

7,8) és 0,05 mMEDTA összetételű oldatban oldjuk.

c) Abefogadó plazmid-fragment hozzákötése a cDNS szakaszokhoz

A befogadó plazmid DNS-fragmentből 2 μΙ-t (-100 mg) (lásd fent) inkubálunk a cDNS szakaszokból μΐ-rel (~20 ng) (Iásdfeljebb) 3 órán át 15 ’C-on 10 pl 5 reakciótérfogatban 20 mM Tris-HCl-t (pH 7.8), lOmMmagnézium-kíoridot, 0,1 mMrATP-t, 0,1 mM

DTT-t és 400 egység T4 DNS ligázt tartalmazó oldatban.

Areakció-elegyekből 5 μΙ-t adunk 150 pl kalcium3 ionokkal kezeletK co/íHBlOlsejteketlOmMTrisHC1 <pH7.5) összetételű oldatban tartalmazó keverékhez, 200 pl össztérfogatban.

Akeveréket20 percig jégbe-hűtjük. 1 percre42 ’Cra melegítjük, majd 20 ’C-on inkubáljuk 10 percig. 1 3 ml tripton táptalajt (10 g Bacto-Trypton (Difco), 1 g glükóz, 8 g nátrium-klorid és 294mg két kristály vizes kalcium-ldorid 1 liter desztillált vízben) adunk hozzá és akeveréket 30 percig 300/percfordulatszámmal rázatjuk 37 ’C-on. A keveréket 2 agar-lemezre széleszt• jük (Mc Conkey agar, Difco; 0,6 ml/Iemez) 10 pg/ml tetraciklinnel (Sigma) ldegésztve. A lemezeket 37 ’Con inkubáljuk 12-17 órán át. Egy transzformációs keverékből körülbelül 1000 telepet kapunk. További elemzés céljára mindegyik transzformációból 4 telepetválasztunkki.

d) Ahibridplazmidokrestrikciós elemzése

A potenciális hibrid plazmídok további elemzése céljából 12telepbóIizoláljukaDNS-t (a ligáló keverék mindegyikéből származó 4 telep, lásd fentebb).

A hibrid plazmid DNS-t a következőképpen izoláljuk. 1 teleppel oltunk 10 ml tripton táptalajt, 25 ml-es Erlenmeyer lombikban, 10 pg/ml tetraciklinnel Idegésztve mint a fentiekben. Atenyészetet 15-18 óráig rázatjuk 37 ’C-on 300/perc fordulatszámma. Körülbelül 0,1 g sejtet nyerünk így, mely sejteket 1 ml 50 mM Tris-HCl-ben (pH 8,0) szuszpendáljuk. 0,25 ml lizozim oldatot adunk hozzá (10 mg/ml 50 mM TrisHCl-ben (pH 8.0), a lizozim Sigma gyártmányú) és 10 perces 0 ’C-os iiíkubálás után 0,15 ml 0,5 M EDTA-t (pH 7.5) adunkhozzá. Újabb 10 perces 0 ’C-os inkubá28

Hü 204095 Β lás után 60 gl 2%-os Triton Χ-100-at (M'arck) adunk hozzá. 30 percig 0 °C-on inkubáljuk, majd 30 percig 15 000/perc fordulatszámmal 4 ’C-on Sorvall SA-600 rotorban centrifugáljuk A felülúszót 1 térfogat fenollal (TNE-vel telített) fehérje-mentesítjük. A fázisokat centrifugálással választjuk el (Sorvall HB-4 rotor, 10 perc, 15 000/perc, 4 ’C, 4 ’C). A felső fázist kétszer extraháljuk 1 térfogat kloroformmal. Pankreatikus RN-áz A-t (Sigma, 10 mg/ml TNE-ben, 10 prcig 85 ’C-ra melegítve) adunk hozzá 25 gg/ml végkoncentrációban és az elegyet 40 percig 37 ’C-on tartjuk Az oldatban ezután 1 mól nátrium-klorid és 10% 6000-es molekulatömegű polietilén-glikol (Fluka, 20 percig 120 ’C-on autoklávozva) koncentrációt állítunk be és -10 ’C-on 2 órán át inkubáljuk. A csapadékot Sorvall HB-4 rotorban centrifugálva (20 perc, 10 000/perc, 0 ’C) összegyűjtjük és 100 gl TNE-ben oldjuk A DNS-oIdatot 1 térfogat fenollal extraháljuk és a DNS12 térfogat etanollal 10 percig -80 ’C-on tartva kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf centrifugában centrifugálva összegyűjtjük és a DNS-t 20 gl 10 mM Tirs-HCl (pH 7,5) és 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk 10 ml tenyészetből 8-10 gg hibrid plazmid DNS-t nyerünk ki.

Mindegyik plazmid DNS-t a következő kettős emésztésekkel elemezzük: mindegyikDNS-ből 0,5 ggot Hindin (Biolabs) és PvuH (Biolabs), Hindin és Pstl (Biolabs), Hindffl és BamHl (Biolabs), EcoRI (Biolabs) és Pstl enzimekkel emésztünk a rendes eljárás szerint, majd 1,5% agaróz gélen méret szerint szétválasztjuk 40 mM Tris-acetát (pH 7.8), 1 mMEDTA és 0,5 gg/ml etidium-bromid összetételű oldatban.

A kívánt restrikciós-enzim mintázott mutató hibrid plazmidokat kiválasztjuk. Az eredményeket a 29. és

30. ábrán foglaljuk össze. A pBR SZZ/HLycIFN-S’j vagy pBR322ZHLycIEN-5₁ vagy pBR322/HLycIFNl’b plazmidokból származó beépített szakaszokat tartalmazó plazmid DNS-eket CG-pBR322/HLycIEN(a3)-252, CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 és CGpBR322/HLycIEN(a-l)258 jelöléssel láttuk el.

Hogy még jobban megerősítsük a linker és az IFN cDNS-ekkódoló szakaszkezdete kapcsolódási pontjának szerkezetét, meghatározzuk ennek a területnek a nukleotid sorrendjét.

Részletesebben, az izolált CG-pRB322/HLycIEN(a-l)-258 plazmid DNS-ből 2 gg-ot emésztünk EcoRl-gyel, 5’ végét jelöljük és Psű-gyel hasítjuk és az EcoRI*-PstI (9,4 bp) DNS-fragmentet a fentiekben leírt módon extraháljuk. A DNS fragmentnek Maxam és Gilbert [15] módszerével meghatározzuk a nukleotid sorrendjét.

A linker és az IFN cDNS-ek kódoló szakaszának kezdőpontja között kapcsolódási pont szerkezetét a CG-pBR322/HLydFN(a-2)-261 és CGpBR322/HLycIFN(a-3)-252 plazmidokban hasonlóképpen erősítjük meg.

A CG-pBR322ZHLycIEN(a-l)-258, (a-2)-261 és (<x-3)-252 plazmidokban a következő, EcoRI restrikciós helyet tartalmazó szakasz előzi meg az IFN kódoló szakaszt.

EcoRI SauSA

-NGAAITCTATGTGTGATC....

-NCTTAAGATACACACTAG....

—

IFN gén

24. példa

APH05 szignál-szakasz kivágása a p31 expressziós plazmidból (lásd 31. ábra)

Ap31 expressziós plazmid tartalmazza a PH05 promoter szakaszt, ideértve amRNS start-helyet, a savas leotidot. Ebben a szerkezetben a szignál-szakaszt kódoló nukleotidokat és az ATG-í távolítjuk el Bal31 emésztéssel. EcoRI linkereket építünk be, hogy lehetővé tegyük a PH05 promoter kapcsolódását megfelelő érett kódoló szakaszokhoz (például interferon gének).

a) Balí-gyel hasított p30 plazmid emésztése Bal31gyel gg p30 DNS-í (lásd 4b példa) emésztünk Ball restrikciós endonukleázzal, így 2, 3,7 és 5,1 kb fragmentet kapunk. Fenol-klorofonnos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t 10 mM Tris-ben (pH 8.0) oldjuk, 0,5 gg/ml koncentrációban, 9 gg Balígyel hasított p30 DNS-t 2 egységBal31 (BRL) exonukleázzal emésztünk 100 gl 20 mM Tris (pH 8.0), 100 mM nátrium-klorid, 12 mM magnézium-klorid, 12 mM kalcium-klorid és ImM EDTA összetételű oldatban. 2 gg DNS-t tartalmazó alikvot részeket veszünk ki 15,30,45 és 60 másodperc múlva a 30 ’C-on inkubált elegyből és azonnal 50 gl fenollal és 60 gl TNE-vel keverjük össze.

Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 10 mM Tris-ben (pH8.0) oldjuk 100 gg/ml koncentrációban. A Bal31-es exonukleázos hasítás mértékének elemzésére minden egyes időpontból 0,5 gg DNS-t BamHl endonukleázzal emésztünk, majd 1.5 százalékos agaróz gélen Tris-borát pufferben (pH 8.3) elemezzük. Átlagban 70 bp hiányzik a fragment után. A további kísérletekhez a 45 másodpercig emésztett DNS-t használjuk.

b) EcoRI linkerek hozzáadása a Bal31-gyel kezelt

DNS-hez

Két A₂go egység EcoRI linkért (5’-GGAATTCC3 ’) oldunk 250 gl 10 mM Tris-t (pH 8,0) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban. Két gg EcoRI linkért foszforilezünk a végén 75 gl 60 mM Tris pH 7.5), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM DDT, 10 gM ATP és 33 egység T4 polinukleotid kináz (Boehringer) tartalmú oldatban. Egy órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, majd -20 ’C-on tároljuk.

A kétszáíú EcoRI linkereket tompa végükkel a Bal31-gyel kezelt DNS fragmentekhez kötjük. Fél mikrogramm Bal31-gyel kezelt DNS-t (24a példa) 16 órán át szobahőmérsékleten inkubálunk 20 gl térfogatban 50-szeres feleslegben jelenlevő foszforilezett EcoRI linkerekkel 60 mM Tris (pH 7.5) 10 mM magnézium-klorid, lOmMDTT, 4mMATP és 600 egység

HU 204095 Β

T4 DNS ligáz (Biolabs) összetételű oldatban. A T4

DNS ligáz inaktiválás után (10 perc, 65°) a feleslegben levő foszforilezett EcoRI linkereket 50 egységEcoRIgyel elhasít juk 50 μΐ térfogatban. A DNS-t fenol/klorofonnmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 10 mM Tris, 1 mMEDTAoldatban oldjuk.

Az EcoRI restrikciós endonukleáz nemcsak a terminális EcoRI linkereket hasítja mindkét Ball fragmenten (3,7 kb és 5,1 kb), hanem az 5,1 kb fragment belsejében levő EcoRI helyet is, így kapunk egy 3,9 kb és egy 1,2 kb fragmentet. A 3,7 kb és 3,9 kb fragmenteket 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen (Sigma) elválasztjuk az 1,2 kb fragmenttől 90 mM TrisHCl(pH8,3), 90 mMbórsav és 2,5mMEDTA összetételű oldatban.

A DNS csíkokat etidium-bromiddal festjük és hosszúhullámú UV fénnyel (366 nm) tesszük láthatóvá. A két nagy, 3,7 kb és 3,9 kb DNS fragmentet nem választjuk el. Egyetlen géldarabban vágjuk ki őket és a 4apéldábanleírtmódon extraháljuk.

Az EcoRI ragadós végű lineáris fragmenteket Iigálással körbe zárjuk. Körülbelül 0,25 pg fragmentet ligálunk 100 pl 60 mM Tris (pH 7,5), 10 mM magnézium-klorid 10 mM DTT, 1 mM A1P és 600 egység T4 DNS ligáz összetételű oldatban 4 órán át 15 °C-on.

A ligáló keverékből 10 pl-t 100 μΐ kalcium-ionokkal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez adunk (lásd 4a. példa). 35 transzformáit, ampicillin rezisztens telepet növesztünk különkülön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai [50] módszerével állítjuk elő és EcoREBamHI kettős emésztéssel elemezzük.

c) Nukleotid-sorrend elemzés az EcoRI lmker hozzáadása helyének meghatározására A 35 klón legtöbbje különbözni fog egymástól az

EcoRI linker helyében a FH05 promoter régióban attól függően, hogy a Bal31 mennyire emésztettemeg az egyes DNS molekulákat.

A nukleotid-sorend elemzéséhez a plazmid DNS-t EcoRI-gyel emésztjük. Fenol /kloroformos extrakció után azemésztettDNS-t etanollal kicsapjuk.

A DNS-t defoszforilezzük és 5’-végét jelöljük a 10

Ed példában leírt módon. A jelzett DNS fragmenteket egy második restrikciós endonukleázzal, BamHI-gyel ² hasítjuk,

A termékeket 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk szét. A 0.5-0.6 kb méretű, 5’-végén jelzett EcoRI-BamHI fragmentet izoláljuk az alacsony olvadáspontú agarózból a 4a, példábanleírtmó- £ dón.

Az EcoRI linkerrel szomszédos nukleotid sorrend meghatározására a különböző DNS fragmenteket kémiailag elbontjuk, és a termékeket poliakrilamid-gél elektroforézissel választjuk szét, Maxam és Gilbert 5 [15]módszerével.

A különböző kiónok, és a PH05 szakasz megfelelő utolsó nuldeotidjának helyzete (ezt EcoRI linker követi) van listázva a 4. táblázatban (lásd még 32. ábra).

4. Táblázat

Klón	APH05 szakasz utolsó nukleotidjánakhelyzete
pE	+25
pG	+16
pe	+12
pY	-4
pR	-10
pP	-16
pV	-18
PL	-21
pN	-22
pC	-24
pH	-27
PS	-28
Pk	-29
P1	-38
pM	-50
pO	-53
pF	-59
pm	-67
pK	-73
pí	-81
ph	-137

d) A PH05/R promotert tartalmazó 0,53 kb BamHIEcoRIfragmentizoIálása

AoRokazmidaPH05/Rpromotert tartalmazza egy

534 kb BamHI-EcoRI fragmenten. A 3a. ábra számozása szerint a fragment az 541-es nukleotidtól (BamHI hely) a 10-es nukleotidig tartalmaz PH05 promoter szakaszt. A 10-es núkleotidhoz kötött EcoRI linker (lásd 24b. példa) EcoRI hasítására két G-maradékot adhozzá.

ApR plazmidot BamHI és EcoRI fragmentet 0,8%os alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el és a 4a. példában leírt módon izoláljuk. Anukleotid-sorrend a 33. ábránlátható.

Hasonló módon a pY plazmidot megemésztjük és a PH05/Y promotert tartalamzó BamHI-EcoRI fragmentet izolálunk. A nukleotid sorrend a 34. ábrán látható.

e) A Sall-EcoRI fragment helyettesítése a p31 plazmidban az új szerkezetű Sall-EcoRI fragmenttel 5 pgp31 plazmidot (lásd 13d példa) emésztünk Sallrestrikciós endonukleázzal. Az emésztettDNSt etanollal kicsapjuk és oldjuk 50 pl 100 mM Tris (pH

7.5) 50 mM nátrium-klorid, 5 mM magnézium-klorid összetételű pufferben. A DNS-t teljesen megemésztjük EcoRI-gyel. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen, Tris-borát-EDTA (pH 8.3) pufferben választjuk el. Egy 3,5 kb méretű DNS fragmentetizolálunkegy, aDNS csíkot tartalmazó kis gél-darabban.

ApR és pY kiónok mindegyikéből (lásd 4. Táblázat és 32. példa) 5 pg-ot emésztünk a fentiekben leírt módon Sáli és EcoRI enzimekkel. A 0,8 kb DNS fragmenteket kis, alacsony olvadáspontú agaróz-gél darabban izoláljuk.

Ap31 vektor 3,5kbméretűSalI-EcoRIfragmentjé30

HU 204095 Β bői 0,67 pg-ot kötünk 0,34 g, apRvagypYpIazmid0,8 kb méretű Sall-EcoRI fragmentjéhez. A DNS fragmenteket tartalmazó megfelelő gélblokkokat összekeverjük és 65 °C-on megolvasztjuk. A megolvasztott gélt háromszorosan meghígítjuk. A ligálást 240 pl össztérfogatban hajtjuk végre, egy éjszakán át 15 ’Con inkubálva 60 mM Tris (pH 7.5), 10 mM magnézíum-ldorid, 10 mMDTT, 1 mM ATP és 750 egység T4 DNS ligáz (Biolabs) összetételű oldatban. Mindegyik ligálásból 2 pl-t adunk 100 pl kalcium-ionokkal kezelt, transzformációra kompetensül· coliHB101 sejtekhez (lásd 4a. példa).

transzformált, ampicillin rezisztens telepet egyenként növesztünk 100 pg/ml ampicillin-tartalmú LB táptalajon. A plazmid DNS-t restrikciós emésztéssel elemezzük. Mindegyik csoport kiónjai azonosak. Mindegyikből egy kiónt használunk tovább, jelzése p31/Rvagy p31/A (Lásd 31. ábra).

25. példa

A limfoblasztoid interferon-a-3 DNS beépítése a p31/R vagy p31/Yplazmidba (ásd 35. ábra).

Ez a szerkezet összekapcsolja a PH05 promoter szakaszt az érett α-3-interferont kódoló génnel. Sem a PH05, sem az interferon szignál szakaszai nincsenek jelen, de van egy, az Összekapcsolódás helyén beillesztett EcoRI linker.

