FI80720B - Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider. - Google Patents

Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider. Download PDF

Info

Publication number
FI80720B
FI80720B FI832825A FI832825A FI80720B FI 80720 B FI80720 B FI 80720B FI 832825 A FI832825 A FI 832825A FI 832825 A FI832825 A FI 832825A FI 80720 B FI80720 B FI 80720B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dna
yeast
plasmid
promoter
fragment
Prior art date
Application number
FI832825A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI832825A0 (fi
FI80720C (fi
FI832825A (fi
Inventor
Francois Meyer
Albert Hinnen
Bernd Meyhack
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB838315145A external-priority patent/GB8315145D0/en
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of FI832825A0 publication Critical patent/FI832825A0/fi
Publication of FI832825A publication Critical patent/FI832825A/fi
Publication of FI80720B publication Critical patent/FI80720B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI80720C publication Critical patent/FI80720C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

80720
Saccharomyces cerevlslae-yhdistelmävektorit ja niiden käyttö polypeptidien valmistamiseksi - Saccharomyces cerevl-slae-hybridvektorer och deras användning för framställning av polypeptider
Keksintö koskee DNA-palasia, jotka sisältävät hiivan happamen fosfataasin geenin eli happofosfataasigeenin PH05-promoottorin ja mainitun promoottorin sisältäviä yh-distelmävektoreita, jotka kykenevät transformoimaan Saccharomyces cerevisiae-soluja. Keksintö tarjoaa myös menetelmiä mainittujen DNA-palasten, mainittujen yhdistelmä-vektorien ja niillä transformoitujen S. cerevisiae-solujen valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikkaa soveltamalla. Edelleen keksintö koskee menetelmää sellaisten polypeptidien valmistamiseksi, jotka ovat mainittujen yhdistel-mävektorien sisältämien liitännäisten koodittamia, ja jotka ovat hyödyllisiä hoidettaessa ihmisillä ja eläimillä esiintyviä sairauksia, sekä näiden johdannaisten valmistamiseksi .
Yhdistelmä-DNA-tekniikan kehityksen myötä on tullut mahdolliseksi tuottaa ohjatusti mikrobien avulla hyödyllisiä polypeptidejä, erityisesti sellaisia, joilla on mielenkiintoa lääketieteelliseltä kannalta. Suurin osa yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla viime aikoina tapahtuneesta työstä koskee prokaryoottisia organismeja. Menetelmät ovat kehittyneet tarkoiksi ja koetelluiksi niin, että näihin organismeihin voidaan siirtää DNA:ta, joka koo-dittaa eukaryoottisia proteiineja. Useita bakteerilaje-ja, erityisesti Escherichia coli-kantoja, jotka on muunnettu tämän uuden tekniikan avulla, on nyt tarjolla ja niillä on mahdollista tuottaa kaupallisessa mittakaavassa erittäin tärkeitä polypeptidejä, kuten insuliinia, ihmisen leukosyytti- ja fibroblasti-interferonia ja ihmisen kasvuhormonia .
2 80720
Kuitenkin tulevaisuudessa tulee moniin tarkoituksiin olemaan toivottavaa tai tarpeellista käyttää eu-karyoottisia systeemejä valmistettaessa proteiineja, erityisesti farmakologisesti tärkeitä proteiineja, kaupallisesti. Koska hiivat ovat eukaryootteja, niillä on monia samoja toimintoja kuin muilla eukaryooteilla, joista erityisen tärkeinä mainittakoon nisäkässolut. Nisäkässolut syntetisoivat monia farmakologisesti tärkeitä proteiineja, ja näiden kahden järjestelmän sukulaisuussuhde voi olla edullinen. Esimerkiksi hiivan eritysmekanismi muistuttaa korkeampien eläinsolujen vastaavaa, ja on tunnettua, että hiivasoluilla on mekanismi signaalisekvenssien lohkaisemiseksi (proteiinin varaukseton N-pään osa, joka tavallisesti lohkeaa pois eritty-miskuljetuksen yhteydessä) (47). Glykosylointijärjestelmä liittyy eritysmekanismiin. Perusvaiheet, jotka johtavat glykosyloituneisiin proteiineihin, ovat samanlaisia kaikissa eukaryooteissa, ja on oletettavissa, että hiiva-solut, toisin kuin prokaryoottiset solut, voivat tuottaa proteiineja, jotka ovat tarkoin vastaavasti glykosyloi-tuneita (vaikka ketjun jotkut loppuvaiheet jouduttaisiin-kin modifioimaan).
Sitäpaitsi hiivasolut ovat vapaita endotoksiineista. Endotoksiiniepäpuhtauksia löytyy usein E. colista saaduista proteiinivalmisteista ja ne pitää poistaa kalliilla puhdistustoimenpiteillä.
Koska hiiva on mikro-organismi, soluja on helppo viljellä. Hiivan solumassa kasvuliuoksen tilavuusyksikköä kohti on huomattavasti suurempi kuin E. colin vastaava. Lisäksi hiivan käymisominaisuudet tunnetaan hyvin ja suuren mittakaavan käymisolosuhteet ovat jo vakiintuneet.
Aivan viime vuosina on leivontahiiva, Saccharomyces cerevisiae, saanut osakseen lisääntyvää huomiota sekä käytännön että teorian parissa työskenteleviltä molekyylibiologeilta. Tämä kehitys johtuu suuressa määrin trans- 3 80720 formointisysteemin aikaansaamisesta (Hinnen et ai. (1); Beggs (2)), joka mahdollistaa tämän mikro-organismin käytön geenimanipulaatioissa, kuten heterologisen DNA:n siirtämisessä ja kloonauksessa. Kuten prokary-oottisissa systeemeissä, ovat plasmidit edullisia vektoreita myös hiivasoluissa käytettäviksi, so. käytettyinä yhdistelmä-DNA:n siirtämiseksi hiivasoluihin.
On olemassa useita patenttihakemuksia ja muita julkaisuja, jotka koskevat hiivasolujen transformointiin soveltuvia vektoreita, mainituilla plasmideilla transformoituneita hiivoja, mainituilla transformoituneilla hiivoilla tuotettuja polypeptidejä ja niiden tuotantomenetelmiä:
Yleinen hiivan transformointimenettely on selostettu julkaisuissa Hinnen et ai. (1),Beggs et ai. (2), Hicks et ai. (3) ja Struhl et ai (4).
Julkaisussa Hitzeman et ai.(5) on kuvattu ihmisen inter f eronigeenin ilmentymistä, kun geeni on liitetty Saccharomyces cerevisiaen alkoholidehydrogenaasi 1:n (ADH1) DNA-palasten 5'-oheissekvensseihin plasmidissa, jolla on transformoitu hiivasolut.
Beggs et ai. (6) selostavat Saccharomyces cerevisiaen transformointia plasmidilla, joka sisältää kanin kromo-somaalisen β-globiinigeenin. Julkaisussa on mainittu, että geenin transkriptio tapahtuu virheellisesti eikä primääristen β-globiinitranskriptien lomittumista voitu havaita.
Eukaryoottisten solujen, kuten hiivasolut ja nisä-kässolut, sekatransformointia vieraalla DNA:11a, joka koodittaa polypeptidiä, ja joka on liitetty indusoivaan promoottoriin, ja ilman liitännäistä olevalla DNA:11a, joka tekee mahdolliseksi transformoitumattomien solujen tunnistamisen, sekä näiden valmistusmenetelmää on selostettu PCT-patenttihakemuksessa 81/02425 (7).
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 48081 (8) on selostettu eukaryoottista toisiintumiskohtaa kooditta- « 80720 vaa DNA-sekvenssiä, eukaryoottisia vektoreita, jotka antavat mitoottisen stabiilisuuden pienellä kopiomäärällä ja sisältävät eukaryoottisen toisiintumiskohdan, sekä hiivasoluja, jotka on transformoitu mainituilla vektoreilla.
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 45573 (9) on selostettu yhdistelmä-DNA-molekyylejä, joissa on mm. eukaryoottisessa isännässä autonomisesti toisiintuva segmentti, menetelmää niiden valmistamiseksi ja menetelmää, jolla voidaan suurella taajuudella transformoida eukaryoottisia soluja, esim. hiivasoluja, mainituilla yhdistelmä-DNA-molekyyleillä.
Saksan Offenlegungsschrift-julkaisussa 2923297 (10) ja ranskalaisessa patenttihakemuksessa 2458585 (11) on selostettu plasmideja, jotka sisältävät ovalbumiinigee-nin, jota ohjaa Escherichia coli β-lac Z-geenin promoottori, ja joilla voidaan transformoida hiivasoluja.
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 11562 (12) selostetaan yhdistelmäplasmideja, joissa on bakteeriplas-midin DNA:ta, hiivan 2y-plasmidin DNA kokonaisuudessaan tai osaksi ja hiivan URA3-geeni, sekä hiivoja, jotka on transformoitu mainituilla yhdistelmäplasmideilla.
Viime vuosien aikana on tapahtunut suurta edistystä geenitekniikan alalla ja ensimmäiset menetelmät, joissa käytetään geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja, erityisesti Escherichia coli-enterobakteerin kantoja, ovat nyt toiminnassa. Kuitenkin on olemassa tarve kehittää uusia ja parempia menetelmiä, erityisesti eukaroyyttisia menetelmiä, joissa käytetään esim. hiivasoluja, jotka soveltuvat proteiinien tuottamiseen taloudellisesti ja suuressa mittakaavassa teollisesti. Tällä hetkellä on tarjolla erilaisia hiivavektoreita geenien kloonaukseen. Jotta vieraat geenit ilmentyisivät tehokkaasti hiivassa, pitää rakennetta koodittavat sekvenssit yhdistää voimakkaisiin hiivapromoottoreihin, joilla mielellään pitäi- 5 80720 si olla säätöominaisuuksia, jotka mahdollistavat geenin ilmentymisen ohjauksen ulkopuolelta käsin. Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota hiivapromoottoreita, jotka täyttävät nämä vaatimukset. Lisäksi tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota yhdistelmävektorieta, jotka sisältävät mainittuja promoottoreita ja vieraita rakennegeenejä, joita mainitut promoottorit ohjaavat.
1. DNA-palasia, jotka sisältävät Saccharomyces cerevi-siaen happofosfataasin promoottoreita, ja niiden valmistus Tämä keksintö tarjoaa äskettäin eristetyn S. cerevi-siaen PH05-promoottorin, jolla on aikaisempaan verrattuna paremmat ilmentämisominaisuudet, sekä menetelmän sen valmistamiseksi .
Tämän keksinnön mukainen promoottori on johdettu Saccharomyces cerevisiaen perimästä. Happofosfataasin ilmentymiseen S. cerevisiaessa osallistuu ainakin kaksi ra-kennegeeniä (PH03 ja PH05) ja useita säätögeenejä (PH02, PH04, PHO80, PH081, PH081) (ks. esim. viite (13)). PH05 ja PH03 koodittavat säädeltävissä olevaa ja vastaavasti konstitutiivista hiivan happofosfataasia. PH05-geeni on kytketty pois päältä, kun epäorgaanisen fosfaatin väkevyydet ovat suuria, ja se kytkeytyy päälle, kun epäorgaanista fosfaattia on liian vähän (tavallisesti suuressa määrin asianomaisissa fysiologisissa olosuhteissa); kun taas PH03-geeni ilmentyy konstitutiivisesti pieninä pitoisuuksina.
Pois tuotannosta kytkettävissä oleva entsyymi on glykosyloi-tunut ja sen molekyylipaino on noin 490 kilodaltonia (14).
Happofosfataasigeenejä ohjaavia promoottoreita ei ole aikaisemmin eristetty tai käytetty yhdistelmä-DNA-teknii-kassa ja näin ollen niiden nukleotidisekvenssejä ei ole määritetty. Toisin kuin muiden viimeaikaisessa yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytettyjen hiivapromoottorien (ADH1) kohdalla on asian laite, hiivan happofosfataasipromootto- 6 80720 reita välittömästi seuraavat DNA-sekvenssit koodittavat signaalipeptidejä, joiden ajatellaan liittyvän erittymis-prosessiin. Olisi edullista liittää vierasta proteiinia koodittava alue hiivan signaalisekvenssiin sen takaamiseksi, että proteiini kulkeutuu in vivo hiivan solukalvon läpi. Tämä vähentäisi isäntäsolun aiheuttamaa tuotteen hajoamista ja kontaminoitumista ja helpottaisi tuotteen talteenottoa.
Tähän asti yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytettyihin promoottoreihin on liittynyt se haitta, että vastaavien geenien transkriptio on tapahtunut konstitutiivisesti. Ilmentynyt polypeptidi voi olla joko myrkyllinen hiivalle (fungisidinen vaikutus) tai se voi ainakin estää solujen lisääntymisen (fungistaattinen vaikutus) tai polypeptidi voi hajota entsymaattisesti solun sisällä, erityisesti, jos se on alttiina hiivan proteaasien vaikutukselle pitkän aikaa. Kaikissa mainituissa tapauksissa halutun polypeptidin saanto on huono. Nämä haitat voidaan välttää käyttämällä PH05-promoottoria ja vektoreita, jotka sisältävät mainitun prcnoottorin. PH05-promoottori voidaan kytkeä pois päältä tai kytkeä takaisin päälle kokeita suorittavan henkilön toimesta vain kohottamalla tai laskemalla epäorgaanisen fosfaatin pitoisuutta väliaineessa. Näin ollen promoottori voi olla kytkettynä pois päältä hiivan eksponentiaalisen kasvuvaiheen aikana ja se voidaan kytkeä päälle aikaisen stationäärisen kasvuvaiheen kuluessa solutiheyden ollessa suurimmillaan, jolloin PH05-promoottorin ohjaama geeni ilmentyy. Tämä ominaisuus sekä siihen liittyvä suuria pitoisuuksia tuottava transkriptio tekevät PH05-promoottorista edullisen tässä keksinnössä.
Tämä keksintö koskee erityisesti DNA-palasta, joka sisältää S.cerevisiaen PH05-happofosfataasipromoottorin, sekä oheissekvenssejä.
7 80720
Mahdollisesti S. cerevisiaen PH05-promoottoria seuraa kokonaisena tai osana S. cerevisiaen PH05:ttä koodittava sig-naalisekvenssi. Lisäksi mainittu DNA-palanen voi sisältää sekvenssejä, jotka ovat tarpeen mRNA:n tehokkaan translaation kannalta. Keksintö kattaa myös ne alafragmentit, joissa on säilynyt mainitun DNA-palasen promoottoritoiminta.
Keksinnön mukainen DNA-palanen voidaan valmistaa esimerkiksi seuraavalla tavalla: (A) valmistetaan happamen fosfataasin (PH05) geeni täydentämällä happamen fosfataasin PH05 suhteen vajaa Saccharo-myces cerevisiae-hiivakanta suorittamalla transformointi plasmidi-DNArlla, joka on saatu mainitun geenin villi-tyyppikopion sisältävästä S. cerevisiae-geenikirjastos-ta, ja eristetään mainittu geeni, (B) valmistetaan saadun geenin alaklooneja ja (C) identifioidaan promoottorialueen sijainti edellämaini-tuissa alaklooneissa ja eristetään restriktioentsyymi-katkaisulla DNA-palaset, jotka olennaisesti koostuvat happamen fosfataasin (PH05) promoottorista, ja alajaksojen valmistamiseksi saadut DNA-jaksot lyhennetään katkaisemalla restriktioendonukleaasilla tai eksonukleaasilla.
Tarkemmin sanottuna mainitun DNA-palasen valmistus sisältää seuraavat vaiheet: (1) S. cerevisiaen geenikokoelma rakennetaan käyttämällä villityyppista S. cerevisiae-DNA:ta, joka on kloonattu bak-teeri-S. cerevisiae-yhdistelmäplasmidiin (erityiseti Escherichia coli), joka sisältää tarvittavat merkkikohdat sekä bakteeri- että S.cerevisiae-solussa tapahtuvalle ilmentymiselle (sopivista merkkikohdista tarkemmin jäljempänä).
(2) Valitaan kloonit, jotka sisältävät S.cerevisiae-happo-fosfataasi(PH05)geenin, transformoimalla happofosfataasin (PH05) suhteen vajaa S.cerevisiae-kanta käyttämällä edellämainitun kokoelman plasmidivarantoja.
(3) Plasmidit, jotka sisältävät S.cerevisiaen happofosfataa-si(PH05)geenin, eristetään transformoiduista S.cerevisiae-soluista ja vahvistetaan transformoimalla takaisin E.coliin suorittamalla valinta bakteerin merkkikohdan fenotyyppisen ominaisuuden mukaan (esim. vastustuskyky ampisilliinin suhteen).
β 80720 (2') Vaihtoehtoisessa lähestymistavassa geeenikokoelma jaetaan alavarantoihin, joilla transformoidaan fosfataasin (PH05) suhteen vajaat S.cerevisiae-kannat, ja (3') positiiviset alavarannot jaetaan edelleen ja suoritetaan niillä transformointi edelläkuvatulla tavalla, kunnes saadaan identifioiduksi yksi ainoa klooni.
(4) Identifioidun kloonin plasmidi-DNA eristetään, hajotetaan sopivilla restriktioendonukleaaseilla ja palaset kloonataan uudestaan haluttuun S.cerevisiae-vektoriin.
(5) DNA-palaset, jotka sisältävät S.cerevisiaen happofosfa-taasi(PH05)geenin, voidaan identifioida transformoimalla hiivan happofosfataasin (PH05) suhteen vajaat S.cerevisiae-kannat mainituilla vektoreilla. Tämän toimenpiteen avulla voidaan happofosfataasigeenin rajat määrittää noin 300 emäs-parin tarkkuudella.
(6) Identifioitujen palasten DNA-emäsjärjestyksen määrityksen avulla voidaan paikantaa promoottorialueet, happofosfa-taasi(PHOS)proteiinia koodittavat alueet ja lisäksi resktrik-tiokohta (dat), jotka voivat olla hyödyllisiä jatkokäsittelyssä, esim. leikattaessa pois DNA-sekvenssejä, jotka eivät ole välttämättömiä promoottorin toiminnalle, restriktioendo-nukleaasien avulla.
Riippuen resktriktioendonukleaasien valinnasta voivat happofosfataasipromoottorin sisältävät DNA-palaset sisältää myös 3'- ja 5'-päissä alkuperäisiä oheissekvenssejä, jotka eivät vaikuta promoottorin toimintaan, mutta joita voidaan käyttää apuna sekvenssien liittämisessä myöhemmissä kloonaus-toimenpiteissä. Haluttaessa näitä lisäsekvenssejä voidaan lyhentää katkaisemalla restriktioendonukleaasien avulla (jos mahdollista) tai sopivan eksonukleaasin, esim. Bal31, avulla. Lisäksi palasiin voidaan liittää kemiallisesti syntetisoituja DNA-liitospolymeerejä, jotka mielellään sisältävät sopivan restriktionendonukleaasin tunnistuskohdan. Näin voidaan happofosfataasi(PHOS)promoottori edullisella tavalla liittää vierasta polypeptidiä koodittaviin alueisiin.
9 80720 PH05:ttä koodittavasta alueesta on myös mahdollista eristää ja/tai konstruoida DNA-palanen, joka sisältää S.cerevisiaen happofosfataasi(PH05)promoottorin ja siihen liittyvän sig-naalisekvenssin osaksi tai kokonaan. Liitettynä oikealla tavalla leikattuun vierasta polypeptidiä koodittavaan alueeseen ilmentyy saatu yhdistelmä-DNA S.cerevisiaessa ja saadaan polypeptidejä, jossa on (PH05) happofosfataasisignaa-lisekvenssejä tai fuusioituneita signaalisekvenssejä.
Tämän keksinnön mukaista S.cerevisiaen (PH05) happo-fosfataasipromoottoria voidaan käyttää ohjaamaan hiivape-räistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavan, hiivan yhdistelmävektorin sisältämän alueen ilmentämistä.
2. Yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät hiivan happofos-fataasipromoottoreita, ja niiden valmistus Tämä keksintö koskee myös hiivan yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät DNA-jakson, joka koostuu olennaisesti S. cerevisiaen happofosfataasin (PH05) säädeltävissä olevasta promoottorista, ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavan alueen, jota mainittu promoottori ohj aa.
Termeillä "vektori", "yhdistelmävektori", "DNA-sek-venssit" jne., joita käytetään tässä hakemuksessa, tarkoitetaan erityisesti kaksisäikeisiä DNA-ketjuja.
Kuitenkin yksisäikeiset DNA-ketjut kuuluvat myös mukaan. Vektorit ja yhdistelmävektorit voivat olla läsnä lineaarisessa tai, mielellään, rengasmuodossa.
Hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue (geeni), jota ohjaa joku edellämainituista promoottoreista, voidaan johtaa perimän DNArsta tai cDNA:sta, joka on valmistettu mRNA-tietä käyttäen, tai se voidaan syntetisoida kemiallisesti. Hiivaan kuulumattomia polypeptidejä koodittavat alueet (geenit) ovat pe- 10 80720 räisin viruksista, prokaryoottisista soluista tai eu-karyoottisista soluista, korkeammat eukaryoottiset solut, erityisesti ihmisen solut, mukaanlukien. Isäntä-hiivasolussa ilmentyessään nämä geenit voivat tehdä mahdolliseksi lukuisien eri polypeptidien tuotannon, mukaanlukien glykosyloituneet polypeptidit, kuten entsyymit, joita voidaan käyttää esim. ravintoaineiden tuotannossa ja entsymaattisissa reaktioissa kemiassa, ja ei-entsymaattiset polypeptidit, esim. hormonit, polypeptidit, joilla on immunomodulatorisia, viruslääke- ja syöpälääkevaikutuksia, vasta-aineet, virusten antigeenit, rokotteet, hyytymätekijät, ruoka-aineet tms. Tällaiset geenit koodittavat esim. amylaaseja, proteaaseja, lysotsyymiä, virusten tymidiinikinaasia, renniiniä, B-laktamaasia, glukoosi-isomeraasia; sekretiiniä, ty-mosiinia, relaksiinia, kalsitoniinia, somatostatiinia, ihmisen ja naudan kasvuhormonia, insuliinia, luteinisoi-vaa hormonia, parakilpirauhashormonia, adrenokortikotro-piinia, β-endotropiinia, melanosyyttejä stimuloivaa hormonia, 6 -lipotropiinia, urogastronia; interferonia, kuten ihmisen interferonia, esim. ihmisen leukosyytti-, lymfoblastoidi- tai fibroblastisoluista johdettua ihmisen interferonia a tai 6 tai ihmisen interferonia Ύ ; lymfokiineja, kasvainten nekroositekijää; antirenniini-vasta-ainetta, maksatulehdus-A-viruksen antigeeniä, mak-satulehdus-B-viruksen (HBV) pinta- ja ydinantigeenejä, maksatulehduksen non-A non-B viruksen antigeeniä, ihmisen kudosten yhteensopivuusantigeenejä, ruuan ja suusairaus-virusten antigeenejä, influenssahemagglutiniinia, lintu-ruttoviruksen hemagglutiniinia; seerumialbumiinia, oval-bumiinia, taumatiinia, egliineja tai plasminogeeniakti-vaattoreita.
Valittu polypeptidiä koodittava alue voi haluttaessa sisältää signaalisekvenssin tai osan siitä. Kuten edellä mainittiin, tällöin voi syntyä fuusioitunut proteiini, 11 80720 jossa on PH05:n signaalisekvenssi tai yhdistelmäsignaali-sekvenssi, joka sisältää osan PH05:n signaalisekvens-sistä ja osan vieraan polypeptidin signaalisekvenssistä, sekä vieraan kypsän polypeptidin. Kummassakin tapauksessa ne yhdistelmät ovat edullisia, jotka johtavat signaalisekvenssin lohkeamiseen vieraan polypeptidin kypsymisen yhteydessä.
Happofosfataasi(PTO5)promoottorin ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodattavan alueen lisäksi keksinnönmukaiset yhdistelraävektorit voivat sisältää lisä-DNA-ketjun(juja), jotka eivät ole välttämättömiä tai ovat vähemmän tärkeitä promoottorin toiminnan kannalta, so. polypeptidiä koodittavan alueen ilmentymisen kannalta, mutta jotka voivat suorittaa tärkeitä toimintoja, esim. mainituilla yhdistelmävektoreilla transformoitujen hiivasolujen lisääntymisen yhteydessä. Lisä-DNA-sekvenssi(t) voi olla johdettu prokaryoottisista ja/tai eukaryoottisista soluista, ja ne voivat sisältää kromosomaalisia ja/tai kromosomien ulkopuolisia DNA-sekvenssejä. Esimerkiksi li-sä-DNA-sekvenssit voivat olla peräisin (tai muodostua) plasmidi-DNArsta, kuten bakteeriperäisestä tai virusperäisestä plasmidi-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromo-somaalisesta-DNA:sta, kuten bakteerien, hiivojen tai korkeampien eukaryoottien kromosomaalisesta DNA:sta.
Lisä-DNA-sekvenssit sisältävät mielellään hiivan i toisiintumisen alkukohdan ja hiivaa varten selektiivisen geneettisen merkkikohdan. Hiivan toisiintumisen alkukohdan, esim. kromosomaalisen autonomisesti toisiin-tuvan segmentin (segmentin osia) sisältävät yhdistelmä-vektorit säilyvät kromosomin ulkopuolella hiivasolussa 12 80720 transformoinnin jälkeen ja toisiintuvat autonomisesti mitoosin yhteydessä. Yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät sekvenssejä, jotka ovat homologisia hiivan 2y-plasmidin DNA:n kanssa, voidaan käyttää yhtä hyvin. Nämä yhdiste lmävektor it intergoituvat rekombinoitumalla 2y-plasmi-deihin, jotka jo ovat läsnä solussa, ja toisiintuvat autonomisesti. 2y-sekvenssit ovat erityisen sopivia plasmideilla tapahtuvassa suurtaajuustransformoinnissa ja voivat saada aikaan suuria kopiomääriä.
Lisäksi keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit voivat sisältää sellaisen geenin DNA-sekvenssin, joka on läsnä isäntähiivan kromosomissa (esim. PH05), ja jonka promoottori voi olla liittyneenä hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavaan alueeseen. Homologisen sekvenssin ansiosta koko vektori voidaan rekombinaatiolla siirtää stabiilisti isäntäkromosomiin. Näin ollen lisääntymisen yhteydessä syntyvät jälkeläissolut säilyttävät geneettisen materiaalin jopa ilman selektiivistä painetta.
Hiivan selektiivisenä merkkikohtana voidaan käyttää mitä tahansa merkkigeeniä, joka tekee mahdolliseksi trans-formanttien valitsemisen merkkikohdan fenotyyppisen ilmentymisen johdosta. Hiivalle sopivia merkkikohtia ovat erityisesti ne, jotka ilmentävät vastutustuskyvyn antibiootin suhteen, tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa kyseessä geenit, jotka täydentävät isännän vajeita. Tällaiset geenit antavat esim. vastustuskyvyn antibioottisen sykloheksimidin suhteen tai antavat prototropian auksotrooppiselle hiivamutantille, esim. URA3-, LEU2-, HIS3- tai TRP1-geeni. On myös mahdollista käyttää merkkeinä rakennegeenejä, jotka ovat yhteydessä autonomisesti toisiintuvaan segmenttiin edellyttäen, että transformoitava isäntä on auksotrooppinen tuotteelle, jonka merkki ilmentää.
Keksinnönmukaisissa yhdistelmävektoreissa läsnäolevat lisä-DNA-sekvenssit voivat mielellään sisältää myös toi- 13 80720 siintumisen alkukohdan ja selektiivisen merkkikohdan bakteeri-isäntää, erityisesti Escherichia coli, varten.
On olemassa edullisia seikkoja, jotka liittyvät E. colin toisiintumiskohdan ja E. colin merkkikohdan läsnäoloon hiivan yhdistelmävektorissa: Ensinnäkin suuret määrät yhdistelmä-vektori-DNA:ta voidaan saada kasvattamalla ja vahvistamalla E. colia, ja toiseksi yhdistelmävektorien rakentaminen on edullista suorittaa E. colissa käyttämällä hyväksi koko E. coliin perustuvaa kloonausteknologi-aa. E. coli-plasmidit, kuten pBR322 tms., sisältävät sekä E. colin toisiintumiskohdan että E. colin geneettisiä merkkikohtia, jotka antavat vastustuskyvyn antibiooteille, esim. tetrasykliinille ja ampisilliinille, ja niitä voidaan edullisesti käyttää yhdistelmähiivavekto-rien osina.
Lisä-DNA-sekvensseistä, jotka sisältävät esim. toi-siintumisen alkukohdat ja geneettiset merkkikohdat hiiva- ja bakteeri-isäntää varten (ks. edellä), käytetään tästä lähtien nimitystä "vektori-DNA", joka yhdessä PH05-hap-pofosfataasiprcmoottorin ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavan alueen kanssa muodostavat keksinnönmukaisen yhdistelmävektorin.
Yhdistelmävektorit voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esim. liittämällä vektori-DNA:hän DNA-jakso, joka koostuu olennaisesti S.cerevisiaen happo-fosfataasin (PH05) säädeltävissä olevasta promoottorista, ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue, jota mainittu promoottori ohjaa.
Voidaan käyttää kartaltaan sopivaa lineaarista tai mielellään rengasmaista vektori-DNA:ta, esim. bakteeri-palsmidi-DNA:ta tms. (ks. edellä), jossa on vähintään yksi katkaisukohta, mielellään kaksi tai useampia katkaisukoh-tia. Vektori-DNA voi mielellään jo sisältää toisiintu-misen alkukohdat ja geenimerkit hiiva- ja/tai bakteeri-isännälle. Vektori-DNA katkaistaan sopivalla restriktio- 14 80720 endonukleaasilla. Katkaistu DNA liitetään DNA-palaseen, joka sisältää happofosfataasiproraoottorin, ja dna·-palaseen, joka koodittaa hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä. Ennen pranoottorin ja polypeptidiä kooditta-van alueen liittämistä tai sen jälkeen (tai yhtä hyvin samanaikaisesti) voidaan myös liittää toisiintumisen alkukohdat ja/tai merkkikohdat hiiva- tai bakteeri-isäntää varten. Joka tapauksessa katkaisu- ja liittämisolo-suhteet Valitaan sillä tavalla, että ne eivät millään tavalla häiritse vektori-DNA:n ja promoottorin oleellisia toimintoja. Yhdistelmävektori voidaan rakentaa peräkkäisesti tai liittämällä yhteen kaksi DNA-palasta, jotka sisältävät kaikki mielenkiinnon kohteena olevat sekvenssit.
Useita menetelmiä voidaan käyttää DNA-palasten liittämiseksi in vitro. Tylpät päät (täydellisistä emäspa-reista koostuvat DNA-kahdenteet), jotka saadaan aikaan tietyillä restriktioendonukleaaseilla, voidaan suoraan liittää T4 DNA-ligaasia käyttämällä. Tavallisemmin DNA-palaset liitetään yhteen yksisäikeisten kohesiivisten päidensä välityksellä ja suljetaan kovalenttisesti DNA-ligaasilla, esim. T4 DNA-ligaasi. Tällaiset "kohesii-viset päät" voidaan muodostaa katkaisemalla DNA toisentyyppisillä endonukelaaseilla, jotka tuottavat lomit-taisia päitä (DNA-kahdenteen kaksi säiettä on katkaistu eri kohdista muutaman nukleotidin etäisyydeltä toisistaan) . Yksisäikeisiä pätkiä voidaan myös muodostaa lisäämällä nukleotideja tylppiin päihin ja lomittaisia päitä käyttämällä terminaalista transferaasia ("homopo-lymeerinen hännänmuodostus") tai yksinkertaisesti syömällä pois toista säiettä tylppäpäisestä DNA-palasesta sopivan eksonukleaasln, kuten λ-eksonukleaasin, avulla.
Vielä eräs tapa muodostaa lomittaisia päitä on se, että tylppäpäiseen DNA-palaseen liitetään kemiallisesti syntetisoitu DNA-sidoksenmuodostaja, joka sisältää tunnis- 15 tuskohdan lomittaisia päitä muodostavalle endonukleaa-sille ja saatu DNA hajotetaan vastaavalla endonukleaa-silla.
Ilmentyäkseen tehokkaasti hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta proteiinia koodittavan geenin tulee sijaita oikealla tavalla niiden sekvenssien suhteen, jotka sisältävät transkriptio- (happofosfataasipromoottori) ja luentafunktiot (ribosomaalinen sidoskohta). Ensinnäkin promoottorin sisältävän DNA-segmentin liittyminen polypep-tidiä koodittavaan alueeseen pitää saada tapahtumaan oikeassa suunnassa. Jos kaksi suuntaa on mahdollista, voidaan oikea määrittää tavanomaisella restriktioanalyy-sillä. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät väärin suunnatun geeniliitännäisen, voidaan suunnata uudestaan leikkaamalla geeniliitännäinen irti sopivalla restriktio-endonukleaasilla ja liittämällä geeni uudestaan yhdistel-mävektoripalaseen. Joka tapauksessa väärä suunta voidaan välttää liittämällä toisiinsa kaksi DNA-segmenttiä, joilla on päissä eri restriktiokohdat. Lisäksi yhdistel-mävektori pitäisi olla rakennettu niin, että transkriptio alkaa ja päättyy oikein. Viimeksimainitussa kohdassa transkription tulisi mielellään päättyä DNA-sekvenssiin, joka on johdettu hiivan kromosomaalisesti DNA:sta tai hiivan 2y-plasmidista. Mielellään transkriptio päättyy DNA-sekvenssiin, joka sisältää hiivan PH05-geenin transkription loppumisen signaalin. Toiseksi pitää olla olemassa oikea lukukehys. Yleensä sekä promoottorialueen että polypeptidiä koodittavan alueen nukleotidi-sekvenssi tunnetaan ennen liittämistä tai ne voidaan helposti määrittää (esim. viite (15)), joten oikean lukukehyksen aikaansaamisessa ei ole ongelmia. Lisäksi voidaan tarvita tiettyjä sekundäärisiä DNA-rakenteita geenin vielä tehokkaamman ilmentymisen saavuttamiseksi.
16 80720
Edullinen alue PH05-happofosfataasiprcmoottorin liittämiseksi vieraaseen koodittavaan alueeseen on laajan haooo-fosfataasi-mRNA:n alun ja happofosfataasia koodittavan alueen ATG:n välissä, noin 40 emäsparin pituudella laajan PH05-mRNA:n alun ja PH05-happofosfataasia koodittavan alueen ATG:n välillä. Tällä alueella olevaa liitosta varten pitäisi vieraalla koodittavalla sekvenssillä olla oma ATG luennan aloittamista varten tai muuten se pitää saada aikaan lisäämällä synteettinen oligonukleotidi.
Koska korkeampien organismien monet polypeptidit ilmentyvät pääasiassa esipolypeptideinä, joissa on sig-naalipeptidi liittyneenä kypsän polypeptidin N-päähän, voi olla hyödyllistä sisällyttää signaalisekvenssi geeni-liitännäiseen. Sopivia signaalisekvenssejä ovat sellaiset, jotka ovat luonnollisesti liittyneinä polypeptidi-geeniin, joka on tarkoitus ilmentää, tai happofosfataa-siprcmoottoriin. Vaihtoehtoisesti voidaan rakentaa yhdistettyjä signaalisekvenssejä liittämällä toisiinsa osa happofosfataasin signaalisekvenssistä ja osa polypeptidin signaalisekvenssistä. Jos halutaan saada aikaan kypsän polypeptidin ilmentyminen suoraan, pitää poistaa signaalisekvenssit tai niiden osat, jotka mahdollisesti seuraavat promoottorialuetta tai mahdollisesti edeltävät kypsää polypeptidiä koodittavaa aluetta, esim. suorittamalla hajotus eksonukleaasilla, esim. Bal31.
Välituotteet, kuten vektorit, joista vielä puuttuu yksi tai useampia välttämättömiä toimintaosia, sekä lopulliset keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit voidaan siirtää bakteeri-isäntään, erityisesti E. coliin, edellämainituista syistä (esim. saadaan tuotetuksi suuret määrät välituotteita tai yhdistelmävektoreita, vastaavasti). Bakteerivektorit, kuten E. colin plasmidi pBR322 ja sen palaset, jotka sisältävät bakteriaalisen toisiintumisen alkukohdan ja geeni merkkikohdan(t), ovat parhaita vektoreita tästä syystä. Käytettäessä tällaista bakteeri- 17 80720 vektoria, kuuluu lopullisten hiivan yhdistelmävektorien valmistukseen myös vaiheet, joissa liitetään mukaan geneettinen merkkikohta ja toisiintumisen alkukohta hiivaa varten.
DNA-jaksot, jotka voidaan liittää bakteerivekto-riin niin, että muodostuu keksinnönmukaisia yhdistel-mävektoreita, kuten autonomisesti toisiintuva jakso (ars, ks. (4)), hiivan 2y-plasmidin jaksoja (2) tai hiivan merkki-DNA (ks. 16), voidaan eristää hiivan kro-mosomaalisesta DNA:sta ja hiivan 2y-plasmidin DNAtsta, vastaavasti, tavalliseen tapaan. Hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava geeni voidaan eristää kromosomista peräisin olevasta DNA:sta tai DNA:sta, joka on saatu kromosomin ulkopuolelta, jolloin johtaminen tapahtuu cDNA:sta, joka on valmistettu mRNA-tietä käyttäen (ks. edellä) tavanomaisilla menetelmillä (esim. 17, 18), tai se voidaan syntetisoida kemiallisesti .
Yhdistelmävektorien valmistus koostuu seuraavista vaiheista: (1) valmistetaan S.cerevisiaen geenikokoelam käyttämällä villityyppistä hiiva-DNA:ta, (2) eristetään (PH05) happofosfataasigeeni, ja kloonataan se bakteeriplasmidiin, kuten pBR322, tai vastaavaan biologisesti toimivaan yksikköön, jossa on sen ehyen toisiintumisen alkukohdan ja valinnan merkkikohdan sisältävä palanen, (3) liitetään mainittuun plasmidiin hiivan geneettinen merkki-kohta, kuten TRP1-geeni, ja hiivan toisiintumisen alkukohta, kuten kromosomaalinen autonomisesti toisiintuva jakso tai vaihtoehtoisesti hiivan 2y -plasmidijaksoja, sopivaan restriktiokohtaan, (4) liitetään hiivaperäiHtä tai hiivaan kuulumatonta po-lypeptidiä, kuten ihmisen interferonia tai HBV-pinta-antigeeniä, koodittava DNA-jakso sillä tavalla, että 18 80720 PF505-happofosfataasipranoottori ohjaa mainittua polypeptidiä koodittavaa jaksoa, ja (5) polypeptidiä koodittavan alueen alapuolelle mahdollisesti liitetään PH05-geenin transkription päätösmerkki.
Yhtä lailla on mahdollista vaihtaa vaiheiden, kuten 3-5, järjestystä esim. siten, että ensin vaiheessa 2 saatuun yhdistelmäplasmidiin liitetään polypeptidiä koo-dittävä jakso ja sen jälkeen liitetään geneettinen merk-kikohta ja toisiintumisen alkukohta hiivaa varten.
Ennen hiivan geneettisen merkkikohdan, hiivan toisiintumisen alkukohdan ja polypeptidiä koodittavan jakson liittämistä voidaan ei-välttämättömiä toimintoja koodittavat alueet, kuten happofosfataasin rakennegeeni, leikata pois vaiheessa 2 saadusta yhdistelmäplasmidista.
Erityisesti hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava DNA-jakso liitetään PH05-happofosfataa-siprcmoottoriin (vaihe 4) alueelle, joka on laajan hap-pofosfataasi-mRNA:n alun ja happofosfataasia koodittavan alueen ATG:n välissä. Mahdollisesti liitetään synteettinen liitospolymeeri, jossa on tarvittava katkaisu-kohta, jotta saadaan aikaan sidos mainitun DNA-jakson ja happofosfataasipromoottorin välille.
Yhdistelmävektorivälituotteet, joissa en S.oerevisiae PK05-hap-pofosfataasin premoottori, mutta ei hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavaa aluetta, ovat myös tämän keksinnön kohteena ja ne voidaan valmistaa edel-läkuvattujen peräkkäisten vaiheiden (1), (2), (3) ja mahdollisesti (5) avulla, jolloin happofosfataasipromoottori mielellään päättyy alueeseen, joka on laajan happofosfa-taasi-mRNA:n alun ja happofosfataasigeenin ATG:n välissä ja/tai mahdollisesti liitetään synteettinen sidospolymee-ri, jossa on tarvittava katkaisukohta, jotta voidaan liittää hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava DNA-jakso.
19 80720 3. Hiivan transformointi yhdistelmävektoreilla, joissa on hiivan happofosfataasipromoottori Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmää transformoituneiden S.cerevisiae-solujen valmistamiseksi, jotka kykenevät tuottamaan hiivaperäisiä tai hiivaan kuulumattomia polypeptide j ä, jossa menetelmässä transformoidaan S. cerevisiae millä tahansa kappaleessa 2 kuvatulla yhdistelmävektorilla.
S.cerevisiaen transformointi hybridivektoreilla voidaan suorittaa kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä, esim. menetelmällä, jota on kuvattu julkaisussa Hinnen et ai.
(1). Tämä menetelmä voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen: (1) Hiivan soluseinän poisto.
(2) "Alastomien" hiivasolujen (sferoplastit) käsittely transformointi-DNA:11a PEG:n (polyetyleeniglykolin) ja Ca^+-ionien läsnäollessa.
(3) Soluseinän regenerointi ja transformoitujen solujen valinta kiinteässä agarkerroksessa.
Edulliset menetelmät: ad (1): Hiivan soluseinä poistetaan käyttämällä erilai sia glukosidaasivalmisteita, kuten etanan suolinestei-
R R
tä (esim. Glusulase tai Helicase ) tai mikro-organis-
D
meistä saatuja entsyymiseoksia (esim. Zymolyase ) osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esim. 1 M sorbitoli). ad (2): Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n läsnä ollessa ja tapahtuu sytoplasmakalvojen paikallisia yhtymisiä. "Yhtymisolosuhteiden" aikaansaaminen on ratkaisevaa ja useista transformoituneista hiivasoluista tulee diploidisia tai triploidisia transformoinnin kuluessa. Menettelytapoja, jotka mahdollistavat yhteenliittyneiden sferoplastien valinnan, voidaan käyttää transformanttien rikastamiseen, so. transformoituneet solut voidaan seu- 20 80720 loa ennalta valittujen yhtymistuotteiden suhteen, ad (3): Koska hiivasolut, joissa ei ole solunseiniä, eivät pysty jakautumaan, pitää soluseinät regeneroida.
Tämä regenerointi on edullista suorittaa peittämällä sferoplastit agariin. Esimerkiksi sferoplasteihin voidaan sekoittaa sulaa agaria (noin 50°C). Jäähdyttämällä liuos hiivan kasvulämpötilaan (noin 30°C), saadaan kiinteä kerros. Tämän agarkerroksen on tarkoitus estää nopea diffuusio ja välttämättömien makromolekyylien poistuminen sferoplasteista ja näin helpottaa soluseinän regeneroitumista. Kuitenkin soluseinien regeneroituminen voidaan myös saavuttaa (vaikka pienemmällä teholla) kasvattamalla sferoplasteja valmiiden agarkerrosten pinnassa.
Regenerointiagar on edullista valmistaa siten, että on mahdollista regeneroida soluseinät ja valita transformoituneet solut samanaikaisesti. Koska valintamerk-keinä käytetään tavallisesti hiivageenejä, jotka koodit-tavat aminohapon biosynteesiä (ks. kappale 2), regenerointi on edullista suorittaa hiivan suhteen minimaalista ranintoalustaa sisältävässä agarissa. Kuitenkin, jos tarvitaan erittäin suuria regeneroitumistehoja, saattaa kaksivaiheinen prosessi olla edullinen: (1) Solun- seinät regeneroidaan ravinnerikkaalla alustalla ja (2) transformoituneet solut valitaan kasvattamalla soluker-roksen toisinto uudestaan selektiivisillä agarlevyillä.
Jos yhdistelmävektori ei sisällä merkkigeeniä, transformoituneet solut voidaan identifioida vaihtoehtoisilla menetelmillä. Tällaisia menetelmiä ovat mm. in situ-hyb-ridisointi radioaktiivisesti merkityllä DNA-palasella, joka on homologinen yhditelmävektorin sekvenssien kanssa (esim. menetelmällä Hinnen et ai. (1)), in situ-iramuno-määritykset, edellyttäen, että geeniliitännäisen tuotteen vasta-aine on saatavissa, tai muut seulontamenetelmät, joissa mitataan transformointiplasmidin(ien) koo-dittamia geenituotteita.
21 80720
Vaihtoehtoisesti voidaan hiiva sekatransformoida kek-sinnönmukaisella yhdistelmävektorilla ja toisella vektorilla, joka sisältää hiivan geneettisen merkkikohdan.
Jos kahdella eri vektorilla on samoja DNA-sekvenssejä (nämä voivat olla vektoreissa olevia bakteerisekvensse-jä), voi tapahtua yhtymimen, joka johtaa yhtyneeseen, valittavissa olevaan hybridimolekyyliin.
Keksintöön liittyy siten myös S.cerevisiae-isäntäsoluja, jotka ovat transformoituneet yhdistelmävektoreilla, joka sisältävät hiivan happofosfataasi(PH05)promoottorin ja hiivaperäis-tä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavan alueen.
4. Transformoituneiden hiivasolujen viljely ja poly-peptidisynteesin aikaansaaminen
Hiivasolut, jotka ovat transformoituneet autonomisesti toisiintuvilla plasmideilla, esim. plasmideilla, joissa on hiivan 2y-plasmidin DNA, ovat taipuvaisia vaihtelevassa määrin menettämään siirretyn yhdistelmä-plasmidin (ks. (16)). Tästä syystä tällaisia hiivasoluja pitää kasvattaa selektiivisissä olosuhteissa, so. olosuhteissa, jotka vaativat plasmidin koodittaman geenin ilmentymistä kasvua varten. Useimmat tällä hetkellä käytössä olevat selektiiviset merkit ovat geenejä, jotka koodittavat aminohappo- tai puriinisynteesin entsyymejä.
Näin ollen pitää käyttää synteettisiä minimikasvualustoja, joista puuttuu vastaava aminohappo tai puriiniemäs. Kuitenkin voidaan yhtä hyvin käyttää joitakin geenejä, jotka antavat vastustuskyvyn antibiootin suhteen (esim. geenejä, jotka antavat vastustuskyvyn sykloheksimidin tai aminoglykosidi G 418:n suhteen (21)). Hiivasoluja, jotka ovat ti&nsformoituneet vektoreilla, jotka antavat vastustuskyvyn antibiootin suhteen, voidaan kasvattaa ravinnerikkaissa alustoissa, jotka sisältävät vastaavaa antibioottia, jolloin voidaan saavuttaa nopeampi kasvu ja suuremmat solutiheydet.
22 80720
Hiivasolut, jotka ovat transformoituneet kromosomeihin integroituneella DNA:11a, eivät vaadi selektiivisiä kasvuolosuhteita. Nämä transformoituneet solut ovat riittävän stabiileja kasvatettaviksi ilman selektiivistä painetta. Tästä syystä näitä soluja voidaan edullisesti kasvattaa ravinnerikkaissa kasvualustoissa.
Hiivasolut, jotka sisältävät yhdistelmäplasmideja, joissa on rakenteellisen happofosfataasin promoottori (esim. PH03), ilmentävät mainittuun promoottoriin liittyvän hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodattavan geenin ilman indusointia. Jos kuitenkin hiiva-peräisen tai hiivaan kuulumattoman proteiinin geeni on säädeltävissä olevan happofosfataasin promoottorin PH05 ohjauksessa, kasvualustan koostumus pitää muuntaa siten, että saadaan maksimaaliset määrät mRNA-kopioita, so. kasvualustassa pitää olla pieni epäorgaanisen fosfaatin väkevyys, jotta PH05-promoottori kytkeytyy päälle.
5. Ilmentyneen polypeptidin eristäminen ja puhdistus
Keksintö koskee myös menetelmää hiivaperäisen tai hiivaan kuulumattoman polypeptidin, kuten ihmisen interferonin tai HBV-pinta-antigeenin, tuottamiseksi, jossa menetelmässä vaiheessa (1) viljellään sopivissa ravinneolosuhteissa S.cerevisiae-kantaa, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, jossa on hiivan happofosfataasin (PH05) promoottori ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue, ja vaiheessa (2) eristetään ja puhdistetaan mainittu polypeptidi.
Tämän keksinnön mukaisia transformoituneista S.cerevisiae-soluja viljellään nestemäisessä kasvualustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja.
Voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Edullisia 23 80720 hiililähteitä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi, tai ase-taatit, joita voidaan käyttää joko yksin tai seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esim. aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni ja lihauutteet, ja edelleen hiivauute, mallasuute, maissinliotusvesi, sekä ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia epäorgaanisia suoloja ovat mm. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit.
Ravinnealusta voi sisältää lisäksi kasvua edistäviä aineita ja/tai sellaisia aineita, jotka aiheuttavat valintapainetta, jotta yhdistelmäplasmidia ei menetettäisi. Kasvua edistäviä aineita ovat esim. hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms. tai yksittäiset aminohapot.
Jos yhdistelmäplasmidi sisältää geenin, joka antaa vastustuskyvyn antibiootin suhteen, tällöin solut, jotka sisältävät tällaisen yhdistelmäplasmidin, pysyvät elossa kasvualustassa, johon on lisätty kyseistä antibioottia, kun taas solut, jotka ovat menettäneet mainitun yhdistelmäplasmidin, sekä kontaminoivat antibiootin suhteen herkät mikro-organismit eivät säily hengissä. Jos yhdistelmäplasmidi sisältää geenin, joka antaa prototropian aukso-trooppiselle hiivamutantille, esim. LEU2- tai HIS3-geenin, voidaan saada aikaan valintapaine, kun geenituote, kuten leusiini tai histidiini, jätetään pois ravinnealustasta.
Jos viljelty hiivasolu on transformoitunut yhdistel-mäplasraidilla, joka sisältää säädeltävissä olevan happo-fosfataasin prcmoottorin PH05, orgaanisen fosfaatin pitoisuus täytyy pitää alhaisena ravinnealustassa esiviljely-faasin jälkeen, jotta saavutetaan maksimaalinen määrä mRNA-kopioita ja sen seurauksena maksimaalinen määrä polypeptide jä.
24 80720
Viljely suoritetaan käyttämällä tavanomaisia menetelmiä. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, kasvualustan pH ja käymisaika, valitaan siten, että muodostuu mahdollisimman suuret määrät polypeptidejä. Valittua hiiva- kantaa kasvatetaan mielellään aerobisissa olosuhteissa pin-nanalaiskasvatuksena ravistelemalla tai sekoittamalla lämpötila-alueella noin 25 - 35°C, mielellään noin 30°C:ssa, pH-alueella 4-8, esim. noin pHrssa 7, noin 4-20 tuntia, mielellään siihen asti, kunnes on saavutettu maksimaalinen polypeptidimäärä.
Kun transformoituneet hiivasolut ovat kasvaneet tyydyttävään solutiheyteen, on ilmentyneen polypeptidin ensimmäinen talteenottovaihe se, että polypeptidi vapautetaan solun sisältä. Useimmissa menetelmissä soluseinä poltetaan ensin entsymaattisella hajotuksella glukosidaa-sien avulla (ks. kohta 3). Sen jälkeen näin saadut sfe-roplastit käsitellään pinta-aktiivisilla aineilla, kuten Triton. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää mekaanisia voimia, kuten hankausvoimaa (esim. X-puristinta, ranskalaista puristinta) tai ravistelua lasikuulien kanssa, solujen rikkomiseksi. Saatu polypeptidiseos voidaan rikastaa halutun polypeptidin suhteen tavanomaisilla menetelmillä, kuten saostamalla ammoniumsulfaatilla tai trikloorietikkahapolla, geelielektroforeesilla, dialyysillä, kromatografisesti, esim. ioninvaihtokromatografisesti, geelisuodatus-kromatografiällä, HPLC- tai käänteisfaasi-HPLC-kromatogra-fiällä tms. Esipuhdistettu tuote voidaan puhdistaa lopullisesti esim. vasta-aineaffiniteettikromatografiällä. Periaatteessa puhdistus (lukuunottamatta solujen hajottamista) voidaan suorittaa menetelmällä, jonka Staehelin et ai (22) ovat kehittäneet ihmisen leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi.
Halutun polypeptidin eristäminen ja puhdistaminen voidaan suorittaa esimerkiksi seuraavalla tavalla: (1) hiivasolut rikotaan glukosidaasin avulla, 25 80720 (2) suoritetaan käsittely pinta-aktiivisella aineella, (3) suurin osa ei-proteiinimateriaalista poistetaan käsittelemällä polyetyleeni-imiinillä, (4) polypeptidit saostetaan kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla , (5) suoritetaan dialyysi sopivassa puskuriseoksessa, (6) suoritetaan pylväskromatografia DEAE-selluloosalla, (7) suoritetaan affiniteettikromatografia monoklonaali-sessa vasta-ainepylväässä ja (8) molekyylit erotellaan koon perusteella sopivassa £
Sephadex -pylväässä.
Jotta saataisiin aikaan riittävän puhdas tuote, saattaa olla tarpeen suorittaa jatkopuhdistus, esim. kationin-tai anioninvaihtokromatografia, adsorptio hydroksyyliapa-tiittiin, kääteisfaasi-HPLC jne. Toisaalta voidaan yksi tai useampi edellämainituista vaiheista jättää pois, mikäli mahdollista, tai käsittelyvaiheiden järjestystä voidaan muuttaa.
Siinä tapauksessa, että hiiva erittää halutun poly-peptidin periplasmaattiseen tilaan, voidaan käyttää yksinkertaisempaa menetelmää. Polypeptidi voidaan ottaa talteen soluja rikkomatta siten, että soluseinä poistetaan entsymaattisesti tai käsittelemällä kemiallisilla aineilla, esim. tiolireagensseilla tai EDTA:lla, jolloin soluseinä vaurioituu ja polypeptidi vapautuu. Jos polypeptidi erittyy kasvualustaan, se voidaan ottaa suoraan talteen siitä.
Tämän keksinnön mukaisesti saatavissa olevat polypeptidit ovat hyödyllisiä ja arvokkaita hoidettaessa ihmisillä ja eläimillä esiintyviä sairauksia tai ehkäistäessä niitä (esim. interferoni, HBV-pinta-antigeeni jne.) tai niitä voidaan käyttää elintarvikkeina, rehuina, rehujen lisäaineina tai entymaattisissa reaktiossa (ks. 2 edellä).
On selvää, että näihin kuuluvat myös luonnossa esiintyvät näiden polypeptidien johdannaiset, kuten proteo-lyyttisesti katkaistut polypeptidit ja/tai glykosyloitu- 26 80720 neet polypeptidit.
Keksintö koskee erityisesti DNA-jaksoja ja yhdistel-mävektoreita ja niiden valmistusmenetelmiä, sekä transformoituneiden hiivojen ja polypeptidien valmistusmenetelmiä, kuten esimerkeissä on selotettu.
Seuraavassa tämän keksinnön eri toteutustapoja koskevassa selostuksessa viitataan liitteenä oleviin piirroksiin, joissa:
Kuva 1 esittää osittaista restriktioendonukleaasikarttaa plasmideista pJDB207/PHO5, PH03 ja pBR322/PH05Bam-Sal, joita käytetään PH05-geenin lähteenä ja DNA-sekvenssin-määrityksessä vastaavasti.
Kuva 2 esittää PH05- ja PH03-happofosfataasigeenien paikantamista 5,1 Kb:n BamHI-jaksossa, joka on eristetty hiivan geenikokoelmasta.
Kuvat 3a ja 3b esittävät PH05:n ja PH03:n promoottorialueiden DNA-sekvenssejä vastaavasti.
Kuva 4 esittää plasmidien p30IFN2(8]j) ja p30IFN2' (8.j) rakentamisen kaaviollisesti.
Kuva 5 esittää PH05-promoottorin DMA:n liittämisen IFN-8.j-cDNA:han rakennettaessa plasmidia p30IFN1(8^).
Kuva 6 esittää plasmidin pJDB207/IFN2'(8j) rakentamista. Kuva 7 on kaavio sellaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien rakentamisesta, jotka sisältävät Namalwa-cDNA:ta.
Kuva 8 on kaavioesitys menetelmistä, joita käytetään syntetisoitaessa IFN-mRNA:n suhteen spesifinen 13-mee-rinen DNA-aluke.
Kuva 9 on kaavioesitys sellaisten kloonien identifioinnista, jotka sisältävät ihmisen lymfoblastoidi-IFN-cDNA:ta.
27 80720
Kuvat 10 - 14 esittävät plasmidien CG-pBR322/HLycIFN-1'b, -6^ , -4^ , -8.J ja -5.j cDNA-liitännäisten DNA- ja aminohapposekvenssejä.
Kuva 15 esittää plasmidin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1 rakentamista ja kuva 16 esittää sen cDNA-liitännäisen DNA- ja aminohapposekvenssiä.
Kuva 17 esittää plasmidin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 rakentamista ja kuva 18 esittää sen cDNA-liitännäisen DNA- ja aminohapposekvenssiä.
Kuva 19 esittää plasmidin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 DNA- ja aminohapposekvenssiä.
Kuva 20 on kaavioesitys plasmidin p31 rakentamisesta, joka sisältää PH05:n päätösjakson.
Kuva 21 esittää PH05:n transkription päätösjakeen Sau3A-Pstl nukleotidisekvenssiä.
Kuva 22 on kaavioesitys plasmidien p31/IFl(5^), p31/IF2(5^), pSI/IFS^) ja p31/IF2(1'b) rakentamisesta.
Kuva 23 on kaavioesitys plasmidin p31/lF(8p rakentamisesta.
Kuva 24 on kaavioesitys oikean liitoksen PH05-HBVS rakentamisesta plasmidiin pBR322/PH05/HBVsAl4.
Kuva 25 esittää DNA-sekvenssiä PH05-promoottoria ja KBVs:a koodittavan alueen liitoskohdan läheisyydessä plasmidissa pBR322/PH05/HBVs.
Kuva 26 on kaavioesitys hiivan ilmentämisplasmidien pJDB207/PH05/HBVsA14 ja pJDB207/PHO5/HBVsAl4t rakentamisesta .
Kuva 27 on kaavioesitys hiivan ilmentämisplasmidien pJDB207/IF2(1'b)Δ ja pJDB207/IF2(51)Δ72 rakentamisesta.
Kuva 28 esittää plasmidien pJDB207/IF2(51)Δ72 ja pJDB207/IF2(5^)Δ82 nukleotidisekvenssejä Xhol-liitoskoh-dassa IFN-5^:n 3'-pään ei-luetun alueen ja PH05:n transkription päätösalueen välissä.
Kuva 29 on kaavioesitys plasmidin CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 rakentamisesta.
28 80720
Kuva 30 esittää plasmidien CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 ja CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258 rakenteita.
Kuva 31 esittää kaaviollisesti PH05:n signaalisekvens-sin poistamisen ilmentämisplasmidista p31 ja erityisesti plasmidin p31/R rakentamisen.
Kuva 32 on kaavioesitys kloonikokoelmasta, joka saatiin kuvassa 31 hahmotellulla menetelmällä.
Kuvat 33 ja 34 esittävät BamHI-EcoRI-restriktiojaksojen nukleotidisekvenssejä, jotka sisältävät PH05/R- ja PH05/Y-promoottorialueet.
Kuvat 35 - 37 ovat kaavioesityksiä menetelmästä, jolla IFN-a-3-, -a-2- ja -α-1-DNA liitetään plasmidiin p31/R. Kuva 38 on kaavioesitys plasmidin pJDB207R/IF(a-2) rakentamisesta.
Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavien esimerkkien avulla.
Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä:
EtBr: etidiumbromidi BSA: naudan seerumialbumiini DTT: 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaanidioli) EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo SDS: natriumdodekyylisulfaatti TNE: liuos, jossa on 100 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl
(pH 7,5) ja 1 mM EDTA
Tris.HCl: tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani, pH sää detty suolahapolla PMSF: fenyylimetaanisulfonyylifluoridi TE: liuos, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja
1 mM EDTA
Esimerkki 1: Hiivan geenikokoelman aikaansaaminen 30 Mg villihiivatyyppisen Saccharomyces cerevisiae-kannan S288C DNA:ta (23),jonka kokonaismolekyylipaino on suuri, inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa 2 yksikön kanssa EcoRI-metylaasia (New England Biolabs) 250 Ml:ssa EcoRI-mety- 29 80 720 lointipuskuria, kuten valmistaja on suositellut. DNA saostetaan etanolilla, suspendoidaan 500 yl:aan puskuria, jossa on 25 mM Tris.HCl pH 8,5 ja 2 mM MgC^ (EcoRI*-puskuri) (24), ja hajotetaan EcoRItlla (Boehringer), kunnes DNA-jaksojen kokojakautuman maksimi on alueella 30 - 50 kb (kun λDNA hajotetaan XhoI:llä, saadaan sopivat 33 kb ja 17 kb merkit). Hiivan DNA, joka on hajotettu EcoRI*-olosuhteissa, fraktioidaan koon perusteella sakkaroosigradientissa (5 - 20 % sakkaroosia puskurissa, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA) 6 tuntia nopeudella 38 000 1/min SW 40-roottorissa. Gradientin päältä kerätään 40 kpl 0,4 ml jaetta. Jae 16 sisältää DNA-jaksot, joiden pituus on 30 - 40 kb. Tämän jakeen sisältämä DNA (3 yg) saostetaan etanolilla ja liitetään 16 tunnin aikana 15°C:ssa 15 yl:n kokonaistilavuudessa 1 yg:aan kosmidivektoria pYc1 (25), joka on tehty lineaariseksi EcoRI:llä. Liittäminen suoritetaan 300 yksiköllä T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) käyttämällä valmistajan kuvaamaa puskurisysteemiä. DNA pakataan in vitro bakteriofaagi-λ :aan (26) ja kootut faagit siirretään E. coli-kantaan HB101 (r^, mk, leu , pro , recA ). Siirron tehokkuus on noin 5000 ampisilliinin suhteen vastustuskykyistä pesäkettä per yg pYc1-vektoria.
£ 3000 amp -pesäkettä poimitaan ja kasvatetaan erikseen mikrotitrauslevyjen koloissa LB-alustassa (10 g Bacto-Tryptonea (Difco), 5 g Bacto-hiivauutetta (Difco), 10 g NaCl), jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä.
Esimerkki 2: Säädettävissä olevan happofosfataasin geenin PH05 eristäminen
Geenikokoelman kopioita kasvatetaan LB-agarlevyillä (LB-alusta + 15 g/1 agaria), joissa on 100 yg/ml ampisilliiniä. 500 pesäkkeen solumateriaali pestään levyiltä ja kerätään yhteen eriksi. DNA eristetään yksittäisistä eristä seuraavalla tavalla: 3o 80720
Solut otetaan talteen sentrifugoimalla (Sorvali, GSA-roottori, 10 min, 6000 1/min, 4°C), suspendoidaan uudestaan 100 ml:aan TE-liuosta (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) ja sentrifugoidaan uudestaan edellämainituissa olosuhteissa. Solupelletti suspendoidaan uudestaan 3 ml:aan Tsuc-liuosta (50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 25 % (paino/tilavuus) sakkaroosia) ja siirretään SS-34-poly-propyleenisiin Sorvall-putkiin. Kaikki seuraavat vaiheet suoritetaan jään päällä. Lisätään 0,3 ml lysotsyy-miliuosta (10 mg/ml, ostettu Worthingtonilta, 11 000 U/mg), 5 min kuluttua lisätään 1,2 ml EDTA (500 mM, pH 8,0) ja vielä 5 min kuluttua lisätään 4,8 ml pinta-aktiivista ainetta (0,1 % Triton X-100 (merck), 50 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl, pH 8,0). 5 minuutin kuluttua lysaatti sentri fugoidaan esijäähdytetyssä SS-34-roottorissa (40 min, 4°C). Emäliuos poistetaan huolellisesti ja lisätään kiinteätä CsCl (8,3 g CsCl per 8,7 ml emäliuosta). Kun on lisätty etidiumbromidi (Sigma) (lopullinen väkevyys 1 mg/ml emäliuosta), liuos siirretään 13,5 ml:n Quick Seal-poly-allomeeriputkiin (Beckman) ja sentrifugoidaan Beckman Ti50-roottorissa 40 tuntia nopeudella 40 000 1/min. Kaksi fluorisoivaa kaistaa voidaan nähdä pitkäaaltoisella UV-valolla (366 nm). Alempi kaista sisältää erittäin kiertynyttä plasmidi-DNA:ta, joka otetaan talteen puhkaisemalla putki sivusta 2 ml:n ruiskulla (18G-neula). Etidiumbromidi poistetaan uuttamalla 5 kertaa yhtä suurilla tilavuuksilla isopropanolia (kyllästetty CsCl:11a) ja tuote siirretään 30 ml:n Corex-putkiin. Lisätään 2,5 tilavuutta TE-liuosta ja DNA saostetaan etanolilla. Sitten liuosta pidetään 12 - 15 tuntia -20°C:ssa. Saostunut DNA otetaan talteen sentrifugoimalla Sorvali HB-4-roottorissa 30 min nopeudella 12 000 1/min 0°C:ssa ja liuotetaan uudestaan 200 yl:aan TE-liuosta. 100 ml:sta viljelmää saadaan 50 - 100 yg yhdistelmäplasmidi-DNA:ta.
3' 80720 Näistä eristä saadulla plasmidi-DNA:11a transformoidaan S. cerevisiae-kanta AH216 (a, his3, leu3, pho3, pho5) noudattamalla menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Hinnen et ai. (1). Hiivatransformanteista kasvatetaan jäljennökset levyillä, joissa on alhainen P.-mini-mikasvualusta (kuten "Difcon minimaalinen kasvualusta ilman aminohappoja" täydennettynä 20 g/1 glukoosia, mutta valmistettu aineosista Difcon reseptin mukaan (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA) paitsi, että käytetään 0,03 g/1 KI^PO^ + 1 g/1 KC1 eikä 1 g/1 KI^PO^) ja värjätään happofosfataasiaktiivisuuden suhteen laittamalla päälle värjäysagar (1% Difco-agar 100 mM asetaattipuskurissa pH 4,0, 2 mg/ml Fast Blue B-suolaa (Serva) ja 0,2 mg/ml α-naftyylifosfaattia (Serva)). Pesäkkeet, joissa on funktionaalinen PH05-geeni, värjäytyvät punaisiksi, koska geenin toiminta kytkeytyy päälle alhaisessa P^-alustassa. Kun alaeriä kerätään yhteen (17), löytyy geenikokoelmasta 3 riippumatonta kloonia, joilla on säädettävissä oleva happofosfataasiaktiivisuus.