A p31/R plazmid (lásd 24e. példa) a savas foszfatáz gén ATG kodonja előtt 9 nukleotiddal egy EcoRI linkénél (5’-GGAATTCC-3’) végződő PH05 promoter szakaszt tartalmaz. A CG-pBR322/HLycIFN(a-3)252 plazmidban levő limfoblasztoid a-3 interferon gén (lásd 23. példa) különösen adaptálódik a PH05 promoterben levő EcoRI linkerhez való kapcsolódásra. Az érett interferon-a-3 kódoló szakaszának 5’ végéhez hozzáadott nukleotídokból EcoRI restrikciós hely és az interferon gén (29. ábra) transzlációjához szükséges ATG bázis-triplett alakul ki. Lényegében hasonló szerkezetet kapunk a p31/Y plazmidból is (lásd 24e. példa).

a) EcoRI-gyel hasított defoszforilezett p31/R plazmid készítése pg p31/R plazmidot teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós endonukleázzal. Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 100 pl 50 mM Tris-ben (pH 8.0) oldjuk. ADNS-t Chelex 100 (BioRad) oszlopon bocsátjuk keresztül, deloszforilezziik borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) és a defoszforilezett DNS-t DE52 ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, mindezt a 14b. példában leírt módon. ADNS-t 10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA összetételű pufferben oldjuk 0,2 mg/ml koncentrációban.

b) Az IFN-a-3 kódoló szakaszt tartalmazó 0,6 kb EcoRI fragment izolálása a CG-pBR322/HLycIEN(a3)-252 plazmidból pg CG-pBR322/HLycIEN(a-3)-252 plazmidot emésztünk EcoRI restrikciós endonukleázzal. Az emésztés eredményeként egy 3,8 kb és egy 0,6 kb fragmentet kapunk. A 0,6 kb fragmenten található az interferon -a-3 kódoló szakasz. A fragmentet 0,6%-os alacsony olvadáspontú agaróz-gélből izoláljuk Trisborát-EDTA pufferben. A 0,6 kb DNS fragmentet tartalmazó géldarabot kivágjuk és ezt használjuk ligáláshoz.

c) A linearizált, defoszforilezett p31/R DNS és az

IEN-a-3 DNS-t tartalmazó 0,6 kb EcoRI fragment összekötése

1.5 pg, EcoRI enzimmel hasított defoszforilezett p31/R vektor DNS-t hozzákötünk 0,19 pg, az IFN-a3-at tartalmazó, 0,6 kb EcoRI fragmenthez. Az utóbbi fragment 65 ’C-on megolvadó, kisméretű, alacsony olvadáspontú agaróz-gél darabban található. A megolvasztott gélt kétszeresre hígítjuk. A ligálást 220 pl össztérfogatban, 60 mM Tris (pH 7,5) 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű oldatban 800 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) egy éjszakán át 15 ’C-on végezzük. A ligáló keverékből 10 pl-t 100 pl kalcium-ionokkal kezelt, transzformációra kompetens ül· coli HB 101 sejtekhez adunk (lásd 40. példa). 6 transzformált Amp^R telepet külön-külön növesztünk 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid-DNS-t Holmes és munkatársai [50] szerint állítjuk elő, majd a beillesztett szakasz méretének és orientációjának meghatározására BglEZBstEH emésztéssel vizsgáljuk.

Az egyik kiónt ezek közül p31R/IF(a~3) jelöléssel látjuk el.

Ugyanezt az eljárást hajtjuk végre a p31/Y-nal (lásd 24e példa). 6 transzformált, amp^ telepből izoláljuk a plazmidot és elemezzük. A hat telepből kettőben helyes orientációjú a beépített szakasz. Az egyiket p31Y/IF(a-3) jelöléssel láttuk el.

26. példa

Az interf eron-a-2 DNS beépítése a p31/R plazmidba (lásd 36. ábra)

Ebben a szerkezetben a PH05 promotert az érett interf eron-a-2 kódoló szakaszához kötjük.

a) A p31/R vektor 3,9 kb Hindin enzimmel. A puff érhez ezután 0,1 térfogat 1M pH7,5 Tris puffért adunk. A HindlH-mal hasított p31/R DNS-t ezután EcoRI-gyel emésztjük. A 3,9 kb HindlH-EcoRI fragmentet 0,8%-os alacsony olvadáspontú agarózgélből kívágottgéldarabból izoláljuk.

b) A pJDB207/IF(5₁) plazmid 0,9 kb Xbal-HindlH fragmentjének izolálása pgpJDB207/IF2(5j)plazmidDNS-t(lásd 17. példa) teljesen megemésztünk Hindin enzimmel. A pufferhez ezután 0,1 téfogat 1M pH7.9 Tris-puffert adunk. A HindlH-mal hasított plazmidot Xbal-gyel hasítjuk. A 0,9 kb Xbal -HindlH fragment az interferon-a-2 kódoló szakaszának egy részét és az utána következő PH05 transzkripciós terminációs szakaszt tartalmazza. A 0,9 kb fragmentet 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el és kivágjuk a gélből.

c) Az ΪΕΝ-α-2 kódoló szakasz egy részét tartalmazó

252 bp EcoRI-Xbal fragment izolálása a CGpBR322/HLycIFN(a-2)-261 plazmidból

HU 204095 Β pg CG-pBR322/HLycIEN(a-2)-261 plazmid

DNS-t (lásd 23. példa) 100 pl 6 mM Tris (pH7.9),

150 mM nátrium-klorid, 6 mM magnézium-klorid és mM merkapto-etanol összetételű oldatban Xbal enzimmel emésztünk. Miután teljesen megemésztettük Xbal-gyel, a linearizált plazmid DNS-t részlegesen emésztjük 3 egység EcoRl enzimmel (Boehringer). 20 percig tartó 37 ’C-os inkubálás után az emésztést -70 °C-ra hűtéssel leállítjuk. A DNS fragmenteket 1,5%-os agaróz gélen Tris-borátEDTA pufferben (pH 8.3) elválasztjuk. A252bp EcoRI-Xbal fragment tartalmazza az érett ínterferon-a-2 kódoló szakasz 5’ részét (azXbalhelyig), aPH05promoterrelvalókapcsolódáshozszükséges specifikus linkerrel.A252hpfragmentet 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélből kis géldarabban kivágva izláljuk.

d) ADNS fragmentek összekötése A 26 a-c pontokban leírt megfelelő ragadós végekkelrendelkezőháromDNSfragmentetegyreakcióban kötjük össze:

0,67 pg, ap31/Rvektorbólszármazó 3,9 kb HindTHEcoRI fragmentet, 0,16 pg, a pJDB207/IF2(5₁) plazmidból származó 0,9 kb Xbal-ffindüE fragmentet és körülbelül 70 ng, a CG-pBR322/HLydEN(a-2)-261 plazmidból származó 250 bp EcoRI-Xbal fragmentet kötünk össze. Mindhárom DNS fragment alacsony olvadáspontú agaróz-gél darabban van. A három agaróz-gél darabot egyesítjük, 65 ’C-onmegolvasztjuk és háromszorosra hígítjuk. A ligálást 450 pl össztéförgathan 60 mM Tris (pH 7.5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű oldatban 15 ’C-on 16 órán át végezzük 1200 egység T4 DNS-ligázzal. A ligáló keverékből 10 pl-es alikvot részt 100 pl, kalcium-ionokkal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB101 sejtekhez adjuk (lásd 4a. példa).

transzformáit, ampicillin rezisztens telepet külön felnövesztünk 100 pg/ml ampicillin-tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Homles és munkatársai [50] módszerével állítjuk elő és BamHIZHindHI · kettős emésztéssel elemezzük Mindegyik klón azonos emésztési mintázatot mutat. Közülük az egyiket p31RZEF(a-2) jelöléssel láttuk el. ApJDB207/DF2(5₁) plazmid 0,9 kb Xbal-Hindni fragmentje helyett a pJDB207/EF2(5₁)A72 vagy a pJDB207/EF2(5₁)A82 ' plazmidok (lásd 22. ábra) 0,5 kb Xbal-Hindni fragmentjeit is használhatjuk h'gáláshoz. Ezenkívül a p31/Rvektor3,9kbHindnr-EcoRIfragmentjeheIyett a ligálást a p31/Y vektor 3,9 kb HindlH-EcoRI fragmentjével is elvégezzük £

ADNSfragmentekligálásánakésaz.E. co/íHBlOl transzformálásának körülményei a fentiekben leírtakkal azonosak

Mindegyik Iigálásból 12 transzformált, ampicillin rezisztens telepet külön felnövesztünk 100 pg/ml am- £ picillin-tartalmú LB táptalajon. A plazmid DNS-t BamHPHindUI kettős emésztéssel elemezzük A kapott Hónokat p31R/ÍF(a-2)A82, p31Y/EF(a-2), p31Υ/Π?(α~2Δ72 és ρ31Υ/Π?(α-2)Δ82 jelöléssel látjuk el. 6