Yhdelle näistä klooneista (pG7) suoritetaan jatkoana-lyysi. Yhdistelmäplasmidin koko on 42 kb. pG7:n EcoRI-ja BamHI-palaset jatkokloonataan plasmideihin pBR322/HIS3 (16) ja pJDB207 (28) vastaavasti. Restriktiokatkaisut suoritetaan valmistajan suosittelemalla tavalla (New England Biolabs) ja liittämiset suoritetaan 20 yl:ssa käyttämällä 150 U T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) ja 20 yg/ml yksittäisiä hajotettuja plasmideja (New England Biolabsin suosittelemissa olosuhteissa). 5,1 kb:n BamHI-palanen, joka on osa 8 kb:n EcoRI-palasesta, jatko-kloonataan hiivavektoriin pJDB207, ja sen jälkeen kun on suoritettu hiivakannan AH216 transformointi, tämä yhdistel-mäplasmidi (pJDB207/PHO5, PH03, ks. kuva 1) tuottaa korkean fosfataasiaktiivisuuden päällekytkeytymisolosuhteissa (alhainen P^-) (PH05-geeni) ja matalan aktiivisuustason normaalissa hiivan minimaalisessa kasvualustassa (PH03-geeni ilmentyy).
32 8 0 7 2 0
Esimerkki 3: PH05- ja PH03-geenin paikantaminen ja DNA:n sekvenssinmääritys a. PH05-geeni PH03:n ja PH05:n paikantamisessa BamHI-palasen sisällä käytetään hyväksi Sau3A:n katkaisukohtien ryhmitel-mää ja ainoata esiintyvää Pstl-kohtaa. Kun BamHI-pala-nen hajotetaan restriktioendonukleaasilla Sau3A (New England Biolabs), saadaan 6 palasta (A-F,kuva 2). Kun Sau3A:lla osittain hajotettu tuote jatkokloonataan itsestään toisiintuvan hiivavektorin pJDB207 BamHI-kohtaan, saadaan plasmideja, joissa on erilaisia Sau3A-jaksoyhdis-telmiä. Sitten näillä plasmideilla transformoidaan pho3,pho5-mutanttihiiva S. cerevisiae AH216. Transfor-manttien happofosfataasiaktiivisuus tarkistetaan sen jälkeen, kun niitä on kasvatettu joko matala-P^-alustaa tai normaalia minimaalista alustaa sisältävillä levyillä. Kloonit, jotka sisältävät ainakin Sau3A-palaset A ja B {kuva 2, no:t 1-4) ilmentävät happofosfataasin samalla tasolla (kvalitatiiviset arviot, kun on peitetty happofosfataasia värjäävällä agarilla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla) kuin koko 5,1 kb:n BamHI-palanen. Ilmentymistä säädellään tavallisesti kasvualustan sisältämällä epäorgaanisen fosfaatin väkevyydellä. Kloonit, joissa on ainoastaan Sau3A-palanen A (kuva 2, no:t 5,6) ilmentävät matalia happofosfataasitasoja, johon ei vaikuta epäorgaanisen fosfaatin väkevyys kasvualustassa. Tämä ilmaisee sen, että Sau3A-palasen A sisältämä informaatio riittää konstitutiivisen happofosfa taa s in (PH03) ilmentymiseen. Sau3A-palanen B (kuva 2, no. 7) ei yksin johda minkään happofosf ataasin ilmentymiseen, ei päältä pois kytkevissä eikä päälle kytkevissä olosuhteissa. Kuitenkin alaklooni, jossa on BamHI-kohdan ja Pstl-kohdan välinen täydellinen sekvenssi (kuva 2, no. 10) osoittaa happofosfataasin säädeltyä, mutta ei konstitutiivista syntetisoitumista. Tämän alakloonin pitää silloin sisältää hiivan PH05-geeni (16).
33 8 0 7 2 0 PH05-geenin tarkka sijainti määritetään DNA-senvens-sinmäärityksellä Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (15).
632 bp sisältävä BamHI-Sall-restriktiopalanen kloonataan plasmidiin pBR322 (ks. kuva 1) korvaamalla sen BamHI-Sall-palanen, joka ulottuu kohdasta 375 kohtaan 650 (pBR322:ssa käytetty merkitsemistapa), käyttämällä hajotus- ja liittämisolosuhteita, jotka on selostettu edellä (kaikki entsyymit ovat New England Biolabsilta). BamHI-Sall-DNA-liitännäisen DNA-jaksot on radioaktiivi-sesti merkitty asymmetrisesti 5'-päistään seuraavista kohdista: Bam HI (-541), Sau3A (-200) ja Sali (+82), (numeroinnin suhteen ks. kuva 3a). 623 bp sisältävän
BamHI-Sall-DNA-liitännäisen nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 3a. Siitä ilmenee, että liitännäinen sisältää PHO5-promoottorialueen ja osan PH05-fosfataasipro-teiinia koodittavasta alueesta.
b. PH03-geeni PH03-geenin tarkka paikka määritetään DNA-sekvenssin-määrityksellä käyttämällä apuna käsikirjaa "M13 cloning and DNA sequencing system", julkaisija New England Biolabs. 416 bp sisältävä (5')Pstl-RsaI(3')-palanen jatkokloonataan vektoreihin M13mp8 ja M13mp9 (49) käyttämällä ainoita PstI- ja Smal-restriktiokohtia. 416 bp sisältävän Pstl-
Rsal-DNA-liitännäisen nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 3b. Siitä ilmenee, että liitännäinen sisältää PHO3-promoottorialueen ja osan PH03-happofosfataasiproteii-nia koodittavasta sekvenssistä.
Esimerkki 4: Plasmidin p30 rakentaminen (ks. kuva 4) a) Ball-katkaisukohdan eliminointi plasmidista pBR322
Kuvassa 4 esitetty kaavio edellyttää ainoan Ball-katakisukohdan eliminoimista plasmidista pBR322. 3 jjg plasmidi pBR322 hajotetaan täydellisesti restriktio-endonukleaaseilla Ball (BRL) ja PvuII (Biolabs) valmis- 34 80720 tajan ohjeiden mukaan. Ballrllä ja PvuII:lla hajotettu pBR322 johtaa kahteen restriktiopalaseen, joiden koot ovat 3738 bp ja 622 bp. Kyseiset kaksi palasta erotetaan toisistaan matalalla sulavassa agaroosigeelissä (Sigma) (1%), joka on tehty TBE-puskuriin (90 mM Tris.HCl pH 8,3, 2,5 mM EDTA, 90 mM boorihappoa). DNA-kaistat värjätään etidiumbromidilla ja tehdään näkyviksi pitkäaaltoisella UV-valolla allonpituudella 366 nm. Se agaroosipala, joka sisältää 3738 bp pituisen jakson, leikataan irti geelistä, geeli nesteytetään 65°C:ssa, säädetään 500 mM NaCl-pitoisuuteen ja inkuboidaan 20 minuuttia 65°C:ssa. Lisätään yksi tilavuus fenolia (tasapainotettu pitoisuuteen 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1mM EDTA, 500 mM NaCl). Vesifaa-si uutetaan kahdesti uudelleen fenonilla ja kerran kloroformilla. DNA saostetaan 2,5 tilavuudella kylmää absoluuttista etanolia ja otetaan talteen sentrifugoimalla. Pelletti pestään kylmällä 80-prosenttisella etanolilla ja kuivataan vakuumissa. DNA suspendoidaan uudestaan TE-liuokseen väkevyyteen 0,15 mg/ml.
Eristetyssä 3738 bp sisältävässä DNA-palasessa on kaksi tylppää päätä, jotka aiheutuvat Ball:llä ja PvuII:lla suoritetusta kaksoishajotuksesta. DNA saatetaan renkaan muotoon liittämällä tylpät päät yhteen.
0,6 pg DNA:ta inkuboidaan yön yli huoneenlämpötilassa 30 piissä liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 900 U T4 DNA-ligaasia (Biolabs). 5 pl erätliittämisseosta lisätään 50 uljaan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli BH101-soluja, jotka oli käsitelty menetelmällä Mandel et ai. (29). Seosta pidetään jäällä 5 minuuttia, sen jälkeen sitä inkuboidaan 2 minuuttia 37°C:ssa ja jätetään 19 minuutiksi huoneenlämpötilaan enenkuin suoritetaan viljely LB-agarlevyillä, joissa on 100ug/ml ampi-silliiniä. Poimitaan kuusi amp -pesäkettä ja niitä kasvatetaan erikseen 100 ml:ssa LB-alustaa (kuten edellä, 35 8 0 7 2 0 mutta ilman agaria), jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan soluista esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Hajotustuotteet, jotka on saatu käsittelemällä plasmidit HaeIII:lla (ostettu Biolabsista, hajo-tusolosuhteet valmistajan suosittelemat), PvuII:lla ja Ball:llä, analysoidaan 1,5-prosenttisessa agaroosigee-lissä, joka on tehty TBE-puskuriin. Katkaisukohtakartta ja vastamuodostuneen liitoksen ennakoitu koko viittaa-vat siihen, että plasmidit ovat identtisiä ja sisältävät kaikki pBR322:n sekvenssit lukuunottamatta Ball-PvuII-palasta. Näissä plasmideissa ei ole Ball-katkaisu-kohtaa, ja niistä käytetään nimitystä pBR322&BalI.
b) Hiivan PH05:n ja PH03:n sisältävän BamHI-restrik-tiopalasen (5,1 kb) kloonaus plasmidiin pBR322ÄBalI
pJDB207/PHO5,PH03 (ks. kuva 1) sisältää hiivan 5,1 kb:n BamHI-liitännäisen, jossa on säädeltävissä olevan ja konstitutiivisen hiivan happofosfataasin geenit (PH05 ja PH03). pJDB207/PHO5,PH03 sekä plasmidi pBR322&BalI hajotetaan restriktioendonukleaasilla BamHI. Täydellisen hajoamisen tapahduttua enstyymi inaktivoidan pitämällä 2 min 65°C:ssa. Kumpikin DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8,0, väkevyyteen 0,2 mg/ml kukin. 0,5 yg kutakin kahdesta BamHI:11a hajotetusta DNA:sta yhdistetään ja liitetään toisiinsa 20 yl:ssa liittämispuskuria (kuten New England Biolabs on suositellut), jossa on 300 U T4 DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 20 tuntia 15°C:ssa. 5 yl:n erät liittämisseosta lisätään 50 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja ja transformointi suoritetaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Transformoitujen E. colisolujen vastustuskyky ampisilliinin ja
R R
tetrasykliinin suhteen tutkitaan. Kahdeksan amp ,tet -pesäkettä eristetään ja kasvatetaan 100 mlrssa LB-alustaa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA eristetään 36 8 0 7 2 0 soluista (ks. esimerkki 2). Kun suoritetaan katkaisu BamHI:llä, havaitaan, että 4 plasmidia sisältää 5,1 kb:n liitännäisen sekä 3,7 kb:n vektoripalasen (pBR322ÄBalI).
Kun suoritetaan katkaisu Sällillä (New England Biolabs), saadaan selville liitetyn 5,1 kb:n palasen suunta: kah dessa plasmidissa on liitännäinen kuvan 4 mukaisessa suunnassa. Yhdelle niistä annetaan nimitys p30. PH05,PH03-geenien transkriptio 5,1 kb:n liitännäisessä tapahtuu vastapäivään, kuten kuvassa 4 on esitetty.
Esimerkki 5: Vieraan DNA:n liittäminen plasmidiin p30 (ks. kuva 4) a) EcoRI-Ball-palasen (3,9 kb) eristäminen plasmidista p30 (A-palanen) 10 yg plasmidin p30 DNA:ta katkaistaan restriktio-endonukleaasilla Ball. Suoritetaan uutto fenolilla ja klororomilla ja DNA saostetaan etanolilla. DNA suspendoi-daan uudestaan 100 yl:aan TE-puskuria. Hajotustuotteet erotetaan toisistaan preparatiivisella, matalalla sulavalla agaroosigeelillä (0,8 %) (Sigma). 5,1 kb:n palanen, joka sisältää plasmidin p30 vektoriosan, eluoidaan geelistä esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. DNA puhdistetaan adsorboimalla se DE52-ioninvaihtopylvääseen (Whatman) laimeaa suolaliuosta sisältävässä puskurissa (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1mM EDTA) ja eluoimalla sen jälkeen väkevää suolaliuosta sisältävällä puskurilla (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0 ja 1 mM EDTA). DNA saostetaan etanolilla ja sen jälkeen katkaistaan edelleen EcoRIillä (Boehringer). 3,9 kb:n EcoRI-Ball-restriktiopalanen ero tetaan sen jälkeen preparatiivisella, matalalla sulavalla agaroosigeelillä (0,8 %) ja otetaan talteen esimerkissä 4a kuvatulla tavalla ja saostetaan etanolilla. Tätä DNA-jaksoa kutsutaan A-palaseksi.
b) Haelll-EcoRI-palasen (602 bp) eristäminen plasmidista CG-p-BR322/HLycIFN-8 .j (B-palanen) 37 80720 E. coli-kantaa HB-101 CG-pBR322/HLycIFN-8j (ks. esimerkki 10 E) kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, johon on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä, ja plasmidi eristetään esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. 9 yg HLycIFN-8 .j-DNA: ta hajotetaan täysin restriktioendonuk-leaasilla Haelll. Hajotustuotteet erotetaan toisistaan preparatiivisella, matalalla sulavalla agaroosigeelillä (0,8 %). 940 bp:n Haelll-palanen leikataan irti ja eluoidaan agaroosigeelistä esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. DNA puhdistetaan DE52:lla, kuten esimerkissä 5a on kuvattu, ja katkaistaan sen jälkeen EcoRIrllä.
602 bp:n EcoRI-Haelll-palanen puolestaan erotetaan preparatiivisella, matalalla sulavalla agaroosigeelillä (0,8 %), otetaan talteen esimerkissä 4a kuvatulla tavalla ja saostetaan etanolilla. Tätä DNA-jaksoa kutsutaan B-palaseksi.
c) A-palasen ja B-palasen liittäminen yhteen (ks. kuva 5)
Kyseiset kaksi restriktiopalasta voidaan liittää yhteen lomittaisista EcoRI-päistä ja tylpistä Ball- ja Haelll-päistä vastaavasti, jolloin syntyy rengasmainen molekyyli, jossa on yksi ainoa EcoRI-kohta ja Ball-Haelll-liitos, joka katkeaa HaeIII:lla (mutta ei katkea Ball: llä) .
Liittäminen suoritetaan puskurisysteemissä, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 16 tuntia 23°C:ssa ja DNA-väkevyyden 20 yg/ml A-palasta ja 3 yg/ml B-palasta ja kokonaistilavuuden 10 yl.
d) E.coli HB101:n transformointi yhteenliitetyillä palasilla 2 yl:n erät liitosseosta (esimerkki 5c) lisätään 50 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E.coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a). Sitten seoksia kasvatetaan LB-agarlevyillä, joihin on lisätty 100 yg/ml ampisilliiniä. Levyjä inkuboidaan 16 tuntia 37°C:ssa.
38 80720 Näin saadaan noin 300 ampisilliinin suhteen vastustuskykyistä E. coli HB101-pesäkettä. Kahdeksasta ampisilliinin suhteen vastustuskykyisestä pesäkkeestä eristetään plasmidi-DNA. suoritetaan analyysi ja niiden rakenne määritetään vertaamalla EcoRIrllä ia HaeIII:lla saatujen restrictiopalasten liikkuvuutta standardi DNA:han (bakteriofaagi Am DNA, joka on hajotettu Hindlllrlla (New England Biolabs) , p30-plasmidi-DNA, joka on hajotettu Haelllrlla ja EcoRI:llä). Kun liitoskohtien rakenne on todettu, saadaan 5 plasmidia, joissa on oikea rakenne. Yhdelle näistä plasmideista, joissa on PH05-pro- moottori liittyneenä 8 '-interferonipolypeDtidiä kooditta- ' » vaan alueeseen (ks. kuva 5) annetaan nimitys p30IFN1(8^).
Esimerkki 6: Hiivan toisiintumisen alkukohdan ja selek tiivisen merkkikohdan lisääminen (ks. kuva 4) a) EcoRI-palasen (1,5 kb) eristäminen plasmidista Yrp7 ja sen liittäminen plasmidiin p30IFN1(8.j)
Liittämisreaktion helpottamiseksi 1,5 kb:n EcoRI-restriktiopalanen puhdistetaan. Plasmidi Yrp7 (4) leikataan EcoRIrllä, saadut kaksi palasta erotetaan toisistaan 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä ja 1,5 kbrn palanen, joka sisältää hiivan autonomisesti toisiintuvan jakson ja hiivan TRP1-geenin, puhdistetaan ja eristetään esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Liittäminen suoritetaan (New England Biolabsin ehdottamalla tavalla) käyttämällä 20 ug/ml EcoRIrllä leikattua p30IFNl (8.j)-plasmidia ja 10 lig/ml Yrp7rstä saatua 1,5 kbrn EcoRI-restriktiopalasta ja 100 yksikköä T4-ligaasia.
b) E. coli JA 194rn transformointi yhteenliitetyillä palasilla
Plasmidit, jotka sisältävät hiivan TRP1-geenin voidaan suoraan valita transformoimalla E. coli trpCrn mutant-tikanta JA 194 (trpC, leuB, B1). E.coli trpC-geeni koo-dittaa E. coli N-(5'-fosforibosyyli)antranilaatti-isome- 39 8 0 7 2 0 raasia. E.coli trpC-mutantit voidaan täydentää hiivan TRP1-geenillä (4). E. coli-kannan JA 194 transformointi suoritetaan samoin kuin E. coli HB101:n (ks. esimerkki 4a) kohdalla on selostettu, mutta seuraavin muunnoksin: ennen agarlevyille levittämistä solujen annetaan toipua 1 ml:ssa LB-alustaa 60 minuuttia 37°C:ssa; solut pestään kerran E. coli M9:n minimaalisella kasvualustalla (30) ja levitetään M9:n minimaaliselle kasvualustalle, johon on lisätty B1-vitamiinia (1 yg/ml) ja L-leusiinia (20 mg/ml). Levyjä inkuboidaan 2 vuorokautta 37°C:ssa. Näin saadaan noin 1000 tryptofaanin suhteen prototrofista E.coli-pesäkettä.
c) Yhdistelmäplasmidien eristäminen ja tunnistaminen
Trp+-pesäkkeet puhdistetaan LB-levyillä, joihin on lisätty 100 yg/ml ampisilliinia. Yksittäiset pesäkkeet poimitaan ja plasmidit erotetaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Puhdistetut plasmidit analysoidaan mittaamalla niiden restriktiopalasten koot, jotka on saatu katkaisemalla EcoRI-, Hindlll-, PstI- ja Bglll-entsyymillä (Biolabs). Näin saadaan kaksi eri plasmidia, jotka sisältävät 1,5 kb:n EcoRI-restriktiopalasen kyseisissä kahdessa mahdollisessa suunnassa (ks. kuva 4). Niille annetaan nimitykset p30IFN2(8.j) ja p30IFN2 ' (8.j ) , kuten kuvaan 4 on merkitty.
Esimerkki 7: Saccharomyces cerevisiae RH971:n transfor mointi ja interferonituotannon aikaansaaminen
Plasmidit p30IFN2(8j) ja p30IFN2'(8^) siirretään kukin Saccharomyces cerevisiae-kantaan RH971 (a, trp1 , leu2, his4) samoin kuin on kuvattu julkaisussa Hinnen et ai. (1). 1 |ig plasmidi-DNA: ta lisätään 100 plraan sferoplastisuspensiota ja seos käsitellään polyetyleeni-glykolilla julkaisussa (1) kuvatulla tavalla. Sfero-plastit sekoitetaan 10 mlraan regenerointiagaria ja le- 40 80 720 vitetään hiivan minimaalista kasvualustaa sisältäville levyille, joissa ei ole leusiinia. Kun on inkuboitu noin 3 vuorokautta, saadaan noin 1000 transformoitunutta solua.
Yksi ainoa hiivapesäke poimitaan hiivan trans-formointilevyiItä (nimeltään Saccharomyces cerevisiae RH971/p30IFN2(Rjj) ja /p30IFN2 ' (8 ·) , vastaavasti) ja sitä kasvatetaan 10 ml:ssa hiivan minimaalista kasvualustaa 100 ml:n Erlenmeyer-pullossa 24 tunnin ajan 30°C:ssa *7 nopeudella 200 1/min solutiheyteen noin 2-3x10 solua/ml. Solut pestään kerran 20 ml:11a alhaisen P^:n minimaalista kasvualustaa. 3 ml uudelleensuspendoituja soluja siirrostetaan 300 ml:aan alhaisen P.:n minimaalista kasvualustaa ja 300 ml:aan normaalia minimaalista kasvualustaa, vastaavasti, 1000 ml:n Erlenmeyer-pulloissa. Inkubointi suoritetaan 30°C:ssa nopeudella 160 1/min.
PH05-promoottorin induktiota seurataan mittaamalla happofosfataasiaktiivisuuden esiintyminen kokonaisissa soluissa menetelmällä, jota Toh-e et ai. ovat kuvanneet (31). Soluja kasvatetaan tiheyteen noin 7 1-2x10 solua/ml (26-30 tunhin inkubointi)
Esimerkki 8: Hiivasolu-uutteiden valmistus ja interte-fonitiitterin määritys 300 ml:n kasvualustasta (ks. esimerkki 7), jonka 7 solutiheys on 1-2x10 /ml, kerätään solut talteen sentri-fugoimalla Sorvali GSA-roottorissa 5 minuuttia nopeudella 8000 1/min 4°C:ssa. Solut pestään kerran 100 ml:11a vettä ja suspendoidaan uudelleen 6 ml:aan jääkylmää rikkomisseosta (0,1M kaliumfosfaattipuskuri pH 7,4, 1% (tilavuusosina) Triton X-100, 0,0001M PMSF (Merck)) ja siirretään 30 ml:n corex-putkeen. Suspensiota sentri-fugoidaan vielä 5 minuuttia Sorvali SS-34-roottorissa nopeudella 8000 1/min 4°C:ssa ja suspendoidaan uudelleen 3 ml:aan rikkomisseosta 0°C:ssa. Solususpensioon lisä- 41 80720 tään 4 g lasihelraiä (halkaisija 0,4 mm) ja suspensiota ravistellaan Vortex Mixerissä (Scientific Instruments Inc., USA) täydellä nopeudella 30 sekuntia ja sen jälkeen sitä jäähdytetään 1 minuutti jäähauteella. Tämä ravistelu-toimenpide toistetaan 5-10 kertaa, kunnes yli 90 % soluista on rikkoutunut (tarkistetaan valomikroskoopilla). Rikkoutunut solumateriaali ja lasihelmet poistetaan liuoksesta sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 8000 1/min Sorvali HB-4-roottorissa. Emäliuos siirretään Eppendorf-putkiin, jäädytetään nestemäisessä typessä ja säilytetään -60°C:ssa. Interferoniaktiivisuus määritetään Armstrongin menetelmällä (32) käyttämällä ihmisen CCL-23-soluja ja rakkulastomatiittivirusta (VSV) ärsytysviruksena. Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 1.
Taulukko 1
Saccharomyces cerevisiae-kannan RH971 interferoniaktiivisuus sen jälkeen kun se on transformoitu plasmidei11a p30lFN2(8.j) ja p30lFN2' (8.J) vastaavasti sekä myös plas-midilla pJDB207/IFN2 ' (8.J) (ks. esimerkki 9)
Interferoniaktiivisuus ilmaistuna yksiköissä/ml hiivasolu-uutetta plasmidi p30lFN2(8^) p30lFN2'(8^) pJDB207/IFN2'(8’) kytketty pois päältä (normaali fosfaattipi- 0 30 100 toisuus) kytketty päälle (alhainen fosfaattipitoi- 700 7000 50000 suus)
Esimerkki 9: Interferonigeenin liittäminen suuren kopio- määrän tuottavaan hiivan 2y-vektoriin pJDB 207 (ks. kuva 6).
Plasmidi p30IFN2 ' (8 .j) katkaistaan restriktioendonuk-leaaseilla Hindlll ja BamHI noudattamalla valmistajan oh- 42 80720 jeita (Biolabs). Saadaan kaksi palasta, joiden koot ovat 4,0 kb ja 2,0 kb. 2,0 kb:n jae erotetaan ja puhdistetaan käyttämällä matalla sulavassa agaroosi-geelissä tehtyä geelielektroforeesia, jota on selostettu kohdassa 4a.
Plasmidi pJDB207 (28) katkaistaan restriktioendo-nukleaaseilla Hindlll ja BamHI. Tällöin syntyy kolme palasta. 6,5 kb:n restriktiopalanen erotetaan edelläkuvatulla tavalla.
0,3 yg 2,0 kb:n palasta (joka sisältää PH05-promoot-torin liittyneenä interferoniproteiinia koodittavaan alueeseen) liitetään 15 tunnin ajan 6,5 kb:n vektori-palaseen reaktioliuoksen kokonaistilavuuden ollessa 20 ui ja käyttämällä 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia valmistajan kuvaamissa olosuhteissa (Biolabs). E. coli HB101-solut transformoidaan ja ampisilliinin suhteen vastustuskykyiset pesäkkeet valitaan. Plasmidi-DNA eristetään ja eristetyn plasmidi-DNA:n oikea rakenne todetaan restriktiokatkaisuilla käyttämällä entsyymejä Hindlll ja BamHI ja käyttämällä molekyylipainostandar-deina samoilla entsyymeillä katkaistuja plasmideja p30IFN2’(8^j) ja pJDB207. Saadulle uudelle plasmidille annetaan nimitys pJDB207/IFN2'(8j).
Plasmidi pJDB207/IFN2 ' (8Jj) transformoidaan S.cere-visiae-kantaan RH971 julkaisussa (1) kuvatulla tavalla valitsemalla leusiinin suhteen prototrooppiset pesäkkeet. Yksi leusiinin suhteen prototrooppinen hiiva-pesäke (nimeltään Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/ IFN2'(8.j)) poimitaan ja sitä kasvatetaan esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Interferonitiitteri määritetään esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Tulokset on esitetty taulukossa 1 .
43 80720
Esimerkki 10: Sellaisten E. coli-kantojen valmistus, jotka ovat transformoituneet yhdistelmäplasmideilla, jotka sisältävät ihmisen lymfoblastoidi-interferoneja koodattavat alueet A. HuIFN mRNA:n suhteen rikastetun poly(A) RNA:n eristäminen (kuva 7) a) Namalwa-solujen indusointi
Namalwa-soluja kasvatetaan RPMI 1640-kasvualustassa, jossa on 10 % naudan sikiöaikaista seerumia, 37°C lämpötilassa. Kun solutiheys on 3x10^ solua/ml, suspensio sentrifugoidaan nopeudella 800x g 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kerätyt solut suspendoidaan 200 ml: aan kasvualustaa, jossa on glutamiinia-(0,027 tilavuus-%), penisilliiniä (100 yksikköä/ml) ja streptomysiiniä (50 yg/ml). Soluja inkuboidaan 90 minuuttia 37°C:ssa Newcastle-sairausviruksen (NDV 110) kanssa suhteessa 190 HAU/10^ solua (HAU = hemagglutinaatioyksikköä). Lisäämällä tuoretta kasvualustaa solutiheys säädetään ar- g voon 1,3x10 solua/ml ja solususpensiota ravistellaan 34°C:ssa nopeudella 100 1/min. 12 tunnin kuluttua kerä- 9 tään talteen 6x10 solua ja ne suspendoidaan uudelleen 50 ml:aan fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta ("PBS": 1 1 PBS-liuosta sisältää 80 g NaCl, 2 g KC1, 14,4 g Na2HP0^ ja 2 g KH2PO4). Ennen solujen korjuuta otetaan näyte ja interferoniaktiivisuus määritetään Armstrongin menetelmällä (32) käyttämällä ihmisen CCL-23-soluja ja rakkulastomatiittivirusta ärsytysvjruksena. Näin saadaan tulokseksi 4300 IFN-yksikköä/ml.
b) Solujen rikkominen ja deproteinisointi 9
Solususpensio (6x10 solua 50 ml:ssa PBS-puskuria) lisätään huoneenlämpötilassa 800 mlraan hajotuspuskuria, jossa on 0,05 M Tris.HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA ja 2% SDS (kiteinen tutkimuslaatu, Serva). Lysaattia hajotetaan määrällä 0,2 mg/ml esi-inkuboitua (2 h 37°C:ssa) proteaasia (Protease P, type VI, Sigma) huoneenlämpötilassa sekoittamalla 1 tunnin ajan. Liuoksesta poistetaan pro 44 80720 teiini uuttamalla 3 kertaa 500 ml:11a fenolilla kyllästettyä TNE-liuosta ja 5 kertaa 500 ml :11a kloroformia. Näin saadaan 500 mg nukleiinihappoja, kun mitataan absorbanssina 260 nmrssa.
c) Kontaminoivan DNA:n ja RNA:n poistaminen
Hieman viskoosinen vesiliuos, joka on saatu edelläkuvatulla tavalla(vaihe Ab), säädetään pitoisuuteen 0,3 M NaCl ja 1 g oligo(dT)selluloosaa (tyyppi 7, P-L Biochemicals). Kun on sekoitettu 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, suspensio sentrifuogidaan 1 litran Sorvall-pulloissa Sorvali RC-3-sentrifugissa nopeudella 4000 1/min 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja oligo(dT) -liete pestään kahdesti 40 ml :11a 2xTNE, jossa on 0,5 % SDS. Sitoutunut poly(A) RNA eluoidaan sen jälkeen viidellä peräkkäisellä pesulla (2,4 ml H2<D) . N&in saadaan 720 yg poly(A) RNA:ta optisen tiheyden perusteella määritettynä. Ensimmäisen adsorption jälkeen saatu emäliuos-RNA adsorboidaan toisen kerran 1 g:aan oligo(dT)-selluloosaa ja eluoidaan edelläkuvatulla tavalla, jolloin saadaan 320 yg poly(A) RNA:ta. Eluaatit yhdistetään, säädetään TNE-liuokseksi ja poly(A) RNA saostetaan 67-prosenttisella etanolilla -20°C:ssa 10 tunnin ajan. RNA otetaan talteen sentrifugoimalla nopeudella 10 000 1/min Sorwall RC-5B-sentrifugissa 10 minuuttia 0°C:ssa. Sakka (1 mg) liuotetaan uudestaan 1 ml:aan 1mM EDTA.
RNA:n HuIFN mRNA-aktiivisuus tutkitaan injektoimalla Xenopus laevis-sammakon varhaismunasoluihin seuraa-valla tavalla: 50 nl RNA-liuosta injektoidaan kuhunkin 20 varhais-munasolusta. Varhaismunasoluja inkuboidaan Barth-alus-tassa (2 mM Tris, 88 mM NaCl, 1mM KCl, 0,33 mM Ca(N03).H20, 0,41 mM CaCl2.2H20, 0,82 mM MgS04.7H20, 2,4 mM NaHCC>3, 0,01 mg/ml penisilliiniä, 0,01 mg/ml streptomysiiniä ja liuoksen pH säädetään suolahapolla arvoon 7,6) julkai 45 80720 sujen Gurdon (33), Barth (34) ja Colman et ai. (35) mukaan. Injektoituja varhaismunasoluja inkuboidaan 42-48 tuntia ja inkubointiväliaine poistetaan, sentrifugoi-daan 5 minuuttia Eppendorf-sentrifugissa ja emäliuosta säilytetään -20 - -80°C:ssa, kunnes se käytetään määrityksessä. IFN-aktiivisuus määritetään oleellisesti ottaen Armstrongin menetelmän mukaan (32) paitsi, että VSV-virusta käytetään ärsytysviruksena Hep-2-soluissa (Flow Laboratories). Varhaismunasolu-uutteen ominais-aktiivisuus on 600 IU interferonia per yg injektoitua RNA:ta.
d) Poly(A) RNA:n rikastaminen HuIFN mRNA:n suhteen
Poly(A) RNA lasketaan Chelex-100-pylvään läpi (200-400 mesh, Bio-Rad) (pakatun pylvään tilavuus 0,5 ml). Pylväs huuhdellaan 1 ml:11a 1mM EDTA.
Eluaatti (1 mg poly(A) RNA:ta 2 ml:ssa EDTA) kuumennetaan 2 minuuttia 100°C:ssa ja sen jälkeen suoritetaan sentrifugointi sakkaroositiheysgardientin läpi (6 kpl 14 ml:n sakkaroosiliuoksia, joiden sakkaroositiheys nousee 5 prosentista 23 prosenttiin (paino/tilavuus), ja jotka sisältävät 50 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,2 M MaCl ja 1 mM EDTA). Sentrifugointi suoritetaan TST 41-roottorissa (Kontron AG) nopeudella 35 000 1/min 16 tunnissa 5 °C:ssa. 0,3 ml:n jakeet kerätään iSCO-gradienttien keräys-laitteeseen. Kuhunkin jakeeseen lisätään 2 tilavuutta etanolia ja liuoksen annetaan seisoa 10 tuntia - 20°C:ssa. Saostunut mRNA sentrifugoidaan talteen (Sorvali, HB-4-roottori, 0°C, 10 000 1/min, 10 minuuttia). Kunkin ja-keen sakka liuotetaan uudestaan 25 yl:aan 1 mM EDTA ja jokaisesta jakeesta määritetään ihmisen IFN mRNA-aktiivi-suus edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ac) paitsi, että RNA-näytettä kohti injektoidaan vain 10 varhaismunasolua eikä 20. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2.
46 80720
Taulukko 2
Sakkaroositiheysgradientin jakeista määritetty HuIFN mRNA-aktiivisuus jae n:o IFN-aktiivisuus (yksikköä/ml) 1-18 19 162 20 162 21 162 22 162 23 ei tutkittu 24 729 25 ei tutkittu 26 405 27 ei tutkittu 28 486 29 ei tutkittu 30 162 31 ei tutkittu 32 162 33 ei tutkittu 34 54 35-40 ei tutkittu i - — .
Jakeet 23 - 29 yhdistetään ja poly(A) RNA puhdistetaan seuraavalla tavalla:
Poly(A) RNA-liuos säädetään 2xTNE-väkevyyteen 0,5-pro-senttisessa SDS-liuoksessa ja siirretään 200 yl:n oligo(dT)selluloosapylvääseen. Pylväs pestään 2 ml:11a 0,5-prosenttista SDS-liuosta, jossa on 2xTNE, ja poly(A) RNA eluoidaan pesemällä 5 kertaa 0,5 ml :11a F^O. Elu-aatti säädetään TNE-pitoisuuteen ja liuos uutetaan kahdesti yhtä suurella tilavuudella fenolia (kylästetty TNE:llä) ja kahdesti yhtä suurella tilavuudella kloroformia.