27. példa

A lűnfoblasztoid interfeon α-l DNS beépítése a p31/Rplazmidba (lásd 37. ábra) a) A p31/R vektor 3,9 kb Hm<HH-EcoRI fragmentjéI nekizolálása pg p31/R vektor-DNS-t a 26a. példában leírt módon Hindin és EcoRl enzimekkel emésztünk A kapott 0,4 kb és 3,9 kb fragmenteket 0,8%-os, alacsony olvadáspontú preparatív agaróz-gélen választjuk el. A ) 3,9 kb HindHI-EcoRI fragmentet a 4a. példában leírt módon kioldjuk a gélből. A DNS-t DE52 (Whatman) ioncserélőkromatográfiával tisztítjuk (lásd 5a. példa), etanollal kicsapjuk és 10 mM Tris (pH8.0), 1 mMEDTA pufferben oldjuk 0,1 mg/ml koncentrációban, i b) A pJDB207/D?2(l ’b) plazmid 0,9 kb PvuH-HindHI fragmentjének izolálása pg pJDB207/IF2(l’b) plazmid DNS-t (lásd 17. példa) emésztünk PvuH és Hindin enzimekkel. A kapott 0,9 kb és 7.3 kb fragmenteket 0,8%-os alacsony ¹ olvadáspontú preparatív agaróz-gélen választjuk el. A 0,9 kb fragmentet a 27a. példában leírt módon oldjuk ki a gélből és tisztítjuk. ADNS-t 10 mM Tris (pH 8.0), mMEDTA összetételű oldatban oldjuk 0,05 mg/ml koncentrációban.

c) Az EFN-α-Ι kódoló szakasz egy részét tartalmazó

286 bp EcoRI-PvuH fragment izolálása a CGpBR322/HLycIEN(a-l)-258 plazmidból pg CG-pB322/HLycIEN(a-l)-258 plazmid DNS-t (lásd 23. példa) emésztünk PvuH és EcoRl enzimekkel. A286 bp restrikciós fragmentet a 4,2 kb fragmenttől 0,8%-os alacsony olvadáspontú preparatív agaróz-gélen választjuk el. A 286 bp EcoRI-PvuH fragmentet a 27a. példában leírt módon oldjuk ki a gélből és tisztítjuk. ADNS-t 10 mM Tris (pH 8.0) mM EDTA összetételű pufferben oldjuk 0,03 mg/ml koncentrációban.

d) ADNS fragmentek összekötése

0,5 pg, a p31/R vektorból származó 3,9 kb HindlHEcoRI fragmentet, 0,25 pg, a pJDB207/IF2(rb) plazmidból származó 0,9 kb PvuH-HindHI fragmentet és 0,1 pg, a CG-pBR322/HLycIEN(a-l)-258 plazmidból származó 286 bp EcoRI-PvuH fragmentet 16 órán át 15 ’C-on20 pl, 60mMTris (pH7,5), lOmMmagnézium-ldorid, 10 mMDTT és 4 mM ATP összetételű oldatban 600 egységDNS-ligázzal kötjük össze. A ligáló keverékből 3 pl-t 100 pl, transzformációrakompetens E. coIFHB 101 sejtekhez adunk (lásd 4a. példa).

transzformált, ampicillin-rezisztens telepet külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban növesztünk. A plazmid DNS-t BamHEHindlH kettős emésztéssel eIemezzük.Egy, l,4kbBamHIfragmentet és 390 bp méretű BamHI-Hindni fragmentet tartalmazó Hónt tovább elemezünk és p3 lR/IF(a-l) jelöléssel látunk el.

Ap31/R vektor 3,9 kbHindlII-EcoRIfragmentjét a p31/Y vektor HmdlH-EcoRI fragmentjével helyettesíthetjük. Ezenkívül a pH)B207/IF2(l’b) plazmid 0,9 kb PvuH-Hindnr fragmentjét a pJDB207/IF2(l’b)A plazmid 0,45 kb PvuH-HmdlH fragmentjével helyettesítjük a ligálásban. A kapott

HU 204 095 Β klónokat a fentiekben leírt módon elemezzük A kiónokat p3 lR/EF(a-l)A, p3 ÍYZIF(a-l) és p3 lY/IF(a-l)Á jelzéssel látjuk el.

28. példa

A gén-szerkezetek szub-klónozása a magas kópiaszámú pJDB207 élesztő-vektorban (lásd 38. ábra)

A 25-27. példákban leírt gén-szerkezetek a PH05 promotert, különböző interferon kódoló szakaszokat és a PH05 transzkripciós terminációs szakaszt tartalmazzák egymás utáni elrendezésben, mindegyik egy pBR322-ből származó vektorba beillesztve. A teljes szakaszt tartalmazó Sáli-Hindin fragmenteket a 17. példában leírt módon a pJDB207 6,2 kb SalI-HindHC fragmenthez kötjük.

μg p31R/IF(a-3) plazmidot Sáli és HindlH restrikciós endonukleázzal emésztünk. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os alacsony olvadáspontú preparatív agaróz-gélen választjuk el. A is, 1,8 kb méretű fragmentet kivágjuk a gélből.

A pHDB207 plazmidot Sáli és HindlH restrikciós endonukleázokkal emésztjük és a nagy, 6,2 kb fragmentet a 17. példában leírt módon izoláljuk.

ADNS fragmentekligálását és a kompetens#, coli HB101 sejtek transzformálását a 17. példában leírt módon végezzük. 8. ampicillin rezisztens telepet külön-külön 100 μg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban növesztünk. A beillesztett szakasz méretének meghatározására a plazmid DNS-t Hindin és Sáli enzimekkel végzett hasítással elemezzük. Egy, a helyes beillesztett szakaszt tartalmazó kiónt kiválasztunk és pJDB207R/EF(a-3) jelöléssel látunk el.

Hasonló módon a p31Y/IF(a-3), p31R/IF(a-2), p31R/EF(a-2)A72, p31R/IF(a-2)A82, p31YHF(a-2), p31Y/IF(a-2)A72, p31Y/IF(a-l), ρ31ΚΖΠ?(α-1)Δ, ρ31Υ/ΕΡ(α-1) és ρ31Υ/ΙΡ(α-1)Δ plazmidokból kiindulva a következő, a megfelelő beillesztett szakasszal rendelkező klónokat nyerjük:

pjDB207YZIF(a-3), pjDB207Y/EF(a-2), pjDB207Y/EF(a-2)A72, pjDB207Y/IF(a-2)A82, pjDB207Y/H’(o'-2), pjDB207Y/H’(a-2)A72, pjDB2O7Y/ÍF(oi-2)A82, pjDB207Y/IF(ct-l), pjDB207Y/IF(a-l)A, pjDB207Y/íF(ct-l),és pjDB207Y/íF(a-l)A

29. példa

Sacharomyces cerevisiae AH220 transzformálása és az interferon-termelés indukciója

A következő plazmidokat: ρΗ)Β207/Π’2(5₁)Δ72, pTOB207^AlF2(5NMR-spektrum (CDC1₃) δ: 1)Δ82, pJDB207/IF(ct/2), pJDB207/DF2(l’b)A, pJDB207R/DF(a3), pJDB207Y/EF(a-3), p3DB2O7R/IF(oi-2), pJDB207R/IF(a-2)A72, pJDB207R/ÍF(a-2)A82, pJDB207Y/IF(a-2), pJDB207Y/ÍF(a-2)A72, pJDB207YZIF(a-2)A82, pJDB207R/IF(a-l), pJDB207R/IF(cz-X)A, pJDB207Y/IF(cí-l) és pJDB207YZIF(a-l)A (lásd 22. és 28. példák) mindegyiket bevisszük Sacharomyyces cerevisiae AH220 (2, trpl, leu2-3, Ieu2-I12, his3, pho5,pho3) törzsbe, a Hűmen és munkatársai [1] által leírt transzformációs eljárás használatával. A transzformáit élesztő-sejteket leucin-mentes élesztő minimál lemezeken szelektáljuk. A transzformált élesztő telepeket izoláljuk és a7. példában leírt módon növesztjük. A különböző élesztő-telepek a következő elnevezést kapják:

Saccharomyces cerevisiae'

AH220/pJDB207JF2(5₁)A72,

Saccharomyces cerevisiae

ΑΗ220/ρΙΟΒ207/Π’2(5₁)Δ82,

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF2(l’b)A,

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF2(a-3),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IF2(a-3),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207/IFRHF(a-2),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207R/IF(a-2)A72,

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207R/IF(a-2)A82,

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207RY/IF(ci-2)_s

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207Y/lF(a-2)A72,

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207Y/IF(a-2)Á82,

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207RHB(a-l),

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pJDB207R/ÍF(oí-l)ASacharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-l) és

Saccharomyces cerevisiae

AH220/pIDB207Y/EF(oí-l)A.

30. példa

Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzs transzformálása és az intereron-termelés indukciója

A 29. példában leírt módszerhez hasonló módon Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (a, his3-ll, his3~ 15, leu2-3, leu2-112, cíwz^r) törzset transzformálunk a 29. példában leírt plazmidokkal. A különböző élesztőtelepek a következő elnevezést kapják:

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB207/DF2(5j)A72,

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pIDB207/n’(5₁)A82,

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB207/IF2(l’b)A

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB207R/EF(a-3)

Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB207Y/IF(ci-3),

Saccharomyces cerevisiae

HU 204095 Β

GRF18/pJDB207RriF(a-2),

Saccharomyces

GRF18/pJDB207R/IF(a-2)A72,

Saccharomyces

GRF18/pJDB207R7IF(a-2)A82,

Saccharomyces

GRF18/pJDB207Y/EF(a-2),

Saccharomyces

GRF18/pJDB207YZEF(a-2)A72,

Saccharomyces

GRF18/pJDB207Y/IF(a-2)A82,

Saccharomyces

GRF18/pJDB207R/IF(a-l),

Saccharomyces

GRF18/pJDB207R/IF(a-l)A,

Saccharomyces

GRF18/pJDB207Y/IF(a-l) és Saccharomyces

GRF18/pJDB207Y/IF(a-l)A.

cerevisiae cerevisiae cerevisiae cerevisiae cerevisiae 10 cerevisiae cerevisiae cerevisiae cerevisiae

31. példa

Élesztő-sejtkivonatok készítése és az interferon titermeghatározása ml tenyészetből származó sejteket (1-2x10 ⁷/ml sejt-sűrűség), Sorvall GSA rotorban 10 percig 25 3000/percfordulatszámmalIecentrifugálunk.Asejteket 2 ml 0,1 M dikálium-hidrogén-foszfátban (pH7.4) szuszpendáljuk és szobahőmérsékleten 5 percig 3000/percfordulatszámmal centrifugáljuk. Aleülepedett sejteket 1,2 ml jéghideg lizáló oldatban [0,1 M kálium-foszfát puffer (pH7.4), 1% (térfogat-százalék) TritonX-100,0,1 mMPMSF (Merck)] szuszpendáljuk és 30 ml-es Corex csőbe visszük át. 1,6 g 0,4 mm átmérőjű üveg-gyöngyöt adunk a sejtekhez és a szuszpenziót Vortex Mixerrel (Scientif ic Instruments Inc., USA) teljes sebességgel 30 másodpercig rázatjuk, majd 1 percig jeges fürdőbe tesszük. Ezt a rázatást 5-10 alkalommal megismételjük, míg a sejteknek több mint 90%-afeltáródik (mikroszkópos megfigyelés szerint). A sejt-törmeléket és az üveggyöngyöket az oldatból eltávolítjuk, 10 perces, 8000/percfordulatszámú4 ’Con cenrtifugálással Sorcall HB-4 rotorban. A félülúszót Eppendorf csövekbe visszük, folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és -60 ’C-on tároljuk. Az interferon aktivitását Armstrong [32] eljárásával határozzuk meg, emberi CCL-23 sejteket és fertőző kórokozókénthólyagos szájgyulladás (VSV) vírusthasználva. Az eredményeket az 5. Táblázat-ban foglaljuk össze.

Rekombináns plazmiddal való transzformálás után az interferon aktivitás a Saccharomyces cerevisiae AH220 és GRF18 törzsekben általában azonos. A 6. Táblázat-ban az interferon aktivitásokat mutatjuk be, a példaként megadott plazmidokkal transzformálva mindkét törzset.

Interferon aktivitás a Saccharomyces cerevisiae AH220 törzsben a következő rekombináns plazmidokkal történt transzformálás után:

5. Táblázat

Plazmidok	Példa sorsz.	Interferon aktivitás
egység/ml élesztő sejtldvonat	egység/ml élesztő sejt-tenyészet
pJDB207/IF(8’1)	17	1.107	2.108
pJDB207R/IF(a-3)	28	1.108	2.109
pIDB207Y/IF(a-3)	28	1.108	2.109
pJDB207/IFl(51)	17	7.105	1.4.107
pJDB207/IF2(5I)	17	5.105	1.0.107
pJDB207/IF3(51)	17	3.103	6.3.104
pJDB207/IF2(51)A72	22	5.105	1.107
pJDB207/IF2(51)A82	22	5.105	1.107
pJDB207R/EF-
-(pJDB207/lF2(51)a-2)	28	1.107	2.108
pJDB207R/IF(a-2)	28	1.107	2.108
pJDB207R/IF(a-2)A82	28	’ 1.107	2.108
pJDB207Y/IF(a-2)	28	1.107	2.108
pJDB207Y/IF(ioa-2)A72	28	1.107	2.108
pJDB207YZEF(ct-2)A82	28	1.107	2.108
p]DB207/IF2(l’b)	17	4.103	8.104
pJDB207/IF2(l’b)A	22	1.103	2.104
pJDB207R/EF(a-l)	28	5.104	1.106
pJDB207R(a-l)A	28	4.104	8.105
pJDB207Y/DF(a-l)	28	5.104	1.106
pTOB207Y(a-l)A)	28	4.104	8.105

HU 204095 Β

Az interferon aktivitás összeashonlítása S.cerevi- kombinánsplazmidokkal történt transzformálás után:

siae AH220 és GRF18 törzsekgben a kökvetkező re6. Táblázat

Plazmidok	Interferon aktivitás (egység/ml élesztő tenyészet)
AH220	GBF18
pJDB207/IF(8’1)	2.108	2.108
pJDB207R/DF(a-3)	2.109	2.109
pJDB207/IF(51)	1.107	9.106
pJDB207R/IF(a-2)	2.108	2.108
pJDB207R(a-2)Á82	. 2.108	2.108

32. példa

Interferon-a-2 előállítása a 300 literes térfogatban Saccharomyces cerevisiae rekombináns élesztőtörzzsel

A GRF18/p.IDB207R/IF(a-2)A82 Saccharomyces cerevisiae törzs a gazdaszervezetben való szelektív fennmaradását biztosító leucin gént, a humán interferon-a-2 strukturfént és a PH05 savas foszfatáz promotert tartalmazó plazmidot hordoz, mely lehetővé teszi azIFN-a-2 gén kifejeződését limitáló mennyiségű szervetlen foszfátot tartalmazó táptalajon.

A törzset a plazmid fennmaradását biztosító leucin-mentes, kémiailag meghatározott Összetételű ferde-agar tenyészetek formájában tartjuk fenn. A frissen oltott ferde-tenyészeteket 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk Egy ferde-tenyészetet 3 ml eló'tenyésztő táptalajban szuszpendálunk, majd az első, elő-tenyésztő rázott lombikba visszük. Az500 ml-es lombikban egy torló-lemez van és 100 ml, a következő összetételű elő-tenyésztő táptalajt tartalmazza (értéket g/1ban):

Élesztő-kivonat (Difco) 10,0: L-aszparagin 6,6; kálium-dihidrogén-foszfát 1,0; két kristályvizes magnézium-szulfát l,0;L-hisztidin 0,02; ésD-glükóz (monohidrát) 33,0. Az ionmentesített vízben készített táptalaj pH-ja körülbelül 6.0. A glükózt külön sterilezőik. Az első elő-tenyészetet 24 óráig 30 °C-on körkörös rázóberendezésen/5 cm kitérés, 250/perc fordulatszám) inkubáljuk.

Az első elő-tenyésztő lombik szolgál a második előtenyésztő lombikok oltóanyagaként. Ezek a lombikok 1 térfogatszázalék oltóanyagot kapnak A táptalaj és az inkubálás körülményei azonosak az első elő-tenyésztésével. 36 ilyen lombikból származó tenyésőevet egyesítünk, így kapunk 1 térfogatszázalék inkulumot a termelő fő-fermentorhoz.

A termelő fermentor össztérfogata körülbelül 500 liter, 4 íorlólemez van benne és egyetlen, 230 mm átmérőjű hatlapú turbinakeverő. A keverő fordulatszáma 450 fordulat/perc, a tőlnyomás 0,3 bar, a levegőztetés 1 térfogat levegő/térfogat fermentlé percenként (v/v-min). Afermentor 300 liter következő összetételű (értékek g/literben) táptalajt tartalmaz: L-aszparagin 2,0; L-hisztidin 0,02; kálium-dihidrogénfoszfát 0,03; két kristályvizes magnézium-szulfát 0,5; nátrium-klorid 0,1; két kristályvizes kalcium-klorid

0,1; kálium-klorid 1,0; B-gíükóz (monohidrát) 20.0; vitamin-oldat 5 ml/1, nyomelem oldat 5 ml/1. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,2-re állítjuk nátrium-hidroxiddal. A gülkózt, vitaminokat és a nyomelemeket külön sterüezzük és adjuk a táptalajhoz. A vitamin és nyomelem törzsoldatok összetétele a következő (g/liter-ben): Vitaminok-biotin 0,0002; kaícium-D-pantotenát 0,04; fólsav 0,0002; nilcoíinsav 0,04; p-aminobenzoesav 0,02; piridoxin-hidroldorid 0,04; riboflacin 0,02; tiamin-hidroldorid 0,04; mozit 0,2 egy liter ion25 mentes vízben; nyomelemek - bórsav 0,05; öt kristályvizes réz(H)-szulfát 0,004; kálium-jodid 0,01; hat kristályvizes vas(ffl)-ldorid 0,02; négy kristályvizes mangán(H)-szulfát 0,04; két kristályvizes dinátriummolibfenát 0,02 és hét kristályvizes cink-szulfát 0,04 egy liter ionmentes vízben. A fermentáció hőmérséklete 30 °C.ApH értéke körülbelül 4,0-4,2között áll be, de kívánságra közbenső értékre is lehet szabályozni nátrium-hidroxiddal. A maximális interferon-menynyiséget körülbelül 18 órás fermentáció után érjük el (a meghatározást Armstrong és munkatársai [32j módszerével végezzük. Az optikai sűrűség (körülbelül 2,0 értéket és el) és a savas foszfatáz aktivitás hasznos mutatói a fermentáció előrehaladásának. Az élesztősejtek kinyerése előtt szükség esetén 10 °C-rahűtjüka fermentlevet.