47 80720
Poly(A) RNA seostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa 10 tunnin ajan ja otetaan talteen sentrifugoimalla HB-4-roottorissa edelläkuvatulla tavalla.
Poly(A) RNA liuotetaan 100 yl:aan 0,5 mM EDTA.
Saanto on 40 yg, kun mitataan optinen tiheys.
Osa poly(A) RNA:ta käytetään ihmisen IFN-aktiivi-suuden määritykseen edelläkuvatulla tavalla käyttämällä 20 varhaismunasolua määritystä kohti. Poly(A) RNA-valmisteen ominaisaktiivisuus on 8100 IU interferonia per yg RNA.
B. Kaksisäikeisen cDNA:n valmistus (kuva 7)
Poly (A) RNA:n suhteen rikastettua HuIFN mRNA:ta (ks. vaihe Ad) käytetään templaattina valmistettaessa kaksisäikeistä cDNA:ta käyttämällä oleellisesti katsoen niitä menetelmiä, joita on kuvattu julkaisuissa Efstra-tiadis et ai. (36), Maniatis et ai. (37) ja Hoeijmakers et ai.(38) .
a) Ensimmäisen säikeen synteesi 250 yl reaktioseosta, jossa on 40 mM Tris.HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT (Calbio- chem.), 1 mM dGTP, dCTP, dTTP (P-L Biochemicals) ja 1 mM 32 P-dATP (Amersham, ominaisaktiivisuus 50 000 cpm/nmol), 20 yg/ml oligo (dT) ^ 2_-| g (P"L Biochemicals), 40 yg/ml poly(A) RNA ja 100 yksikköä linnun myeloblastosis-viruk-sen (AMV) käänteiskopioijaentsyymiä (Life Sciences, Inc.,
St. Petersburg, Florida), inkuboidaan 80 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio katkaistaan säätämällä liuoksen pitoisuudeksi 10 mM EDTA ja 0,1% SDS. Seos uutetaan kerran 1 tilavuudella fenolia. Vesifaasi uutetaan uusestaan 1 tilavuudella kloroformia ja sijoitetaan 3 ml:n Sephadex G-30-pylvää-seen (Pharmacia, fine). Kerätään 0,1 ml:n jakeet. Kunkin jakeen radioaktiivisuus määritetään mittaamalla Ceren-kov-säteily. Radioaktiiviset jakeet yhdistetään ja nukleiinihapot saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa 10 tunnin aikana. Näytettä sentrifugoidaan HB-4-rootto- « 80720 rissa 20 minuuttia nopeudella 10 000 1/min 0°C:ssa. Sakka liuotetaan 95 yl:aan I^O. Lisätään 5 yl 10 N NaOH ja seosta inkuboidaan 40 minuuttia 25°C:ssa. Kun on neutraloitu 5 M etikkahapolla, lisätään 50 yl vettä ja 2 tilavuutta etanolia ja näytettä säilytetään 10 tuntia -20°C:ssa. Sakka sentrifugoidaan talteen edelläkuvatulla tavalla ja liuotetaan uudestaan 200 yl:aan 0,1 mM EDTA. Näin saadaan 3,7 yg yksisäikeistä cDNA:ta. cDNA:n pituus on 700-1500 nukleotidia, kun määritetään elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella 6-prosenttisessa polyakryyliamidi-geelissä Tris-boraatti-EDTA:ssa (108 g Tris, 9,3 g di-natrium-EDTA ja 55 g boorihappoa per 1 litra liuosta, pH 8,3), jossa on 7 M ureaa, vertaamalla pituudeltaan tunnettuihin merkki-DNA-palasiin (39).
b) Toisen säikeen synteesi ja katkaisu S^-endonukleaa-silla
Saatua cDNA-liuosta kuumennetaan 90 sekuntia 100°C:ssa, jäähdytetään ja inkuboidaan 400 ylrssa reaktioseosta, jossa on 0,1 M kaliumfosfaattipuskuria (pH 6,9), 10 mM MgC^»
10 mM DTT (Calbiochem), 1 mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dTTP (P-L
3
Biochemicals) 1mM H-dGTP (Amersham, ominaisaktiivisuus 94 000 cpm/nmol) ja 165 yksikköä/ml E. colin DNA-polymeraa-si I:tä (Biolabs, New England), 8 tuntia 15°C:ssa. Reaktio katkaistaan lisäämällä EDTA ja SDS väkevyyteen 10 mM ja 0,1% vastaavasti. Seos uutetaan fenolilla ja kloroformilla, kromatografoidaan Sephadex G-50:llä (Pharmacia, fine, pakatun kolonnin tilavuus 2 ml) ja saostetaan etanolilla edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ba).
Saatu DNA käsitellään 50 ylrssa inkubointiseosta, jossa on 0,25 M NaCl, 50 mM natriumasetaattia (pH 4,5) ja 1 mM ZnSO^, 6 yksiköllä S^-endonukleaasia (P-L Biochemicals) 30 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäsytetään säätämällä väkevyydeksi 0,1% SDS ja 10 mM EDTA. Reaktio-seoksesta poistetaan proteiini 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty 50 mM natriumasetaattiin, pH 4,5) ja kloro- 49 80720 formia. Vesifaasi kromatografoidaan 2 ml:n Sephadex G-50-pylväässä (Pharmacia, fine) TNE:ssä. 100 yl jakeet ke rätään ja kunkin jakeen Cerenkov-säteily määritetään. Erotetut jakeet yhdistetään ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia 10 tunnin aikana -20°C:ssa edelläkuvatulla tavalla. Sakka sentrifugoidaan HB-4-roottorissa (ks. edellä) ja kertynyt sakka liuotetaan 100 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. Näin saadaan 4 yg DNA:ta. DNA fraktioidaan TST-60-roottorissa (Kontron AG) sakkaroosigradientin läpi (5-23%), jossa on 50 mM Tris.HCl (Ph 7,5) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 55 000 1/min 5 tunnissa 15°C:ssa. DNA, joka laskeutuu nopeammin kuin 800 emäsparin merkki-DNA, jota käsitellään rinnakkaisgradientissa, kerätään talteen, säädetään TNE-pitoisuuteen ja saostetaan 67-prosenttisel-la etanolilla -20°C:ssa 10 tuntia. Näin saadaan 0,4 yg kaksisäikeistä cDNA:ta.
C. pBR322:een liitetyn cDNA:n valmistus (kuva 7) a) dCMPrllä pidennetyn cDNA:n valmistus 0,1 ygsaan saatua kaksisäikeistä cDNA:ta liitetään 3'-päihin poly(dC)-hännät 10 ylrssa reaktiosesta, jossa on 100 mM natriumkakodylaattia (pH 7,2), 2,4 mM C0CI2» 50 yg BSA (Calbiochem.) per ml, 1 mM dCTP ja 10 yksikköä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia (P-L Biochemi-cals) per yg kaksisäikeistä cDNA:ta. Inkuboinnin jälkeen (20 min, 27°C) lisätään EDTA väkevyyteen 10 mM ja seosta säilytetään -20°C:ssa käyttöön asti.
b) Pst I:llä katkaistun, dGMP:llä pidennetyn pBR322:n valmistus 10 yg pBR 322:n plasmidi-DNA:ta hajotetaan 10 yksiköllä Pst I-endonukleaasia (Biolabs) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^, 6 mM 2-merkaptoetanolia ja 100 yg/ml gelatiinia, 1 tunti 37°C:ssa. Liuos uutetaan 1 tilavuuella fenolia ja kloroformia. Liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja linearisoitu so 80720 DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa 5 tunnin ajan.
Linearisoitu plasmidi-DNA pidennetään dGMP:llä 200 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 100 mM natriumkakodylaat-tia (pH 7,1), 5 mM MgCl2, 20 mM NaH2PC>4 , 50 yg BSA per ml, 1 mM dGTP ja 100 yksikköä terminaalista deoksinukleoti-dyylitransferaasia (P-L Biochemicals). Kun on inkuboitu 20 minuuttia 37°C:ssa, lisätään EDTA:ta väkevyyteen 10 mM ja reaktioseos jäädytetään -20°C:een käyttöön asti.
c) dGMP:llä pidennetyn pBR322:n liittäminen dCMP:llä pidennettyyn kaksisäikeiseen cDNA:han
Seosta, jossa on cCMP:llä pidennettyä kaksisäikeistä cDNA:ta (0,1 yg) ja dGMP-häntäistä, linearisoitua pBR 322:ta (0,5 yg) 500 yl:ssa TNE:tä, inkuboidaan 65°C:ssa 1 tunti, 37°C:ssa 1 tunti ja 20°C:ssa 1 tunti. Liuos, jossa on pBR322 siihen liitetyn cDNA:n kanssa sijoitetaan jäähän ja käytetään transformointiin välittömästi.
D. E. coli HB 101:n transformointi yhteenliitetyllä yhdis-telmäplasmidilla
Kalsiumilla käsitelty E. coli HB 101 valmistetaan trans-formointia varten menetelmällä Mandel et ai. (29).
10 yl reaktioseosta, jossa on edellävalmistettua (vaihe Cc) yhteenliitettyä pBR322-yhdistelmäplasmidi-DNA:ta lisätään seokseen, jossa on 150 yl kalsiumilla käsiteltyä E. coli HB 101:tä, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), kokonaistilavuuden ollessa 200 yl.
Seosta jäähdytetään jäässä 20 minuuttia, kuumennetaan 42°C:een 1 minuutiksi ja inkuboidaan 10 minuuttia 20°C:ssa. Lisätään 1 ml tryptonialustaa (tryptonialusta sisältää 10 g Bacto-Tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoosia; 8g NaCl ja 294 mg CaCl2.2H20 1 litrassa tislattua vettä) ja saatua seosta inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:ssa ravistelemalla nopeudella 300 1/min. Seosta kasvatetaan 2 agarlevyllä (McConkey, Difco; 0,6 ml/levy), joi- 51 80720 hin on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä (Sigma). Levyjä inkuboidaan 37°C:ssa 12-17 tuntia. Näin saadaan noin 5600 tetrasykliinin suhteen vastustuskykyistä transformoitunutta E. coli HB 101-kantaa.
E. Sellaisten kloonien identifiointi, jotka sisältävät HuIFN cDNA:n a) 13-meerisen oligodeoksinukleotidialukkeen syntetisointi (kuva 8)
Oligodeoksinukleotidi, joka on komplementaarinen 13 nukleotidia sisältävälle jaksolle, joka on sama sekä HuIFN-α^:n että HuIFN- β:η mRNAtssa, syntetisoidaan kemiallisesti fosfotriesterimenetelmällä (ks. Itakura et ai.
(40), de Rooij et ai. (41)). Synteesin erilliset vaiheet on esitetty periaatteellisesti kuvassa 8. Kuvan 8 rivillä 1 mainitut lähtöaineet (mono- ja dideoksinukleotidit, joissa on suojaryhmät) tunnetaan kirjallisuudesta. Suoja-ryhmät lohkaistaan irti Itakura et ai:n kuvaamilla menetelmillä: 5'-monometoksitrityylillä (M) tai dimetoksitri- tyylillä (D) substituoitujen hydroksyyliryhmien suojaus poistetaan etikkahapolla (80 %) huoneenlämpötilassa ja 8-syanoetyyli-fosfaattiryhmät lohkaistaan 0,1 N natriumhydroksidilla dioksaani-vesiseoksessa (4:1) huoneenlämpötilassa. Rakenneosien kondensointi suoritetaan käyttämällä tri-isopro-pyylibentseenisulfonyylikloridia aktivointiaineena niin, että saadaan oligodeoksinukleotideja aina täysin suojattuun 13-meeriseen alukkeeseen asti, joka on esitetty kuvan 8 rivillä 7. Viimeinen vaihe (kaikkien suojaryhmien poisto) suoritetaan seuraavalla tavalla:
Liuokseen, jossa on 64,6 mg täysin suojattua 13-meeristä oligodeoksinukleotidia dioksaanin (3 ml) ja asetonitriilin (1 ml) seoksessa, lisätään 200 mg syn-p- 113 3 nitrobentsaldoksiimia ja 124 mg N , N , N , N -tetrametyy-liguanidiinia ja annetaan seisoa 27 tuntia. Lisätään 10 ml ammoniakkia (25 %) ja liuosta säilytetään 24 tuntia 52 80720 50°C:ssa. Kun liuos on haihdutettu vakuumissa, jäännös liuotetaan veteen, pH säädetään etikkahapolla arvoon 4 ja liuos uutetaan 20 kertaa kloroformilla. Vesiliuos haihdutetaan vakuumissa ja jäännös liuotetaan 1 ml:aan etik-kahappoa (80 %) . Liuoksen annetaan seisoa 1 tunti, laimennetaan 6 ml:11a vettä, uutetaan 3 kertaa kloroformilla ja lyofilisoidaan. Kolmasosa epäpuhtaasta tuotteesta puhdistetaan kromatografisesti käyttämällä DEAE-Sephadex A 25-pylvästä (pylvään koko: 10x1,3 cm) ja 200 ml 0,2- 1,2 M trietyyliammoniumbikarbonaattigradienttia. Pääja-keen eluoituminen tapahtuu väkevyydessä 0,87 M. Pääjae, joka sisältää puhtaan tuotteen, todetaan HPLC-kokeella, haihdutetaan 3 kertaa veden kanssa, suodatetaan 10 ml:n läpi Dowex 50 W:tä (NH^-suola) ja lyofilisoidaan. HPLC (perma-phase AAX, column size 90x0,3 cm, 60°C, 2 ml/min, gradients : A = 0,005 M KH2P04, B = 0,5 M KH2PC>4, 0,5 M KC1, pH 4,5; 20 % A-> 100% B 30 minuutissa): tR 11,8 min.
32 b) P:llä merkityn IFN-a:n ja IFNB:n suhteen spesifisen cDNA-koettimen valmistus (kuva 9) 40 pmol synteettistä 13-meeristä oligodeoksinukleoti- - -32 — dialuketta (ks. vaihe Ea) ja 40 pmol (_ γ P/-ATP:tä -1 (5700 Ci.mmol , Amersham) yhdistetään 100 yl:ssa 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 ja 5 mM DTT. 50 yksikköä T4~polynukleotidikinaasia (P-L Biochemiclas) lisätään ja kun on pidetty 30 minuuttia 37uC:ssa, lisätään vielä 20 yksikköä entsyymiä ja inkubointia jatketaan vielä o 32 15 minuuttia 37°C:ssa. Vesiliuos, jossa on P:llä merkitty aluke, puhdistetaan fenolilla uuttamalla. Jatko-puhdistus suoritetaan kromatografisesti 4 ml:n Sephadex G-50-pylväässä (Pharmacia, fine) 1 ml:ssa Tris.HCl-pusku-ria (pH 8,0). Kerätään 0,1 ml:n jakeet. Kunkin jakeen radioaktiivisuus määritetään mittaamalla Cerenkov-säteily.
Ominaisaktiivisuudeksi saadaan 4x10** Cerenkov cpm per 32 mooli oligodeoksinukleotidia. P:llä merkitty aluke 53 80720 (40 pmol) lyofilisoidaan, suspendoidaan uudestaan 91 μΐ:aan vettä, jossa on 14 yg poly(A) RNA:ta (saatu indusoiduista Namalwa-soluista vaiheessa A kuvatulla tavalla) ja kuumennetaan 60 sekuntia 100°C:ssa. 9 μΐ 4 M KC1 lisätään ja seosta inkuboidaan 25°C:ssa 60 minuuttia.
450 yl käänteiskopioijaentsyymiseosta lisätään niin, että reaktiotilavuus sisältää 40 mM Tris.HCl (pH 8), 4 mM MgCl2, 1 mM DTT (Calbiochem, Inc.), 74 mM KC1, dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, 1 mM kutakin, (P-L Biochemi-cals) ja 90 yksikköä linnun myeloblastosisviruksen (AMV) käänteiskopioijaentsyymiä. Inkubointia jatketaan 1 tunti 37°C:ssa. Liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNE-liuokseen) ja nukleiinihapot saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa 10 tunnin kuluessa. Sakka sentrifugoidaan talteen (HB-4-roottori, 20 min, 10 000 1/min, 0°C) ja liuotetaan 20 yl:aan värjäysseosta, jossa on 90 % (tilavuusosina) formamidia (Merck, pro analysis), 1 mM EDTA, 0,05 % bromifenolisinistä ja 0,05 % ksyleeni-syanolisinistä. Näytettä kuumennetaan 2 minuuttia 90°C:ssa ja sen jälkeen se sijoitetaan 5-prosenttiselle polyakryy-liamidigeelille, jossa on Tris-boraatti-EDTA:ta (ks. Peacock et ai. (39)). Tällöin näkyy autoradiogrammilla yk- 32 si kaista, joka liikkuu P:llä merkittyjen 267 bp ja 435 bp sisältävien DNA-palasten välissä, jotka on saatu 32 leikkaamalla plasmidi pBR 322 Hae 111:11a. P:llä merkitty cDNA-palanen uutetaan geelistä ja puhdistetaan julkaisussa Mueller et ai. (42) kuvatulla tavalla. Näin 32 saadaan P:llä merkitty ihmisen IFN-a:n ja IFN-8:n suhteen spesifinen cDNA-koetin, jonka säteily on 20 000 Cerenkov cpm.
c) Sellaisten kloonien seulonta, joissa on HuIFN cDNA (kuva 9) 1650 edelläkuvatulla tavalla valmistettua transfor-manttipesäkettä (vaihe D) siirretään nitroselluloosasuo-timille BA 85 (Schleicher & Schuell, halkaisija 8 cm).
54 8 0 7 2 0
Solut hajotetaan ja niiden DNA denaturoidaan ja kiinnitetään suotimiin in situ menetelmällä Grunstein ja Hogness (20) . Pesäkkeet sisältävät suotimet esihybri-disoidaan liuoksessa, jossa on 4xSET (liuos, jossa on 0,15 M NaCl, 30 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA), 0,1 % (paino/tilavuus) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1 % (paino/ tilavuus) polyvinyylipyrrolidonia (PVP-360, Sigma), 0,1 % (tilavuusosina) BSA, 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateen-korva-DNA:ta (valmistettu seuraavalla tavalla: 5 mg vasikan kateenkorva-DNA:ta (tyyppi I, Sigma) keitetään 10 min 0,5 M NaOH:ssa DNA leikkaamiseksi, neutraloidaan 5M etikkahapolla ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa. Sakka sentrifugoidaan talteen HB-4-roottoris-sa 10 minuutin ajan 0°C:ssa ja liuotetaan uudestaan 500 yl:aan 0,5 mM EDTA), 65°C:ssa 4 tuntia käyttämällä 20 ml 3 seosta suodinta kohti ja hybridisoidaan määrällä 10 32
Cerenkov cpm P:llä merkittyä koetinta per nitrosellu-loosasuodin liuoksessa, jossa on 5xSET, 0,02 % (paino/ tilavuus )Ficoll, 0,01% polyvinyylipyrrolidonia, 0,02 % (tilavuusosina) BSA, 0,2 % SDS ja 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateenkorva-DNA:ta. Hybridisointi suoritetaan 65°C:ssa 36 tunnin kuluessa.
Suotimet huuhdellaan kerran kloroformissa, kahdesti SET, 0,5 SDS:ssä huoneenlämpötilassa ja kahdesti SET, 0,5% SDS:ssä 1 tunnin ajan 60°C:ssa ja kerran 3 mM Trizma-emäksessä huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Suotimet kuivataan imemällä 3 MM-paperilla (Whatman) ja suotimista otetaan röntgenkuva käyttämällä varjostinta (Ilford vahvistusvarjostin) -80°C:ssa 72 tunnin valotus-ajalla.
Autoradiogrammilta löydetään yhdeksän positiivista pesäkettä, jotka otetaan jatkotutkimuksiin.
Koska transformoituneiden solujen primääriset kloonit sisältävät silloin tällöin useampaa kuin yhtä yhdiste lmä-DNA-molekyylilaatua, yhdistelmäplasmidi-DNA:t 55 80720 eristetään yhdeksästä positiivisesti hybridisoituvasta kloonista ja käytetään E. coli HB 101:n transformointiin edelläkuvatulla tavalla.
Yhdistelmäplasmidi-DNA eristetään seuraavalla tavalla: 1 pesäke siirrostetaan 10 ml:aan tryptonialustaa,
joka on täydennetty 10 yg/ml:lla tetrasykliiniä, 25 ml:n Erlenmeyer-kolvissa edelläkuvatulla tavalla. Viljelmää ravistellaan 15-18 tuntia 37°C:ssa nopeudella 300 1/min. Solut sentrifugoidaan talteen (Sorvali, HS-4-roottori, 10 minuuttia, 400 1/min, 4°C). Näin saadaan noin 0,1 g soluja, jotka suspendoidaan uudestaan 1 ml:aan 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) . Lisätään 0,25 ml lysotsyymi-liuosta (10 mg/ml 50 mM Tris-HCl-puskurissa (pH 8,0), lysotsyymi on hankittu Sigmalta) ja kun on inkuboitu 10 minuuttia 0°C:ssa, lisätään 0,15 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5). Kun seosta on pidetty vielä 10 minuuttia 0°C: ssa, lisätään 60 yl 2% Triton X-100 (Merck). Kun seosta on pidetty vielä 30 minuuttia 0°C:ssa, näytettä sentrigu-goidaan 30 minuuttia nopeudella 15 000 1/min 4°C:ssa Sorvali SA-600-roottorissa. Emäliuos deproteinisoidaan 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNE:hen). Faasit erotetaan sentrifugoimalla (Sorvali HB-4-roottori) 10 min nopeudella 500 1/min 4°C:ssa. Ylempi faasi uutetaan kahdesti 1 tilavuudella kloroformia. Haiman RNAaasia A (Sigma; 10 mg/ml TNE:ssä, esikuumennettu 20 min 85°C:ssa) lisätään lopulliseen väkevyyteen 25 pg/ml ja saatua seosta inkuboidaan 40 minuuttia 37°C:ssa. Sitten liuos säädetään pitoisuuteen 1 M NaCl ja 10 % polyetyleeniglykolia 6000 (Fluka, autoklavoitu 20 min 120°C:ssa) ja inkuboidaan -10 °C:ssa 2 tuntia. Sakka otetaan talteen Sorvali HB-4-root-torilla (20 min, 10000 1/min, 0°C) ja liuotetaan uudestaan 100 yl;aan TNE. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuutin ajan. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugissa ja DNA liuotetaan uudestaan 20 Ml: aan luosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM
56 8 0 7 2 0 EDTA. 10 ml:sta viljelmää saadaan 8-10 yg yhdistelmä-plasmidi-DNA:ta.
E. coli HB 101 transformoidaan kullakin yhdeksästä eristetystä yhdistelmä-DNA:sta ja transformoituja soluja kasvatetaan agar-levyillä, joissa on tetrasykliiniä, edelläkuvatulla tavalla (vaihe D). Kustakin transformaatiosta poimitaan 3 tetrasykliinin suhteen vastustuskykyistä kloonia, valmistetaan 10 ml:n viljelmät ja yhdistelmä-DNA:t eristetään viljelmistä edelläkuvatulla tavalla.
Kaikki DNA-näytteet analysoidaan ennen transformoin-tia ja sen jälkeen katkaisemalla Pstl-endonukleaasilla ja käyttämällä apuna elektroforeesia 1 % agaroosigeelis-sä, jossa on 50 mM Tris-asetaattia (pH 7,8) ja 1 mM EDTA. Kaikilla näytteillä on identtiset katkeamiskartat ennen transformointia ja sen jälkeen.
Yksi uudelleenkloonatuista yhdistelmä-DNA-molekyyleistä antaa 2 kaistaa, joista toisen liikkuvuus vastaa Pstl:llä katkaistun pBR322:n liikkuvuutta ja toinen noin 1000 bp sisältävän jakson liikkuvuutta. Sille annetaan nimitys CG-pBR322/HlycIFN-1'b.
Toinen yhdistelmä-DNA antaa 3 kaistaa, joista yhden liikkuvuus vastaa PstI:llä katkaistua pBR322:ta, yhden liikkuvuus noin 600 bp ja yhden liikkuvuus noin 150 bp.
Tämän kloonin yhdistelmä-DNA-molekyylille annetaan nimitys CG-pBR322/HLycIFN- ^ .
d. Kloonien CG-pBR 322/HLycIFN-1b' ja CG-pBR322/HLycIFN-81 karakterisointi
Kloonien CG-pBR 322/HLycIFN-1'b ja CG-pBR322/HLycIFN-B-| yhdistelmä-DNA :t eristetään viljelmistä edelläkuvatulla tavalla (ks. vaihe Ec) ja tunnistetaan määrittämällä cDNA-liitännäi-sen nukleotidisekvenssi Maxamin ja Gilbertin kuvaamalla menetelmällä (15). Määritys tapahtuu periaatteessa seuraavasti: 57 80720
Eristetty yhdistelmäplasmidi-DNA katkaistaan erilaisilla restriktioendonukleaaseilla. Entsyymejä käytetään oleellisesti ottaen valmistajan ohjeiden mukaan (New England Biolabs) paitsi, että BSA korvataan gelatiinilla entsyymipuskureissa. Liuos, joka sisältää katkaistun DNA:n, deproteinisoidaan fenolilla (kyllästetty TNErllä). DNA saostetaan etanolilla, liuotetaan uudestaan 50 mM Tris.HCl-puskuriin (pH 8,0) DNA-väkevyyteen 50 yg/ml ja inkuboidaan 0,1 yksikön kanssa naudan sisäelinten emäsfos-fataasia (Boehringer) per pmol DNA:n 5'-päitä 30 min 37 °C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuuttia 65°C:ssa. DNA puhdistetaan DEAE-selluloosa-kromatografisesti Mueller et ai. (42) kuvaamalla menetelmällä ja saostetaan etanolilla. Sitten DNA merkitään __32 - 5'-päistään ly P/-ATP:llä (>5000 Ci/mmol, Amersham) ja suoritetaan T4-polynukleotidikinaasireaktio (P-L Biochemicals) oleellisesti ottaen julkaisussa Maxam ja Gilbert (15) kuvatulla tavalla, mutta DNA:ta ei denaturoida ennen kinaasireaktiota. Yleensä ominaisaktiivisuu-det ovat 1-3x10° cpm/pmol 5'-päitä.
Radioaktiivisesti merkityt DNA-palaset katkaistaan toisella restriktioendonukleaasilla ja tuotteet erotetaan elektrofeettisesti käyttämällä 6%, 8% ja 10% polyakryyli-amidigeeliä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa. DNA-palaset uutetaan geelistä ja puhdistetaan Mueller et ai. (42) kuvaamalla tavalla. Nukleotidisekvenssien määrittämiseksi DNA-palaset hajotetaan kemiallisesti ja tuotteet erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla Maxamin ja Gilbertin (15) kuvaamalla tavalla.
Erityisesti kloonista CG-pBR 322/HLycIFN-1'b eristetyt plasmidi-DNA:t käsitellään seuraavalla tavalla. Toisaalta 5 yg plasmidi-DNA:ta katkaistaan BglII:lla, merkitään radioaktiivisesti 5'-päistä ja katkaistaan PvuII: 11a. PvuII-Bgl*- (* tarkoittaa radioaktiivisesti merkittyä kohtaa) ja BglII-PvuII*-DNA-palaset eristetään 6% polyakryyliamidigeelillä. Toisaalta 5 yg plasmidia 58 80720 5 ug plasmidia hajotetaan Alu I:llä, merkitään 5'-päistään ja katkaistaan Pstlillä. PstI-AluI*-DNA-palanen eristetään 8% polyakryyliamidigeelillä. Sen jälkeen yksittäiset palaset hajotetaan ja sekvenssit määritetään Maxamin ja Gilbertin menetelmällä. Saatu nukleotidisek-venssi on esitetty kuvassa 10. Noin 25-35 deoksiguano-siinitähdettä sisältävä jakso on cDNA-liitännäisen 5'-pään edessä. Esitetty nukleotidisekvenssi on jossain määrin samanlainen kuin IFN-a:n (tyyppi F) cDNA:n vastaava, jota Goeddel et ai. ((43), ks. myös Weissmann (44)) ovat kuvanneet, mutta siinä esiintyy kuitenkin paljon selviä poikkeamia (pistemutaatioita), joista jotkut vaikuttavat aminohappoihin (ks. kuva 10).
Kloonista CG-pBR322/HLycIFN-B.j eristetty plasmidi-DNA käsitellään samalla tavalla. 5 yg plasmidi-DNA:ta hajotetaan PvuII:lla ja merkitään radioaktiivisesti 5'-päistä. Puolet seoksesta katkaistaan Pstlrllä ja loput Bgl II:11a. Pstl-PvuII*- ja Bglll-PvuII*-jakeet eristetään elektroforeettisesti 6% polyakryyliamidigeelillä ja hajotetaan edelläkuvatulla tavalla. Nukleotidisekvenssi (N-pään sekvenssi) on esitetty kuvassa 11 ja se osoittaa, että cDNA liitännäinen alkaa nukleotidista numero 102 IFN-8^:n cDNA:ssa, kuten Taniguchi et ai. (45) kuvanneet. Näin ollen cDNA-liitännäisellä on kyky koo-dittaa ihmisen IFN-B^ia, josta puuttuu 11 aminohappoa N-päässä. cDNA-liitännäisessä on 5'-päässä noin 20-25 oheisdeoksiguanosiinitähdettä ja siinä on pistemutaatio kohdassa 153, joka muuntaa C-tähteen T-tähteeksi vaikuttamatta syntyvään aminohappoon.
e. Sellaisten kloonien identifiointi, jotka sisältävät DNA-molekyylejä, jotka ristihybridisoituvat CG-pBR 322/HLycIFN-1'b:n ja CG-pBR 322/HlycIFN-B1:n liitännäisiin
Kloonien CG-pBR 322/HLycIFN-1'b ja CG-pBR 322/HLycIFN-B^ yhdistelmäplasmidi-DNA:t eristetään viljelmistä edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ec). CG-pBR 322/HLycIFN-1'b:n 59 80720 plasmidi-DNA (5yg) katkaistaan Bgl II:11a, merkitään radioaktiivisesta 5'-päistään ja katkaistaan PvuIIrlla. Toisaalta eristetty CG-pBR 322/HLycIFN-8.j-plasmidi-DNA (5 yg) katkaistaan Pvu II:lla, merkitään radioaktiivises-ti 5'-päistään ja katkaistaan Bgl II:11a. Pvu II- Bgl II*-DNA-palanen (351 bp) (koetin A) ja Pvu II*-Bgl II-DNA-palanen (368 bp) (koetin B) eristetään 8% polyakryy-liamidigeelistä edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ed) ja käytetään in situ pesäkehybridisointiin (ks. jäljempänä). Plasmidi-DNA-molekyylien katkaisu, radioaktiivinen merkitseminen ja DNA-palasten puhdistus suoritetaan edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ed).
Edelläkuvatulla tavalla valmistetaan 4000 transformant-tipesäkettä (vaihe D), jotka siirretään nitroselluloosa-suotimille BA 85 (Schleicher & Schuell, halkaisija 8 cm). Solut hajotetaan ja niiden DNA denaturoidaan ja kiinnitetään suotimiin in situ menetelmällä Grunstein ja Hogness (20) . Koettimien A ja B hybridisointi (molemmat koet-timet on sekoitettu) suoritetaan edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ec). Autoradiografisesti identifioidaan 6 posi tiivista pesäkettä, joista kolmelle annetaan nimet E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41, E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51 ja E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^ ja ne tutkitaan tarkemmin. Näiden kloonien plasmidi-DNA:t eristetään, transformoidaan uudelleen ja eristetään uudelleen edelläkuvatulla tavalla (vaiheet Ec, ja Ed).
Yhdistelmä-DNA-molekyylien liitännäisten luonteen toteamiseksi cDNA-liitännäisten nukleotidisekvenssit (osittain tai kokonaan) määritetään käyttämällä edelläkuvattua yleistä lähestymistapaa (vaihe Ed).
Tarkemmin sanottuna 5 yg eristettyä plasmidi-DNA:ta CG-pBR 322/HLycIFN-41 ja CG-pBR 322/HLycIFN-8' kutakin so 80720 hajotetaan Pvu II:11a, merkitään radioaktiivisesti 5'-päistään ja katkaistaan Pst I:llä. DNA-palaset fraktioidaan 8% polyakryyliamidigeelillä ja 8j-DNA:n PstI -PvuII* (n. 120 bp) ja 4^-DNA:n Pst I - Pvu II* (82 bp) eristetään tavalliseen tapaan.
Eristetty CG-pBR 322/HLycIFN-5^:n eristetty plasmidi-DNA käsitellään seuraavalla tavalla. Toisaalta 5 yg plasmidi-DNA:ta katkaistaan Hae III:11a, merkitään radioaktiivisesti 5'-päistään ja katkaistaan Pst I:llä.
Pst I -Hae III*-DNA-jakeet (57 bp) eristetään 10% polyakryyliamidigeelillä. Toisaalta 5 yg plasmidia katkaistaan EcoR I:llä, merkitään 5'-päistään ja katkaistaan Pst I:llä. Pst I -EcoR I*-DNA-palanen (235 bp) ja EcoR I* -Pst I-DNA-palanen (n. 700 bp) eristetään 8% polyakryyliamidigeelillä. Eri DNA-palasten sekvenssit määritetään Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (15).
cDNA-liitännäisten nukleotidisekvenssit on esitetty kuvissa 12-14. Kuvassa 12 on esitetty CG-pBR 322/HLycIFN-4^:n cDNA-liitännäisen osittainen nukleotidisekvenssi. Liitännäisessä on 5'-päässä oheisena 23 deoksiguanosiinitäh-teen jakso ja se sisältää osan IFN-o^n (Le) cDNA:sta, jota Streuli et ai. (46) ovat selostaneet. 3'-ekstra-kistronisessa alueessa on joitakin pieniä poikkeamia (pis-temutaatioita) ja 318 lisänukleotidin jakso. CG-pBR 322/ HLycIFN-8j:n cDNA-liitännäisen nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 13. Liitännäisessä on 5'-päässä ohessa ' 20-23 deoksiguanosiinitähdettä ja se on samanlainen, mut ta ei identtinen sen IFN-a:n (tyyppi D) cDNA:n kanssa, jota Goeddel et ai. ovat selostaneet /143); ks. myös Mantei et ai. (27 )J. Lukuunottamatta eroja cDNA-alueissa, jotka edeltävät ja seuraavat IFN:ää koodittavaa sekvenssiä, IFN-geeni sisältää kohdissa 28-30 GCC-tripletin ja kohdissa 409-411 GCG-tripletin, jotka koodittavat ala-niinia, eikä triplettejä GTC ja GTG, vastaavasti, jotka koodittavat valiinia. Viimein CG-pBR 322/HLycIFN-5^:n cDNA-liitännäisen nukleotidisekvenssissä (kuva 14) on 61 80720 17 deoksiguanosiinitähdettä 5'-päässä. Nukleotidisekvens-si muistuttaa IFN-a:n (tyyppi B) cDNA:n vastaavaa, jota Goeddel et ai. ovat selostaneet (43). Kuitenkin HLycIFN-5^:n cDNA-liitännäisen 5'-päässä on lisänukleo-tideja, pistemutaatioita, puuttuvia kohtia ja lisäyksiä ekstrakistronisessa alueessa ja IFN:ää koodittavassa sekvenssissä kohdissa 22 ja 361-372.
F. Ihmisen interferonien synteesi käyttämällä E. coli-bakteereita, joissa on ihmisen IFN:n suhteen spesifisiä yhdistelmä-DNA-mokekyylejä 5 kloonin, joiden on osoitettu sisältävän ihmisen interferonin suhteen spesifisiä DNA-molekyylejä, nimittäin E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41, E, coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51, E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8'1, ja E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-B., , IFN-aktiivisuus tutkitaan, mikä kussakin tapauksessa tehdään seuraavalla tavalla:
Vastaavan E. coli-kloonin viljelmiä (30 ml:n suspensiot) kasvatetaan tryptonialustassa optiseen tiheyteen (ODgBQ) noin 1. Solut otetaan talteen ja suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan vesiliuosta, jossa on 30 mM NaCl ja 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisätään lysotsyymiä määrään 1 mg/ml (Sigma). Kun on pidetty 30 minuuttia 0°C:ssa, suspensiot jäädytetään (nestemäinen typpi) ja sulatetaan (37°C:ssa) 5 kertaa ja sentrifugoidaan 20 minuuttia nopeudella 20 000 1/min SS 34 Sorvall-roottorissa 4°C:ssa. Emäliuosten IFN-aktiivisuus määritetään käyttämällä syto-paattista biomääritystä Armstrongin mukaan (32), kuten vaiheessa Ac on selostettu. Saadaan seuraavat aktiivisuudet : 62 80720
Uutteen lähde IFN-aktiivisuus
Yhdistelmä-DNA:n sisältävä E. coli HB 101 (IU/ml) CG-pBR 322/HLycIFN-1'b 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-41 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-51 10 000;10 000 CG-pBR 322/HLycIFN-81 100;100 CG-pBR 322/HLycIFN-81 0;0
Mahdollisesti kloonit, jotka eivät anna mitään mitattavissa olevaa IFN-aktiivisuutta, sisältävät yhdiste lmä-DNA-muotoja, joissa HuLylFN-cDNA-liitännäinen on väärässä suunnassa transkription suunnan suhteen. Tästä syystä tällaisen kloonin (CG-pBR 322/HLycIFN-1’b) yhdistelmä-DNA, jossa on täyspitkä cDNA-liitännäinen, suunnataan uudestaan seuraavalla tavalla: Kloonin E.
coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1’b plasmidi-DNA eristetään edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ec) ja katkaistaan Pst I:llä. 0,5 yg katkaistua DNA:ta 20 y1:ssa puskuri-seosta, jossa on 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgC^/ 10 mM DTT, 25 mM NaCL ja 50 yg/ml gelatiinia, käsitellään 0,2 yksiköllä T4 DNA-ligaasia (Biolabs) ja 0,5 mM ATP 2 tuntia 15°C:ssa. E. coli HB 101 transformoidaan cDNA-seoksella edelläkuvatulla tavalla (vaihe D). Transformoituneet kloonit valitaan McConkey-agarlevyillä, joihin on lisätty tetrasykliiniä ja sen jälkeen otetaan toisinnot nitroselluloosasuotimille. Neljälle bakteeri- pesäkkeelle, jotka hvbridisoituvat CG-pBR 322/HLycIFN-1'b :n 32 yhdistelmä-DNA:n P:llä merkityn Pvu II-Bgl II*-palasen (351 bp) kanssa annetaan nimet E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b^ - -1'b^. Näistä 4 kloonista valmistetaan uutteet ja niiden IFN-aktiivisuus mitataan edelläkuvatulla tavalla. Näin saadaan seuraavat aktiivisuudet: 63 80720
Uutteen lähde IFN-aktiivisuus
Yhdistelmä-DNA:n sisältävä E. coli HB 101 (IU/ml) CG-pBR 322/HLycIFN-1,b1 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b2 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b3 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-1’b4 30;30 Näin ollen plasmidi CG-pBR 322/HLycIFN-1'b^ sisältää cDNA-liitännäisen, joka kykenee ohjaamaan sellaisen poly-peptidin synteesiä, jolla on IFN-aktiivisuus.
G. Sellaisten yhdistelmäplasmidien rakentaminen, jotka kykenevät tuottamaan suuria määriä IFN-aktiivisuuden omaa-via polypeptidejä I. CG-pBR (AP)/LyIFN-a-1-yhdistelmäplasmidin rakentaminen
Jotta saataisiin parannetuksi E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b-kloonin IFN-spesifisen proteiinin saantoa, suoritettiin seuraava rakentaminen, joka on esitetty kaaviollisesti kuvassa 15.
a. cDNA-liitännäisen valmistus
Kloonin E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b yhdis-telmäplasmidi-DNA (150 Ug) katkaistaan Pst I:llä (Biolabs) tavallisilla menetelmillä (ks. vaihe Ed). Uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla ja leikattu liitännäinen eristetään sakkaroositiheysgradienttisentrifugoinnilla (5-23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 35 000 1/min TST 41-roottorissa (Kontron AG) 15°C:ssa 16 tunnissa. Kerätään 0,3 ml:n jakeet ISCO-gradientinke-räyslaitteessa nopeudella 1 ml/min. Jakeet, jotka si- 64 80720 sältävät pienen jakeen (so. liitännäisen) yhdistetään.
DNA saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan ja sakka sentrifugoidaan HB-4-roottorissa (Sorvali) nopeudella 10 000 1/min 0°C:ssa 10 minuuttia. Sakka liuotetaan uudestaan 60 yi:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA. Näin saadaan 30 yg DNA:ta, kun mitataan optinen tiheys.
DNA-liitännäinen (10 yq) katkaistaan Hae 111:11a (Biolabs) ja palaset fraktioidaan 2-prosenttisella agaroosigeelil-lä liuoksessa, jossa on 50 mM Tris, 50 mM boorihappoa, 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Suurimmat DNA-palaset, Hae III-Pst I (869bp) ja Haelll - Hae III (82 bp, ks. kuva 15, palaset 3 ja 4 vastaavasti), ja kukin leikataan geelistä, ruiskutetaan ohuen neulan läpi ruiskulla 5 ml:aan liuosta, jossa on 0,15 M NaCl, 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA, ja eluoidaan yön yli ravistellen. Eluaatti lasketaan 100 yl:n DE-52 (Whatman) Pasteur-pipet-tipylvään läpi DNA:n adsorboimiseksi. Pylväs pestään 2 ml:11a samaa puskuria ja DNA eluoidaan 400 y1:11a liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sakka saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa yön aikana. Sakka sentrifugoidaan talteen Eppendorf-sentrifugissa.
Hae III-Hae III-DNA-jae (82 bp) liuotetaan uudestaan ja katkaistaan Sau 3A:lla (Biolabs). Entsyymi inaktivoi-daan lämmön avulla 65°C:ssa 30 minuutin aikana. 1 yg Hae III-Pst I-DNA-jaetta (869 bp) lisätään, liuoksen väkevyys säädetään määrään 10 mM MgC^» 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP, ja lisätään T4 DNA-ligaasia (Biolabs) 30 yksik-köä/yl reaktiotilavuutta. Liuosta inkuboidaan 10 tuntia 15°C:ssa. Uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja seos fraktioidaan 2% agaroosigeelillä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA:han, etidiumbromidin läsnäollessa. Sau 3A-Pst I-DNA-jae (ks. kuva 15, jae 5) uutetaan edelläkuvatulla tavalla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) 65 8 0 7 2 0 ja 0,05 mM EDTA.
b. Sellaisen DNA-palasen valmistaminen, joka sisältää pBR 322:n β-laktamaasin ohjausalueen (ApPr)
Plasmidi pBR 322 katkaistaan Pst I:llä (ks. vaihe Cb) ja käsitellään 4 yksiköllä/ml eksonukleaasia Bal 31 (Bethesda Research Lab.) 30°C:ssa 4-10 minuutin ajan β-laktamaasia koodittavan sekvenssin poistamiseksi.
Syntetisoidaan kemiallinen DNA-sidoksenmuodostaja, jonka kaava on 5'-ATGTGTGATCACACAT-3' edelläkuvatulla menetelmällä (vaihe Ea). Sidoksenmuo-dostaja liitetään Bal 31:llä käsiteltyyn pBR 322 DMArhan käyttämällä tavanomaisia menetelmiä. Saatu yhdistelmä-molekyyli katkaistaan restriktioendonukleaaseilla BdI (Biolabs) ja EcoR I. Katkaisutuotteet fraktioidaan 8% polyakryyliamidigeelillä Tris-boraatti-EDTA:ssa edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ba). DNA-palaset (ApPr-DNA-palaset), jotka kulkevat 184 bp:n ja 234 bp:n merkki-DNA-palasten välissä, eristetään edelläkuvatulla tavalla (vaihe Ia) ja saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan.
Sakka liuotetaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA.
c. ApPr-DNA-palasen liittäminen cDNA-liitännäiseen
Liuokset, joissa on ApPr-DNA-palaset ja cDNA-liitän-näinen, yhdistetään. Seos säädetään väkevyyteen 10 mM MgCl2* 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP, ja inkuboidaan 30 yksikön/yl kanssa T4 DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 12 tuntia. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, seos fraktioidaan 1% matalalla sulavassa agaroosigeelissä (Biorad). Saatu ApPr-cDNA-palanen liitetään suureen pBR 322-palaseen, joka on katkaistu sekä Pst I:llä (Biolabs) että Eco I:llä (Biolabs), seuraavalla tavalla. Geelipala, jossa on ApPr- 66 80720 cDNA-palanen (noin 20 yl) sekoitetaan pBR 322:n PstI -Eco I-palaseen, sulatetaan 2 minuuttia 65°C:ssa ja jäähdytetään 37°C:een ja väkevyydeksi säädetään 0,5 mM ATP, 10 mM DTT ja 10 mM MgCl2 ja inkuboidaan T4 DNA-ligaasin (30 yksikköä/yl) kanssa (Biolabs) 12 tuntia 15°C:ssa.
Lisätään 1/10 tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM
Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 ja 100 mM MgCl2, liuosta kuumennetaan 10 minuuttia 65°C:ssa ligaasin inaktivoimi- seksi ja jäähdytetään 37°C:een. Sitten liuoksella trans-2 + formoidaan Ca -käsitelty E. coli HB 101-kanta edelläkuvatulla tavalla (vaihe D) ja suoritetaan kasvatus McConkey-agarlevyillä, joihin on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä. Transformoituneet pesäkkeet seulotaan IFN-aktiivisuuden suhteen (ks. vaihe F). Suurimman IFN-aktii-visuuden tuottava klooni valitaan ja sille annetaan nimi E. coli HB 101 CG-pBR(AP)/LycIFN-a-1. Aktiivisuudeksi saadaan 40 000 (IU/ml), joka merkitsee 1300-kertaista parannusta verrattuna alkuperäiseen klooniin E. coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-1'b.
Kloonin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1 yhdistelmäplasmidi eristetään viljelmästä edelläkuvatulla tavalla (vaihe 3c) ja tunnistetaan määrittämällä cDNA-liitännäisen (IFN-geeni) ja 8-laktamaasin ohjausalueen nukleotidisekvenssi. Saadun tuloksen yhteenveto on esitetty kuvassa 16.
II. Yhdistelmäplasmidin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 rakentaminen
Kloonin E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8.j :n IFN-spesifisiä proteiinisaantoja parannetaan seuraaval-la tavalla (ks. kuva 17): a. Sellaisen DNA-palasen valmistus, joka sisältää CG-pBR (AP)/LyIFN-a-1:n β-laktamaasin ohjausalueen.
67 8 0 7 2 0 CG-pBR (AP) /LyIFN-ot-1 -DNA (100 yg) katkaistaan Hind III :11a (Biolabs) ja Bgl II:lla (Biolabs). Uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla ja leikattu DNA-palanen erotetaan sakkaroosigradienttisentrifugoinnilla (5-23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 58 000 1/min TST 60-roottorissa (Kontron AG) 15°C:ssa 4 tunnin kuluessa. Kerätään 0,2 ml jakeet edelläkuvatulla tavalla. Pienen palan sisältävät jakeet (Hind III - Bgl II) yhdistetään ja DNA saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan. Sak ka liuotetaan uudestaan 80 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA. Näin saadaan 16 yg DNA, kun mitataan optinen tiheys.
DNA-palanen (Hind III-Bgl II) (4 yg) katkaistaan Sau 3A:lla (Biolabs) ja katkaisutuotteet fraktioidaan 6% polyakryyliamidigeelissä Tris-boraatti-EDTA:ssa edelläkuvatulla tavalla. DNA-palaset värjätään EtBr:ssä (0,5 yg/ml), Hind ΙΙΙ-Sau 3A-DNA-palanen (239 bp) uutetaan ja ersitetään edelläkuvatulla tavalla. DNA saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan. Sakka liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH
7,5) ja 0,05 mM EDTA.
b. cDNA-liitännäisen valmistus cDNA-liitännäinen leikataan irti yhdistelmäplasmidis-ta CG-pBR 322/HLycIFN-8^J edelläkuvatulla tavalla (kohta Ia) .
cDNA-liitännäinen (2yg) katkaistaan 2,5 yksiköllä Sau 3A (Biolabs) käyttämällä 10 yg/ml EtBr ja inkuboidaan 60 minuuttia 37°C:ssa. Katkaisutuotteet uutetaan fenolilla ja DNA saostetaan etanolilla edelläkuvatulla tavalla. DNA-palaset fraktioidaan 1,2 % agaroosigeelissä liuoksessa, jossa on 50 mM Tris, 50 mM boorihappoa, 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia.
Toiseksi suurin DNA-palanen (Sau 3A-Pst I: 693 bp) uutetaan geelistä ja puhdistetaan kohdassa Ia) kuvatulla 68 80720 tavalla. DNA liuotetaan uudestaan 20 pltaan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA.
c. Hind ΙΙΙ-Sau 3A-DNA-palasen liittäminen cDNA-liitän-näiseen (Sau 3A-PstI)
Yhtä suuret määrät molempia DNA-palasia (n. 50 ng) inkuboidaan liuoksessa, jossa on 10 mM MgC^, 10 mM DTT,
0,5 mM ATP ja 30 yksikköä/μΐ T4 DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 3 tuntia. Seosta inkuboidaan 15 minuuttia 80 °C:ssa ja pitoisuus säädetään määrään 50 mM NaCl. DNA-seosta hajotetaan 0,5 yksiköllä PstI (Biolabs) ja 1 yksiköllä Hind III (Biolabs) 20 minuuttia 37°C:ssa. DNA uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan 20 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH
7,5) ja 0,05 mM EDTA.
Puolet saadusta liuoksesta liitetään plasmidin pBR 322 suureen Hind III-Pstl-DNA-palaseen (n. 100 ng) liuoksessa, jossa on 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 30 yksikköä/yl T4 DNA-ligaasia (Biolabs), 2 tuntia 15°C:ssa.
1/10 liuoksen tilavuudesta käytetään E. coli HB 101:n transformointiin kohdassa D) kuvatulla tavalla. Transformoituneiden pesäkkeiden IFN-aktiivisuus tutkitaan edelläkuvatulla tavalla (ks. vaihe F).
Suurimman IFN-aktiivisuuden syntetisoiva klooni valitaan ja sille annetaan nimitys E. coli HB 101 CG-pBR (AP)/ LyIFN-a-3.
IFN-aktiivisuus määritetään edelläkuvatulla tavalla (vaihe F). Näin saadaan aktiivisuudeksi 70 000 IU/ml, joka vastaa 700-kertaista parannusta verrattuna alkuperäiseen klooniin E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^.
Kloonin CG-pBR (AP)/LyIFN-a-3 yhdistelmäplasmidi eristetään viljelmästä edelläkuvatulla tavalla (vaihe Cc) ja tunnistetaan määrittämällä cDNA-liitännäisen (IFN-geeni) ja g-laktamaasin ohjausalueen nukleotidisekvenssi. Tuloksesta on esitetty yhteenveto kuvassa 18.
69 80720
Plasmidin CG-pBR (AP)/LyIFN-a-3 rakentamisjärjestystä voidaan käyttää kaikkien α-IFN-cDNA-geenien tai sopivasti leikattujen kromosomaalisten ot-IFN-geenien rakentamiseen yleensä.
Esimerkiksi lähtemällä plasmidista CG-pBR 322/HlycIFN-51 saadaan plasmidi CG-pBR (AP)/LyIFN-a-2 aivan samalla tavalla kuin plasmidin CG-pBR (AP) /LyIFN-ct-3 kohdalla on kuvattu. Tämä uusi plasmidi sisältää CG-pBR 322/HLycIFN-5^:n DNA-liitännäisen ja β-laktamaasin ohjausalueen CG-pBR (AP)/LyIFN-a-1:stä. Edelläkuvatulla tavalla valitaan klooni E. coli HB 101 CG-pBR (AP)/LyIFN-a-2. IFN-aktiivisuudeksi saadaan 50 000 IU/ml, joka vastaa 5-kertaista kohoamista alkuperäiseen E. coli HB 101 CG-pBR 322/HlycIFN-5^-kantaan verrattuna. cDNA-liitännäisen 8-laktamaasin ohjausalueen nukleotidisekvenssi plasmi-dissa CG-pBR (AP)/LyIFN-a-2 määritetään edelläkuvatulla tavalla ja se on esitetty kuvassa 19.
III. Valmistettujen mikro-organismien taltiointi
Esimerkissä 10 kuvatulla tavalla valmistetuista mikro-organismeista ja yhdistelmä-DNA-molekyyleistä on taltioitu näytteet kokoelmaan Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 14. syyskuuta 1981, ja niille on annettu kokoelmanumerot: E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-81; NRRL B-12528 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41: NRRL B-12529 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b: NRRL B-12530 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51; NRRL B-12531 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8}: NRRL B-12532
Esimerkki 11: E. coli-plasmidien CG-pBR 322/HLycIFN-1'b ja -5.J (ks. esimerkki 10) lymfoblastoidista IFN-1'b:tä ja IFN-5.J :tä koodittavat alueet voidaan alakloonata plas- 70 80720 midiin p30 (ks. esimerkki 4) vastaavasti kuin IFN-8.J :n kohdalla on kuvattu esimerkeissä 5 ja 6. Tällöin tarvitaan osittainen hajotus restriktioendonukleaasilla Hae III. Tällä tavalla saadut hiivan yhdistelmäplasmi-dit ovat p30IFN2(1 ’b) , p30IFN2'(1'b), p30lFN2(51) ja p30IFN2 ' (5.,) .
Saatuja yhdistelmäplasmideja voidaan käyttää Saccharomyces cerevisiae RH971-kannan transformointiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Voidaan valita seuraa-vat pesäkkeet, jotka sisältävät yhdistelmäplasmidin, jossa on lymfoblastoidisen IFN:n cDNA-liitännäinen.
S. cerevisiae RH971/p30lFN2(1'b) S. cerevisiae RH971/p39IFN2'(1*b) S. cerevisiae RH971/p39IFN2(5^) S. cerevisiae RH971/p30IFN2’(5^)
Esimerkki 12: Esimerkissä 9 kuvatulla tavalla voidaan saada seuraavat hiivan yhdistelmäplasmidit lähtemällä plasmideista p30lFN2(11b), -(5^), -(8^) ja p30lFN2'(1'b), -(5^) , vastaavasti: pJDB207/IFN2(1’b), pJDB207/IFN2'(1'b), pJDB207/IFN2(51), pJDB207/IFN2' (51) ja pJDB207/IFN2(8 *).
Nämä yhdistelmäplasmidit voidaan transformoida S. cerevisiae RH971-kantaan valitsemalla leusiinin suhteen prototrooppiset pesäkkeet. Näin saadaan seuraavat pesäkkeet, joissa on yhdistelmäplasmidi, jossa on lymfoblastoidisen IFN:n cDNA-liitännäinen: S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(1’b) S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2'(1'b) S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(5i) S. cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2'(51) S. cerevisiae RH971 /pJDB207/IFN2 (8Jj) 71 80720
Esimerkki 13: Sellaisen ilmentämisplasmidin rakentaminen, jossa on PHO5-promoottori ja PH05:n transkription päätös-signaalit (ks. kuva 20) a) EcoRI-katkaisukohdan poisto plasmidista p30:
Kuvissa 20-22 kaaviollisesti esitetty toimintatapa vaatii plasmidissa p30 sijaitsevan ainoan EcoRI-katkaisukohdan poistamista. 5 yg p30-DNA:ta (ks. esimerkki 4) katkaistaan täysin restriktioendonukleaasilla EcoRI (Boehringer). Syntyneiden lomittaisten päiden täyttämiseksi 1 yg EcoRI:llä hajotettua p30-DNA:ta käsitellään 50 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,25 mM dATP ja 0,25 mM dTTP, 30 minuuttia 37°C:ssa 1 yksiköllä DNA-polyme-raasia (Klenow, suuri palanen, BRL). Etanolisaostuksella saatu DNA liitetään tavalliseen tapaan ja sillä transformoidaan tätä varten käsitellyt E. coli HB 101-solut esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Kloonit, jotka ovat vastustuskykyisiä EcoRI:llä tapahtuvalle katkaisulle, ni-
R
metään p30/EcoRI :ksi.
b) PH05:n transkription päättämisen Sau3A-PstI-palasen (0,37 kb) eristäminen PH05-transkripti on kartoitettu S1-nukleaasikartoi-tuksella (48). Transkription päätöksen signaalien on osoitettu sijaitsevan PH05-geenin Sau3A-PstI-palasessa (0,37 kb). Sau3A-PstI-palasen nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 21.
5 yr pJDB207/PHO5,PH03-DNA:ta (ks. esimerkki 2) katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Sau3A ja PstI. Katkaisutulokset erotetaan vertikaalisessa 1,5% matalalla sulavassa agaroosigeelissä TBE-puskurissa.
0,37 kb sisältävä Sau3A-PstI-palanen paikannetaan eti-diumbromidivärjäyksellä ja tämän DNA-palasen sisältävä 72 80720 geelikohta leikataan irti mahdollisimman tarkasti.
c) Sau3A-PstI-PH05-palasen kloonaaminen M13mp9:ään M13mp9-fagi-DNA on hyödyllinen vektori, jossa on kimppu ainoita katkaisukohtia (49). 5 yg M13mp9-
DNA:ta katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla BamHI ja PstI. Suurempi 7,2 kb:n DNA-palanen erotetaan hyvin pienestä palasesta (8 bp) 0,8% matalalla sulavassa agaroosigeelissä. Suuren DNA-palasen sisältävä geeli-kohta leikataan irti. Geelikohdat, joissa on 0,37 kb:n Sau3A-PstI-palanen pJDB207/PHO5»PH03:sta (ks. esimerkki 13b) ja 7,2 kb:n BamHI-Pstl-palanen M13mp9:stä, nestey-tetään 65°C:ssa, sekoitetaan keskenään suunnilleen ekvi-molaarisina määrinä ja laimennetaan vedellä agaroosipi-toisuuden alentamiseksi 0,3%:iin. Liittäminen suoritetaan 200 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH
7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Tätä varten käsiteltyjen E. coli JM101 (Ca++)-solujen transduktio suoriteaan käsikirjan "M13-kloonaus ja DNA-sekvenssinmääritysjärjestelmä" mukaan, jonka on julkaissut New England Biolabs. Useista valkoisista täplistä kasvatetaan faageja ja niiden DNA-liitännäisen koko analysoidaan katkaisemalla restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja PstI.
M13mp9:stä johdettu klooni, jossa on Sau3A-PstI-PH05-transkription päätöspalanen eristetään ja sille annetaan nimi M13mp9/PH05(Sau3A-PstI).
d) PH05:n transkription päätöspalasen kloonaus plasmi-diin p30/EcoRI^:
Alkuperäinen PH05:n transkription päätöspalanen, joka on kloonattu faagiin M13mp9 (M13mp9/PH05(Sau3A-PstI),
R
kloonataan Haelll-Hindlll-palasena plasmidiin p30/EcoRI , joka on katkaistu Ball:llä ja HindIII:lla: M13mp9/PH05 (Sau3A-PstI)-DNA katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Haelll ja Hind III. Saadut kaksi DNA-palasta erotetaan toisistaan 1,5 % vertikaalisessa matalalla sula- 73 80720 vassa agaroosigeelissä TBE-puskurissa. 0,3 9 kb:n pa lanen eristetään geelistä leikatusta palasesta. p30/Eco RIR-DNA katkaistaan Ball:llä ja Hindlllrlla. Suuri 3,98 kb:n palanen erotetaan 0,8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä TBE-puskurissa ja eristetään leikkaamalla irti tämän DNA-palasen sisältävä geelipala.
Geelipalat, joissa on 0,39 kb:n Haelll-Hindlll PH05:n transkription päätöspalanen ja 0,39 kb:n Ball-Hindlll-palanen p30/EcoRI :stä, sulatetaan ja sekoitetaan keskenään suunnilleen ekvimolaarisina määrinä. Liittäminen ja kypsien E. coli HB101-solujen transformointi suoritetaan Esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Transformoituneiden solujen DNA analysoidaan katkaisemalla Ball: llä ja HaeIII:lla. Klooni, jossa on PH05:n transkription päätösjakso, analysoidaan tarkemmin ja sille annetaan nimi p31 (ks. kuva 20).
Ilmentämisplasmidi p31 sisältää PH05:n promoottorialueen ja osan PH05:n signaalisekvenssiä ja siihen liittyneenä DNA-jakson, jossa on PH05:n transkription päätössignaalit. Tämän vektorin ilmentämäksi tarkoitettuja vieraita kooditussekvenssejä voidaan helposti liittää pranoottorin ja transkription päätössekvenssin väliin.
Esimerkki 14: Lymfoblastoidi-interferoni-5^-DNA:n liit täminen plasmidiin p31 (ks. kuva 22) a) Plasmidin CG-pBR322/HLycIFN-5^ Haelll-Hpal-palasten erottaminen E. coli-kantaa HB101 CG-pBR322/HLycIFN-5^ (ks. esimerkki 10E) kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, johon on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä, ja plasmidi-DNA eristetään esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. 10 yg CG-pBR322/HLycIFN-5^-DNA:ta hajotetaan täysin restriktioendonukleaaseilla PstI ja Hpal. Katkaisutuotteet erotetaan preparatiivi-sella 0,8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä. PstI- 74 80720
Hpal-palanen (noin 860 bp), jossa on IFN-5^:tä koodittava sekvenssi, leikataan irti geelistä ja eluoidaan agaroosi-geelistä esimerkissä 4a kuvatulla tavalla ja puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografisesti esimerkissä 5a kuvatulla tavalla.
Pstl-Hpal-palasessa on 3 Haelll-kohtaa: kohdissa 41, 65 ja 146 (ATGrsta lähtien) IFN-5^:tä koodittavassa sekvenssissä. Osittainen Haelll-katkaisu johtaa kolmeen Haelll-Hpal-palaseen, joiden pituudet ovat vastaavasti 699 bp, 780 bp ja 804 bp. Haelll-katkaisu säädetään huolellisesti niin, että saadaan suunnilleen yhtä suuret määrät kaikkia kolmea palasta. Palasten seos uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 10 mM Tris:iin (pH 8) väkevyyteen 0,1 mg/ml.
b) Ball:llä katkaistun, defosforyloidun plasmidin p31 valmistus 6 yg p31-DNA:ta (ks. esim. 13d) katkaistaan täysin restriktioendonukleaasilla Ball (BRL). Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen DNA liuotetaan uudestaan 100 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris pH 8,0, ja lasketaan 50 y 1: n kerroksen läpi tasapainotettua Chelex 100 (BioRAD) silikonoidussa Pasteur-pipetissä. Läpi virrannut määrä ja 450 μΐ sen jälkeistä pesuliuosta yhdistetään. Lisätään 0,4 yksikköä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (Boeh-ringer). Kun on inkuboitu 1 tunti 37°C:ssa, entsyymi in-aktivoidaan 65°C:ssa 1,5 tunnin kuluessa. Inkuboidun seoksen NaCl-pitoisuus säädetään määrään 150 mM. Lineari-soitu, defosforyloitu p31-DNA puhdistetaan DE52-ionin-vaihtokromatografisesti (ks. esimerkki 5a). Etanolisaostuksen jälkeen DNA suspendoidaan uudestaan 10 mM Tris:iin pH 8 väkevyyteen 0,3 mg/ml.
c) Linearisoidun, defosforyloidun p31-DNA:n liittäminen IFN-5.J-DNA:n Haelll-Hpal-palasiin 75 80720 0,6 yg defosforyloitua p31-vektori-DNA:ta, joka on katkaistu Ballsllä, liitetään 0,5 ygraan IFN-5^-DNA:n osittaisia Haelll-Hpal-palasia (ks. esimerkki 14a). Liittäminen suoritetaan 10 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5. 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), yön yli huoneenlämpötilassa. 1 yl:n erä liitosseosta lisätään 50 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikypsiä E. coli HB 101-soluja. Transformointimenetelmä on selostettu esimerkissä 4a.
Transformoituneita amp -pesäkkeitä kasvatetaan yksittäisesti LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan Holmes et al:n menetelmällä (50) ja analysoidaan hajottamalla restriktioendonukleaa-silla BstEII (yksi ainoa kohta PH05-promoottorissa).
20 kloonia, joissa on IFN-5^-liitännäinen tutkitaan tarkemmin BstEII-EcoRI-kaksoiskatkaisulla liitännäisen suunnan ja koon määrittämiseksi. 8 kloonista, joissa liitännäinen on oikeassa suunnassa, löydetään kaikki 3 odotettua liitännäiskokoa. Koko vastaa niitä kolmea Haelll^_3-Hpal-palasta, jotka saatiin suorittamalla osittainen IFN-5^-geenin Haelll-hajotus (ks. esimerkki 14a). Klooneille annetaan nimet p31/IFl(5^), p31/IF2(51) ja p31/IF3(51), joiden sisältämät IFN-5.J-liitännäiset ovat 804 bp:n (Haelll^-Hpal-liitännäinen), 780 bp:n (HaeIII2-HpaI) ja 699 bp:n (Haelll^-Hpal) vastaavasti .
Esimerkki 15: Lymfoblastoidi-interferoni-1'b-DNA:n liit täminen plasmidiin p31 (ks. kuva 22) a) Plasmidin CG-pBR322/HLycIFN-1'b:n Haelll-Rsal-palasten eristäminen 10 yg CG-pBR322/HLycIFN-1'b:n DNA:ta (ks. esimerkki 10E) katkaistaan restriktioendonukleaaseilla PstI ja Rsal. Katkeamistuotteet erotetaan 0,8% matalalla sulavassa aga- 76 80720 roosigeelissä. Geelistä eristetään Pstl-Rsal-palanen, jonka koko on noin 870 bp, ja puhdistetaan edelläkuvatulla tavalla (esimerkii 14a).
Pstl-Rsal-palanen sisältää kolme Haelll-kohtaa: kohdissa 13, 37 ja 118 IFN-1'b:tä koodittavan sekvenssin ATG:stä lukien. Osittainen Haelll-katkaisu johtaa kolmeen Haelll-Rsal-palaseen, joiden pituudet ovat 735 bp, 816 bp ja 840 bp vastaavasti. Palasten seos uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 10 mM Tris:iin pH 8,0 väkevyyteen 0,1 mg/ml.
b) Linearisoidun, defosforyloidun p31-DNA:n liittäminen IFN-11b-DNA:n Haelll-Rsal-palasiin 0,6 yg defosforyloitua p31-vektorin DNA:ta, joka on katkaistu Ball:llä (ks. esimerkki 14b), liitetään 0,5 yg: aan IFN-1'b-DNA:n osittaisia Haelll-Rsal-palasia. Liittäminen, kypsien E. coli HB 101-solujen transformointi liitosseoksella ja transformoituneiden amp -pesäkkeiden valinta suoritetaan esimerkissä 14c kuvatulla tavalla. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai. (50) ja analysoidaan hajottamalla restriktioendonukleaasilla BstEII.