33. példa

AHLyIFN-a-2 kinyerése és tisztítása a) Polipeptid-oldat készítése a monoklonális antitest oszlophoz

600 liter össztérfogatú, 4,1-es pH-jú tenyészlevet 10 “C-ra hűtünk. A sejteket Alfa-Laval BRPX-207 iszapmentesítő centrifugával nyerjük ki. A tiszta felűlúszónak nincs ffiN-aktivitása. A sejtek között ma50 radtfelülúszót 20 literAlizáló pufferrel (lOOmMkálium-dihidrogén-foszfát, 500 mM nátrium-klorid 0,1 térfogati Triton-x 100 és 0,1 mM PMSF, a pH-t kálium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk) kimossuk. A centrifuga-poharak (7 liter) tartalmát teljes iszap-mentesítés55 sel eltávolítjuk és az iszap-mentesítőt egyszer mossuk 5 liter Alizáló pufferrel. A kapott sejt-tömeget A pufferral 60 literre hígítjuk, pH-ja 7.3. A szuszpenziót 510 °C-ra hűtjük és 100 l/ó táplálási sebességgel DYNO-malmon (KD5 típusú) engedjük keresztül. A malom poliuretán kevero-lemezekkel van felszerelve,

HU 204095 Β

4200 ml 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyöngyöt tartalmaz és 1625/percfordulatszámmalműködik Afeltárt sejt-szuszpenziót (pH-7.3) azelőzőekbenleírtmódon lecentrifugáljuk. Afelülúszót (751) ultraszűréssel betöményítjük. Ebből a polipeptíd oldatból 300 ml-t H1P100 üreges szűrő-tölteten engedjük keresztül Amicon DC-2 Hollow Fibre System használatával. A sűrítményt DEAE-Trisacryl^R MDEAE oszlopra adszorbeáljuk (LKB Ltd.). Az oszlopot mossuk, majd C pufferrel (200 mM nátrium-klorid, 25 mM Tris-HCl pH 8.5) eluáljuk Az eluátum interferon aktivitása 1.4xl0⁶ NE/mgpoIipeptid, Armstrong [32] módszerével vizsgálva. Az eluátumot a monoklonális antitest oszlopon végzett további tisztítás előtt-20 'C-on tároljuk

c) Az emberi LyEFN-a-2 tisztítása monoklonális antitest oszlopon

Az NK2 monoklonális antitest oszlopot (gyártja CELLTECH LK) (ágytérfogat 20 ml) 20 mM nátrium-foszfát, 154 mM nátrium-klorid, pH 7.4 oldattal hozzuk egyensúlyba és a fenti polipeptíd oldat részleteit50ml/órasebességgelszobahőmérsékleten visszük az oszlopra. A nemadszorbeált polipeptideket és a 100 ml PBS mosófolyadékot tartalmazó első frakciókat kiöntjük A további, nem specifikusan kötött polipeptideket 110 ml, 0,5 M nátrium-kloridot és 0,2% TritonX 100-t tartalmazó PBS oldattal mossuk le. Az oszlopot ezután 200 ml 20 mM nátrium-foszfát, 0,3 M nátrium-klorid pH 7.4 összetételű pufferrel mossuk, majd aspecifikusankötött pilipeptideket 50 mlD pufferrel (0,1 M citromsav, 0,3 Mnátrium-klorid, pH2,0) távolitjuk el az oszlopról. Az oldat pH-ját 2 N nátrium-hidroxiddal 6,3-ra állítjuk és 4 °C-on bemeriilős

CX™ molekula szeparátorral (Millipore) besűrítjük A sűrítményt 0,025 M hisztidin-hidroldorid-dal (pH 6.3) egyensúlyba hozott Sephadex G-25^R finom szemcsézetű oszlopra visszük (2,6 x 34 cm, 200 ml- ágytér5 fogat). Az oszlopotugyanezzel a hisztidín-hidroklorid pufferral mossuk 4 °C-on 42 ml/óra áramlási sebességgel. 20 db 10.5 ml térfogatú frakciót gyűjtünk Apolipeptid-tartalmú frakciókat 280 nm-en mért elnyelésük alapján azonosítjuk A 7. és 8. frakció tartalmazza 10 az IFN aktivitással rendelkező polipeptidet Armstrong [32] módszerével viszgálva. A LyIFN-a-2 tartalmú aktív frakciókat további felhasználásig -20 *C-on tároljuk

A frakciók IFN aktivitása 1,8.10⁸ NE/mgpolipep15 tid [32], A fenti frakciókat liofilizálva 1 ml oldatból 20-40 pgpolipeptidetnyerünkki.

SDS-poliakrilamid gél-elektroforézissel [53] a kapott LyIFN-a-2 molekulatömegére körülbelül 18 kDaltontkapunk

34. példa

Interferon kiválasztása transzformált élesztő sejtekből a táptalajba

Az N-terminális fehérje szignál-szakasznak a fe25 hérje-kiválasztásra gyakorolt hatásának meghatározására az S.cerevisiae GRF 18/pJDB 207/03(8½) törzset (hibrid szignál-szakaszt tartalmaz, lásd 17. példa) és a S.cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-3) törzset (szignál-szakasz nélkül) a 28. példában leírt módon 30 növesztjük A keletkezett interferon mennyiségét a táptalajban, valamint a sejt-kivonatokban meghatározzuk (a 31. példa szerint készített sejt-kivonat) és az eredményeket a 7. Táblázatban mutajtukbe.

7. Táblázat

A transzformált S.cerevisiae GRF18 törzsek összehasonlítása a táptalajba való interferon-kiválasztás szempontjából

S cerevisiae törzs	Inteferőn aktivitás (egység/1 élesztő tenyészet)
Sejt-kivonat	Táptalaj
GRF18/pJDB20-R(a-3)	1.5.109	3.104
010718^106207/03(8½)	2.108	2.107

IRODALOMJEGYZÉK

1. A Hinnen et al., „Transformation of yeast”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA75,1929 (1978)

2. JD. Beggs, „Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid”,Nature 275, 104 (1978)

3. J. Hicks et al., „Properties of yeast transzformati- 50 on, Cold Spring harbor, Symp. Quant. Bioi. 43, 1305(1979)

4. KStruhl et al., ,High-frequency transformation of yeast; autonomous replication of hybrid DNA moleculas”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,1035 55 (1979)

5. RA Hotueman et al., .Expression of a humán gene fór interferon in yeast”, Natúré 293, 717 (1981)

6. JU. Beggs et al.,, Abnormal expression of chro- 60 mosomal rabbit β-globin gene in Saccharomyces cerevisiae”, Natúré283,835 (1980) . 7. R. Axel, „The use of eukaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials”, PCT patent application 8102425.

8. JA Carbon et al., „DNA capable of replication and stable mitotic maintenance in a hőst eukaryote, method of preparation thereof and eukaryotic cell containing same”, European patent application 48081 (The regents of the University of Califomia)

9. D.T. Stinchcomb et al., .Eukaryotic autonomoudy replicating segment, European patent application 45573 (The board of tristees of Leland StanfördJunior University)

10. .Elasmidvektoren, Hybridplasmide und ihre Ver36

HU 204095 Β wendung zűr HersteUung von Proteinen”, Germán Offenlegungschrift 2 923 297 (Ihtitut Pasteur)

11. „Procédé de production de protéines pár expression des génes correspondants dans des microorganismes et vecteurs susceptibles d’étre mis en oeuvre dans de tels procédés, French Patent applícation 2 458 585 (Institut Pasteur)

12. M. Aigle et al., „Nouveaux plasmides hybrides et microorganísmes les contenant”, European patent apllication 11562 (Agence nationale devalorisationdelarecherche)