7 kloonia, joissa on IFN-1 'b-liitännäinen analysoidaan BstEII-PvuII-kaksoiskatkaisulla, Löytyy kaksi kloonia, joissa HaeIIl2~RsaI-palanen (816 bp) on oikeassa suunnassa. Tälle rakenteelle annetaan nimi p31/IF2(1’b).
Esimerkki 16: Lymfoblastoidi-interferoni-8 .j-DNA:n liit täminen plasmidiin p31 (ks. kuva 23) a) Plasmidin p30IFN1(8,j) Sall-EcoRI-palasen (1,46 kb) eristäminen 5 yg p30IFN1 (8Jj) -DNA:ta (ks. esimerkki 5d) katkaistaan restriktioendonukleaaseilla Sali ja EcoRI. 1,46 kb:n
Sall-EcoRI-palanen, joka sisältää PH05-promoottorin liittyneenä IFN-8^j-proteiinia koodittavaan alueeseen, eristetään 0,8% matalalla sulavassa agaroosigeelissä. DNA-kaista pai- 77 80720 kannetaan etidiumbromidivärjäyksellä ja leikataan irti geelistä.
b) Plasmidin p31 Sall-EcoRI-palasen (3,5 kb) eristäminen 5 yg p31-DNA:ta (ks. esimerkki 13d) katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Sali ja EcoRI. 3,5 kb:n vektoripalanen, joka sisältää PH05:n transkription päätös-sekvenssin erotetaan 0,8 % matalalla sulavalla agaroosi-geelillä ja DNA leikataan irti.
c) p30lFN1(8^):n Sall-EcoRI-palasen (1,46 kb) liittäminen p31:n Sall-EcoRI-palaseen (3,5 kb)
Geelipalat, joissa on 0,67 yg p31:n Sall-EcoRI-pa-lasta (3,5 kb) ja 0,5 yg p30IFN1 (8.J) :n Sall-EcoRI-palasta (1,46 kb), liitetään 240 yl:n reaktiotilavuudessa esimerkissä 4a kuvatulla tavalla 15°C:ssa yön yli. 10 yl lii-tosseosta käytetään transformointikypsien E. coli HB101-solujen transformointiin.
Transformoituneita, amp -pesäkkeitä kasvatetaan yksitellen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai.
(50) ja analysoidaan katkaisemalla restriktioendonukle-aasilla BstEII (yksi ainoa kohta PH05-promoottosissa).
Joukko klooneja, joissa on IFN-8.J-liitännäinen, analysoidaan BstEII-PvuII-kaksoiskatkaisulla. Ne kaikki sisältävät 1,46 kb:n Sall-EcoRI-palasen. Identtisille klooneille annetaan nimitys p31/IF(8j).
Esimerkki 17: Geenirakenteiden alakloonaus suuren kopio- määrän tuottavaan hiivavektoriin pJDB207
Esimerkeissä 14-16 kuvatut rakenteet sisältävät PH05-prcmoottorin, eri interferoneja koodittavat alueet ja PH05:n transkription päätössignaalit peräkkäin ryhmitettyinä ja kaikki sisällytettyinä pBR322:sta johdettuun vektoriin. Hiivassa tapahtuvaa ilmentämistä varten koko liitännäi- 78 80720 nen alakloonataan hiivavektoriin pJDB207 (28), jolloin voidaan valita leusiinin suhteen prototrofiset pe säkkeet (ks. esimerkki 9 ja kuva 6).
p31 /IF (8 JJ) DNA, P31/IFK5.,) DNA, p31/IF2(51) DNA, p31IF3(5l) DNA ja p31/lF2(1’b) DNA, 2 yg kutakin, katkaistaan restriktioendonukelaaseilla Sali ja Hindlll. Katkaisutuotteet erotetaan toisistaan preparatiivisella 0.8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä. Kustakin katkaisutuotteesta leikataan pieni jae (n. 2 kb) irti geelistä.
10 yg pJDB207-DNA:ta katkaistaan restriktioendonuk-leaaseilla Sai1 ja Hindlll. Suuri 6,2 kb:n palanen eristetään preparatiivisesta 0,8% matalalla sulavasta agaroosigeelistä. Geelipalat, joissa on DNA-jaksot, nesteytetään 65°C:ssa ja laimennetaan vedellä niin, että agaroosipitoisuus laskee noin 0,3 %:iin.
Kukin plasmidien p31/IF(8^j), p31/IFl(5^), p31/IF2(5^), p31/IF3(51) ja p31/IF2(1'b) 2 kb:n Sall-Hindlll-jakeista sekoitetaan ekvimolaariseen määrään 6,2 kb:n Hindlll-Sall-jaetta, joka on saatu pJDB207:stä. Liittämiset suoritetaan 100 yl:n reaktiotilavuuksissa 4 tunnissa 15°C:ssa.
10 y.l.tlla kutakin liitosseosta transformoidaan transfor-mointikypsät E. coli HB101-solut esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Useita kustakin kokeesta saatuja amp -pesäkkeitä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA:n sisältämän liitännäisen koko analysoidaan restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja Sali. Saaduille klooneille, joissa on oikeat liitännäiset, annetaan nimet pJDB207/IF (8^j) , pJDB207/IF1 (5^) , pJDB207/IF2(51) (ks. kuva 27), pJDB207/IF3(51) ja pJDB207/IF2(1 *b) (ks. kuva 27).
Esimerkki 18: Saccharomyces cerevisiae AH220:n transfor- mointi ja interferonituotannon aikaansaaminen
Kukin plasmideista pJDB207/IF (8.j) , pJDB207/IF1(5^), 79 80720 pJDB207/lF2(51), pJDB207/IF3(51) ja pJDB207/IF2(1*b) siirretään Saccharomyces cerevisiae-kantaa AH220 (a, trp1 , leu-2, leu2-112, his3, pho5, pho3) käyttämällä trans-formoinnissa Hinnen et ai. kuvaamaa menetelmää (1). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimaalista kasvualustaa sisältäviltä levyiltä, joissa ei ole leusiinia. Yksittäiset transformoituneet hiivapesäk-keet poimitaan ja niitä kasvatetaan esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Eri hiivapesäkkeille annetaan seuraavat nimet:
Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB2Q7/IF(81^), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF1(5^), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(5^), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF3(5^) ja Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(1'b)
Esimerkki 19: Hiivasolu-uutteiden valmistus ja interfero- nitiitterin määritys
Solu-uutteet valmistetaan ja interferoniaktiivisuus määritetään esimerkissä 8 kuvatulla tavalla.
Saaduista tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 3.
so 80720
Taulukko 3:
Saccharomyces cerevisiae-kannan AH220 interferoniaktiivi-suus sen jälkeen kun se on transformoitunut yhdistelmä-plasmideilla:
Plasmidit Interferoniaktiivisuus yksikköä/ ml hiivasolu-uutetta pJDB207/IF(8'1) 1 * 1 0? pJDB207/IF1 (5.,) 7 · 105 pJDB207/IF2 (5.,) 5 · 105 pJDB207/IF3(51) 3 * 103 PJDB207/IF2(1’b) 4 · 103
Esimerkki 20: Hepatitis B-viruksen pinta-antigeenin (HBVs) ilmentäminen hiivan PH05-promoottorin ohjauksen alaisena a) Liitoksen rakentaminen PH05-prcmoottorin ja HBVs-proteii-nia koodittavan alueen välille 5 yg plasmidin pHBV130 DNA:ta (51) katkaistaan rest-riktioendonukleaasilla Aval valmistajan suosittelemalla tavalla (New England Biolabs). Näin saadaan 1336 emäs-paria sisältävä jakso, joka sisältää koko HBVs-proteiinia koodittavan alueen, mukaanlukien potentiaalisen esi-HBVs-sekvenssin 27 emäsparia. (ks. kuva 2 viitteessä 51: Aval-jakso ulottuu DNA-palasessa Xho-kohdasta Aval-kohtaan 62 emäsparia BamHl-kohdan yli, joka sijaitsee pintaa koodittavan ja ydintä koodittavan alueen välissä). 1336 emäs-paria sisältävä jakso puhdistetaan pehmeäagaroosiele&tro-foreesilla (0,8% agaroosigeeli) kuten esimerkissä 4a on kuvattu.
81 80720 5 yg plasmidia pBR322/PH05Bam-Sal (ks. kuva 1) leikataan restriktioendonukleaaseilla Sali ja Aval (pBR322:n kohta 1424) ja saatu 3,9 kb:n vektoripalanen, joka sisältää pBR322-sekvenssit yhdessä PH05 Bam-Sal-jakson kanssa puhdistetaan pehmeäagaroosielektroforeesilla edelläkuvatulla tavalla.
1 yg 1336 emäsparia sisältävää jaksoa liitetään 3 yg:aan 3,9 kb sisältävään vektorijaksoon 50 yl:ssa reak-tioseosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^/ 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), 15°C:ssa 4 tuntia. E. coli HB101:n transfor-mointi ampisilliinin suhteen vastustuskykyiseksi ja plas-midin eristäminen suoritetaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla.
Plasmidin oikea rakenne todetaan restriktioanalyysil-lä. Näin rakennetun uuden plasmidin nimi on pBR322/PH05/ HBVs (ks. kuva 24).
b) PH05-pranoottorin asentaminen tarkoin HBVs-proteiinia koodittavaan alueeseen
Edelläkuvattu liitos saa aikaan kuvassa 25 esitetyn DNA-sekvenssiryhmitelmän. Emäsjärjestystiedot on otettu kuvasta 3 (PH05) ja julkaisusta Pasel et ai. (52; HBVs). mRNA:n aloituskohta määritetään tavanomaisella S1-kartoituksella (48) käyttämällä pBR322/PH05 Bam-Sal:n BamHI-Sall-palasta (kuva 1). Jotta voitaisiin eliminoida plas-midissa pBR322/PH05/HBVs oleva PH05-proteiinia koodittava alue, 5 yg plasmidia katkaistaan Kpnl-restriktioendonukle-aasilla (valmistajan ohjeiden mukaan), jolloin saadaan li-nearisoitu plasmidi.
4 yg linearisoitua plasmidia katkaistaan 1 yksiköllä eksonukleaasia Bal31 (Bethesda Research Laboratory) 30°C: ssa 45 sekunnin ajan kokonaistilavuudessa 100 yl reaktio-sesta, jossa on 12 mM CaClj/ 12 mM MgClj# 300 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,1. Reaktio pysäytetään fenoli- 82 80720 uutolla edelläkuvatulla tavalla. Etanolisaostuksen jälkeen DNA suspendoidaan uudestaan 5 yl:aan TE-liuosta.
1 yg:sta DNA:ta muodostetaan uudestaan rengas liittämällä yhteen T4-DNA-ligaasilla 20 yl:n tilavuudessa (olosuhteet esimerkin 4a mukaiset). Kun E. coli HB101 on transformoitu ampisilliinin suhteen vastustuskykyiseksi (ks. esimerkki 4a), plasmidi-DNA eristetään edelläkuvatulla tavalla ja yksittäiset plasmidivalmisteet analysoidaan restriktioanalyysillä seuraavilla entsyymeillä: Haelll, PstI, BstEII ja HhaI. Tämä analyysi mah dollistaa Hhal-kohdan läsnäolon määrittämisen (6 emäspa-ria ennen HBVs-proteiinia koodittavan alueen alkua) ja antaa mitan poistetun kohdan koolle. Liitoskohdan DNA-sekvenssi määritetään Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (15) (radioaktiivinen merkitseminen BstEII-kohdassa, jonka paikka on -374/ ks. kuva 3). Yhteen plasmidiin syntyneet poiston päätekohdat on merkitty kuvaan 24.
Tämän jiasmidin nimi on pBR322/PH05/HBVsA14.
c) PH05-HBVs-liitännäisen siirto hiivaplasmidiin pJDB207 (ks. kuva 26) 5 yg plasmidin pBR322/PH05/HBVs 14 DNA:ta katkaistaan restriktioendonukleaasilla BamHI (New England Biolabs, valmistajan kuvaamissa olosuhteissa). 1,8 kb:n BamHI-palanen valmistetaan pehmeäagaroosigeelielektroforeesilla (0,8 % agaroosi) esimerkissä 4a kuvatulla tavalla.
2 yg hiivavektoria pJD207 katkaistaan samalla entsyymillä. 1 yg katkaistua plasmidia pJDB207 ja 1 yg 1,8 kb:n BamHI-restriktiopalasta liitetään yhteen 20 yl:n kokonaistilavuudessa käyttämällä esimerkissä 20a kuvattuja olosuhteita. E. coli HB101:n transformointi ampisilliinin suhteen vastustuskykyiseksi ja plasmidi-DNA:n eristäminen suoritetaan edelläkuvatulla tavalla (esimerkki 4a). Yksittäiset plasmidit analysoidaan restriktioanalyysillä (BamHI) ja liitetyn BamHI-palasen suunta määritetään Hindlll/BstEII-kaksoiskatkaisulla. Rakentaminen on esi- 83 80720 tetty kaaviollisesti kuvassa 26. Kuten kuvassa 26 on merkitty, plasmidin nimi on pJDB207/PHO5/HBVs^14
Plasmidi transformoidaan hiivakantaan AH220 esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Transformoituneet hiivasolut valitaan, inkuboidaan nestemäisessä alustassa ja kasvatetaan esimerkissä 7 kuvatuissa tuotannon päällekytke-vissä olosuhteissa.Yhdelle transformoituneelle hiivape-säkkeelle annetaan nimi Saccharomyces cerevisiae AH220/ PJDB207/HBVSÖ14.
Solu-uute valmistetaan esimerkissä 8 kuvatulla tavalla ja tuotettu proteiinimäärä määritetään Abbottin radioimmuunimäärityksellä (51). Olettaen, että hiivan tuottama HBVs-antigeeni reagoi Samalla tavalla kuin ihmisen seerumin antigeeni, löytyy päälle kytketyissä olosuhteissa 2 yg HBVs-antigeeniä per ml hiivauutetta. Pois kytketyissä olosuhteissa tiitteri on alle 0,001 yg/ml.
d) PH05-HBVs-liitännäisen siirto sellaiseen hiivaplas-midiin, jossa on PH05:n transkription päätössekvenssi 5 yg plasmidin pJDB207/IF (8,j) DNA:ta (esimerkki 17) katkaistaan BamHIillä edelläkuvatulla tavalla ja 6,9 kb:n vektoriosa eristetään pehmeäagaroosielektroforeesilla (0,8% agaroosi) kuten esimerkissä 4a on kuvattu. 5 yg pBR322/PH05/HBVsA14:ta katkaistaan BamHI:llä edelläkuvatulla tavalla ja 1,8 kb:n BamHI-palanen eristetään pehmeäagaroosigeelielektroforeesilla. 1 yg 6,9 kb:n vek- torinpalasta ja 1 yg 1,8 kb:n BamHI-palasta liitetään yhteen 20 yl:n kokonaistilavuudessa käyttämällä esimerkissä 20a kuvattuja olosuhteita. E. coli HB101:n transfor-mointi ampisilliinin suhteen vastustuskykyiseksi ja plasmidin eristäminen suoritetaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Plasmidianalyysi suoritetaan restriktioendonuk-leaasikatkaisuilla. Kuvan 26 mukaiselle plasmidille annetaan nimi pJDB207/PHO5/HBVsAl4t. Hiivakannan AH220 transformointi ja transformoituneiden solujen valinta suoritetaan esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Yhdelle 84 80720 transformoituneelle hiivapesäkkeelle annetaan nimi Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/HBVsA14t.
Esimerkki 21:
Hepatiitti B-viruksen (HBV) DNA-sekvenssit, jotka on leikattu irti plasmideista pBR322-PstI dG:HBV-KpnI dC; pBR322-PstI dG: HBV-BamHI dC; pBR322-PstI dG: HBV-Bg1II dC; pBR322-PstI dG: HBV-EcoRI dC; pBR322-BamHI:: HBV-BamHI; pBR322-EcoRI: HBV-EcoRI; pBR322-PstI dG:HBV-KpnI dC, pBR322-PstI' dG:pHBV114-PstI dC; (pBR322-EcoRI Hindlll: Lac pranoottorisekvenssi-Hindlll: sidoksenmuodostajät)-BamHI, pUR2-EcoRI: HBV114-HhaI EcoRI sidoksenmuodostajät, pUR2-EcoRI: HBV114-Hhal EcoRI sidoksenmuodostajät, pBR322-PstI dG:pHBV114-AcaI dC, ja pBR322-PstI dG:pHB114-Taq dC , kuten eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 13828 on kuvattu, voidaan liittää (mielellään päiden sopivan muotoilun jälkeen) plasmidiin p30 tai p31 esimerkkien 5, 14 tai 15 mukaisesti ja sen jälkeen plasmidiin pJDB207 esimerkin 17 mukaisesti. S. cerevisiaen transformointi suoritetaan esimerkin 18 mukaisesti. Sellaisten polypep-tidien ilmentyminen, joilla on HBV-antigeenisyys, määritetään esimerkin 20c mukaisesti.
Esimerkki 22: 3'-pään luentaan osallistumattomien DNA- sekvenssien poisto plasmideista KTDB207/IF2(5^) ja pJDB207/IF2(1 *b) (ks. kuvat 27 ja 28) 85 80720
Plasmidien pJDB207/IF2(51) ja pJDB207/IF2(1'b) (ks. esimerkki 17) syntyi suhteellisen pitkät 3'-pään luentaan osallistumattomat jaksot, joiden pituudet olivat noin 440 bp ja 480 bp vastaavasti. Jotta rakennettujen plasmidien tämä alue saataisiin lyhemmäksi, DNA katkaistaan eksonukleaasilla Bal31 tämän alueen keskellä sijaitsevasta yhdestä ainoasta Smal-kohdasta. Liitetään Xho-sidoksenmuodostajat ja DNA:sta muodostetaan rengas yhteenliittämällä.
a) Smal:llä katkaistujen plasmidien pJDB207/IF2(5^) ja pJDB207/IF2(1'b) Bal31-hajotus 20 yg kutakin plasmidi-DNA:ta katkaistaan restrik-tioendonukleaasilla Smal. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, DNA seostetaan etanolilla. DNA suspen-doidaan uudestaan 10 mM Tris:iin pH 8,0 väkevyyteen 0,5 mg/ml. 10 yg Smaltllä katkaistua DNA:ta kutakin hajotetaan 2 yksiköllä Bal31-endonukleaasia (BRL) 100 ylrssa reaktioseosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl,
12 mM MgC^/ 12 CaC^ ja 1 mM EDTA. 3 yg:n DNA-erät otetaan sen jälkeen, kun on inkuboitu 90, 120 ja 150 sekuntia 30°C:ssa, ja sekoitetaan välittömästi seokseen, jossa on 50 yl fenolia ja 60 yl TNE-liuosta. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, suoritetaan saostus etanolilla ja DNA suspendoidaan uudestaan 10 mM Tris:iin pH
8,0 väkevyyteen 100 yg/ml. Bal31:n eksonukleolyytti-sen hajotuksen analysoimiseksi 0,7 yg kunakin ajankohtana saatua DNA-näytettä hajotetaan kutakin Hindlll/EcoRI: llä, kun on kyseessä plasmidista pJDB207/IF2(5^) johdetut näytteet, ja PvuII/Hindlll:11a, kun on kyseessä plasmidista pJDB207/IF2(1'b) johdetut näytteet. Jatkokokeis-sa käytetään DNA-näytteitä, jotka on otettu 90 sekunnin kohdalla.
b) Xhol-sidoksenmuodostajien lisääminen Bal31:llä käsiteltyihin DNA-molekyyl eihin 86 80720 2,2 yg kutakin plasmidi-DNA:ta pJDB207/IF2(5^) ja pJDB207/IF2(1 *b) inkuboidaan 90 sekunnin Bal31-hajotuksen jälkeen (ks. esimerkki 22a) 1 tunti 37°C:ssa 2,8 yksikön kanssa Klenow-DNA-polymeraasia (polymeraa-si I:n suuri palanen, BRL) 35 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 n\M MfCl2 7a ^ dNTP-laatuja.
3 yg Xhol-sidoksenmuodostajia (5'-CCTCGAGG-3', Collaborative Research) kinasoidaan 50 ylrssa 6 mM Tris pH
7,5, 10 mM MgCl2, 4 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 35 U T4 poly-nukleotidikinaasia (Boehringer), 30 minuuttia 37°C:ssa.
0,67 yg kinasoituja Xhol-sidoksenmuodostajia ja 0,4 yg Bal31:llä käsiteltyä tylppäpäistä plasmidin pJDB207/ IF2(5^) tai pJDB207/IF2(1 *b) DNA:ta liitetään yhteen yön ajan huoneenlämpötilassa 25 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 450 U T4 DNA-ligaasia. Yhteenliitetty DNA erotetaan ylimääräisistä sidoksenmuodostajista isopropanolisaostuk-sella, seoksessa jossa on 10 mM EDTA, 0,3 M natriumase-taattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. Kun on inkuboitu 35 minuuttia huoneenlämpötilassa, DNA sedi-mentoidaan sentrifugoimalla. Pelletit kuivataan ilmassa ja suspendoidaan uudestaan 17 yl:aan seosta, jossa on 6 mM Tris pH 7,9, 150 mM NaCl, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkapto-etanolia. DNA:han liitetyt Xhol-sidoksenmuodostajat katkaistaan Xholrllä, DNA seostetaan isopropanolilla edelläkuvatulla tavalla ja muodostetaan rengas yhteenliittämällä. Kun on liitetty yhteen 6 tuntia 15°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 600 U T4 ligaasia, lisätään 10 yl kutakin liittämisseosta 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikypsiä E. coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a).
R
72 transformoitunutta amp -pesäkettä, jotka sisältävät plasmidin, jossa on IFN-5^-liitännäinen, kasvatetaan 87 80720 yksittäisesti LB-seoksessa, jossa on 100 mg/1 ampisil-liiniä. Plasmidi-DNA-analysoidaan HaeIII-hajotuksella. Restriktiokartasta voidaan arvioida sen poistuman koko, jonka Bal31 on saanut aikaan. Kaksi kloonia tutkitaan tarkemmin ja niiden interferoniaktiivisuus määritetään. Niille annetaan nimet pJDB207/IF2(5^)Δ72 ja pJDB207/IF2 (51)Δ 82.
Kuvassa 28 on esitetty sen uuden liitoksen (Xhol-si-doksenmuodostaja) molemmilla puolilla oleva nukleotidisek-venssi, joka liitos on IFN-5^-geenin 3'-pään luentaan osallistumattoman alueen ja PH05:n transkription päätös-alueen välissä.
Vastaavalla tavalla kasvatetaan yksittäisesti 60 amp -pesäkettä, joissa in IFN-1'b-liitännäinen, LB-alustassa, jossa on 100 mg/1 ampisilliiniä. Plasmidi-DNA analysoidaan edelläkuvatulla tavalla. Valitaan yksi klooni ja sen IFN-aktiivisuus määritetään. Sille annetaan nimi pJDB207/IF2 (1 'b) Δ .
Esimerkki 23: Sellaisten yhdistelmäplasmidien rakenta minen, jotka sisältävät siirrettäviä IFN-5^:n, -8.J :n ja -1'b:n cDNA-liitännäisiä, joita voidaan käyttää kypsän lymfoblastoidi-IFNrn suoraan ilmentämiseen (ks. kuvat 29 ja 30) .
a) cDNA-liitännäisten valmistus cDNA leikataan yhdistelmäplasmideista CG-pBR322/ HLycIFN-8^, CG-pBR322/HLycIFN-1'b, CG-pBR322/HLycIFN-51 katkaisemalla 150 yg kutakin plasmidi-DNA:ta Pstl:llä (Biolabs) valmistajan ehdottamalla menetelmällä. Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, leikatut liitännäiset eristetään sakkaroositiheysgradienttisentri-fugoinnilla (5-23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 35 000 1/min TST 41-roottorissa (Kontron AG) 15°C: ssa 16 tunnin ajan. 0,3 ml:n jakeet kerätään ISCO- 88 80720 gradientinkerääjällä nopeudella 1 ml/min. Jakeet, joissa on pieni palanen (so. liitännäinen), yhdistetään. DNA saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan ja sakka sent-rifugoidaan talteen HB-4-roottorissa (Sorvali) nopeudella 10 000 1/min 0°C:ssa 10 minuutin ajan. Sakka liuotetaan uudestaan 60 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris. HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA. Näin saadaan 30 yg DNA:ta, kun mitataan optinen tiheys.
2 yg kutakin cDNA-liitännäistä hajotetaan 2,5 yksiköllä Sau3A:ta (Biolabs) 10 yg/ml:ssa EtBr ja inkuboi-daan 37°C:ssa 60 minuuttia. Katkaisutuotteet uutetaan fenolilla ja DNA saostetaan etanolilla edelläkuvatulla tavalla. DNA-palaset fraktioidaan 1,2% agaroosigeelissä liuoksessa, jossa on 50 mM Tris, 50 mM boorihappoa, 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia.
Kunkin kolmen hajotustuotteen toiseksi suurin DNA-jakso (Sau3A-PstI) leikataan irti geelistä, puristetaan ohuen neulan läpi ruiskulla 5 ml:aan 0,15 M NaCl, 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA ja eluoidaan yön yli ravistelemalla. Eluaatti lasketaan 100 yl:n DE-52 (Whatman) Pasteur-pipettipylvään läpi DNA:n adsorboimiseksi. Pylväs pestään 2 ml:11a samaa puskuria ja DNA eluoidaan 400 yl:lla liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa yön yli. Sakka sentrifugoidaan talteen Eppen-dorf-sentifugilla ja liuotetaan uudestaan 10 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,8) ja 0,05 mM EDTA.
b) Vastaanottajaplasmidi-DNA-jakson valmistaminen 1. Plasmidin pBR322 katkaisu EcoRI:llä ja Sätilä 10 yg plasmidin pBR322 DNA:ta katkaistaan 15 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) 60 minuuttia 37°C:ssa valmistajan ohjeiden mukaan. Uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla ja DNA liuotetaan uudestaan 25 yl:aan vettä ja lomittaiset päät poistetaan käsittelemällä DNA 20 yksi- 89 80720 köliä S.j -endonukleaasia (P-L Biochemicals) 350 ylrssa liuosta, jossa on 250 mM NaCl, 30 mM natriumasetaattia (pH 4,5) ja 1 mM ZnSO^, 30°C:ssa 30 minuuttia. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTAtta (pH 7,5) määrään 10 mM.
DNA uutetaan fenolilla, väkevöidään etanolisaostuksella ja liuotetaan uudestaan 50 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,8), 0,05 mM EDTA.
2. Kemiallisesti syntetisoidun DNA-sidoksenmuodostajän liittäminen pBR322seen, joka on katkaistu EcoRI:llä ja S1:llä
Seuraavien kaavojen mukaiset kaksi oligodeoksinukleo- tidia 5'-AATTCTATGTGT-31 ja 5'-GATCACACATAGAATT-3' syntetisoidaan esimerkin 10 Ea mukaisesti.
Synteettiset oligodeoksinukleotidit fosforyloidaan 5’-päistään inkuboimalla 80 pmol kumpaakin oligodeoksinukleo-tidia 20 yCi:n kanssa (_ y ^P7~ATP:tä (6700 Ci.mmol , Amersham) 80 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 0,1 mM rATP (Sigma) , 50 mM Tris.HCl (pH 9,5) , 10 mM MgC^/ 5 mM DTT ja 20 yksikköä polynukleotidikinaasia (P-L Biochemicals), 30 minuuttia 37uC:ssa. Reaktio pysäytetään jäädyttämällä seos -80°C:een.
Saatua radioaktiivisesti fosforyloitua sidoksenmuo-dostajaa, jonka kaava on
(32P)-AATTCTATGTGT
TTAAGATACACAC TAG-(J^p) inkuboidaan sen jälkeen 6 yg:n kanssa pBR322:ta, joka on katkaistu EcoRI:llä ja S^rllä (ks. edellä) 200 yl:n reaktiotilavuudessa, jossa on 0.5 mM rATP (Sigma), 0,1 mM DTT (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl~ 3 Δ ja 4.10 yksikköä T^ DNA-ligaasia (Biolabs), 2 tuntia 15 cu C: ssa.
Liuos deproteinisoidaan uuttamalla fenolilla ja DNA väkevöidään etanolisaostuksella. DNA liuotetaan uudestaan 90 80720 100 uljaan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA, ja sentrifugoidaan sakkaroosigradientin läpi (5-23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 60 000 1/min TST 60-roottorissa (Kontron AG) 15°C:ssa 2,5 tunnissa. 0,2 ml:n jakeet kerätään iSCO-gradientin-keräyslaitteessa nopeudella 1 ml/min. Jakeet, joissa
_ O O
on (_ P7:llä merkitty plasmidi-DNA (jakeet 11-14 kaikkiaan 22 jakeesta) yhdistetään, DNA saostetaan etanolilla ja hajotetaan 12 yksiköllä Bell:ta (Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen hajotettu DNA käsitellään 10 yksiköllä Petistä (Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. Fenolilla uutettu kat-kaisutuote sentrifugoidaan sen jälkeen sakkaroositiheys-gradientin (5-23%) läpi 15 tunnin ajan nopeudella 35 000 1/min 15°C:ssa TST 41-roottorissa (Kontron AG). 0,3 ml:n jakeet kerätään (ks. edellä) ja jakeet, joissa on suuri l_ ^P7_merkitty BclI-Pstl-DNA-jakso (jakeet 27-31 kaikkiaan 42 jakeesta) yhdistetään ja väkevöidään etanolisaos-tuksella. DNA liuotetaan uudestaan 20 HL:aan liuosta, jossa on Tris.HCl pH 7,8 ja 0,05 mM EDTA.
c) Vastaanottajaplasmidin liittäminen cDNA-liitännäi-siin 2 yl vastaanottajaplasmidin DNA-jaksoa (n. 100 ng) (ks. edellä) inkuboidaan 5 yl:n kanssa kutakin cDNA-lii-tännäistä (n. 20 ng) reaktiotilavuudessa, jossa on 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 0,1 mM rATP, 0,1 mM DTT ja 400 yksikköä T^ DNA-ligaasia 10 yl:ssa 3 tuntia 15°C:ssa.
Sitten 5 yl reaktioseoksia lisätään seokseen, jossa on 150 yl kalsiumilla käsiteltyä E. coli HB101 200 yl:n kokonaistilavuudessa, jossa on 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5).
Seosta jäähdytetään jäällä 20 minuuttia, kuumennetaan 42°C:een 1 minuutiksi ja inkuboidaan 20°C:ssa 10 minuuttia.
91 80720
Lisätään 1 ml tryptonialustaa (tryptonialusta sisältää 10 g Bacto-Tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoosia; 8g NaCl ja 294 mg CaCl2.2H20 1 litrassa tislattua vettä) ja saatua seosta inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa ravistelemalla nopeudella 300 1/min. Seos levitetään 2 agarlevylle (McConkey-agar, Difco; 0,6 ml/ levy), joihin on lisätty 10 g/ml tetrasykliiniä (Sigma). Levyjä inkuboidaan 12-17 tuntia 37°C:ssa. Transformointi-seosta kohti saadaan noin 1000 pesäkettä. Kustakin trans-formointiseoksesta poimitaan 4 pesäkettä jatkotutkimuksia varten.
d) Yhdistelmäplasmidien restriktioanalyysi
Kiinnostavien yhdistelmäplasmidien tarkempaa tutkimista varten plasmidi-DNA eristetään 12 pesäkkeestä (4 kustakin kolmesta liitosseoksesta, ks. edellä).
Yhdistelmäplasmidi-DNA eristetään seuraavalla tavalla: 1 pesäkkeellä siirrostetaan 10 ml tryptonialustaa, johon on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä kuten edellä, 25 ml:n Erlenmeyer-pullossa. Viljelmää ravistellaan 15-18 tuntia 37°C:ssa nopeudella 300 1/min. Solut sentrifugoidaan talteen (Sorvali, HS-4-roottori, 10 minuuttia, 4000 1/min, 4 °C). Näin saadaan noin 0,1 g soluja ja ne suspendoidaan uudestaan 1 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). 0,25 ml lysotsyymiliuosta (10 mg/ml 50 mM Tris.HCl: ssa (pH 8,0), lysotsyymi hankittu Sigmalta) lisätään ja, kun on inkuboitu 10 minuuttia 0°C;ssa, lisätään 0,15 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5). Kun seosta on pidetty 10 minuuttia 0°C:ssa, lisätään 60 yl 2% Triton X-100 (Merck). Kun on pidetty 30 minuuttia 0°C:ssa, näytettä sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 15 000 rpm 4°C:ssa Sorvali SA-600-root-torissa. Emäliuos deproteinisoidaan 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNE-liuokseen). Faasit erotetaan sentri-fugoimalla (Sorvali HB-4-roottori) 10 minuuttia nopeudella 5000 1/min 4°C:ssa. Ylempi faasi uutetaan kahdesti 1 tilavuudella klorofromia. Haiman RNAaasia (Sigma; 10 mg/ml TNE:ssä, esikuumennettu 10 minuuttia 85°C:ssa) lisä 92 80720 tään lopulliseen väkevyyteen 25 yg/ml ja seosta inkuboi-daan 40 minuuttia 37°C:ssa. Sitten seoksen väkevyys säädetään määrään 1 M NaCl ja 10 % polyetyleeniglykolia 6000 (Fluka, autoklavoitu 20 minuuttia 120°C:ssa) ja in-kuboidaan 2 tuntia -10°C:ssa. Sakka kerätään Sorvali HB-4-roottorilla (20 minuuttia nopeudella 10 000 1/min, 0°C) ja liuotetaan uudestaan 100 yl:aan TNE-liuosta. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saos-tetaan 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuuttia.
Sakka otetaan talteen Eppendorf-sentrifugilla ja DNA liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 10 ml:sta viljelmää saadaan 8-10 yg yhdistelmäplasmidi-DNA:ta.
Kaikki plasmidi-DNA-laadut analysoidaan seuraavilla kaksoiskatkaisuilla: 0,5 yg kutakin DNA:ta katkaistaan
Hindlllrlla (Biolabs) ja PvuIIrlla (Biolabs), HindIII:lla ja Pstl:llä (Biolabs), HindIII:lla ja BamH^:llä (Biolabs), EcoRIrllä (Biolabs) ja PstI:llä tavalliseen tapaan ja fraktioidaan 1,5 % agaroosigeelissä koon mukaan liuoksessa, jossa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml EtBr.
Valitaan sellaiset yhdistelmäplasmidit, joilla on haluttu restriktioentsyymikartta. Tuloksesta on esitetty yhteenveto kuvissa 29 ja 30. Plasmidi-DNA-tyypeille, joissa on pBR322/HLycIFN-8|:stä tai pBR322/HLycIFN-5^:stä tai pBR322/HLycIFN1'b:stä johdettu liitännäinen nimetään vastaavasti CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 ja CG-pBR322/HLycIFN ία-2)-261 ja CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258.
Jotta saataisiin varmistetuksi tarkemmin sen liitoskohdan rakenne, joka on synteettisen sidoksenmuodostajän ja IFN-cDNA-laatujen koodausalueen alun välissä, nukleo-tidisekvenssi määritetään tältä alueelta. Tarkemmin sanottuna 2 yg eristettyä plasmidin CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258 DNA:ta katkaistaan EcoRI:llä, merkitään 5'-päistään ja katkaistaan PstI:llä. DNA-palaset fraktioidaan 6 % poly-akryyliamidigeelillä ja EcoRI*-PstI-DNA-jakso (9,4 bp) 93 80720 uutetaan edelläkuvatulla tavalla. DNA-palaselle suoritetaan sekvenssianalyysi Maxamin ja Gilbertin (15) mukaan.
Sidoksenmuodostajän ja IFN-cDNA-laatuja koodaavan alueen alun välisen liitoskohdan rakenne määritetään vastaavalla tavalla plasmideista CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 ja CG-pBR-322/HLycIFN(a-3)-252.
Plasmideissa CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258, (a-2)-261 ja (a-3)-252 edeltää interferonia koodittavaa sekvenssiä seuraava nukleotidijakso, jossa on EcoRI-katkaisukohta.
EcoRI Sau3A
-NGAATTCTATGTGTGATC.....
-NCTTAAGATACACACTAG.....
-> IFN geeni
Esimerkki 24: PH05-signaalisekvenssin poisto ilmentämis- plasmidista p31 (ks. kuva 31)
Ilmentämisplasmidi p31 sisältää PH05-promoottorisek-venssin mukaanlukien mRNA:n aloituskohdat, happofosfataa-sin luennan aloituskodonin ATG ja lisäksi 40 nukleotidia, jotka koodittavat osaa happofosfataasin signaali-sekvenssistä. Tässä rakentamistoimenpiteessä signaali-sekvenssin nukleotidit ja ATG eliminoidaan Bal31-hajotuksella. EcoRI-sidoksenmuodostajat liitetään, jotta voidaan yhdistää PH05-promoottori haluttuihin kypsiin koodaussekvensseihin (esim. interferonigeeneihin).
a) Ball:llä katkaistun plasmidin p30 hajotus Bal31:llä 20 yg p30-DNA:ta (ks. esimerkki 4b) katkaistaan rest-riktioendonukleaasilla Ball, jolloin saadaan 2 palasta, joiden koot ovat 3,7 ja 5,1 kb. Kun on uutettu fenolil 94 8 0 7 2 0 la ja kloroformilla, DNA saostetaan etanolilla. DNA suspendoidaan uudestaan 10 mM Tris:iin pH 8,0 väkevyyteen 0,5 yg/ml. 9 yg Ballrllä katkaistua p30-DNA:ta katkaistaan 2 yksiköllä eksonukleaasia Bal31 (BRL) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaC^ ja 1 mM EDTA. 2 yg:n näytteet otetaan 15, 30, 45 ja 60 sekunnin kuluttua inkuboitaessa 30°C:ssa ja kukin näyte sekoitetaan välittömästi seokseen, jossa on 50 yl fenolia ja 60 yl TNE. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, DNA saostetaan uudestaan 10 mM Tris:iin pH 8,9 väkevyyteen 100 yg/ml. Jotta saataisiin selville eksonukleolyyttisen Bal31-katkaisun aste, 0,5 yg kunakin ajankohtana otettua DNA:ta katkaistaan endo-nukleaasilla BamHI ja analysoidaan 1,5 % agaroosigeelillä Tris-boraattipuskurissa pH 8,3. Keskimäärin 70 bp poistuu palasen kustakin päästä 45 sekunnin kuluttua Bal31-hajotuksessa. Jatkotutkimuksissa käytetään DNArta, joka on saatu 45 sekunnin kohdalla.
b) EcoRI-sidoksenmuodostajien liittäminen Bal31:llä käsiteltyyn DNA:hän
Kaksi Ä2gg-yksikköä EcoRI-sidoksenmuodostajia (5'-GGAATTCC-3', BRL) suspendoidaan uudestaan 250 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris pH 8 ja 1 mM EDTA. 2 yg EcoRI-sidoksenmuodostajia kinasoidaan 75 ylrssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^, 15 mM DTT, 10 yM ATP ja 33 U T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer).
Kun seosta on pidetty 1 tunti 37°C:ssa, sen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan ja sen jälkeen sitä säilytetään -20°C:ssa.
Yhdistetyt, kaksisäikeiset EcoRI-sidoksenmuodosta-jat liitetään tylpistä päistään Bal31:llä käsiteltyihin DNA-palasiin. Puoli mikrogrammaa Bal31:llä käsiteltyä DNArta (ks. esimerkki 24a) inkuboidaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa 50-kertaisen ylimäärän kanssa kinasoitu-ja EcoRI-sidoksenmuodostajia 20 yl:ssa liuosta, jossa on 95 80720 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 600 U T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Kun T4 DNA-ligaasi on inaktivoitu (10 min 65°C:ssa) EcoRI-sidoksenmuodostajien ylimäärä katkaistaan 50 yksiköllä EcoRI (Boehringer) 50 yl:n tilavuudessa. DNA uutetaan fenolilla ja kloroformilla, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris ja 1 mM EDTA.
Restriktioendonukleaasi EcoRI katkaisee päihin lisätyt EcoRI-sidoksenmuodostajät molemmissa Ball-palasissa (3,7 kb ja 5,1 kb) ja myös 5,1 kb:n palasen sisäisessä EcoRI-kohdassa, jolloin syntyy 3,9 kb:n ja 1,2 kb:n palanen. 3,7 kb:n ja 3,9 kb:n palanen erotetaan 1,2 kb:n palasesta 0,8% matalalla sulavassa agaroosigeelissä (Sigma) liuoksessa, jossa on 90 mM Tris.HCl pH 8,3, 90 mM boori-happoa ja 2,5 mM EDTA. DNA-kaistat värjätään etidiumbro-midilla ja tehdään näkyviksi pitkäaaltoisella UV-valolla aallonpituudella 366 nm. Kahta suurta 3,7 kb:n ja 3,9 kb:n DNA-palasta ei eroteta toisistaan. Ne leikataan irti geelistä yhtenä geelipalana ja uutetaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla.
Lineaariset palaset, jotka päättyvät EcoRI-päihin, muodostetaan renkaiksi yhteenliittämällä. Noin 0,25 yg palasia liitetään yhteen 100 yl:ssa reaktioliuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia 4 tuntia 15°C:ssa.
10 yl:n erät liitosseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä transformaatiokelpoisia E. coli HB101-soluja (ks. esimerkki 4a). 35 transformoitunutta
R
amp -pesäkettä kasvatetaan yksittäisesti LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai. (50) ja analysoidaan EcoRl/BamHI-kaksoiskatkaisulla.
c) Nukleotidisekvenssianalyysi EcoRI-sidoksenmuodosta-jan liittymäkohdan paikan määrittämiseksi
Useimmat 35 kloonia eroavat toisistaan sen kohdan 96 8 0 7 2 0 suhteen, jossa EcoRI-sidoksenmuodostaja on liittynyt PHO5-promoottorialueeseen, riippuen siitä määrästä, jossa Bal31 on hajottanut yksittäisiä DNA-molekyylejä. Nukleotidisekvenssianalyysiä varten plasmidi-DNA katkaistaan EcoRItllä. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, katkaistu DNA saostetaan etanolilla. DNA de-fosforyloidaan ja 5'-päät merkitään radioaktiivisesti esimerkissä 10Ed kuvatulla tavalla. Merkityt DNA-pala-set katkaistaan toisella restriktioendonukleaasilla,
BamHI. Tuotteet erotetaan 0,8% matalalla sulavalla aga-roosigeelillä. 0,5-0,6 kb:n pituinen 5'-merkitty EcoRI-
BamHI-palanen ersitetään matalalla sulavasta agaroosis-ta esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. EcoRI-sidoksen-muodostajan vieressä olevan nukleotidisekvenssin määrittämiseksi eri DNA-palaset hajotetaan kemiallisesti ja tuotteet erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla Maxanin ja Gilbertin (15) kuvaamalla tavalla.
Taulukossa 4 (ks. myös kuva 32) on lueteltu eri kloonit ja vastaavasti PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin (jota seuraa EcoRI-sidoksenmuodostaja) sijainti.
Taulukko 4 klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin sijainti pE +25 pG +16 pe +15 pd +12 PY -4 PR -10
Pp -16 pV -18 PL -21 PN -22 97 80720 pc -24 PH -27 ps -28 pk -29 P1 -38 pM -50 P° -53 PF -59 pm -67 PK -73 P1 -81
Ph -137 d) 0,53 kb:n BamHI-EcoRI-palasen eristäminen, jossa on PH05/R-promoottor i
Plasmidi pR sisältää PH05/R-promoottorin 534 bp:n BamHI-EcoRI-palasessa. Kuvan 3a numeroinnin mukaan palanen kattaa PH05-promoottorisekvenssit nukleotidista -541 (BamHI-kohta) nukleotidiin -10. EcoRI-sidoksen-muodostaja, joka on liitetty nukleotidiin -10 (ks. esimerkki 24b), antaa kaksi G-tähdettä EcoRI-katkaisun jälkeen.
Plasmidi pR katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la BamHI ja EcoRI. 0,53 kb:n BamHI-EcoRI-palanen ero tetaan 0,8% matalalla sulavassa agaroosigeelissä esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 33.
Vastaavalla tavalla katkaistaan plasmidi pY ja 0,53 kb:n BamHI-EcoRI-palanen eristetään, jossa on PH05/Y-pro-moottori. Nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 34.
e) Sall-EcoRI-palasen korvaaminen uusien rakenteiden Sall-EcoRI-palasella plasmidissa p31 5 yg plasmidia p31 (ks. esimerkki 13d) katkaistaan restriktioendonukleaasilla Sali. Katkaistu DNA saoste-taan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 50 yl:aan liuosta, jossa on 100 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl ja 5 mM MgCl2· 98 8 0 7 2 0 DNA hajotetaan EcoRI:llä täydellisesti. Katkaisutuot-teet erotetaan toisistaan 0,8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3.
3,5 kb:n DNA-palanen eristetään pienenä geelipalasena, jossa on DNA-kaista.
5 yg kutakin kloonia pR ja pY (ks. taulukko 4 ja kuva 32) katkaistaan Sall:llä ja EcoRI:llä, kuten edellä on kuvattu. 0,8 kb:n palaset eristetään pieninä palasina matalalla sulavasta agaroosigeelistä.
0,67 yg vektorin p31 Sall-EcoRI-palasta (3,5 kb) liitetään 0,34 yg:aan plasmidin pR tai dY 0,8 kb:n Sall-EcoRI-palasta vastaavasti. Vastaavat geelipalat, joissa on DNA-jaksot, sekoitetaan keskenään ja sulatetaan 65°C:ssa. Nes-teytetty geeli laimennetaan kolminkertaisesti. Liittäminen suoritetaan 240 yl:n kokonaistilavudessa, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^; 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 750 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), yön yli 15°C:ssa.
2 yl:n erä kutakin liitosseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a).
R
8 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA analysoidaan katkaisuanalyysillä. Kunkin ryhmän kloonit ovat identtisiä. Kustakin otetaan yksi klooni jatkokäyttöön, ja niille annetaan vastaavasti nimet p31/R ja p31/Y (kuva 31).
Esimerkki 25: Lymfoblastoidi-interferoni-a-3-DNA:n liit täminen plasmidiin p31/R tai p31/Y (ks. kuva 35) Tässä rakentamisessa liitetään PH05-promoottorialue geeniin, joka koodittaa kypsää interferoni-a-3:a. Ei PH05:n eikä interferonin signaalisekvenssejä ole läsnä, mutta liitoskohdassa on liitettynä EcoRI-sidoksenmuodos-taja.
Plasmidi p31/R (ks. esimerkki 24e) sisältää PH05-promoottorisekvenssin, joka päättyy 9 nukleotidia ennen hap-pofosfataasigeenin ATG-kodonia EcoRI-sidoksenmuodosta- 99 80720 jaan 5'-GGAATTCC-3'. Plasmidin CG-pBR322/HlycIFNfa-3)-252 lymfoblastoidi-interferoni-a-3-geeni (ks. esimerkki 23) on erityisesti sovitettu liitettäväksi PH05-pro-moottorissa olevaan EcoRI-sidoksenmuodostajaan. Kypsää interferoni-a-3:a koodittavan sekvenssin 5'-päässä olevat lisänukleotidit antavat EcoRI-katkaisukohdan ja ATG-kodonin, jotka tarvitaan interferonigeenin luennassa (ks. kuva 29). Oleellisesti ottaen sama rakentaminen tehdään myös plasmidilla p31/Y (ks. esimerkki 24e).
a) EcoRI:llä katkaistun, defosforyloidun plasmidin p31/R rakentaminen 5 yg plasmidia p31/R katkaistaan restriktioendonuk-leaasilla EcoRI (Boehringer) täydellisesti. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 100 yl:aan 50 mM Tris-liuosta pH 8,0. DNA lasketaan Chelex 100-pylvään (BioRAD) läpi, defosforyloidaan naudan sisäelinten emäsfosfataasilla (Boehringer) ja defosforyloitu DNA puhdistetaan DE52-ionin-vaihtokromatografisesti esimerkissä 14b kuvatulla tavalla. DNA suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA, väkevyyteen 0,2 mg/ml.
b) Plasmidin CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 EcoRI-palasen (0,6 kb) eristäminen, jossa on IFN-a-3:a koodittava sekvenssi 10 yg plasmidia CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 katkaistaan restriktioendonukleaasilla EcoRI. Näin saadaan kaksi palasta, joiden koot ovat 3,8 kb ja 0,6 kb. 0,6 kb:n palanen sisältää interferoni-a-3:a koodittavan alueen. Palanen eristetään 0,6 % matalalla sulavassa agaroosi-geelissä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa. Geelipala, jossa on 0,6 kb:n DNA-jakso, leikataan irti geelistä ja käytetään liittämisessä.
c) Linearisoidun, defosforyloidun p31/R-DNA-palasen ja IFN-a-3-DNA:n EcoRI-palasen (0,6 kb) liittäminen yhteen loo 80720 1,5 yg defosforyloitua p31/R-vektori-DNA:ta, joka on katkaistu EcoRI:llä, liitetään 0,19 ygraan IFN-a-3:n 0,6 kb:n EcoRI-palasta. Viimeksimainittu palanen on pienessä, matalallasulavassa agaroosigeelileikkeessä, joka sulatetaan 65°C:ssa. Nesteytetty geeli laimennetaan kaksinkertaisesti. Liittäminen suoritetaan kokonaistilavuudessa 220 yl; jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^» 10 mM ATP ja 8000 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), yön yli 15°C:ssa. 10 yl:n erä liitosseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a).
6 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plas-midi-DNA valmistetaan Holmes et al:n menetelmällä (50) ja analysoidaan Bglll/BstEII-kaksoiskatkaisulla liitännäisen suunnan ja koon mcärittämiseksi. Yhdelle näistä klooneista annetaan nimi p31R/IF(a-3).
Sama rakentaminen tehdään p31/Y:llä (ks. esimerkki 24e). 6 transformoituneen, amp -pesäkkeen plasmidit analysoidaan.
2 kloonissa on liitännäinen oikeassa suunnassa. Yhdelle niistä annetaan nimi p31Y/IF(a-3).
Esimerkki 26: Lymfoblastoidi-interferoni-a-2-DNA:n liit täminen plasmidiin p31/R (ks. kuva 36) Tässä rakentamisessa yhdistetään PH05-promoottori kypsää interferoni-a-2:ta koodittavaan alueeseen.
a) Vektorin p31/R 3,9 kb:n Hindlll-EcoRI-palasen eristäminen 10 yg vektoria p31/R katkaistaan täysin HindIII:lla. Puskurointi säädetään 0,1 tilavuudella 1 M Tris pH 7,5.
Sitten Hindlllrlla katkaistu p31/R-DNA hajotetaan EcoRI: llä. 3,9 kb:n Hindlll-EcoRI-palanen eristetään 0,8 % matalalla sulavasta agaroosigeelistä leikkaamalla geelipala irti geelistä.
b) Plasmidin JDB207/IF2(5^) Xbal-Hindlll-palasen (0,9 kb) eristäminen 101 80720 5 yg plasmidia pJDB207/IF2(5^) (ks. esimerkki 17) katkaistaan täysin Hindlllrlla. Puskurointi säädetään 0,1 tilavuudella 1M Tris pH 7,9. Sitten Hindlllrlla katkaistu plasm'idi katkaistaan Xbalrllä. 0,9 kb:n Xbal-Hindlll-palanen sisältää osan interferonia-2:ta koodittavasta sekvenssistä ja alapuolella olevan PH05:n transkription päätössignaalit. 0,9 kb:n palanen erote taan 0,8 % matalalla sulavassa agaroosigeelissä ja leikataan irti geelistä.
c) 252 bp:n EcoRI-Xbal-palasen erottaminen plasmidista CG-pBR322/HlycIFN(a-2)-261, jossa palasessa on IFN-a-2: ta koodittava sekvenssi 10 yg plasmidia CG-pBR322/HlycIFN(a-2)-261 (ks. esimerkki 23) katkaistaan Xbalrllä 100 ylrssa reaktio-seosta, jossa on 6 mM Tris pH 7,9, 150 mM NaCl, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia. Kun on suoritettu katkaisu kokonaan Xbalrllä, linearisoitu plasmidi-DNA hajotetaan osittain 3 yksiköllä EcoRIrtä (Boehringer). 20 minuutin kuluttua 37°C:ssa hajotus pysäytetään jäädyttämällä seos -70°C:een. DNA-palaset analysoidaan 1,5 % agaroosigeelillä Tris-Boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. EcoRI-Xbal-palanen sisältää kypsää interferoni-a-2:ta koodittavan sekvenssin 5'-osan (Xbal-kohtaan asti) sekä erityisen sidoksenmuodostajän PH05-prcxnoottorin liittämistä varten. 252 bprn palanen eristetään pienestä geelileik-keestä 0,8% matalalla sulavasta agaroosigeelistä.
d) DNA-palasten liittäminen
Esimerkeissä 26 a-c kuvatut kolme DNA-palasta, joissa on tarvittavat lomittaiset päät, liitetään yhteen yhdessä reaktiossa: 0,67 yg 3,9 kb:n Hindlll-EcoRI-palasta, joka on saatu vektorista p31/g, 0,16 yg 0,9 kbrn Xbal-Hindlll-palas-ta, joka on saatu plasmidista pJDB207/IF2(51) ja noin 70 ng 250 bprn EcoRI-Xbal-palasta, joka on saatu plasmidista CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261, liitetään yhteen. Kaikki 102 80720 kolme DNA-palasta ovat pienissä matalalla sulavan agaroo-sin palasissa. Kyseiset kolme agaroosigeelipalasta yhdistetään, sulatetaan 65°C:ssa ja laimennetaan kolminkertaisesti. Liittäminen suoritetaan 450 yl:n kokonaistilavuudessa, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 1200 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 15 °C:ssa 16 tunnin kuluessa. 10 yl:n erä liitosseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointi-kypsiä E. coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a).
p 12 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA erotetaan Holmes et ai. menetelmällä (50) ja analysoidaan BamHI/Hindlll-kaksoiskatkaisulla. Kaikilla klooneilla on identtinen katkeamiskartta. Yhdelle annetaan nimi p31R/(a-2).
Plasmidin pJDB207/IF2(5^) Xbal-Hindlll-palasen (0,9 kb) tilalla voidaan liittämiseen käyttää plasmidista pJDB207/IF2(5^)Δ72 tai plasmidista pJDB207/IF2(5^)Δ82 saatua 0,5 kb:n Xbal-Hindlll-palasta (ks. esimerkki 22). Vektorin p31/R Hindlll-EcoRI-palasen (3,9 kb) sijasta liittäminen suoritetaan myös vektorin p31/Y Hindlll-EcoRI-palaseen (3,9 kb).
DNA-palasten liittäminen ja E. coli HB101:n trans-formointi suoritetaan edelläkuvatulla tavalla.
Kustakin liittämisseoksesta kasvatetaan 12 trans- p formoitunutta, amp -pesäkettä yksittäisesti LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA analysoidaan BamHI/Hindlll-kaksoiskatkaisulla. Saaduille klooneille annetaan nimet p31R/IF(α-2)Δ72, p3lR/IF(a~2)Δ82, P31Y/lF(a-2), p31Y(a-2)Δ72 ja p31Y/IF(α-2)Δ82.
Esimerkki 27: Lymfoblastoidi-interferoni-a-1:n liittämi nen plasmidiin p31/R (ks. kuva 37) a) Vektorin p31/R Hindlll-EcoRI-palasen (3,9 kb) erottaminen 103 80720 10 yg vektoria p31/R hajotetaan HindIII:lla ja EcoRI:llä esimerkissä 26a kuvatulla tavalla. Saadut 0,4 kb:n ja 3,9 kb:n palaset erotetaan preparatiivisella 0,8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä. 3,9 kb:n Hindlll-EcoRX-palanen eluoidaan geelistä esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihto-kromatografisesti (Whatman) (ks. esimerkki 5a), saoste-taan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris pH 8,0 ja 1 mM EDTA, väkevyyteen 0,1 mg/ml.
b) Plasmidin pJDB207/IF2(1'b) PvuII-Hindlll-palasen (0,9 kb) erottaminen 5 yg plasmidia pJDB207/IF2(1*b) (ks. esimerkki 17) katkaistaan PvuIIrlla ja HindIII:lla. Saadut 0,9 kb:n ja 7,3 kb:n palaset erotetaan preparatiivisella 0,8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä. 0,9 kb:n palanen eluoidaan geelistä ja puhdistetaan esimerkissä 27a kuvatulla tavalla. DNA suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris pH 8,0 ja 1 mM EDTA, väkevyyteen 0,05 mg/ml.
c) Plasmidin CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258 EcoRI-PvuII (286 bp) palasen eristäminen, jossa on IFN-a-1:tä koo-dittava sekvenssi 10 yg plasmidia CG-pBR322/HLycIFN (ot-1)-258 (ks. esimerkki 23) katkaistaan PvuII:lla ja EcoRIillä. 286 bp:n katkaisutuote erotetaan 4,2 kb:n palasesta preparatiivisella 0,8% matalalla sulavalla agaroosigeelillä. 286 bp:n EcoRI-PvuII-palanen eluoidaan geelistä ja puhdistetaan esimerkissä 27a kuvatulla tavalla. DNA suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris pH 8,0 ja 1 mM EDTA, väkevyyteen 0,03 mg/ml.
d) DNA-palasten liittäminen 0,5 yg 3,9 kb:n Hindlll-EcoRI-palasta, joka on saatu vektorista p31/R, 0,25 yg 0^9 kb:n PvuII-Hindlll-palasta, joka on saatu plasmidista pJDB207/IF2(1'b), ja 104 80720 0,1 yg 286 bp:n EcoRI-PvuII-palasta, joka on saatu plas- midista CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258, liitetään yhteen 15 °C:ssa 20 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 rnM MgC^/ 10 mM DTT, 4 raM ATP ja 600 yksikköä DNA- ligaasia. 3 yl:n erä liitosseoksesta lisätään 100 ylraan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a).
£ 12 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan yksittäisesti LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisil-liiniä. Plasmidi-DNA analysoidaan BamHI/Hindlll-kaksois-katkaisulla. Yksi klooni, joka antaa 1,4 kb:n BamHI-pa-lasen ja 390 bp:n BamHI-Hindlll-palasen, tutkitaan tarkemmin ja sille annetaan nimi p3lR/IF(a-1).
Vektorin p31/R HindiII-EcoRI-palanen (3,9 kb) voidaan korvata vektorin p31/Y Hindlll-EcoRI-palasella. Myös liittämisessä voidaan käyttää plasmidista pJDB207/IF2(1’b) saadun 0,9 kb:n PvuII-Hindlll-palasen tilalla plasmidista pJDB207/IF2(1'b)Δ saatua 0,45 kb:n PvuII-Hindlll-palasta. Saadut kloonit analysoidaan edelläkuvatulla tavalla. Klooneille annetaan nimet p31R/IF(α-1)Δ , p31Y/IF(a-1) ja p31Y/ IF(α-1)Δ ·
Esimerkki 28: Geenirakenteiden alakloonaus suuren kopio- määrän tuottavaan hiivavektoriin pJDB207 (ks. kuva 38)
Esimerkeissä 25-27 kuvatuissa rakenteissa on PH05-prcmoottori, eri interferoneja koodittava alue ja PH05:n transkription päätössignaalit peräkkäisessä järjestyksessä kaikki plasmidista pBR322 johdettuun vektoriin liitettyinä. Sall-Hindlll-palaset, jotka sisältävät koko ryhmitelmän liitetään 6,2 kb:n Sall-Hindlll-palaseen, joka on saatu pJDB207:stä, esimerkissä 27 kuvatulla tavalla .
2 yg plasmidia p3lR/IF(a-3) katkaistaan restriktioen-donukleaaseilla Sali ja Hindlll. Katkaisutuotteet erotetaan toisistaan preparatiivisella 0,8% matalalla sulaval 105 80720 la agaroosigeelillä. Geelistä leikataan irti pieni palanen (koko 1,8 kb).
Plasmidi pJDB207 katkaistaan restriktioendonukle-aaseilla Sali ja Hindlll ja suuri 6,2 kb:n palanen erotetaan esimerkissä 17 kuvatulla tavalla.
DNA-palasten liittäminen ja transformointikypsien E. coli HB101-solujen transformointi suoritetaan esimer- £ kissä 17 kuvatulla tavalla. 8 amp -pesäkettä kasvatetaan yksittäisesti LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampi-silliiniä. Plasmidi-DNA analysoidaan liitännäisen liitännäisen koon mukaan katkaisemalla restriktioendonukleaa-seilla Hindlll ja Sali. Yksi klooni, jossa on oikea liitännäinen, valitaan ja sille annetaan nimi pJDB207R/IF ( a- 3) .
Vastaavalla tavalla lähtemällä plasmideista p31Y/IF (a-3), p31R/IF(a-2), p31R/IF(a-2)Δ72, p31R/IF(a-2)Δ82, p31Y/IF(a-2), p3lY/IF(a-2)Δ72 , p31Y/IF(a-2)Δ82, p31R/IF(a-1), p31R/IF(a-1)Δ, p31Y/IF(a-1) ja p31/IF(a-1)Δ saadaan seuraavat kloonit, joissa on oikeat liitännäiset : pJDB207Y/lF(a-3), pJDB207R/IF(a-2), pJDB207R/IF(a-2)Δ72, pJDB207R/IF(a-2)Δ82, pJDB207Y/IF(a-2), pJDB207Y/IF(a-2)Δ72, PJDB207Y/IF(a-2)Δ82, pJDB207R/IF(a-1), pJDB207R/IR(a-1)Δ, pJDB207Y/IF(a-1), ja pJDB207Y/IF(α-1)Δ.
106 80720
Esimerkki 29: Saccharomyces cerevisiae AH220:n transfor- mointi ja interferonituotannon aikaansaaminen Plasmidit pJDB207/IF2(51)Δ72, pJDB207/IF2(51)Δ82, pJDB207/ IF2(1'b)A, pJDB207R/IF(a-3) , pJDB207Y/IF (a-3) , pJDB207R/IF (a-2), pJDB207R/IF {a -2)Δ 72 , pJDB207R/IF (α-2)Δ 82 , pJDB207Y/ IF (a -2 ) , pJDB2 07Y/IF (α-2)Δ 72 , pJDB207Y/lF (α-2)Δ 82 , pJDB207R/ IF (a “1) , pJDB207R/lF (a-1 )Δ , pJDB207(/IF (a-1 )Δ ja pJDB207 (/IF(a-1)A (ks. esimerkit 22 ja 28) vastaavasti) siirretään kukin Saccharomyces cerevisiae AH220-kantaan (a, trp1, leu2-3, leu2-112, his3, pho5, pho3) käyttämällä Hinnen et ai. kuvaamaa transformointi-menetelmää (1). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimaalista kasvualustaa sisältäviltä levyiltä, joissa ei ole leusiinia. Yksittäiset transformoituneet pesäkkeet poimitaan ja niitä kasvatetaan esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Eri hiivapesäkkeille annetaan nimet Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(5^)Δ72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(5^)Δ82, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(1’b)Δ, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(α-2)Δ72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(α-2)Δ82, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(ot—2) , Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF (α-2)Δ72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(α-2)^82, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF (et—ί ) , Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(α-1)Δ, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-1), ja Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(α-1)Δ.
107 80720
Esimerkki 30: Saccharomyces cerevisiae GRF18-kannan transformointi ja interferonituotannon aikaansaaminen
Saccharomyces cerevisiae GRF18-kanta (a, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can ) transformoidaan esimerkissä 29 luetelluilla plasmideilla esimerkissä 29 kuvatulla tavalla. Eri hiivapesäkkeille annetaan nimet Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/IF2(51)Δ72, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/IF2(5^)Δ82, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/IF2(1'b)Δ, Saccharomyces cerevisiae GRF1 8/pJDB207R/IF (a-3) , Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-3), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(«-2)Δ72, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(α-2)Δ82, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-2), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(α-2)Δ72, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-2)Ä82, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pKDB207R/IF(a-1), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(α-1)Δ, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-1) ja Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(α-1)Δ.
Esimerkki 31: Hiivasolu-uutteiden valmistus ja inter- feronitiitterin määritys 50 ml:sta kasvualustaa, jossa solutiheys on 1-2x10^/ml, kootaan solut sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 3000 1/min. Solut suspendoidaan uudestaan 2 ml:aan 0,1 M KH2PC>4 pH 7,4 ja sentrifugoidaan huoneenlämpötilassa 5 minuuttia nopeudella 3000 1/min. Sedimentoituneet solut suspendoidaan uudestaan 1,2 ml:aan jääkylmää lysointi-seosta /Ö,1M kaliumfosfaattipuskuri pH 7,4, 1% (tilavuus-osina) Triton X-100, 1 mM PMSF (Merck)_7 ja siirretään 108 80720 30 ml:n Corex-putkeen. 1,6 g lasikuulia lisätään (hal kaisija 0,4 mm) soluihin ja saatua suspensiota ravistellaan Vortex Mixerissä (Scientific Instruments Inc., USA) täydellä nopeudella 30 sekuntia ja sen jälkeen jäähdytetään 1 minuutti jäähauteella. Tämä ravistelutoimenpide toistetaan 5-10 kertaa, kunnes yli 90% soluista on rikkoutunut (tarkistetaan valomikroskoopilla).
Rikkoutuneet solujätteet ja lasikuulat poistetaan liuoksesta sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 8000 1/min 4°C:ssa Sorvali HB-4-roottorilla. Emäliuos siirretään Eppendorf-putkiin, jäädytetään nestemäisessä typessä ja säilytetään -60°C:ssa. Interferoniaktiivisuus määritetään Armstrongin menetelmällä (32) käyttämällä ihmisen CCL-23-soluja ja rakkulastomatiittivirusta (VSV) ärsytysviruksena. Saaduista tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 5.
S. cerevisiae-kantojen AH220 ja GRF18 interferoni-aktiivisuus on yleensä identtinen sen jälkeen, kun ne ovat transformoituneet yhdistelmäplasmidilla. Taulukossa 6 on esitetty molempien kantojen interferoniaktii-visuuden vertailu, kun ne on transformoitu esimerkkeinä luetelluilla plasmideilla.
109 80720
Taulukko 5 S. cerevisiae-kannan AH220 interferoniaktiivisuus, kun se on transformoitunut seuraavilla yhdistelmäplasmi-deilla:
Egi_ Xnt*rferoniaktiivisuus ilmaistuna
Plasmidit merkki yksikköinä/ml yksikköinä/1 hiiva- hiivasolu-uutet-| soluviljelmää ______ta__ pJDB207/IF(8^) 17 1-107 2 «10® pJDB207R/IF(a-3) 28 1·108 2·109 pJDB207Y/IF(o-3) 28 1·10® 2·109 pJDB207/IFl(5j) 17 7·105 1.4·107 pJDB207/IF2(51) 17 5·105 1.0-107 pJDB207/IF3(51) 17 3·103 6.3·104 pJDB207/IF2(5 )Δ72 22 5·105 1·10? 1 S 7 pJDB207/IF2(51)A82 22 5·10 1·10 ρJDB207R/IF (α- 2) 28 1·107 2·10® pJDB207R/IF(o-2)A72 28 1·107 2·10® pJDB207R/IF(a-2)A82 28 1·107 2-10® pJDB207Y/lF(a_2) 28 W07 2-10® pJDB207Y/IF(a-2)A72 28 · 1·10? 2·10® pJDB207Y/IF(a-2)A82 28 1·107 2·10® pJDB207/IF2(l»b) 17 4*10® 8·104 pJDB207/IF2(l*b)A 22 1·103 2·104 pJDB207R/IF(a-l) 28 5·104 1·106 pJDB207R/IF(a-l )Δ 28 4·104 8·105 pJDB207Y/IF(a-l) 28 5·104 1·106 pJDB207Y/IF(a-l )Δ 28 4·104 8.105 110 80720
Taulukko 6: S. cerevisiae-kantojen AH220 ja GRF18 in- terferoniaktiivisuus, kun ne ovat transformoituneet seu-raavilla yhdistelmäplasmideilla: I Interferoniaktiivisuus (yksikköä/1 hiiva-.