13. A Schurr et al., I Gén. Microbiol. 65,291 (1971) and A. Toh-e et al., Mól. Gén. Génét. 162, 139 (1978)

14. P, Mildner et al., Biochim. Biophys. Acta 429,274 (1976)

15. AM. Maxam et al. in „Methods in Enzymology”, vol. 65, p.499,NewYork 1980

A. Hinnen et al., „Vectors fór clonin in Yeast”, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 96,101 (1982)

A. Hinnen et al, in „Eukariotic Gene Regulation”. vol. 14, p. 43, NewYork 1979

18. „Genetic Engineering” (ed. A.M. Chakrabarty), West Palm Beach 1978

19. J.Lodder, „The Yeasts”, Amsterdam 1971

20. M. Grinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961(1979)

21. A. Jimenez et al., Natúré 287,869 (1980)

22. T. Staehelin et al., J. Bioi. Chem. 256,9750 (1981)

23. M.V. Olson et al., J. Mól. Bioi. 132,387 (1979)

24. H.Meyer,EEBSLett.9ö, 341 (1978)

25. B. Hohn et al. in „Genetic Engineering”, vol. 2, p. 169,New York 1980

26. B. Hohn in „Methods in Enzymology”, vol. 68, p. 299, NewYork 1979

27. N.Mantei et al., gene 10,1 (1980)

28. J.D. Beggs in „Genetic Engineering”, vol. 2, p. 175, NewYork 1981

29. M.Mandeletal„ J.Mol.Biol. 55,159 (1970)

30. J.H. Miller, „Experiments inMolecular Genetics”, Cold Spring Harbor 1972

31. A. Toh-e, etal., LBacteriol, 113,727 (1973)

32. JA Armstrong, Appl. Microbiol. 21,723 (1971)

33. JJB. Gurdon, J. Embryol. Exp. Morph. 20,401-414 (1968)

34. Barth, J. Embryol. Exp. Morph, 7,210-222 (1959)

35. A Colman, CeU 17,517 (1979)

36. A Efstratiadis et al., CeU4,367-378 (1975)

37. T. Maniatis et al., CeU 8,163-182 (1976)

38. J.HJ. Hoeijmakers et al., Gene 8,391-417 (1980)

39. AC. Peacock etal.,Biochemistryő, 1818 (1967)

40. K Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97 7327 (1975)

41. J.FM.deRooij etal.,Recl.Tranc.Chim.Pays-Bas 98,537-548(1979)

42. W.MueUeretal., J.MoLBiol. 124,343 (1978)

43. D.V.Foeddel etal.,Natúré 290,20(1981)

44. C. Weissmann, European patent applícation No.32134 (BiogenN.V.)

45. T.Taniguchietal., Gene 10,11 (1980)

46. MStreuli etal., Science 209,1343 (1980)

47. Perlman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,781 (1982)

48. AJ. Berk et al., CeU 12,721-732 (1977)

49. J. Messing, In the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA (ed. A Watton), Elsevier, Amsterdam 1981,pp. 143-153

50. D.S. Holmes et al., AnaLBiochem. 114, 193-197 (1981)

51. N.M. Goughet al., J.MoLBiol. 162,43-67 (1982)

52. Pasek etal., Natúré282,575-579 (1979).

53. U.K.Laemmli, Natúré 227,680-685 (1970),

Claims (5)

1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK

   1. Eljárás élesztő savas foszfatáz promoter és kívánt esetben az élesztő savas foszfatáz promoterhez kapcsolódó megfelelő savas foszfatáz fehérjét kódoló szakasz szignál-szakaszát vagy annak egy részét tartalmazó DNS fragmens, valamint promotor funkciót megtartó muntásainak előállítására, azzal jellemezve, hogy

   1) savas foszfatáz gént tartalmazó vad élesztő génbankból származó plazmid DNS-sel savas foszfatáz hiányos élesztő törzseket transzformálunk és a helyreállított savas foszfatáz funkció alapján az említett gént izoláljuk,
2. 2) a kapott savas foszfatáz gént szub-ldónozzuk és
3. 3) a fenti szub-ldónokban meghatározzuk a promoterrégió helyét és a savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmenseket izoláljuk, és kívánt esetben a szomszédos DNS szakaszokat módosítjuk. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a PH03 promotert tartalmazó DNS fragmenst vagy promoter funkciót megtartó mutánsait izoláljuk. (Elsőbbsége: 1982,08.09.)

   3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a PH05 promotert tartalmazó DNS fragmenst vagy promoter funkciót megtartó mutánsait izoláljuk. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő savas foszfatáz promotert a megfelelő savas foszfatáz fehérjét kódoló DNS szakasz szignál-szakaszával együtt vagy ennek az

   1-3. igénypontok szerinti, promoter funkciót megtartó mutánsait izoláljuk. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott élesztő savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmenst a szomszédos DNS szakasz lerövidítésére restrikciós endonukleázzal vagy exonuldeázzal emésztjük, anélkül, hogy a promoter funkciót érintenénk. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott, az élesztő savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmenst egy restrikciós endonukleáz felismerési helyét tartalmazó kémiai úton szintetizált linker-molekulához kötjük. (Elsőbbsége: 1983.08.08.)

   7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott, az élesztő savas foszfatáz promotert tartalmazó DNS fragmenst exonuldeázzal emésztjük és a

   HU 204095 Β kémiai úton szintetizált linker-molekulához kötjük a savas foszfatáz mRNS-ének starthelye és a savas foszfatáz kódoló szakaszának ATG bázistriplettje között(Elsőbbsége: 1983.08.08.)

   8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy EcoRI restrikciós helyet tartalmazó, kémiai úton szintetizált linkermolekulát használunk(EIsőbbsége: 1983.08.08.)

   9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10

   ATCCCAAAGTTGTATTCAACAAGAATCGG CAAATATGTCAACGTAACGTATTTGGAAGT CATCTrATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCA TGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAAC GAAGGTAAAAGGTTCATACGCGTmTCnT 15 GTCTGCACAAGAAATATATATTAAATTAGC ACGTTTTCGGATAGAACGCAACTGCACAAT GCCAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGT TAAITGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCG ATACAACCITGGCACTCACACGTGGCACrA 20 GCACAGACTAAArrTATGATrCTGGTCCCTG TTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATC AAAITGGTCACCrTACrTGGCCAACGCATAT ACCCATTTGCCATAAGGGGTAAACATCHTG AATTGTCGAAATGAAACGTATATATAACGC 25 GCTGATGITTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATG GCITCATCrCTCATGAGAATAAGAACAACA ACAAATATAGAGCAGCAAGCAAATTCGAGA TTAXXAATGTTrAAATCTGTTGTTTATTCAAT TTTAGCCCGCTTCTTTGGCCAATGCAGGTAC 30 CATTCCCTTAGGCAAACTAGCCCATG o nukleotid-sorrendű DNS fragmenst vagy az 1. igénypont szerinti promoter funkciót megtartó szubfragmenseit vagy mutánsait állítjuk elő.(Elsőbbsége: 1983.08.08.) 35

   10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,hogy

   GAGATATCCCGAAACAGGTAAATGGATG TTTCAATCCCTGTAGTCAGTCAGGAACCCAT ATTATATTACAGTATTAGTCGCCGCTTAGGC 40 ACGOCITAATTAGCAAATCAAACCITAAGT GCATATGCCCGTAIAAGGGAAACTCAAAGA ACTGGCATCGCAAAATGAAAAAAAGGAAG AGTGAAAAAAAAAAATTCAAAAGAAATTTA CTAAATAAIACCAGIITGGGAAATAGTAAA 45 CAGCITTGAGTAGTCCTATGCAACATATATA TAAGTGCTTAAATITGCTGGATGGAAGTCA ATTATGCCTTGATTATCATAAAAAAATACTA GAGTAAAGAAAGGGCCATTCCAAATTACCT ATGTTTAAGTCTGTTGTTTATTCGGTTCIAGC 50 CCGCTGCTTTAGTTAATGCAGGT nukleotid-sorrendű DNS szakaszt vagy az 1. igénypont szerinti promoter-funkciót megtartó szubfragmenseit vagy mutánsait állítjuk elő. (Elsőbbésge: 1983.08.08. 55

   11. A9.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

   GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATG CGCAAATAIGTCAACGTATITGGAAGTCATC ITATGTGTCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGT 60

   AAGCGGACGTCGTCTATAAACnCAAACGA

   AGGTAAAAGGTTCATAGCGCTITrTCTTTGT

   CTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCA

   CGTTTTCGCAATCrCTCTAAATGAATCGATA

   CAACCITGGCACTCACACGTGGGACTAGCA

   CAGACrAAATTTATGTATTCTGGTCCCCTGIT

   TTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATC

   AAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATAT

   ACCCATTTGGCATAAGGTAAACATCTITGAA

   TTGTGCGAAATGAAACGTATATAAGCGÓCT

   GATGTnTGCTAAGTCGAGCITAGTATGGCT

   TCATCTCTCCATGAGAATAAGAACAACAAC

   AAATAGAGCAAGCAAATTCGGG, vagya

   GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATG CGCAAATAGTGCAAGCTATTTGGAAGTCAT CTTATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGT AAGCGGACGTCGTCTATAAACnCAAACGA AGGTAAAGGITCATAGCGCTnTTCITrGTC TGCACAAAGAAATATATATTAAATEAGCAC GTTTTCGCATAGAACGCAACIGCACAATGC CAAAAAAGTAAAAGTGAITAAAAGAGTTAA TIGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATA CAACCITGGCACTCACACGTGGGACrAGCA CAGACrAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTITT CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAA TTGGTCACCTTACITGGCAAGGCATATACCC ATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTTGAATTG TCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTGATGT TTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGGCnCATC TCTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAG AGCAAGCAAATTCGAGATTAGG, nukleotid sorrendű DNS fragmenst állítunk elő. (Elsőbbége: 1983.08.08.)