Plasmidit soluviljelmää) tuasmiait AH220 GRF18 pJDB207/IF(8*) 2*10® 2*10® pJDB207R/IF(a-3) 2·109 2·109 pJDB207/IF2(51) 1·107 9·106 pJDB207R/IF(a-2) 2·10® . 2·10® pJDB207R/IF(a-2)A82 2·10® 2·10®
Esimerkki 32: Interferoni-a-2:η tuottaminen hiivan
Saccharomyces cerevisiae yhdistelmäkannalla 300 l:n mittakaavassa
Saccharomyces cerevisiae-kanta GRF18/pJDB207R/IF (α-2)Δ82 kantaa plasmidia, jossa on leusiinimerkki, joka mahdollistaa plasmidin selektiivisen ylläpidon isäntä-organismissa, ihmisen interferoni-a-2:n rakennegeeni ja happofosfataasin PH05-prcmoottori, joka mahdollistaa IFN-α-2-geenin ilmentymisen kasvualustoissa, joissa on rajoittava määrä epäorgaanista fosfaattia.
Kantaa ylläpidetään agarvinopintaviljelmissä, joissa on määriteltyä kasvualustaa ilman leusiinia, jotta voidaan varmistaa plasmidin pysyvyys. Juurisiirrostettuja vinopintoja inkuboidaan 24 tuntia 30°C:ssa. Yhden vino-pinnan pintakasvusto suspendoidaan uudestaan 3 ml:aan esikasvatusalustaa, joka sitten siirretään ensimmäiseen ravistelupullossa tapahtuvaan esikasvatukseen. 500 ml:n 111 80720 pullossa on yksi ohjauslevy ja se sisältää 100 ml esi-kasvatusalustaa, jonka koostumus on seuraava (määrät g/1): hiivauutetta (Difco) 10,0; L-asparagiinia 6,6; KH2P04 1,0; MgS04.7H20 1,0; L-histidiiniä 0,02 ja D-glukoosia (monohydraatti) 33,0. Kasvualusta on valmistettu käyttämällä deionoitua vettä ja sen pH on noin 6,0. Glukoosi steriloidaan erikseen. Ensimmäistä esi-viljelmää inkuboidaan 24 tuntia 30°C:ssa orbitaalisekoit-timessa, jossa on 5 cm:n heilahdus ja nopeus 250 kierrosta minuutissa.
Ensimmäisestä esikasvatuspullosta saadaan siirros-teet toisiin esikasvatuspulloihin. Pulloihin laitetaan siirrostetta 1% tilavuusosina. Kasvualusta ja inkuboin-tiolosuhteet ovat samat kuin ensimmäisessä esikasvatukses-sa. 36 tällaisesta pullosta saadut kasvuliemet yhdistetään niin, että saadaan 1% (tilavuusosina) siirrostetta päätuotantofermentoriin.
Tuotantofermentorin kokonaistilavuus on noin 500 1 ja se sisältää 4 ohjauslevyä ja yksisiipisen levyturbiini-sekoittimen, jonka halkaisija on 230 mm. Sekoitusnopeus on 450 kierrosta minuutissa ja ylipaine 0,3 bar ja il-mastusnopeus 1 tilavuus/tilavuus/minuutti. Fermentori sisältää 300 1 kasvualustaa, jolla on seuraava koostumuus (määrät g/1): L-asparagiini 2,0; L-histidiini 0,02; KH2P04 0,03; MgS04.7H20 0,5; NaCl 0,1; CaCl2.2H20 0,1; KCl 1,0; D-glukoosi (monohydraatti) 20,0; vitamiiniliuos 5 ml/1 ja hivenaineliuos 5 ml/1. Kasvualunstan pH säädetään arvoon 7,2 lisäämällä natriumhydroksidia ennen sterilointia. Glukoosi, vitamiinit ja hivenaineet steriloidaan erikseen ja lisätään kasvualustaan. Vitamiinien ja hivenaineiden varastoliuoksilla on seuraavat koostumukset: vitamiinit - biotiini 0,0002; kalsium-D-pantotenaatti 0,04; foolihappo 0,0002; nikotiinihappo 0,04; p-aminobentsoe-happo 0,02; pyridoksiinihydrokloridi 0,04; riboflaviini 0,02; tiamiinihydrokloridi 0,04; ja inositoli 0,2; 1 1: ssa deionoitua vettä; hivenaineet - boorihappo 0,05; CuSC>4.
112 80720 5H20 0,004; ΚΙ 0,01; FeCl3.6H20 0,02; MnS04.4H20 0,04; Na2Mo04.2H20 0,02 ja Zn.7H20 0,04; 1 l:ssa deionoitua vettä. Fermentointilämpötila on 30°C. pH laskee alueelle noin 4,0 - 4,2, mutta sitä voidaan haluttaessa pitää välillä olevassa arvossa natriumhydroksidia lisäämällä. Maksimaalinen interferonimäärä saavutetaan, kun on fermentoitu 18 tuntia. Optinen tiheys, joka saavuttaa noin 2,0 yksikköä, ja happofosfataasiaktiivisuus ovat hyödyllisiä indikaattoreita fermentaation etenemiselle. Käymisseos voidaan jäähdyttää 10°C:een ennen hiivasolujen talteenottoa.
Esimerkki 33: HLyIFN-a-2:n eristäminen ja talteenotto a) Polypeptidiliuoksen valmistus monoklonaalista vasta-ainepylvästä varten
Kaikkiaan 600 1 kasvatusseosta, jonka pH on 4,1, jäähdytetään 10°C:een. Solut erotetaan käyttämällä Alfa-Laval BRPX-207 lietteenpoistosentrifugia. Kirkkaassa emäliuoksessa ei ole lainkaan IFN-aktiivisuutta. Solujen pidättämä emäliuosjäännös poistetaan pesemällä 20 litralla lysispuskuria A (100 mM KH2PC>4, 500 mM NaCl, 0.1 % (tilavuusosina) Triton X-100R ja 0,1 mM PMSF-liuosta, pH säädetty arvoon 7,5 kaliumhydroksidilla). Sentrifugikulhon sisältö (7 1) otetaan talteen kokonaan ja lietteenpoistolaite pestään kerran 5 litralla lysispuskuria A. Saatu solumassa liuotetaan puskurilla A 60 litraksi ja sen pH:ksi tulee 7,3. Suspensio jäähdytetään 5-10°C:een ja lasketaan DYNOR-Mill'in (tyyppi KD5) läpi syöttönopeudella 100 1/h. Mylly on varustettu polyuretaanisekoitinkiekoilla ja 4200 ml:11a lasihelmiä, joiden halkaisija on 0,5 - 0,75 mm, ja sitä käytetään nopeudella 1625 kierrosta/minuutti. Rikottujen solujen suspensio (pH n. 7,3) sentrifugoidaan edelläkuvatulla tavalla. Emäliuos (75 1) väkevöidään 3 litraksi ultrasuo-datuksella. Erä (300 ml) tästä polypeptidiliuoksesta 113 80720 lasketaan H1P100 Hollow filter-makasiinin läpi käyttämällä Amicon DC-2 Hollow Fibre Systemiä. Suotimeen lisätään vielä 2 1 puskurisysteemiä B (30 mM Tris.HCl, 500 mL NaCl, pH säädetty arvoon 8,5). Suodos ja pesu-liuokset (2 1) yhdistetään ja väkevöidään 100 mlrksi H1P10 Hollow filter-makasiinin avulla. Konsentraatti adsorboidaan DEAE-Trisacryl M DEAE (LKB Ltd.)-pylvääseen. Pylväs pestään ja eluoidaan sen jälkeen puskurilla C (200 mM NaCl, 25 mM Rris.HCl, pH 8,5). Eluaatin g interferoniaktiivisuus on 1,4 x 10 IU/mg polypeptidiä, kun määritys suoritetaan Armstrongin menetelmällä (32). Eluaattia säilytetään -20°C:ssa ennen monoklonaalisessa vasta-ainepylväässä tapahtuvaa jatkopuhdistusta.
b) Ihmisen LyIFN-a-2:n puhdistaminen monoklonaalisessa vasta-ainepylväässä
Monoklonaalinen vasta-ainepylväs NK2 (toimittaja CELLTECH U.K.) (pakatun kolonnin tilavuus 20 ml) tasapainotetaan liuoksella, jossa on 20 mM Na-fosfaattia ja 154 mM NaCl, pH 7,4, ja edellävalmistettua polypeptidi-liuosta lisätään pylvääseen huoneenlämpötilassa virtausnopeudella 50 ml/h. Ensimmäiset jakeet, jotka sisältävät adsorboitumattomat polypeptidit ja 100 ml PBR-pesu-liuoksia, heitetään pois. Muut epäspesifiset sitoutuneet polypeptidit eluoidaan 110 ml:11a PBS-liuosta, jossa on 0,5 M NaCl ja 0,2 % Triton X-100R. Pylväs pestään 200 mlilla liuosta, jossa on 20 mM Na-fosfaattia ja 0,3 M NaCl, pH 7,4, jonka jälkeen spesifisesti adsorboituneet polypeptidit eluoidaan 50 ml:11a puskuria D (0,1 M sitruunahappoa ja 0,3 M NaCl, pH 2). Tämän liuoksen pH säädetään arvoon 6,3 2N natriumhydroksidilla ja väkevöidään 4°C:ssa upotettavan-CX™-molekyylierottimen avul-
R R
la (Millipore ). Konsentraatti lisätään Sephadex G-25 - hienopylvääseen (2,6x34 cm, pakatun kolonnin tilavuus 200 ml), joka on tasapainotettu 0,025 M histidiini.HCl: 11a, pH 6,3. Pylväs eluoidaan samalla histidiini-HCl- 114 80720 puskurilla 4°C:ssa virtausnopeudella 42 ml/h. Kerätään 20 jaetta, joiden kunkin suuruus on 10,5 ml. Polypepti-dipitoiset jakeet erotetaan optisen adsorption perusteella aallonpituudella 280 nm. Jakeet 7 ja 8 sisältävät sen polypeptidin, jolla on IFN-aktiivisuus, kun määritys suoritetaan Armstrongin menetelmällä (32). Aktiivisia jakeita, joissa on LyIFN-a-2, varastoidaan -20°C:ssa jatkokäyttöä varten. Jakeiden IFN-aktiivisuus on 1,8.
10® IU/mg polypeptidiä (32).
Kun edelläsaadut jakeet lyofilisoidaan, saadaan 1 ml: sta liuosta 20-40 yg polypeptidiä.
SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (ks. (53)) osoittaa, että saadun LyIFN-a-2:n molekyylipaino on noin 18 kDaltonia.
Esimerkki 34: Transformoituneiden hiivasolujen tuottaman interferonin erittyminen kasvuliuokseen
Jotta saataisiin määritetyksi N-pään proteiinin signaalisekvenssin vaikutus proteiinin erittymiseen, hiivakantaa S. cerevisiae GRF18/pJDB207/IF(8^) (jossa on yhdistelmäsignaalisekvenssi, ks. esimerkki 17) ja hiivakantaa S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2) (ilman signaalisekvenssiä) kasvatetaan esimerkissä 28 kuvatulla tavalla. Kasvuliuokseen tuotetun interferonin määrä sekä se interferonimäärä, joka on solu-uutteissa (valmistettu esimerkissä 31 kuvatulla tavalla), määritetään ja saadut tulokset on esitetty taulukossa 7.
115 80720
Taulukko 7: Vertailu transformoituneiden S. cerevi- siae GRF18-kantojen kasvuliuokseen erittämien inter-feronimäärien välillä --:-+-
Interferoniaktiivisuus (yksikköä/1 S. cerevisiae-kanta hiivasoluviljelmää solu-uute kasvuliuos GRF18/pJDB207R/IF(a-3) 1.5 · 109 <3 · 10* GRFl8/pJDB207/IF(8*) 2 · 10® 2 · 10? '16 80720
Viitteet 1. A. Hinnen et ai., "Transformation of yeast", Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 75, 1929 (1978) 2. i.D. Beggs, "Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid", Nature 275, 104 (1978) 3. J. Hicks et al., "Properties of yeast transformation", Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 43^ 1305 (1979) 4. K.Struhl et al., "High-frequency transformation of yeast; autonomous replication of hybrid DNA molecules", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035 (1979) 5. R.A. Hitzeman et al., "Expression of a human gene for interferon in yeast", Nature 293, 717 (1981) 6. J.D. Beggs et al., "Abnormal expression of chromosomal rabbit β-globin gene in Saccharomyces cerevisiae", Nature 283, 835 (1980) 7. R. Axel, "The use of eukaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials", PCT-patenttihakemus 81/02425.
8. J.A. Carbon et al., "DNA capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote, method of preparation thereof and eukaryotic cell containing same", EurOOppa-patenttihaksnus 48081 (The regents of the University of California) 9. D.T. Stinchcomb et al., "Eukaryotic autonomously replicating segment", Eurooppa-patenttihakemus 45573 (The board of trustees of Leland Stanford Junior University) 10. "Plasmidvektoren, Hybridplasmide und ihre Verwendung zur Herstel- lung von Proteinen", DE-hakemusjulkaisu 2 923 297 (Insti tut Pasteur) 117 80720 11. "Procede de production de proteines par expression des genes correspondants dans des microorganismes et vecteurs susceptiblcs d'etre mis en oeuvre dansdetels procedes", FR-patenttiha- kemus 2 458 585 (Institut Pasteur) 12. M. Aigle et al., "Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant" Eurooppa-patenttihakemus 11562 (Agence natio-nale de valorisation de la recherche) 13. A. Schurr et al., J. Gen. Microbiol. 65, 291 (1971) and A. Toh-e et al., Mol. Gen. Genet. 162, 139 (1978) 14. P. Mildner et al., Biochim. Biophys. Acta 429, 274 (1976) 15. A.M. Maxam et al. in "Methods in Enzymology", vol. 65, p.499,
New York 1980 16. A. Hinnen et al., "Vectors for cloning in yeast", Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96_, 101 (1982) 17. A. Hinnen et al. in "Eukaryotic Gene Regulation", vol. 14, p. 43, New York 1979 18. "Genetic Engineering" (ed. A.M. Chakrabarty) , West Palm Beach 1978 19. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971 20. M. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72^, 3961 (1979) 21. A. Jimenez et al., Nature 287, 869 (1980) 22. T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750 (1981) 23. M.V. Olson et al., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979) 24. H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1978) 25. B. Hohn et al. in "Genetic Engineering", vol. 2, p. 169,
New York 1980 26. B. Hohn in "Methods in Enzymology", vol. 68, p. 299, New York 1979 27. N. Mantei et al., Gene JO, 1 (1980) 28. J.D. Beggs in "Genetic Engineering", vol. 2, p. 175, New York 1981 118 80720 29. M. Handel et ai., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) 30. J.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor 1972 31. A. Toh-e et ai., J.Bacteriol. U3* 727 (1973) 32. J.A. Armstrong, Appi. Microbiol. 21^, 723 (1971) 33. J.B. Gurdon, J. Embryol. Exp. Morph. 20, 401-414 (1968) 34. Barth, J. Embryol. Exp. Morph. 7_t 210-222 (1959) 35. A. Colman, Cell 17, 517 (1979) 36. A. Efstratiadis et al., Cell 4^, 367-378 (1975) 37. T. Maniatis et al., Cell j}, 163-182 (1976) 38. J.H.J. Hoeijmakers et al., Gene {}, 391-417 (1980) 39. A.C. Peacock et al., Biochemistry J6, 1818 (1967) 40. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975) 41. J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537-548 (1979) 42. W. Mueller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978) 43. D.V. Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981) 44. C. Wcissmann, Eurooppa-patenttihakemus No.32134 (Biogen N.V.) 45. T.Taniguchi et al., Gene 10, 11 (1980) 46. M. Streuli et al., Science 209, 1343 (1980) 47. Perlman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79\ 781 (1982) 48. A.J. Berk et al., Cell 12, 721-732 (1977) 49. J. Messing, In the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA (ed. A. Walton), Elsevier, Amsterdam 1981, pp. 143-153 50. D.S. Holmes et al., Anal.Biochem. 114, 193-197 (1981) 119 80720 51. N.M. Gough et ai., J. Mol. Biol. 162, 43-67 (1982) 52. Pasek et ai., Nature 282, 575-579 (1979).
53. U.K. Laemroli, Nature 227. 680-685 (1970).
i 120 80720
Liite:
Liitteenä olevien kuvien 10-14 piirrosten symboleilla on seuraavat merkitykset: vaihtunut aminohappo • ja ·. vaihtunut nukleotidi sekvenssi, joka ei ole läsnä ennestään tunnetun tiedon mukaan polyadenyloituneet kohdat ennestään tunnetun ^ tiedon mukaan | poistunut nukleotidi | lisätty nukleotidi
Vastaavissa kuvissa viittaavat merkityt symbolit lähim-piin tekniikan tason mukaisiin viitejulkaisuihin, kuten esimerkissä 10 on esitetty.
Muissa liitteenä olevien piirrosten kuvissa käytetyillä symboleilla on seuraavat merkitykset: 121 80720 &ΛΛΛΛΛ HBVs-geeni --- pBR 322 -sekvenssit hiivan kromosomaali-niiinimm nen DNA, joka on johdettu PH03, PH05-alueesta
mum*!» hiivan 2y-plasmidi-DNA
hiivan kromosomaali-^=^==i nen DNA, joka on johdettu LEU2-alueesta poistunut katkaisukohta ihmisen lymfoblastoidi-interferonigeeni hiivan kromosomaalinen DNA, ..............: joka on johdettu TRP1- alueesta poistunut kohta pBR322:ssa — katkaisukohta —.. — transkription suunta —L— sidoksenmuodostajan DNA-—jakso ___R ampisilliinin vastustus- omP kykygeeni tetrasykliinin vastustus-kykygeeni

Claims (19)

122 80720
1. DNA—restriktiojakso, joka koostuu olennaisesti Sacc-haromyces cerevlslaen happamen fosfataasin (PH05) säädeltävissä olevasta promoottorista, tunnettu siitä, että se sisältää nukleotidisekvenssin G ATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATCCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAACTCATCTT ATG TG CGCTGCTTTAATGTTTTCTCATCTAACCGGACGT CGTCTAT AAACTT CAAACG AA CCTAaAACCTTCATAGCCCTTTTTCTTTGTCTGCACAAACAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTCATTAAAAGAGTT AATTGAATAGCCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGCCACTCACACGTGGGACTAG CACACACTAAATTTATGATTCTCGTCCCTGTrrrCGAACAGATCGCACATGCCAAATTAT CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAACGCATATACCCATTTCCGaTAAGGGTAAACATCTTT GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAACCGCTGATGTTTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGG cttcatctctcatgagaataagaacaacaacaaatac-agcaagcaaattcgagattacca ATGTTTAAATCTCTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAGGTACCATT CCCTTAGGCAAACTAGCCGATG ja sen alajaksot, joissa promoottorifunktio on säilynyt.
2. Patenttivaatimuksen l mukainen DNA-jakso, tunnet-t u siitä, että sillä on nukleotidisekvenssi G AT CCGAAAGTT GT ATT CAACAAGAATGCGCAAAT ATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT ATGTGCGCTGCTTTAATCTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAA GGTAaAAGGTTCATAGCCCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT aattgaataggcaatctctaaatgaatcgatacaaccttggcactcacacgtgggactag 123 80720 cacagactaaatttatgattctggtccctgttttcgaagacatcgcacatgccaaattat CAAATTCGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGCGaTAAGGGTAAACATCTTT GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTGATCTTTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGG CTTCATCTCTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTACCA ATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAGCTACCATT CCCTTAGGCAAACTAGCCGATG ja sen alajaksot, joissa promoottorifunktio on säilynyt.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-jakso, tunnet-t u siitä, että sillä on sekvenssi G ATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAACTCATCTT ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAACCGGACGTCCTCTATAAACTTCAAACGAA GGTAAAAGGTTCATAGCCCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATCCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT AATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACCTGGGACTAG CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTCATCTTTTGCTAAGTCGACGTTAGTATGG cttcatctctcatgagaataagaacaacaacaaatagagcaaccaaattcggg,
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että sillä on sekvenssi G ATCCCAAACTTCTATTCAACAACAATCCGCAAATATGTCAACCTATTTGCAAGTCATCTT ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGCACCTCGTCTATAAACTTCAAACGAA 124 80720 GGTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAACAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT AATTGAATAGCCAATCTCTAAATGAATCGAT ACAACCTTGGCACT C AC ACGTGGGACT AG CACAGACTAAATTTATGATrCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT GAATTGTCGAAATCAAACGTATATAAGCGCTGATGTTTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGG CTTCATCTCTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTAGC.
5. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen DNA-jakson valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (A) valmistetaan happamen fosfataasin (PH05) geeni täydentämällä happamen fosfataasin PH05 suhteen vajaa Saccharo-mVces cerevlsiae-hiivakanta suorittamalla transformointi plasmidi-DNArlla, joka on saatu mainitun geenin villi-tyyppikopion sisältävästä S. cerevisiae-geenikirjastos-ta, ja eristetään mainittu geeni, (B) valmistetaan saadun geenin alaklooneja ja (C) identifioidaan promoottorialueen sijainti edellämaini-tuissa alaklooneissa ja eristetään restriktioentsyymi-katkaisulla DNA-palaset, jotka olennaisesti koostuvat happamen fosfataasin (PH05) promoottorista, ja alajaksojen valmistamiseksi saadut DNA-jaksot lyhennetään katkaisemalla restriktioendonukleaasilla tai eksonukleaasil-la.
6. Hiiva-yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-jakson, joka olennaisesti koostuu jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisesta säädeltävissä olevasta Saccharomyces cerevisiaen happamen fosfataasin (PH05) promoottorista ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta poly-peptidiä koodittavasta alueesta, jota mainittu promoottori ohj aa.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, 125 80720 tunnettu siitä, että hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue koodittaa ihmisen interferonia.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue koodittaa hepatiitti B-viruksen antigeeniä.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää hiivageenin transkription päätössignaaleja.
10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittavaa aluetta edeltää signaali-sekvenssi.
11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue liittyy happamen fos-fataasin (PH05) promoottorialueeseen happamen fosfataasin (PH05) pää-mRNA:n alun ja happanta fosfataasia (PH05) koo-dittavan alueen ATG:n välissä.
12. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 6-11 mukaisen yhdistelmävektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä liitetään vektori-DNArhan DNA-jakso, joka koostuu olennaisesti jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisesta säädeltävissä olevasta happamen fosfataasin (PH05) promoottorista, ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue, jota mainittu promoottori ohjaa.
13. Menetelmä Saccharomyces cerevisiae-kannan valmistamiseksi, joka on transformoitu hiiva-yhdistelmävektorilla, jossa on DNA-jakso, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen säädeltävissä olevan happamen fosfataasin (PHQ5) promoottorin, ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue, jota mainittu promoottori ohjaa, tunnettu siitä, että Saccharomyces cerevisiae-kanta transformoidaan patenttivaatimuksen 6 mukaisella yhdistelmävektorilla. 126 80 720
14. Menetelmä hiivaperälsen tai hiivaan kuulumattoman polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (1) viljellään Saccharomyces cerevisiae-kantaa, joka on transformoitu hiiva-yhdistelmävektorilla, jossa on DNA-jakso, joka koostuu olennaisesti jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisesta säädeltävissä olevasta happamen fosfataasin (PHQ5) promoottorista, ja hiivaperäistä tai hiivaan kuulumatonta polypeptidiä koodittava alue, jota mainittu promoottori ohjaa, ja (2) eristetään ja puhdistetaan polypeptidi.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on ihmisen interferoni.
16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on IFN-a-l.
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on IFN-a-2.
18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on lFN-a-3.
19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on hepatiitti B-viruksen antigeeni. 127 8 0 7 2 0
FI832825A 1982-08-09 1983-08-05 Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider. FI80720C (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8222883 1982-08-09
GB8315145 1982-12-31
GB8222883 1982-12-31
GB8237026 1982-12-31
GB8237026 1982-12-31
GB838315145A GB8315145D0 (en) 1982-08-09 1983-06-02 Yeast hybrid vectors

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI832825A0 FI832825A0 (fi) 1983-08-05
FI832825A FI832825A (fi) 1984-02-10
FI80720B true FI80720B (fi) 1990-03-30
FI80720C FI80720C (fi) 1990-07-10

Family

ID=27261693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI832825A FI80720C (fi) 1982-08-09 1983-08-05 Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0100561B1 (fi)
JP (2) JPH0653073B2 (fi)
AT (1) ATE43636T1 (fi)
AU (1) AU566348B2 (fi)
CA (1) CA1341381C (fi)
CY (1) CY1451A (fi)
DD (1) DD218118A5 (fi)
DE (1) DE3379960D1 (fi)
DK (1) DK174905B1 (fi)
ES (3) ES8505724A1 (fi)
FI (1) FI80720C (fi)
GB (1) GB2125047B (fi)
GR (1) GR78924B (fi)
HK (1) HK90688A (fi)
HU (1) HU204095B (fi)
IE (1) IE55598B1 (fi)
NO (1) NO172548C (fi)
NZ (1) NZ205178A (fi)
PH (1) PH25617A (fi)
PT (1) PT77167B (fi)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2125047B (en) * 1982-08-09 1986-02-19 Ciba Geigy Ag Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
DE3381619D1 (de) * 1982-08-16 1990-07-05 Chemo Sero Therapeut Res Inst Pendelvektor.
JPS5936699A (ja) * 1982-08-20 1984-02-28 Chemo Sero Therapeut Res Inst シヤトルベクタ−
JPS5931799A (ja) * 1982-08-16 1984-02-20 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド
AU584580B2 (en) * 1982-09-08 1989-06-01 Smith Kline - Rit Hepatitis B virus vaccine
JPS5974988A (ja) * 1982-10-20 1984-04-27 Suntory Ltd 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法
ZA843275B (en) * 1983-05-05 1984-12-24 Hoffmann La Roche Novel vectors for interferon expression
PH22337A (en) * 1983-11-21 1988-08-12 Ciba Geigy Ag Synthesis of fibrinolytic agents by yeast
JPS60248181A (ja) * 1984-05-23 1985-12-07 Shiseido Co Ltd 酵母発現ベクタ−
US5723292A (en) * 1984-05-25 1998-03-03 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs
AU600885B2 (en) * 1984-05-25 1990-08-30 Zymogenetics Inc. Stable DNA constructs
GB8415186D0 (en) * 1984-06-14 1984-07-18 Ciba Geigy Ag Polypeptides
EP0189463A4 (en) * 1984-07-09 1988-04-18 Jeffrey F Lemontt YEAST CLONING VECTOR.
WO1986000637A1 (en) * 1984-07-09 1986-01-30 Integrated Genetics, Inc. Yeast cloning vehicle
WO1986000923A1 (en) * 1984-07-31 1986-02-13 Integrated Genetics, Inc. Yeast cloning vehicles
JPS61103895A (ja) * 1984-10-26 1986-05-22 Green Cross Corp:The ＨＢｓＡｇの精製方法
DE3587307T2 (de) * 1984-12-06 1993-09-02 Fina Research Transformierte hefen die lysozym produzieren, fuer diese transformation zu verwendende plasmide und deren verwendung.
DE3685044D1 (de) * 1985-02-01 1992-06-04 Ici Plc Analoge interferon-polypeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
JPS62151183A (ja) * 1985-09-18 1987-07-06 Green Cross Corp:The 酵母プロモ−タ−及び異種蛋白質の製造方法
EP0216573B1 (en) * 1985-09-18 1990-11-22 Green Cross Corporation Yeast promoter and method of producing heterologous proteins
GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1986-01-22 Ciba Geigy Ag Thrombin inhibitors
GB2188049B (en) * 1986-03-15 1990-09-05 Ciba Geigy Ag Insecticidal proteinaceous substance
EP0240224A3 (en) * 1986-03-31 1989-02-01 Interferon Sciences, Inc. An alpha interferon analogue
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
ES2052602T3 (es) 1986-10-03 1994-07-16 Ciba Geigy Ag Nuevos peptidos afines a las linfocinas.
US5013652A (en) * 1986-10-14 1991-05-07 Genex Corporation Composite yeast vectors
DE58907373D1 (de) * 1988-03-07 1994-05-11 Ciba Geigy Modifizierte Proteine.
US5180667A (en) * 1988-03-07 1993-01-19 Ciba-Geigy Corporation Genes encoding eglin C mutants
WO1990002762A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 The Rockefeller University Macrophage-derived inflammatory mediator (mip-2)
JPH02145193A (ja) * 1988-11-19 1990-06-04 Lotte Confectionery Co Ltd 遺伝子の組換えによる酵母でのヒト・アルファ・インターフェロンの製造方法
AU648214B2 (en) * 1991-12-31 1994-04-14 Lucky Limited Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc.
DE69434492T2 (de) 1993-03-10 2006-07-13 Smithkline Beecham Corp. Phosphodiesterase des menschlichen gehirns
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
US7309505B2 (en) 2002-09-13 2007-12-18 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve Aspergillus phytases
DE102005030552B4 (de) * 2005-06-22 2009-05-28 Eucodis Bioscience Selektion von Phosphatase-Aktivität
CN102059495A (zh) * 2010-11-06 2011-05-18 中国长江航运集团宜昌船厂 一种船体框架胎模及加工方法
CN105821078A (zh) 2010-12-09 2016-08-03 巴斯德研究所 用于获得高产量重组蛋白表达的基于mgmt的方法
US8951752B2 (en) 2011-10-20 2015-02-10 University Of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
ES2648899T3 (es) 2011-12-09 2018-01-08 Institut Pasteur Inmunoensayo de cribado múltiplex
EP2861740A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 University of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
WO2022049409A1 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Sia Terragen Express diagnosticum for sars-cov-2

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2458585A1 (fr) * 1979-06-07 1981-01-02 Pasteur Institut Procede de production de proteines par expression des genes correspondants dans des micro-organismes et vecteurs susceptibles d'etre mis en oeuvre dans de tels procedes
WO1981002425A1 (en) * 1980-02-25 1981-09-03 R Axel The use of eucaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials
IL63270A0 (en) * 1980-08-05 1981-10-30 Univ Leland Stanford Junior Eukaryotic autonomously replicating segment
IL63035A (en) * 1980-09-09 1985-05-31 Univ California Dnas capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote,their preparation and eukaryotic cells comprising them
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
IE54046B1 (en) * 1981-08-25 1989-05-24 Celltech Ltd Expression vectors
NZ201705A (en) * 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
GB2125047B (en) * 1982-08-09 1986-02-19 Ciba Geigy Ag Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
JPS5931799A (ja) * 1982-08-16 1984-02-20 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0813277B2 (ja) 1996-02-14
CA1341381C (en) 2002-08-06
AU566348B2 (en) 1987-10-15
ES540881A0 (es) 1986-05-16
CY1451A (en) 1989-03-10
ES8607391A1 (es) 1986-05-16
PT77167B (en) 1986-03-20
DE3379960D1 (en) 1989-07-06
PT77167A (en) 1983-09-01
DD218118A5 (de) 1985-01-30
HK90688A (en) 1988-11-18
ES8607026A1 (es) 1986-05-16
DK361483A (da) 1984-02-10
EP0100561A1 (en) 1984-02-15
ES524816A0 (es) 1985-06-01
NZ205178A (en) 1986-09-10
IE55598B1 (en) 1990-11-21
NO172548C (no) 1993-08-04
FI832825A0 (fi) 1983-08-05
GB2125047A (en) 1984-02-29
ES8505724A1 (es) 1985-06-01
GB8319099D0 (en) 1983-08-17
NO832848L (no) 1984-02-10
JPS5948082A (ja) 1984-03-19
IE831860L (en) 1984-02-09
GB2125047B (en) 1986-02-19
DK174905B1 (da) 2004-02-16
ES540880A0 (es) 1986-05-16
JPH0653073B2 (ja) 1994-07-20
PH25617A (en) 1991-08-08
ATE43636T1 (de) 1989-06-15
DK361483D0 (da) 1983-08-08
NO172548B (no) 1993-04-26
HU204095B (en) 1991-11-28
FI80720C (fi) 1990-07-10
GR78924B (fi) 1984-10-02
EP0100561B1 (en) 1989-05-31
FI832825A (fi) 1984-02-10
AU1768283A (en) 1984-02-16
JPH0515379A (ja) 1993-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI80720B (fi) Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
US4661454A (en) GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
FI94427B (fi) Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa
US5102789A (en) Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
US5139936A (en) Use of the GAL1 yeast promoter
FI94773C (fi) Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi
FI91280B (fi) Repressoituvat hiivapromoottorit
JPH07503368A (ja) 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物
FI104639B (fi) Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa
JPS62272976A (ja) 変異組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−及びその製造
WO1984001153A1 (en) Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
US5258302A (en) DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
FI103206B (fi) Uusi ilmentämisjärjestelmä sieniä varten
KR940005584B1 (ko) 트롬빈 억제제의 제조방법
CA1273883A (en) Recombinant dna material comprising bovine growth hormone nucleotide sequence
KR940011534B1 (ko) 억제성 효모 프로모터의 제조방법
HU204087B (en) Process for producing humqn alpha or beta interferon
GB2217332A (en) Expression of salmon growth hormone in methylotrophic yeast of genus pichia
PH26266A (en) Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVARTIS AG

MA Patent expired

Owner name: NOVARTIS AG