   12. Eljárás az 1—11. igénypontok bármelyike szerinti élesztő savas foszfatáz promotert és a promoter által szabályozott élesztő vagy nem-élesztő polipeptid-kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely vektor DNS-be az 1-11. igénypontok bármelyike szerint előállított élesztő savas foszfatáz promotert és élesztő vagynem-élesztő polipeptid kódoló szakaszt és kívánt esetben egyéb transzkripciós, transzlációs, replikációt szabályozó szakaszokat és markergént építünk be, élesztőtörzsbe transzformáljuk, és a keletkező hibrid vektort kiválasztjuk (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibrid vektort a következő lépésekben állítjuk elő:

   1) vad-típusú élesztő DNS-ből élesztő génbankot készítünk

   2) izoláljuk a savas foszfatáz gént és baktériumvektorba vagy annak biológiailag funkcióképes fragmentjébe klónozzuk majd kívánt esetben a lényegtelenDNS szakaszokat kivágjuk a vektorból,

   3) az említett vektorba élesztő merkerként és élesztő replikációs origót építünkbe,
4. 4) élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló DNS szakaszt építünk be olyan módon, hogy a savas foszfatáz promoter szabályozza a polipeptidet

   HU 204095 Β kódoló szakaszt, és
5. 5) kívánt esetben a polipeptidet kódoló szakasz után transzkripciós terminációs jelet tartalmazó DNS szakaszt építunkbe, ahol a 3-5. lépések sorrendje felcserélhető. (Elsőbbége: 1983.08.08.)

   14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibird vektor előállítása során a lényegtelen szakaszokat kivágjuk a 2. lépésben nyert vektorból. (Elsőbbége: 1983.08.08.)

   15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejeződésben kívülről szabályozható savas foszfatáz gént izolálunk a 2. lépésben. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hpgy a hibrid vektorba savas foszfatáz promoterként &PH03 promotert építjük be. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   17. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hqgy a hibrid vektorba savas foszfatáz promoterként a PH05 promotert építjük be. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   18. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibrid vektorba az élesztő vagy nem élesztő fehérjét kódoló szakaszként humán interferont kódoló szakaszt építünk be. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   19. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibrid vektorba az élesztő vagy nem-élesztő fehérjét kódoló szakaszként hepatitisz B vírus antigént kódoló szakaszt építünk be. (Elsőbbsége:

   1982.12.31.)

   20. A12-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hibrid vektort álltunk elő, melynél baktérium-plazmidból, és/vagy élesztő kromoszómális DNS-ből származó járulékos DNS szakaszokat építünk be a hibridvektorba. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektort állítunk elő, melybe replikációs origót és szelekcióra használható gént tartalmazó élesztő kromoszómális DNS-t építünk be. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   22. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektort állítunk elő, melyben az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakaszok után egy élesztő génből származó transzkripciós terminációs jelet tartalmazó DNS szakaszt építünk be. (Elsőbbsége: 1982.08.12.31.)

   23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektort állítunk elő, amelybe e.PH05 gén transzkripciós terminációs jelét építjükbe. (Elsőbbsége: 1982.12.31.)

   24. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektort állítunk elő, melybe az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakasz elé a savas foszfatáz gén szignálszekvenciáját építjükbe. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   25. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektort állítunk elő, melyben az élesztő vagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakaszt a savas foszfatáz promoter szakaszhoz kötjük a savas foszfatáz mRNS kezdete és a savas foszfatáz kódoló szakasz ATG bázistriplettje között. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   26. A 12. igénypont szerinti eljárás interferon kifejeződésre képes p30IFN2(8’₁), p30IFN2’(8’₁) vagy pJDB207/IFN2(’8’₁) plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti plazmidokat választjukki. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   27. A12. igénypont szerinti eljárás hepatitis B vírus antigén kifejezésére képest pJDN207/PH05/HBV5/HBVsA14 és pJDB207/PH05/HBVsA14t plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti plazmidokat választjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.31.)

   28. A 12. igénypont szerinti eljárás interferonok kifejeződésére képes pJDB207/IF(8’₁), pH)B207/lF25₁), pJDB207/DF2(l’b), p31R0F(ct2)Δ82, pJDB207/lF2(5₁)A72, pJDB207/BF2(5₁)A82, p31RTF(a-3), p31Y/IF(a-3), p31R/IF(a-3), _P31RTF(a-2)A72, p31Y/IF(a-2), ρ31Υ(α-2)Δ72, ρ31Υ(α-2)Δ82, p31RűF(a-l), ρ31ΚΛΡ(α-1)Δ, ρ31ΥΖΠ?(α-1), ρ31Υ/ΙΡ(α-1)Δ, pJDB207/IF(a-3), pJDB2O7RTF(oí-2), pJDB207RTF(a-2)A72, pJDB207Y(c-2), ρΠ)Β207Υ/ΙΕ(α-2)Δ72, ρΠ)Β207Υ/ΪΡ(α-2)Δ82, pJDB207R/IF(a-l), pJDBR/IF(a-l)A, pJDB207YZIF(a-l) és pJDB207Y(o:1)Δ, plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti plazmidokat választjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.31)

   29. A 12. igénypont szerinti eljárás interferonok kifejeződésére képes pJDB207R/EF(a-3) és pJDB207F/IF(a-2)A82 plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kor szerinti plazmidokat választjukki. (Elsőbbsége: 1983.06.02.)

   30. Eljárás élesztő savas foszfatáz promotert és kívánt esetben a promoter által szabályozott élesztővagy nem-élesztő polipeptidet kódoló szakaszt tartalmazó hibrid vektort tartalmazó élesztő transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 12-28. igénypont szerint előállított hibrid vektorral élesztő sejteket transzformálunk és a transzformánsokat kiválasztjuk. (Elsőbbsége:

   1982.12.31.)

   31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Saccharomyces cerevisiae élesztőt transzformálunk. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   32. A 30. igénypont szerinti eljárás interferonok kifejezésére képes Saccharomyces cerevisiae RH 971/p301FN2(8’₁), Saccharomyces cerevisiae RH 9714)302^42^84) és Saccharomyces cerevisiae RH 971/pJDB207/IFN2’(8’₁) élesztő transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti transzformánsokat választjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)

   33. A 31. igénypont szerinti eljárás HBV vírus antigén kifejezésére képes Saccharomyces cervisiae AH220/pJDB207/PH05/HBVsA14 és Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/PH05/HBVsA14 élesztő transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy

   HU 204095 Β a tárgyi kör szerinti transzformánsokat választjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.31.)

   34. A 31. igénypont szerinti eljárás interferon kifejezésére képes Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF(8’₁), Saccharomyces cerevisiae AH220/plDB207/IE2(5_I),

   Saccharomyces cerevisiae

   AH220/pJDB207/IE2(lh),

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a3),

   Saccharomyces cerevisiae

   ΑΗ220/ρΠ)Β207(5₁)Δ72,

   Saccharomyces cerevisiae

   AH220/pJDB207/IF2(5₁)A82,

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(cc2),

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a2)Δ72,

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a2),

   Saccharomyces cerevisiae ΑΗ220/ρΠ3Β207ΥΖΠ?(α2)Δ72,

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a2)Δ82,

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(aI),

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a1)Δ,

   SaccharomycescerevisiaeAH220/pJDB207Y/IF(a1),

   Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(o'1)Δ,

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/pJDB207/IF2(5₁)A72,

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/pJDB207/IF2(5₁)A82,

   Saccharomyces cerevisiae

   GRP18/pJDB207Y/IF(a-3),

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/p3DB207RŰF(a-2),

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/pJDB207R/IF(a-2)A72,

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/pJDB207YZIF(a-2),

   Saccharomyces cerevisiae

   GSF18/pJDB207Y/IF(a-2)A72,

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/p]DB207R/IF(a-2)A82,

   Saccharomyces cerevisiae

   GRF18/pJUB207RJF(a-l)A,

   Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207YZEF(al)és

   Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a1)Δ

   10 élesztő transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti transzformánsokat választjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.31.)

   35. A 30. igénypont szerinti eljárás interferonok

   15 kifejezésére alkalmas Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/DF(a-3) élesztő transzformáns előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti transzformánst választjuk ki. (Elsőbbsége: 1983.06.02.)

   20 36. A 30. igénypont szerinti eljárás interferonok kifejezésére alkalmas Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2) élesztő transzformáns előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti transzformánst választjuk ki. (Elsőbbsége:

   25 1982.06.02.)

   37. A 31. igénypont szerinti eljárás interferonok kifejezésére alkalmas Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-3) élesztő transzformáns előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör

   30 szerinti transzformánst választjuk ki. (Elsőbbsége: 1983.08.08.)

   38. A 30. igénypont szerinti eljárás interferonok kifejezésére alkalmas Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2) élesztő transzformáns

   35 előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kor szerinti transzformánst választjuk ki. (Elsőbbsége: 1983.08.08.)

   39. A 30. igénypont szerinti eljárás élesztő transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy

   40 (1) az élesztő sejtfalat eltávolítjuk, (2) a kapott szferoplasztokat a transzformáló DNS-sd kezeljük polietilén-glikol és kalcium-ionok jelenlétében és (3) a sejtfalat regeneráljuk és a transzformált sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1982.08.09.)